Nghiên ứu tạo hế phẩm sinh họ dùng trong môi trường ao nuôi giúp giảm ô nhiễm môi trường, phòng bệnh xuất huyết trên á rô phi do streptoous agalatiae

Với mục tiêu sản lƣợng cá rô phi đạt 400.0000 tấn năm 2030, ngồi việc tăng diện tích ni trồng thì việc áp dụng các khoa học kĩ thuật, các giải pháp quản lý dịch bệnh trên đối tƣợng vật n

TRƯỜNG ĐẠ I HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ

L I C Ờ ẢM ƠN

Sau hai năm học tập và nghiên cứu, nay tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghi p Th c s ệ ạ ỹ kĩ thuật chuyên nghành công nghệ sinh học Để đạt được thành

qu ả như ngày hôm nay, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến giáo viên hướng

d n cẫ ủa tôi TS Nguyễn Đức Lưu; PGS TS Trần Liên Hà những người thầy luôn

t n tậ âm đối v i hớ ọc trò của mình Người đã hết lòng hướng d n ch bẫ ỉ ảo và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn:

Toàn thể quý Thầy, cô Viện Công nghệ Sinh h c i họ – Đạ ọc Bách Khoa Hà

Nội đã truyền đạt nh ng ki n thữ ế ức quý báu trong suốt thời gian tôi theo họ ạc t i trường

Lãnh đạo công ty TNHH Dược Hanvet và tập th ể phân xưởng Probiotic đã

tạo điều kiện cho tôi làm nghiên cứu và thực hiện đề tài một cách tốt nh ất

Những người thân yêu trong gia đình đã luôn bên cạnh, ng h tủ ộ ôi và là nguồn động viên lớn lao nhất và hy sinh nhiều nhất để tôi có được ngày hôm nay.Xin chân thành cảm ơn !

Hà Nội, ngày 25 tháng 06 năm 2020

Tác giả ận văn lu

Nguy n Th M n ễ ị ế

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệụ, kết

qu ảnêu trên trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong b t ấ

k ỳ công trình nào Các tài liệu tham khảo trích dẫn đều có nguồn gốc xác thực

Tác giả ận văn lu

Nguy n Th M n ễ ị ế

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình chăn nuôi cá rô phi trên thế giới và Việt Nam 3

1.1.1 Thực trạng chăn nuôi cá rô phi trên thế giới 3

1.1.2 Thực trạng chăn nuôi cá rô phi tại Việt Nam 6

1.2 Các chất NH3, NO2- sinh ra trong môi trường ao nuôi 9

1.2.1 Ammonia (NH3) 9

1.2.2 Nitrite (NO2-) 10

1.3 Tình hình dịch bệnh trên cá rô phi 10

1.3.1 Tình hình dịch bệnh trên cá rô phi 10

1.3.2 Tình hình dịch bệnh xuất huyết trên cá rô phi do Streptococcus agalactiae gây ra tại Việt Nam 13

1.3.3 Thực trạng việc sử dụng các phương pháp phòng và điều trị bệnh xuất huyết trên cá rô phi do Streptoccus agalactiae gây ra 16

1.4 Vai trò của ch ph m sinh h c vế ẩ ọ ới nuôi trồng th y s n ủ ả 17

1.4.1 Các nghiên cứu trên thế ớ gi i 17

1.4.2 Các nghiên cứ ạu t i Vi t Nam 18 ệ 1.5 Vi khu n Bacillus ẩ 19

1.5.1 Đặc điểm sinh h c c a ch ng Bacillus 19 ọ ủ ủ 1.5.2 M t s ộ ố loài Bacillus phổ ế bi n trong t ự nhiên 20

1.5.3 Cơ sở khoa học của vi c chệ ọn chủng Bacillus dùng cho nuôi trồng thủy sản 22

1.5.4 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các chế phẩm có thành phần Bacillus trong nuôi trồng th y s n ủ ả 23

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Vật liệu nghiên cứu 25

2.1.1 Ngu n vi sinh v t ồ ậ 25

2.1.2 D ng c ụ ụ 25

2.1.3 Hóa chất 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu 27

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu 27

2.2.2 Phương pháp phân lập vi khu n Bacillus ẩ 28

2.2.3 Tuyển chọn chủng giống 29

2.2.4 Định danh ch ng gi ng 30 ủ ố 2.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trường của B subtilis SHV27 33

2.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của B subtilis SHV27 33

2.3.2 Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của B subtilis SHV27 33

2.3.3 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng khác nhau đến sinh trưởng của B subtilis SHV27 33

2.3.4 Ảnh hưởng của lưu lượng khí vào đến sinh trưởng của B subtilis SHV2734 2.3 Khảo sát sinh trưởng của B licheniformis SHV43 và B pumilus SHV52 34

2.4 Tạo chế phẩm 34

2.4.1 Thu sinh khối 34

2.4.2 Chọn chất mang và tạo chế phẩm 34

2.4.3 Khảo sát độ ổn định của chế phẩm 35

2.5 Đánh giá hiệu quả sản phẩm 36

2.5.1 Ảnh hưởng của các nồng độ chế phẩm khác nhau đến nồng độ NO2-, NH4+ và tăng trọng của cá 36

2.5.2 Ảnh hưởng của các nồng độ chế phẩm khác nhau đến khả năng ức chế Streptococcus agalactiae HV-Strep O2 36

2.6 Phương pháp phân tích 37

2.6.1 Đánh giá cảm quan 37

2.6.2 Phương pháp xử lý số liệu 37

Chương 3 NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Phân lập chủng giống 38

3.2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh học mạnh 41

3.2.1 Tuy n ch n kh ể ọ ả năng sinh enzyme ngoại bào 45

3.2.2 Tuy n ch n kh ể ọ ả năng sinh chất kháng khuẩn kháng S.agalactiae 46

3.2.3 Tuy n ch n kh ể ọ ả năng khử chất độc h i NOạ 2-, NH4+ 46

3.3 Định danh 46

3.3.1 Định danh bằng các phả ứng sinh hóan 46

3.3.2 Phân loại các chủng Bacillus đã tuyển ch n b ng giọ ằ ải trình tự gen 50

3.3.3 Tính đối kháng của chủng giống 52

3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của vi sinh vật 53

3.4.2 Ảnh hưởng của pH đầu vào môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng của vi sinh vật 54

3.4.3 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng của vi sinh vật 55

3.4.4 Ảnh hưởng của lưu lượng khí vào đến sinh trưởng của vi sinh vật 56

3.5 Khảo sát lên men chủng B paralicheniformis SHV43 và B.pumilus SHV5257 3.6 Tạo chế phẩm 58

3.6.1 Thu sinh khối 58

3.6.2 Lựa chọn chất mang 58

3.6.3 Khảo sát độ ổn định của chế phẩm 60

3.7 Đánh giá hiệu quả sản phẩm 61

3.7.1 Ảnh hưởng của các nồng độ chế phẩm đến nồng độ NO2-, NH4+ và tăng trọng của cá 61

3.7.2 Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm khác nhau đến khả năng ức chế S.agalactiae gây bệnh xuất huyết trên cá rô phi 63

KẾT LUẬN 65

KIẾN NGHỊ 67

PHỤ LỤC 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

B ng 1.1 M t s s n phả ộ ố ả ẩm Probiotic dùng trong thủy sản trên thị trường Việt

Nam 24

Bảng 2.1 Các thiết bị dùng trong quá trình thí nghiệm 25

Bảng 3.1 Phân lập ch ng giủ ống 38

B ng 3.2 Khả ảo sát hoạt tính sinh học c a ch ng giủ ủ ống 41

Bảng 3.4 Định danh bằng kít API 50CH các chủng Bacillus đã chọn 48

B ng 3.5 Mả ối tương quan di truyền của các dòng vi khuẩn tuy n chể ọn có trong ngân hàng gen (NCBI) 50

B ng 3.6 ả Ảnh hưởng c a nhiủ ệt độ nuôi cấy ch ng B.subtilis SHV27 ủ 53

B ng 3.7 ả Ảnh hưởng pH môi trường đầu vào chủng B.subtilis SHV27 54

B ng 3.8 ả Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy ch ng B subtilis SHV27 ủ 55

B ng 3.9 ả Ảnh hưởng lưu lượng khí vào khi lên men chủng B.subtilis SHV27 56

B ng 3.10 Khả ảo sát lên men chủng B paralicheniformis SHV43 và B.pumilus SHV52 57

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của các nồng độ nguyên liệu khác nhau đến khả năng ức chế S.agalactiae 58

Bảng 3.12 Thành phần công thức chế phẩm 60

B ng 3.13 K t qu ả ế ả khảo sát độ ổn định c a ch ph m ủ ế ẩ 60

B ng 3.14 ả Ảnh hưởng của các nồng độ chế phẩm khác nhau đến nồng độ NO2 -trong nước 61

B ng 3 15 ả Ảnh hưởng của các nồng độ chế phẩm khác nhau đến s nự ồng độ NH4+ trong nướ 62 c B ng 3.16 ả Ảnh hưởng của các nồng độ ch phế ẩm khác nhau đến sinh trưởng c a ủ cá 63

B ng 3.17 ả Ảnh hưởng của các nồng độ chế phẩm khác nhau đến kh ả năng ức ch ế S.agalactiae 63

Bảng 3.18 Hóa nghiệm thành phần dinh dưỡng môi trường MT1 71

Hình 1.1 Sản lượng cá rô phi của các nước trên thế giới năm 2017 3

Hình 1.2 Sản lượng cá rô phi đông lạnh của Trung Quốc trên thị trường Mỹ 4

Hình 1.3 Sản lượng cá rô phi trên toàn thế giới 5

Hình 1.4 Sản lượng cá rô phi dự kiến đến 2029 6

Hình 1.5 Khu hồ nuôi cá rô phi bằng công nghệ lồng Nauy của Marvin group tại Hòa Bình 8

Hình 1.6 Sản lượng thủy sản xuất khẩu trong 10 tháng đầu năm 2019 8

Hình 1.7 Sơ đồ vòng tuần hoàn của Nitơ 10

Hình 1.8 Dung huyế β của khuẩn lạc Streptococcus agalactiae, blood agar 18h ở t 36°C 15

Hình 1.9 Dấu hi u bệ ệnh lý của cá nhiễm b nh xu t huy t do S.aglactiae 15 ệ ấ ế Hinh 1.10 Tr c khu n Bacillus ự ẩ 19

Hình 2.1 Hệ thống lên men 5 lít 26

Hình 2.2 Hệ thống bể nuôi cá thí nghiệm 26

Hình 2.3 Sơ đồ ố trí thí nghiệ b m tổng quát 27

Hình 3.1 Hình thái của các chủng đã chọn ( ở độ phóng đại 1000 lần đối v i t ớ ế bào và bào tử) 47

Hình 3.2 Cây phân loạ ủa các chủi c ng SHV27 51

Hình 3.3 Cây phân loạ ủa các chủi c ng SHV43 51

Hình 3.4 Cây phân loạ ủa các chủi c ng SHV52 52

Hình 3.5 Tính đối kháng của chủng giống 52

Hình 3.6 Quy trình tổng quát tạo chế phẩm 59

Hình 3.7 Khuẩn lạc Streptococcus agalactiae trên môi trường BA bổ sung kháng sinh 64

Hình 3.8 Trình tự nucleotid chủng B subtilis SHV27 68

Hình 3.9 Trình tự nucleotid chủng B licheniformis SHV43 69

Hình 3.10 Trình tự nucleotid chủng B pumilus SHV52 70

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

TAE Tris-acetate Ethylenediaminetetraacetic acid

CTAB Cetyltrimethylammonium Bromide

SDS Sodium dodecyl sulfate

p thi t cNhững năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam đã không ngừng phát triển và ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong ngành Thủy sản nói riêng và kinh tế nước ta nói chung Theo trung tâm giống huyến nông uốc gia, K Qnăm 2015, diện tích nuôi cá rô phi cả nước là 21.000 ha; sản lượng đạt 150 nghìn tấn; xuất khẩu đi hơn 60 nước; kim ngạch xuất khẩu trên 36 triệu đô Năm 2017, Xuất khẩu sang 68 nước chủ yếu là EU và Mỹ, tăng 32% so năm 2016 và sẽ tăng mạnh trong thời gian tới Với mục tiêu sản lượng cá rô phi đạt 400.0000 tấn năm

2030, ngoài việc tăng diện tích nuôi trồng thì việc áp dụng các khoa học kĩ thuật, các giải pháp quản lý dịch bệnh trên đối tượng vật nuôi là yếu tố quan trọng [1]

Khi ngành nuôi trồng thủy sản theo hướng công nghiệp phát triển, mật độ nuôi ngày càng cao, sử dụng đến thức ăn công nghiệp thì phát sinh tình trạng ô nhiễm nguồn nước ở các ao nuôi, việc cải tạo đảm bảo nguồn nước trong sạch ngày càng trở nên phức tạp và đau đầu cho các nhà quản lý và chăn nuôi Nguồn nước bị ô nhiễm dẫn tới các bệnh dịch xảy ra nhiều hơn, trầm trọng hơn Để giảm bớt thiệt hại, người chăn nuôi phải sử dụng đến các hóa chất và thuốc kháng sinh Tình trạng lạm dụng hóa chất và thuốc kháng sinh trong chăn nuôi thủy sản, dẫn tới hiện tượng các chủng vi khuẩn gây bệnh ngày càng đề kháng thuốc, hàm lượng hóa chất và chất kháng sinh tồn dư trong thương phẩm ảnh hưởng lớn tới vấn đề xuất khẩu tôm, cá ra nước ngoài khi mà các nước đặc biệt là các thị trường xuất khẩu thủy hải sản lớn của Việt Nam như Nhật Bản, Mỹ và EU ngày càng tăng cường việc kiểm tra kiểm soát mặt hàng thủy sản xuất khẩu từ Việt Nam

Ở Việt Nam mỗi năm nuôi khoảng 695.000.000 cá rô phi và xu hướng ngày càng mở rộng về diện tích nuôi và tập trung vào nuôi công nghiệp Đối với chăn nuôi cá rô phi thương phẩm, ngoài việc ô nhiễm nguồn nước ao nuôi, bệnh xuất huyết do vi khuẩn Streptococcocus sp trên cá rô phi bùng phát mạnh từ năm

2009 đến nay tại các tỉnh nuôi cá rô phi trong cả nước Diễn biến dịch bệnh ngày càng phức tạp, việc trị bệnh ngày càng khó khăn, hiện nay tại Việt am đã có Nvắc xin phòng bệnh xuất huyết trên cá rô phi tuy nhiên chưa được ứng dụng nhiều Các biện pháp phòng và trị bệnh hiện nay chủ yếu dựa vào các loại kháng sinh, trong khi đó hiệu quả phòng trị bằng kháng sinh không cao, giá thành chi

phí lại đắt Việc sử dụng kháng sinh một cách tràn lan và không có kiểm soát cũng mang lại nhiều nguy cơ cho ngành chăn nuôi như việc các chủng gây bệnh

đề kháng lại kháng sinh, hàm lượng kháng sinh tồn dư trong thịt cá ảnh hưởng u tới việc xuất khẩu, v.v

Để khắc phục tình trạng này việc cần thiết chuyển sang sử dụng biện pháp sinh học đang là một xu hướng chăn nuôi bền vững Chế phẩm sinh học chứa các

vi sinh vật hữu ích có tác dụng xử lý chất thải gây ô nhiễm trong quá trình nuôi, giúp cân bằng hệ vi sinh vật có lợi trong ao nuôi, hạn chế các vi sinh vật gây bệnh

Vì vậy việc đề xuất đề tài “Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh dùng trong môi trường ao nuôi giúp xử lý ô nhiễm, phòng bệnh xuất huyết trên cá rô phi do Streptococcus agalactiae” là một yêu cầu cấp thiết

Phân lập và tuyển chọn được các chủng giống sinh enzyme amylase, protease, cellulase, xylanase tốt, khả năng khử các khi độc NO2-, NH4+ để xử lý ô nhiễm môi trường ao nuôi đồng thời có khả năng sinh chất kháng khuẩn, ức chế

vi khuẩn Streptococcus agalactiae

Từ đó lên men thu sinh khối, tạo chế phẩm vi sinh xử lý môi trường ao nuôi và phòng bệnh xuất huyết trên cá rô phi do Streptococcus agalactiae gây ra

Đối tượng: Các chủng vi khuẩn Bacillus như Bacillus subtilis; Bacilus licheniformis; Baccillus pumilus

Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm tại phòng nghiên cứu và sản xuất chế phẩm Probiotic – công ty TNHH Dược Hanvet

Phân lập và tuyển chọn chủng giống

Lên men thu sinh khối và tạo chế phẩm

Đánh giá hiệu quả của chế phẩm trong việc xử lý môi trường, hỗ trợ phòng bệnh xuất huyết trên cá rô phi do Streptococcus agalactiae

1.1

1.1.1 Thực trạng chăn nuôi cá rô phi trên thế giới

Cá rô phi có nguồn gốc từ châu Phi Trên thế giới có khoảng 80 loài, thuộc 3 nhó gồm 3 giống là: m Tilapia, Sarotherodon và Oreochromis [2], thuộc

họ Cichlidae, bộ phụ Percoidae thuộc bộ cá vược Perciformes [3]

Hiện nay, cá rô phi được nuôi ở trên 140 nước trên thế giới với tổng sản lượng đạt 6.517.700 tấn/năm (2017) Tuy nhiên, sản lượng tập trung chủ yếu ở 1

số nước trong đó Trung Quốc, Ai Cập, Indonesia, Thái Lan, Đài Loan, Philippin đang là những nước có sản lượng nhiều nhất trên thế giới

Trung Quốc chỉ mới phát triển nuôi loài cá này từ những năm 80 của thế

kỉ trước Tuy nhiên, chỉ sau hơn một thập kỉ, với sản lượng nuôi năm 2017 đạt 1,8 triệu tấn/năm chiếm 27,65% tổng sản lượng cá rô phi trên toàn thế giới Trung Quốc đã trở thành quốc gia nuôi cá rô phi nhiều nhất thế giới

Indonesia là quốc gia đứng thứ 2 với tổng sản lượng đạt 1,2 triệu tấn/năm Tiếp theo Indonesia, Ai Cập là quốc gia có sản lượng lớn thứ 3 thế giới với 1 triệu tấn/năm Ngoài ra Philippines, Thái Lan, Bangladesh, Brazil, Việt Nam, Myanmar, Mexico, Ecuador, Costa Rica, Honduras, Uganda, Ghana, Kenya và Nigeria là những nước góp phần nâng cao sản lượng cá rô phi trên toàn thế giới Trong đó, Việt Nam là nước đứng thứ 6 nuôi nhiều cá rô phi trên thế giới với tổng sản lượng trên 300.000 tấn/năm [4] [5]

Hình 1.1 Sản lượng cá rô phi của các nước trên thế giới năm 2017 [5]

Trên thế giới, cá rô phi được công nhận là nguồn cung cấp protein dinh dưỡng và rẻ tiền, đóng vai trò quan trọng trong việc giảm thiểu tình trạng thiếu dinh dưỡng giữa các khu vực nghèo Nó cũng là một món yêu thích của nhiều gia đình và là một trong năm loài cá hàng đầu được sử dụng ở Hoa Kỳ Trung Quốc

là nước đứng đầu về sản xuất cá rô phi, đồng thời cũng là nước tiêu thụ và xuất khẩu loài cá này nhiều nhất trên thế giới

