Với mục tiêu sản lƣợng cá rô phi đạt 400.0000 tấn năm 2030, ngồi việc tăng diện tích ni trồng thì việc áp dụng các khoa học kĩ thuật, các giải pháp quản lý dịch bệnh trên đối tƣợng vật n
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học dùng môi trường ao nuôi giúp giảm ô nhiễm môi trường, phịng bệnh xuất huyết cá rơ phi streptococcus agalactiae NGUYỄN THỊ MẾN Ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Đức Lưu PGS TS Trần Liên Hà Viện: Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm HÀ NỘI, 2020 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17061132070271000000 LỜI CẢM ƠN Sau hai năm học tập nghiên cứu, tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ kĩ thuật chuyên nghành công nghệ sinh học Để đạt thành ngày hơm nay, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn TS Nguyễn Đức Lưu; PGS TS Trần Liên Hà người thầy ln tận tâm học trị Người hết lịng hướng dẫn bảo động viên tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn: Tồn thể q Thầy, cô Viện Công nghệ Sinh học – Đại học Bách Khoa Hà Nội truyền đạt kiến thức quý báu suốt thời gian theo học trường Lãnh đạo công ty TNHH Dược Hanvet tập thể phân xưởng Probiotic tạo điều kiện cho làm nghiên cứu thực đề tài cách tốt Những người thân yêu gia đình bên cạnh, ủng hộ nguồn động viên lớn lao hy sinh nhiều để tơi có ngày hơm Xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày 25 tháng 06 năm 2020 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Mến LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệụ, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình Các tài liệu tham khảo trích dẫn có nguồn gốc xác thực Hà Nội, ngày 25 tháng 06 năm 2020 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Mến ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình chăn ni cá rơ phi giới Việt Nam 1.1.1 Thực trạng chăn nuôi cá rô phi giới 1.1.2 Thực trạng chăn nuôi cá rô phi Việt Nam 1.2 Các chất NH3, NO2 sinh môi trƣờng ao nuôi 1.2.1 Ammonia (NH3) 1.2.2 Nitrite (NO2-) 10 1.3 Tình hình dịch bệnh cá rơ phi 10 1.3.1 Tình hình dịch bệnh cá rơ phi 10 1.3.2 Tình hình dịch bệnh xuất huyết cá rơ phi Streptococcus agalactiae gây Việt Nam 13 1.3.3 Thực trạng việc sử dụng phƣơng pháp phòng điều trị bệnh xuất huyết cá rô phi Streptoccus agalactiae gây 16 1.4 Vai trò chế phẩm sinh học với nuôi trồng thủy sản 17 1.4.1 Các nghiên cứu giới 17 1.4.2 Các nghiên cứu Việt Nam 18 1.5 Vi khuẩn Bacillus 19 1.5.1 Đặc điểm sinh học chủng Bacillus 19 1.5.2 Một số loài Bacillus phổ biến tự nhiên 20 1.5.3 Cơ sở khoa học việc chọn chủng Bacillus dùng cho nuôi trồng thủy sản 22 1.5.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chế phẩm có thành phần Bacillus ni trồng thủy sản 23 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Vật liệu nghiên cứu 25 2.1.1 Nguồn vi sinh vật 25 2.1.2 Dụng cụ 25 2.1.3 Hóa chất 26 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 27 2.2.2 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Bacillus 28 i 2.2.3 Tuyển chọn chủng giống 29 2.2.4 Định danh chủng giống 30 2.3 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣờng B subtilis SHV27 33 2.3.