Trang 1 ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌCỨng dụng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction trong chẩn đoán bệnh khảm lá trên cây sắn do Sri Lanka Cassava Mosaic Viru
ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC Bộ môn: Thiết bị kỹ thuật Công nghệ sinh học BÁO CÁO TIỂU LUẬN Ứng dụng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction chẩn đoán bệnh khảm sắn Sri Lanka Cassava Mosaic Virus gây Trình bày: Nhóm Giáo viên hướng dẫn: TS Huỳnh Văn Biết KS Trương Quang Toản TP Hồ Chí Minh, ngày 22 tháng 10 năm 2023 01 Thành viên: Nội dung: Phan Minh Ngọc 21126426 DH21SHB Tổng quan Hen Rích 21126488 DH21SHB Quy trình PCR Nguyễn Thị Mỹ Ngọc 21126425 DH21SHB Phương pháp điện dii 10 02 TỔNG QUAN Cây sắn 13 chủ lực quốc gia, đứng thứ ba sản lượng nông nghiệp xuất Việt Nam, sau gạo cà phê Tuy nhiên, mối lo kéo dài dai dẳng từ vùng trồng sắn bệnh khảm virus Những năm gần đây, loại bệnh gây hại nhiều địa phương khiến lợi nhuận từ trồng bà nông dân khơng cịn cao ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản lượng vùng nguyên liệu 03 Về Sri Lanka Cassava Mosaic Virus: Virus khảm sắn Sri Lanka (SLCMV), loại Begomovirus lưỡng cực, loài virus gây bệnh CMD Đông Nam Á (SEA) phổ biến Campuchia, Việt Nam, Thái Lan miền nam Trung Quốc (Siriwan cộng 2020) 04 Về Sri Lanka Cassava Mosaic Virus: Bệnh chủ yếu ảnh hưởng đến non Khi bị bệnh khảm sắn xoắn lại gần phát triển Đồng thời, thân trở nên giòn, rỗng dẫn đến dễ gãy 05 CÁC BƯỚC CHẨN ĐOÁN Để kiểm sốt nguồn bệnh, ngồi việc phịng ngừa ruồi trắng việc cấp thiết cần làm kiểm tra xét nghiệm sàng lọc sắn bệnh phương pháp PCR Sử dụng đoạn mồi SLCMV-F (5′ATGTCGAAGCGACCAGCAGATATAAT-3′) SLCMV-R (5′-TTAATTGCTGACCGAATCGTAGAAG3′) nhắm vào gen AV1 đoạn mồi SLCMV-B-F1 (5′ACCGGATGGCCGCGCCCCCCTCT-3′) SLCMV-B606R (5′-CACCTACCCTGTTATCGCTAAG-3′) hướng tới phần gen BV1 06 QUY TRÌNH PCR Phản ứng PCR thực cách lặp lặp lại chu kỳ gồm giai đoạn: Biến tính Hỗn hợp đặt nhiệt độ cao nhằm tách sợi DNA mạch đôi thành DNA mạch đơn Bắt cặp Nhiệt độ hạ xuống cho phù hợp để đoạn mồi gắn bổ sung vào khuôn DNA Kéo dài Dưới tác động enzyme DNA polymerase, nucleotide gắn vào đầu 3’ đoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn, từ tổng hợp nên sợi theo chiều 5’ – 3’ 07 NGUYÊN LÝ CỦA PHẢN ỨNG PCR www.researchgate.net 08 Dùng pipetman hút cho vào eppendorf 0,2 ml theo thứ tự VẬT LIỆU, DỤNG CỤ, THIẾT BỊ - DNA gene (DNA genomic) Mồi xuôi mồi ngược Dung dịch đệm 10X PCR buffer dNTP 10mM Enzyme Taq DNA polymerase Nước cất hai lần vô trùng Pipetteman loại Máy luân nhiệt Eppendorf 0,5 ml; 0,2 ml vô trùng Đăt eppendorf chứa dung dịch phản ứng vào máy luân nhiệt đem điện di sản phẩm PCR gel agarose 1,0 % 20 phút, xem kết 09 Phương