Hình 1.2 Sản lượng cá rô phi đông lạnh của Trung Quốc trên thị trường Mỹ [5] Tại Mỹ, tổng sản lượng nhập khẩu là 215.585 tấn tương ứng với 962 triệu

đô (2015) Trung Quốc cung cấp 75% sản lượng, 25% còn lại được cung cấp bởi các nước như Indonesia, Hondruas, Đài Loan – Trung Quốc, Comlombia, Ecuador…Trong đó, Việt nam cũng tham gia xuất khẩu 2% sản lượng mặt hàng này vào Mỹ

Tại Châu Phi, ản lượng cá rô phi nuôi trồng chủ yếu là ở Ai Cập chiếm s80% tổng sản lượng toàn châu lục với xu hướng liên tục tăng Năm 2017, tổng sản lượng đạt 940.000 tấn, tương ứng 12 triệu đô Tuy nhiên do nhu cầu sử dụng mặt hàng này lớn mà Trung Quốc vẫn là nước cung cấp đến 98% sản lượng cá rô phi đông lạnh cho thị trường này Thái Lan cũng tham gia xuất khẩu cung cấp 1% sản lượng rô phi tại Châu Mỹ

Châu Âu là châu lục ít nhập khẩu mặt hàng này nhất do các hàng rào về giá cả và chất lượng [5]

Hình 1.3 Sản lượng cá rô phi trên toàn thế giới [6]

Mặc dù trên thế giới, giá cá có biến động và có xu hướng giảm từ khoảng

7 USD/kg (2007) xuống còn khoảng 4,5 USD/kg (năm 2018), tuy nhiên do sản lượng liên tục tăng nên giá trị mà nó đem lại từ 1990 đến 2018 vẫn liên tục tăng Tổng giá trị đem lại năm 2018 là trên 12 tỷ đô và dự kiến 2028 sẽ là trên 25 tỷ

đô Do đó ngành công nghiệp chăn nuôi cá rô phi vẫn đóng vai trò không nhỏ

trong nghành nuôi trồng thủy sản [6]

Để nâng cao năng suất, việc ứng dụng các công nghệ nuôi cá rô phi ngày càng phát triển và đa dạng Từ nuôi thâm canh, bán thâm canh đến nuôi lồng bè trên sông hồ hay mô hình sông trong ao Hệ thống nuôi thâm canh trong ao được

áp dụng rộng rãi ở các nước như Đài Loan, ung Quốc và Thái Lan Hệ thống Trnuôi này cho năng suất từ 10 50 tấn/ha/năm Trong khi nuôi mô hình lồng bè lại -khá phổ biến ở Indonesia, Philippin, Malaysia, năng suất trong lồng nuôi đạt khoảng 40-60kg/m3, tùy thuộc vào kích thước lồng và mật độ nuôi [7]

Hình 1.4 Sản lượng cá rô phi dự kiến đến 2029 [5]

Dự kiến sản lượng cá rô phi trên toàn thế giới vẫn tiếp tục gia tăng Ước tính đến năm 2028, sản lượng cá rô phi trên toàn thế giới sẽ đạt 9.000.000 tấn, tăng khoảng 28,5% so với năm 2019 Ngành công nghiệp cá rô phi ngày càng khẳng định vai trò to lớn trong ngành nuôi trồng thủy sản trên thế giới [5]

