IỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID

Phản ứng với thuốc thử diazonium Thực hiện: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, kiềm hóa bằng vài giọt dung dịch NaOH 10%, thêm 1-2 giọt thuốc thử diazonium lạnh.. Phản ứng Cyanidin tr

KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU

CHỨA FLAVONOID

TS Vũ Huỳnh Kim Long

THÍ NGHIỆM DƯỢC LIỆU 1

Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn

thường có màu sắc và gặp phổ biến trong thực vật.

Đặc điểm: nhiều OH phenolics

• Tăng màu với NaOH

khi nh ữ ng

h ợ p ch ấ t b ị

oxh đ ó đ i vào c ơ th ể

DNA độ t bi ế n

Nguyên liệu

− Hòe (Flos Styphnolobii japonici imaturi, là nụ hoa đã phơi hay sấy nhẹ đến khô của cây Hoè,

Styphnolobium japonicum, Fabaceae);

− Đậu đen (Semen Vignae unguiculatae) là hạt của cây Đậu đen (Vigna unguiculata,

Fabaceae);

− Vỏ Bưởi (Pericarpium Citri grandi) là vỏ quả giữa của cây Bưởi (Citrus grandis, Rutaceae);

− Vỏ quả Me (Pericarpium Tamarindi) là vỏ quả của cây Me (Tamarindus indica L., Fabaceae).

− Rễ Tranh (Rhizoma Imperatae) là thân ngầm của cây Cỏ tranh (Imperata cylindrica,

t ươ i: đắ ng (do flavonoid -Naringin)

SOI BỘT

SOI BỘT

Quan sát về mặt cảm quan và khảo sát bột hoa Hòe dưới kính hiển

vi, tìm các cấu tử sau:

Lông che chở đơn bào

Lông che chở đa bào

Hạt phấn hoa có 3 lỗ nảy mầm

Mảnh đài hoa mang lông che chở

Mảnh đài hoa mang lông che chở và lỗ khí

SOI BỘT

Quan sát về mặt cảm quan và khảo sát bột hoa Hòe dưới kính hiển

vi, tìm các cấu tử sau:

m ả nh bi ể u bì cánh hoa vách dày

hình đ a giác

m ả nh m ạ ch v ạ ch

mô m ề m

lông che ch ở đơ n bào

lông che chở đa bào

tinh th ể calci õalat

tinh th ể trong m ả nh mô m ề m

Quan sát về mặt cảm quan và khảo sát bột rễ Nhàu dưới kính hiển

vi, tìm các cấu tử sau:

b ộ t r ễ nhàu dành cho bài anthaglycosid có nh ữ ng đặ c đ i ể m đặ c tr ư ng cho r ễ ngoài cùng là l ớ p b ầ n (nh ữ ng tb hình ch ữ nh ậ t)

tb hình ch ữ nh ậ t vách dày x ế p thành 1 dãy v ớ i nhau

SOI BỘT

Quan sát về mặt cảm quan và khảo sát bột Đại hoàng dưới kính

hiển vi, tìm các cấu tử sau:

c ử u ch ư ng, c ử u sái (9 l ầ n n ấ u, 9 l ầ n ph ơ i) -> th ụ c đị a (r ễ cây đạ i hoàng)

tb hình ch ữ nh ậ t vách dày x ế p thành 1 dãy v ớ i nhau

SOI BỘT

Quan sát về mặt cảm quan và khảo sát bột Đại hoàng dưới kính

hiển vi, tìm các cấu tử sau:

hình ch ữ nh ậ t

m ả nh trong

su ố t ch ứ a nhi ề u h ạ t tinh

b ộ t

hình c ầ u gai

tinh b ộ t

ĐỊNH TÍNH

ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID

1 Chiết xuất flavonoid:

Lấy 1 g mỗi bột dược liệu cho vào

một erlen 100 ml riêng biệt Thêm 25

ml ethanol 96% vào mỗi bình (Riêng

Đậu đen dùng cồn 25%) Đun trên

bếp cách thủy trong 5 phút Dịch

chiết được để nguội, lọc vào các ống

nghiệm riêng biệt dùng làm các phản

ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID

2 Định tính trên giấy lọc

• Trên 1 tờ giấy lọc 15 ´ 18 cm dùng bút chì kẻ

thành bảng gồm 5 hàng ´ 5 cột, ghi chú như bên

• Mỗi hàng, dùng pipette Pasteur nhỏ thật gọn vào

các ô 1 giọt dịch chiết của mỗi loại dược liệu, để khô

tự nhiên, lặp lại thêm 3 lần nữa Vẽ vòng đánh dấu

các vết dịch chiết bằng bút chì Nhỏ riêng biệt vào

các cột tương ứng dung dịch NaOH 1%, AlCl3 1%

trong MeOH và dung dịch FeCl3 1% Chú ý nhỏ

dung dịch thuốc thử thành vòng bé, nằm gọn trong

vết dịch chiết

• Để khô tự nhiên, quan sát và ghi nhận màu sắc

của các vết không có và có thuốc thử dưới ánh sáng

thường và UV 365 nm

ph ả n ứ ng t ă ng màu

t ủ a xanh đ en

3 Định tính bằng phản ứng hóa học:

3.1 Phản ứng của nhóm OH phenol và nhân thơm

3.1.1 Phản ứng tăng màu với dung dịch NaOH 1% và tạo phức với ion kim loại

Với mỗi dược liệu, lấy 5 ống nghiệm cho vào mỗi ống 1 ml dịch chiết để làm các phản ứng sau:

Ống nghiệm 2: Thêm 2 giọt dung dịch NaOH 1%, quan sát màu;

Ống nghiệm 3: Thêm 2 giọt dung dịch AlCl3 1%, quan sát màu; soi dưới đèn UV, quan sát hiện tượng, so sánh với ống chứng;

Ống nghiệm 4: Thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 1%, quan sát màu, có thể pha loãng với 2 ml nước để quan sát rõ hơn.

Cách thực hiện: Riêng mẫu Bưởi, phản ứng với NaOH 1%: quan sát màu của ống

nghiệm trước và sau khi nhúng vào nồi cách thủy 2-3 phút.

ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID

3

3 Định tính bằng phản ứng hóa học:

3.1 Phản ứng của nhóm OH phenol và

nhân thơm

3.1.2 Phản ứng với thuốc thử diazonium

Thực hiện: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch

chiết, kiềm hóa bằng vài giọt dung dịch

NaOH 10%, thêm 1-2 giọt thuốc thử

diazonium lạnh Lắc đều và quan sát màu

3 Định tính bằng phản ứng hóa học:

3.2 Phản ứng Cyanidin trên vòng γ-pyrone

(phản ứng Shinoda)

Cho 1 ml dịch chiết Đậu đen vào 3 ống nghiệm có

sẵn một ít bột Mg kim loại (nửa hạt bắp) Đặt 3 ống

nghiệm lên giá, đưa vào tủ hood Thêm từ từ theo

thành ống nghiệm 0.5-1 ml HCl đậm đặc, quan sát

sự chuyển màu của dung dịch.

ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID

VÀNG -> ĐỎ ĐẬ M

1 m ũ i mác là đủ

cho HCl đế n khi đỏ b ề n

là ph ả n ứ ng đặ c tr ư ng cho khung flavonoid

3 Định tính bằng phản ứng hóa học:

3.3 Định tính các hợp chất anthocyanidin

Cho vào 3 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống nghiệm 1 ml dịch chiết, sau đó:

ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID

ch ấ t này s ẽ chuy ể n màu theo pH ( đậ u đ en, )

tìm c ơ ch ế anthocyannidin và leucoanthocyanidin

=> đ em vào báo cáo

4 Định tính bằng SKLM:

Bản mỏng sắc ký: Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 (Merck), kích thước 7 cm × 2 cm

Hệ dung môi khai triển: ethyl acetat- methanol - nước (100: 17: 13).

Mẫu thử: Dịch chiết Hoa hoè.

Mẫu chuẩn: Hoà tan rutin trong ethanol 96% để được dung dịch có chứa 1 mg/ml.

Cách tiến hành: Dùng mao quản chấm riêng biệt dịch chấm sắc ký và dung dịch rutin chuẩn lên

bản mỏng silica gel.

Phát hiện:

• Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm,

• Hiện màu bằng hơi amoniac đậm đặc

• Nhúng thuốc thử FeCl3/EtOH

Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết cùng màu vàng có cùng giá trị Rf với vết rutin chuẩn (Rf: 0,5 - 0,54) trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.

ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID

ĐỊNH LƯỢNG

N=O thành d ạ ng ion

h ồ ng -> đỏ

ĐỊNH LƯỢNG

• Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,2 g rutin chuẩn đã sấy khô (trong chân không) tới khối lượng

không đổi, cho vào một bình định mức 100 ml Hoà tan trong 70 ml methanol (TT) bằng cách làm ấm trên cách thuỷ Để nguội, thêm methanol (TT) đủ 100 ml, lắc kỹ Lấy chính xác 10 ml dung dịch này cho vào một bình định

mức 100 ml khác Thêm nước tới vạch, lắc kỹ (mỗi ml chứa 0,2 mg rutin khan)

• Xây dựng đường cong chuẩn: Lấy chính xác 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; và 6,0 ml dung dịch chuẩn cho vào bình

định mức 25 ml riêng biệt, thêm nước cho tới 6 ml ở mỗi bình rồi thêm 1 ml dung dịch natri nitrit 5% (TT), trộn

kỹ Để yên 6 phút, thêm 1 ml dung dịch nhôm nitrat 10% (TT), trộn kỹ, lại để yên 6 phút Thêm 10 ml dung dịch

natri hydroxyd 10% (TT), thêm nước tới vạch, trộn kỹ và để yên trong 15 phút Đo độ hấp thụ ở bước sóng 500

nm Vẽ đường cong chuẩn, lấy độ hấp thụ là trục tung, nồng độ là trục hoành

• Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1 g bột dược liệu thô cho vào bình Soxhlet Thêm 120 ml ether (TT),

chiết tới khi dịch chiết không màu Để nguội và gạn bỏ ether Thêm 90 ml methanol (TT) và chiết tới khi dịch

chiết không còn màu Chuyển dịch chiết vào một bình định mức 100 ml, rửa bình chiết bằng một lượng nhỏmethanol rồi cho tiếp vào bình định mức Thêm methanol cho tới vạch và lắc kỹ Lấy chính xác 10 ml dung dịchtrên cho vào bình định mức 100 ml, thêm nước tới vạch và trộn kỹ Lấy chính xác 3 ml cho vào bình định mức

25 ml, thêm 3 ml nước rồi thêm 1 ml dung dịch natri nitrit 5% (TT), trộn kỹ Để yên 6 phút, thêm 1 ml dung dịch

nhôm nitrat 10% (TT), trộn kỹ, để yên 6 phút Thêm 10 ml dung dịch natri hydroxyd 10% (TT), thêm nước tới

vạch, trộn kỹ và để yên trong 15 phút Đo độ hấp thụ ở bước sóng 500 nm (Phụ lục 4.1) Tính khối lượng rutin(mg) của dung dịch thử từ nồng độ đọc được trên đường cong chuẩn và tính hàm lượng phần trăm rutin trongdược liệu Hàm lượng rutin trong nụ hoa Hoè không ít hơn 20%

ĐỊNH LƯỢNG

• Dung dịch chuẩn: Cân chính xác

khoảng 0,2 g rutin chuẩn đã sấy khô (trong chân không) tới khối lượng không đổi, cho vào một bình định mức 100 ml Hoà tan

trong 70 ml methanol (TT) bằng

cách làm ấm trên cách thuỷ Để

nguội, thêm methanol (TT) đủ 100

ml, lắc kỹ Lấy chính xác 10 ml dung dịch này cho vào một bình định mức 100 ml khác Thêm nước tới vạch, lắc kỹ (mỗi ml chứa 0,2 mg rutin khan).

ĐỊNH LƯỢNG

• Xây dựng đường cong chuẩn: Lấy chính

xác 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; và 6,0 ml dung dịch chuẩn cho vào bình định mức 25 ml riêng biệt, thêm nước cho tới 6 ml ở mỗi bình rồi thêm 1 ml dung dịch natri nitrit 5%

(TT), trộn kỹ Để yên 6 phút, thêm 1 ml

dung dịch nhôm nitrat 10% (TT), trộn kỹ, lại

để yên 6 phút Thêm 10 ml dung dịch natri

hydroxyd 10% (TT), thêm nước tới vạch, trộn kỹ và để yên trong 15 phút Đo độ hấp thụ ở bước sóng 500 nm Vẽ đường cong chuẩn, lấy độ hấp thụ là trục tung, nồng độ

là trục hoành.

ĐỊNH LƯỢNG

• Dung dịch thử:

CẢM ƠN CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE!