IỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID

THÍ NGHIỆM DƯỢC LIỆU 1 KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID TS Vũ Huỳnh Kim Long Flavo: màu vàng FLAVONOID là 1 hợp chất lớn, làm thực vật có màu sắc (màu vàng nhạt -> vàng đậm -> tím, xanh) có nhiều liên kết đôi liên hợp Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường có màu sắc và gặp phổ biến trong thực vật => chống oxy hóa mạnh (vì Đặc điểm: nhiều OH phenolicsnhững hợp chất cao hơn OH có thể bị oxy hóa thành VD: andehit, acid) • Tạo phức với kim loại (Fe3+, Al3+) ,Pb2+ • Tăng màu với NaOH xanh vàng khi những hợp chất bị CẤU TRÚC: 3 vòng A,B,C - C6-C3-C6 oxh đó đi vào cơ thể gốc tự do sẽ tác dụng với gốc tự làm biến tính do (khói, bụi, thức protein, làm hệ ăn dùng dầu cũ, thịt DNA đột biến nướng, ) Vỏ của cây thuộc họ cam, chanh có 3 phần: VỎ QUẢ NGOÀI, VỎ QUẢ GIỮA, VỎ QUẢ TRONG tươi: đắng => Vỏ quả giữa nhiều flavonoid nhất (do flavonoid -Naringin) => dùng vỏ quả giữa làm thí nghiệm pectin - vỏ dai Nguyên liệu tinh dầu nhiều túi tiết dùng nụ hoa xay thành bột hoa chưa nở có rutin cao (>20%) − Hòe (Flos Styphnolobii japonici imaturi, là nụ hoa đã phơi hay sấy nhẹ đến khô của cây Hoè, − Styphnolobium japonicum, Fabaceae); chỉ cho phép có hoa đã nở − Đậu đen (Semen Vignae unguiculatae) là hạt của cây Đậu đen (Vigna unguiculata, − − Fabaceae); dùng đậu đen nguyên hạt họ lúa Vỏ Bưởi (Pericarpium Citri grandi) là vỏ quả giữa của cây Bưởi (Citrus grandis, Rutaceae); − Vỏ quả Me (Pericarpium Tamarindi) là vỏ quả của cây Me (Tamarindus indica L., Fabaceae) Rễ Tranh (Rhizoma Imperatae) là thân ngầm của cây Cỏ tranh (Imperata cylindrica, Poeaceae); là thân rễ Chất chuẩn rutin nâu - do flavonoid SOI BỘT Hoa => đặc trưng: hạt phấn hoa có 3 lỗ nảy mầm, lỗ khí, mảnh đài hoa, lông che chở đa - đơn bào, calci oxalat hình khối/lăng trụ SOI BỘT Quan sát về mặt cảm quan và khảo sát bột hoa Hòe dưới kính hiển vi, tìm các cấu tử sau: chỉ có 1 tb xuyên suốt lỗ bên trong trốnghoàn toàn Lông che chở đơn bào Hạt phấn hoa có 3 lỗ nảy mầm Mảnh đài hoa mang lông che chở và lỗ khí Mảnh mạch vòng Lông che chở đa bào Mảnh đài hoa mang lông che chở Mạch vạch, mạch xoắn xương cá, vạch song song SOI BỘT Quan sát về mặt cảm quan và khảo sát bột hoa Hòe dưới kính hiển vi, tìm các cấu tử sau: mảnh biểu bì vách dày cánh hoa lỗ nảy mầm hình đa giác mảnh biểu bì mang lỗ khí mô mềm lông che chở đơn bào tinh thể calci õalat lông che chở đa bào tinh thể trong mảnh mô mềm mảnh mạch vạch hạt phấn mảnh mạch xoắn phân biệt với tinh bột nha - TỄ bột rễ nhàu dành cho bài anthaglycosid có những đặc điểm đặc trưng cho rễ ngoài cùng là lớp bần (những tb hình chữ nhật) SOI BỘT chứa hạt tinh bột (vì rễ là nơi dự trữ chất dinh dưỡng của cây) có mảnh mô mềm Quan sát về mặt cảm quan và khảo sát bột rễ Nhàu dưới kính hiển vi, tìm các cấu tử sau: cấu tử đặc trưng cho Nhàu tb hình chữ nhật vách dày xếp thành 1 dãy với nhau sợi dọc dính lại với nhau thanh rải rác - trong suốt Mảnh bần Bó sợi Tinh thể calci oxalat hình kim cấu trử đặc mảnh lỗ hình tròn xếp thành dãy trưng cho rễ Mạch điểm Mảnh mô mềm Hạt tinh bột tb đa giác xếp xen kẽ hình bầu dục SOI BỘT cửu chưng, cửu sái (9 lần nấu, 9 lần phơi) -> thục địa (rễ cây đại hoàng) Quan sát về mặt cảm quan và khảo sát bột Đại hoàng dưới kính hiển vi, tìm các cấu tử sau: cấu tử đặc trưng cho rễ tb hình chữ nhật vách dày xếp thành 1 dãy với nhau mảnh dài dính nhau, có lõi bên trong TỄ Mảnh bần Bó sợi Hạt tinh bột cấu tử đặc Mạch vạch, mạch trưng cho đại hoàng chứa nhiều hạt tinh bột Tinh thể calci oxalate hình cầu gai Mảnh mô mềm SOI BỘT Quan sát về mặt cảm quan và khảo sát bột Đại hoàng dưới kính hiển vi, tìm các cấu tử sau: mảnh trong tinh bột suốt chứa hình cầu gai nhiều hạt tinh bột hình chữ nhật ĐỊNH TÍNH flavonoid hơi kém phân cực => dùng dung môi: cồn 96% ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID 5 erlen 1 Chiết xuất flavonoid: Lấy 1 g mỗi bột dược liệu cho vào vì đậu đen chứa anthocyanidin một erlen 100 ml riêng biệt Thêm 25 rất phân cực ml ethanol 96% vào mỗi bình (Riêng Đậu đen dùng cồn 25%) Đun trên bếp cách thủy trong 5 phút Dịch chiết được để nguội, lọc vào