1.1.2 Thực trạng chăn nuôi cá rô phi tại Việt Nam

Năm 1973, loài cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus) được du nhập vào Việt Nam từ Đài Loan và nuôi tập trung chủ yếu ở miền Nam Sau năm 1975, loài cá này được chuyển ra ngoài Bắc và được các tỉnh phí Bắc rất ưa chuộng do a

cá lớn nhanh, kích thước lớn, đẻ thưa và ít đẻ Tuy nhiên, do trình độ quản lý, kĩ thuật con giống còn hạn chế làm lai tạp rô phi đen và rô phi vằn, làm đặc tính di truyền của giống cá rô phi vằn này bị thoái hóa và giảm sản lượng đáng kể Để khôi phục tình trạng này, trong những năm 1994 1997, Viện Nghiên cứu nuôi -trồng Thủy sản 1 (NCNTTS 1) đã nhập và thuần hóa 3 dòng cá rô phi O.niloticus

từ Philippin và Thái Lan Trong đó GIFT là dòng có sức sinh trưởng tốt nhất, nó được nuôi ở khắp nơi trên cả nước đặc biệt là các tỉnh vùng đồng bằng sông Hồng [8]

Từ những năm 90 trở lại đây, nghề nuôi cá rô phi ở Việt Nam đã phát triển mạnh mẽ Cá rô phi là loài cá dễ nuôi, ít dịch bệnh, thức ăn không đòi hỏi chất

Nam đặc biệt chú trọng phát triển nuôi loài cá này Thêm vào đó, thịt loài cá này

có chất lượng thơm ngon, ít xương dăm nên được người tiêu dùng ưa chuộng Các nỗ lực nhằm phát triển nghề nuôi cá rô phi ở nước ta trong thời gian qua đã đạt được nhiều thành tựu khả quan như nghiên cứu cải thiện di truyền, quy trình sản xuất giống và nuôi thương phẩm

Diện tích nuôi cá rô phi của cả nước ta là 22.340 ha chiếm 3% tổng diện tích nuôi trồng thủy sản, trong đó nuôi nước lợ, mặn là 2.068 ha, nuôi nước ngọt

là 20.272 ha Tổng sản lượng cá rô phi ước tính đạt 54.486,8 tấn chiếm 9,08% tổng sản lượng cá nuôi Đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long là hai vùng nuôi cá rô phi chủ yếu ở Việt Nam, lần lượt chiếm 17,6% và 58,4% tổng sản lượng cá rô phi của cả nước Ở Việt Nam, cá rô phi được nuôi dưới nhiều hình thức khác nhau, trong năm 2005, sản lượng cá rô phi nuôi ở ao và đầm đã đạt 37.931,8 tấn, nuôi trong lồng bè đạt 10.182 tấn Tổng cục thủy sản đã đưa ra mục tiêu nuôi cá rô phi đến năm 2015 đạt sản lượng 200.000 tấn/năm, trong đó sẽ giành 40% cho xuất khẩu, phần còn lại để tiêu thụ nội địa [6]

Năm 2018, sản xuất trên 1,2 tỉ cá rô phi bột, trên 500 triệu con giống, đáp ứng khoảng 75% nhu cầu nuôi trồng Diện tích nuôi cá rô phi thương phẩm đạt khoảng 30.000 ha và trên 1,2 triệu m3 lồng nuôi, phát triển mạnh tại các tỉnh phía Bắc như: Hải Dương, Bắc Giang, Bắc Ninh, Phú Thọ, Hòa Bình, Hà Nội và một

số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long

Tại diễn đàn Tổng cục Thủy sản định hướng phát triển cá rô phi ở Việt Nam thành ngành hàng sản phẩm chủ lực sản xuất gắn với thị trường tiêu thụ,

có sức cạnh tranh cao Hình thành các vùng nguyên liệu lớn ở các hồ chứa, vùng nuôi tập trung (nuôi lồng ở sông và hồ chứa, thâm canh ở đồng bằng) gắn với chế biến, tiêu thụ sản phẩm phát triển chuỗi giá trị hiệu quả, bền vững ngành hàng đến năm 2030, vùng nuôi đạt 40.000 ha, 1,8 triệu m3 lồng, sản lượng đạt 400.000 tấn [9]

Hình 1.5 Khu hồ nuôi cá rô phi bằng công nghệ lồng Nauy của Marvin group tại

Hòa Bình [10]