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng B subtilis SHV27 33 2.3.2 Ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng B subtilis SHV27 33 2.3.3 Ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng khác đến sinh trƣởng B subtilis SHV27 33 2.3.4 Ảnh hƣởng lƣu lƣợng khí vào đến sinh trƣởng B subtilis SHV2734 2.3 Khảo sát sinh trƣởng B licheniformis SHV43 B pumilus SHV52 34 2.4 Tạo chế phẩm 34 2.4.1 Thu sinh khối 34 2.4.2 Chọn chất mang tạo chế phẩm 34 2.4.3 Khảo sát độ ổn định chế phẩm 35 2.5 Đánh giá hiệu sản phẩm 36 2.5.1 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm khác đến nồng độ NO2-, NH4+ tăng trọng cá 36 2.5.2 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm khác đến khả ức chế Streptococcus agalactiae HV-Strep O2 36 2.6 Phƣơng pháp phân tích 37 2.6.1 Đánh giá cảm quan 37 2.6.2 Phƣơng pháp xử lý số liệu 37 Chƣơng NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Phân lập chủng giống 38 3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh học mạnh 41 3.2.1 Tuyển chọn khả sinh enzyme ngoại bào 45 3.2.2 Tuyển chọn khả sinh chất kháng khuẩn kháng S.agalactiae 46 3.2.3 Tuyển chọn khả khử chất độc hại NO2-, NH4+ 46 3.3 Định danh 46 3.3.1 Định danh phản ứng sinh hóa 46 3.3.2 Phân loại chủng Bacillus tuyển chọn giải trình tự gen 50 3.3.3 Tính đối kháng chủng giống 52 3.4 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng vi sinh vật 53 ii 3.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến phát triển vi sinh vật 53 3.4.2 Ảnh hƣởng pH đầu vào môi trƣờng nuôi cấy đến sinh trƣởng vi sinh vật 54 3.4.3 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy đến sinh trƣởng vi sinh vật 55 3.4.4 Ảnh hƣởng lƣu lƣợng khí vào đến sinh trƣởng vi sinh vật 56 3.5 Khảo sát lên men chủng B paralicheniformis SHV43 B.pumilus SHV5257 3.6 Tạo chế phẩm 58 3.6.1 Thu sinh khối 58 3.6.2 Lựa chọn chất mang 58 3.6.3 Khảo sát độ ổn định chế phẩm 60 3.7 Đánh giá hiệu sản phẩm 61 3.7.1 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm đến nồng độ NO2-, NH4+ tăng trọng cá 61 3.7.2 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm khác đến khả ức chế S.agalactiae gây bệnh xuất huyết cá rô phi 63 KẾT LUẬN 65 KIẾN NGHỊ 67 PHỤ LỤC 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 iii Bảng 1.1 Một số sản phẩm Probiotic dùng thủy sản thị trƣờng Việt Nam 24 Bảng 2.1 Các thiết bị dùng q trình thí nghiệm 25 Bảng 3.1 Phân lập chủng giống 38 Bảng 3.2 Khảo sát hoạt tính sinh học chủng giống 41 Bảng 3.4 Định danh kít API 50CH chủng Bacillus chọn 48 Bảng 3.5 Mối tƣơng quan di truyền dịng vi khuẩn tuyển chọn có ngân hàng gen (NCBI) 50 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy chủng B.subtilis SHV27 53 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng đầu vào chủng B.subtilis SHV27 54 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy chủng B subtilis SHV27 55 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng lƣu lƣợng khí vào lên men chủng B.subtilis SHV27 56 Bảng 3.10 Khảo sát lên men chủng B paralicheniformis SHV43 B.pumilus SHV52 57 Bảng 3.11 Ảnh hƣởng nồng độ nguyên liệu khác đến khả ức chế S.agalactiae 58 Bảng 3.12 Thành phần công thức chế phẩm 60 Bảng 3.13 Kết khảo sát độ ổn định chế phẩm 60 Bảng 3.14 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm khác đến nồng độ NO2trong nƣớc 61 Bảng 15 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm khác đến nồng độ NH4+ nƣớc 62 Bảng 3.16 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm khác đến sinh trƣởng cá 63 Bảng 3.17 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm khác đến khả ức chế S.agalactiae 63 Bảng 3.18 Hóa nghiệm thành phần dinh dƣỡng mơi trƣờng MT1 71 iv Hình 1.1 Sản lƣợng cá rô phi nƣớc giới năm 2017 Hình 1.2 Sản lƣợng cá rô phi đông lạnh Trung Quốc thị trƣờng Mỹ Hình 1.3 Sản lƣợng cá rơ phi toàn giới Hình 1.4 Sản lƣợng cá rơ phi dự kiến đến 2029 Hình 1.5 Khu hồ ni cá