pháp điện di Vật liệu Thiết bị điện di agarose: • Bộ cung cấp nguồn điện (power source) • Bồn điện di (gel box) •Khay gel (casting tray), lược gel (combs) Hóa chất • Dung dịch đệm điện di (TAE) • Agarose • GelRed (Loading dye + sample dye) 10 Chuẩn bị gel: - Chuẩn bị khay đổ gel, gài 13 giếng vào cho cách đáy khay khoảng 1mm tránh làm thủng gel - Pha dung dịch gel: 2% agarose (1g), 50 ml dung dịch đệm TAE - Đun lị vi sóng khoảng phút cho agarose tan - Để nguội tầm 5-10 phút sau đổ gel vào khn chờ gel đơng lại Chuẩn bị bồn điện di: - Khi gel nguội đặc lại, khay gel đặt vào bồn điện di, ngập dung dịch đệm điện di Lược gel tháo tạo nên “giếng” rỗng dành mẫu điện di vào 11 Chuẩn bị mẫu: - Sử dụng dung dịch loading dye trộn với GelRed Hút 10 µl dung dịch loading dye lên miếng nylon sau hút µl dung dịch DNA mẫu (DNA tổng số DNA plasmid) vào miếng nylon, trộn giếng cho mẫu DNA ly trích - Pipeting hút hết dịch vừa trộn cho vào giếng - Giếng cuối chứa thang chuẩn DNA (Là hỗn hợp đoạn DNA chứa kích thước khác biết trước kích thước -> Mua) Cách làm: Hút 10 µl GelRed + µl Ladder -> Trộn Điện di: - Đậy nắp bồn điện di cẩn thận Không chạm vào mẫu Thường nắp bồn điện di lắp vào bồn theo hướng dựa vào vị trí đánh dấu điện cực 12 TÀI LIỆU THAM KHẢO Chittarath, K., Jimenez, J., Vongphachanh, P., Leiva, A M., Sengsay, S., Lopez-Alvarez, D., & Cuellar, W J (2021) First report of cassava mosaic disease and Sri Lankan cassava mosaic virus in Laos Plant Disease, 105(6), 1861 Malik, A I., Sophearith, S., Delaquis, E., Cuellar, W J., Jimenez, J., & Newby, J C (2022) Susceptibility of cassava varieties to disease caused by Sri Lankan cassava mosaic virus and impacts on yield by use of asymptomatic and virus-free planting material Agronomy, 12(7), 1658 Legg, J P., Kumar, P L., Makeshkumar, T., Tripathi, L., Ferguson, M., Kanju, E., & Cuellar, W (2015) Cassava virus diseases: biology, epidemiology, and management In Advances in virus research (Vol 91, pp 85-142) Academic Press Siriwan, W., Jimenez, J., Hemniam, N., Saokham, K., Lopez-Alvarez, D., Leiva, A M., & Cuellar, W J (2020) Surveillance and diagnostics of the emergent Sri Lankan cassava mosaic virus (Fam Geminiviridae) in Southeast Asia Virus research, 285, 197959 Dutt, N., Briddon, R W., & Dasgupta, I (2005) Identification of a second begomovirus, Sri Lankan cassava mosaic virus, causing cassava mosaic disease in India Archives of Virology, 150, 2101-2108 Trần, K C (2019) Chẩn đoán xác định đặc điểm di truyền học Sri Lanka Mosaic virus gây bệnh khảm Cây Sắn: Khóa luận tốt nghiệp Chun ngành Cơng nghệ Sinh học (Doctoral dissertation, Đại học Nguyễn Tất Thành (Khoa Công nghệ Sinh học)) 13 CẢM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE 14