các ống nghiệm riêng biệt dùng làm các phản ứng hóa học và dịch chấm sắc ký lớp mỏng ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID 2 Định tính trên giấy lọc tủa xanh đen • Trên 1 tờ giấy lọc 15 ´ 18 cm dùng bút chì kẻ phản ứng tăng màu thành bảng gồm 5 hàng ´ 5 cột, ghi chú như bên • Mỗi hàng, dùng pipette Pasteur nhỏ thật gọn vào các ô 1 giọt dịch chiết của mỗi loại dược liệu, để khô tự nhiên, lặp lại thêm 3 lần nữa Vẽ vòng đánh dấu các vết dịch chiết bằng bút chì Nhỏ riêng biệt vào các cột tương ứng dung dịch NaOH 1%, AlCl3 1% trong MeOH và dung dịch FeCl3 1% Chú ý nhỏ dung dịch thuốc thử thành vòng bé, nằm gọn trong vết dịch chiết • Để khô tự nhiên, quan sát và ghi nhận màu sắc của các vết không có và có thuốc thử dưới ánh sáng thường và UV 365 nm ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID 3 Định tính bằng phản ứng hóa học: 3.1 Phản ứng của nhóm OH phenol và nhân thơm 3.1.1 Phản ứng tăng màu với dung dịch NaOH 1% và tạo phức với ion kim loại Với mỗi dược liệu, lấy 5 ống nghiệm cho vào mỗi ống 1 ml dịch chiết để làm các phản ứng sau: 3 Ống nghiệm 2: Thêm 2 giọt dung dịch NaOH 1%, quan sát màu; Ống nghiệm 3: Thêm 2 giọt dung dịch AlCl3 1%, quan sát màu; soi dưới đèn UV, quan sát hiện tượng, so sánh với ống chứng; Ống nghiệm 4: Thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 1%, quan sát màu, có thể pha loãng với 2 ml nước để quan sát rõ hơn Cách thực hiện: Riêng mẫu Bưởi, phản ứng với NaOH 1%: quan sát màu của ống nghiệm trước và sau khi nhúng vào nồi cách thủy 2-3 phút ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID 3 Định tính bằng phản ứng hóa học: 3.1 Phản ứng của nhóm OH phenol và nhân thơm 5 ống nghiệm 3.1.2 Phản ứng với thuốc thử diazonium Thực hiện: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, kiềm hóa bằng vài giọt dung dịch NaOH 10%, thêm 1-2 giọt thuốc thử diazonium lạnh Lắc đều và quan sát màu của dung dịch Ghi chú: Chỉ dùng 1-2 giọt thuốc thử diazonium ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID 1 mũi mác là đủ 3 Định tính bằng phản ứng hóa học: 3.2 Phản ứng Cyanidin trên vòng γ-pyrone (phản ứng Shinoda) là phản ứng đặc trưng cho khung flavonoid Cho 1 ml dịch chiết Đậu đen vào 3 ống nghiệm có sẵn một ít bột Mg kim loại (nửa hạt bắp) Đặt 3 ống nghiệm lên giá, đưa vào tủ hood Thêm từ từ theo thành ống nghiệm 0.5-1 ml HCl đậm đặc, quan sát sự chuyển màu của dung dịch VÀNG -> ĐỎ ĐẬM cho HCl đến khi đỏbền ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID 3 Định tính bằng phản ứng hóa học: 3.3 Định tính các hợp chất anthocyanidin chất này sẽ chuyển màu theo pH (đậu đen, ) Cho vào 3 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống nghiệm 1 ml dịch chiết, sau đó: tìm cơ chế anthocyannidin và leucoanthocyanidin => đem vào báo cáo ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID 3 Định tính bằng phản ứng hóa học: 3.4 Định tính các hợp chất Leucoanthocyanidin Cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 2 ml dịch chiết vỏ quả me trong cồn Quan sát màu của dung dịch và so với ống chứng Sau đó: ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID 4 Định tính bằng SKLM: Bản mỏng sắc ký: Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 (Merck), kích thước 7 cm × 2 cm Hệ dung môi khai triển: ethyl acetat- methanol - nước (100: 17: 13) Mẫu thử: Dịch chiết Hoa hoè chấm 2 vết: mẫu thử và mẫu chuẩn Mẫu chuẩn: Hoà tan rutin trong ethanol 96% để được dung dịch có chứa 1 mg/ml Cách tiến hành: Dùng mao quản chấm riêng biệt dịch chấm sắc ký và dung dịch rutin chuẩn lên bản mỏng silica gel Phát hiện: • Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm, • Hiện màu bằng hơi amoniac đậm đặc : lấy bình amoniac vào tủ hood, cầm bảng mỏng hơ trên bình amoniac -> nếu là flavonoid sẽ là màu vàng • Nhúng thuốc thử FeCl3/EtOH -> vết màu xanh đen (butyl phenol) Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết cùng màu vàng có cùng giá trị Rf với vết rutin chuẩn (Rf: 0,5 - 0,54) trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu ĐỊNH LƯỢNG Nguyên tắc vàng nhạt -> cam -OH bị oxy hóa thành 2 cetone chuyển thêm nhóm N=O N=O thành dạng bắt cặp tạo phức nhôm ion hồng -> đỏ