rơ phi cơng nghệ lồng Nauy Marvin group Hịa Bình Hình 1.6 Sản lƣợng thủy sản xuất 10 tháng đầu năm 2019 Hình 1.7 Sơ đồ vịng tuần hồn Nitơ 10 Hình 1.8 Dung huyết β khuẩn lạc Streptococcus agalactiae, blood agar 18h 36°C 15 Hình 1.9 Dấu hiệu bệnh lý cá nhiễm bệnh xuất huyết S.aglactiae 15 Hinh 1.10 Trực khuẩn Bacillus 19 Hình 2.1 Hệ thống lên men lít 26 Hình 2.2 Hệ thống bể ni cá thí nghiệm 26 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 27 Hình 3.1 Hình thái chủng chọn (ở độ phóng đại 1000 lần tế bào bào tử) 47 Hình 3.2 Cây phân loại chủng SHV27 51 Hình 3.3 Cây phân loại chủng SHV43 51 Hình 3.4 Cây phân loại chủng SHV52 52 Hình 3.5 Tính đối kháng chủng giống 52 Hình 3.6 Quy trình tổng quát tạo chế phẩm 59 Hình 3.7 Khuẩn lạc Streptococcus agalactiae môi trƣờng BA bổ sung kháng sinh 64 Hình 3.8 Trình tự nucleotid chủng B subtilis SHV27 68 Hình 3.9 Trình tự nucleotid chủng B licheniformis SHV43 69 Hình 3.10 Trình tự nucleotid chủng B pumilus SHV52 70 v Vit tt Gi NCNTTS Viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản LD50 Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm CFU Colony forming unit TNHH Trách nhiệm hữu hạn TQ Trung Quốc NA Nutrient agar NB Nutrient broth TE Tellurium Trypsin-EDTA Ha Héc ta EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid TAE Tris-acetate Ethylenediaminetetraacetic acid CTAB Cetyltrimethylammonium Bromide SDS Sodium dodecyl sulfate VK Vi khuẩn CMC Carboxymethyl cellulose PCI phenol: chloroform: isoamyl alcohol SP Sản phẩm KT Kiểm tra HQ Hiệu vi p thit c Những năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản Việt Nam khơng ngừng phát triển ngày chiếm vị trí quan trọng ngành Thủy sản nói riêng kinh tế nƣớc ta nói chung Theo trung tâm giống Khuyến nơng Quốc gia, năm 2015, diện tích ni cá rơ phi nƣớc 21.000 ha; sản lƣợng đạt 150 nghìn tấn; xuất 60 nƣớc; kim ngạch xuất 36 triệu đô Năm 2017, Xuất sang 68 nƣớc chủ yếu EU Mỹ, tăng 32% so năm 2016 tăng mạnh thời gian tới Với mục tiêu sản lƣợng cá rô phi đạt 400.0000 năm 2030, ngồi việc tăng diện tích ni trồng việc áp dụng khoa học kĩ thuật, giải pháp quản lý dịch bệnh đối tƣợng vật nuôi yếu tố quan trọng [1] Khi ngành nuôi trồng thủy sản theo hƣớng công nghiệp phát triển, mật độ nuôi ngày cao, sử dụng đến thức ăn cơng nghiệp phát sinh tình trạng nhiễm nguồn nƣớc ao nuôi, việc cải tạo đảm bảo nguồn nƣớc ngày trở nên phức tạp đau đầu cho nhà quản lý chăn nuôi Nguồn nƣớc bị ô nhiễm dẫn tới bệnh dịch xảy nhiều hơn, trầm trọng Để giảm bớt thiệt hại, ngƣời chăn nuôi phải sử dụng đến hóa chất thuốc kháng sinh Tình trạng lạm dụng hóa chất thuốc kháng sinh chăn nuôi thủy sản, dẫn tới tƣợng chủng vi khuẩn gây bệnh ngày đề kháng thuốc, hàm lƣợng hóa chất chất kháng sinh tồn dƣ thƣơng phẩm ảnh hƣởng lớn tới vấn đề xuất tơm, cá nƣớc ngồi mà nƣớc đặc biệt thị trƣờng xuất thủy hải sản lớn Việt Nam nhƣ Nhật Bản, Mỹ EU ngày tăng cƣờng việc kiểm tra kiểm soát mặt hàng thủy sản xuất từ Việt Nam Ở Việt Nam năm nuôi khoảng 695.000.000 cá rô phi xu hƣớng ngày mở rộng diện tích ni tập trung vào nuôi công nghiệp Đối với chăn ni cá rơ phi thƣơng phẩm, ngồi việc nhiễm nguồn nƣớc ao nuôi, bệnh xuất huyết vi khuẩn Streptococcocus sp cá rô phi bùng phát mạnh từ năm 2009 đến tỉnh nuôi cá rô phi nƣớc Diễn biến dịch bệnh ngày phức tạp, việc trị bệnh ngày khó khăn, Việt Nam có vắc xin phịng bệnh xuất huyết cá rô phi nhiên chƣa đƣợc ứng dụng nhiều Các biện pháp phòng trị bệnh chủ yếu dựa vào loại kháng sinh, hiệu phịng trị kháng sinh không cao, giá thành chi