Kế hoạch sản xuất đến năm 2020, đạt chỉ tiêu nuôi thâm canh 20.000 ha, năng suất 20 25 tấn/ha, sản lượng 400.000 500.000 tấn; nuôi bán thâm canh - - 10.000 ha, năng suất 10 15 tấn, sản lượng khoảng 100.000 150.000 tấn Đặc - - biệt, giá trị xuất khẩu cá rô phi ước đạt 150 triệu USD, tạo việc làm cho 2 vạn lao động trên cả nước [9]

n

Hình 1.6 Sản lượng thủy sản xuất khẩu trong 10 tháng đầu năm 2019 [6]

Năm 2019, với sản lượng 150.000 tấn, cá rô phi đang là mặt hàng xuất khẩu đứng thứ 4 trong ngành thủy sản của cả nước sau tôm, cá tra và nhuyễn thể Với đặc điểm dễ nuôi, cho năng suất cao, giàu dinh dưỡng, tiềm năng phát triển mặt hàng này còn rất lớn khi liên tục được các cấp ngành đại phương, tổng cục thủy sản quan tâm và chú trọng đầu tư phát triển

Khi phân giải các hợp chất hữu cơ từ dạng ammonia, ammonium thành

nitrit, nitrate do các vi khuẩn hiếu khí, cần cung cấp oxi từ môi trường gọi là quá trình nitrate hóa Trong điều kiện kị khí, quá trình N2 được sản xuất từ nitrite gọi

là sự khử nitơ

Sự cân bằng giữa NH3 và NH4+phụ thuộc vào nhiệt độ và pH

NH3 + H2O = NH4+ + OH

-NH3 rất độc đối với cá Có rất nhiều nghiêm cứu về sự ảnh hưởng của

NH3 đến động vật thủy sản Nồng độ NH3đến LD50 trong vòng 96 giờ đối với

một số loài cá nước ngọt khác nhau là khác nhau á heo Mỹ (c Channel catfish): 1,5 – 3,1mg/lít; á hương nhiều màu nước ngọt (Guppy fryc ): 1,2mg/lít; cá vược miệng rộng (Largemouth bass): 0,72-1,20 mg/lít; cá vược sọc (Striped bass): 1,10 mg/lít; cá hồi cầu vồng (Rainbow trount): 0,32 mg/lít; cá gai nước ngọt (Stickleback): 0,72 – 0,84 mg/lít; cá hồi dữ (Cutthroat trount): 0,43 –

0,66 mg/lít [11]

Tính độc của NH4+ thấp hơn NH3 khoảng 300 – 400 lần, nồng độ NH3

trong amoni tổng số phụ thuộc vào nhiệt độ và chỉ số pH của nước

1.2.2 Nitrite (NO2-)

Hình 1.7 Sơ đồ vòng tuần hoàn của Nitơ [12]

Dưới tác dụng của vi khuẩn nitrite hóa, NH3 chuyển thành NO2- và NO3

-là quá trình nitrate hóa, quá trình này xảy ra nhờ các vi khuẩn tự dưỡng hiếu khí Nitrosomonas, Nitrobacteria

Cá hấp thu NO2- trong nước qua đường hô hấp xảy ra phản ứng:

Hb + NO2- = Met – Hb

Trong phản ứng trên Fe2+ trong thành phần hồng cầu bị oxi hóa thành Fe3+làm mất khả năng vận chuyển oxy Máu của động vật thủy sản chứa Met – Hb với lượng lớn sẽ chuyển thành màu nâu, nhiễm độc NO2- còn gọi là bệnh máu nâu Mức độ độc của NO2- đối với động vật thủy sản tùy thuộc vào độ mặn, pH, kích cỡ vật nuôi, dinh dưỡng, dịch bệnh và hàm lượng oxy hòa tan

1.3

1.3.1. Tình hình dịch bệnh trên cá rô phi

Cá rô phi đã được phát triển nuôi ở nhiều quốc gia với các hình thức nuôi khác nhau, trong đó khá phổ biến loại hình nuôi cá rô phi thâm canh với mật độ

tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, nấm hoặc kí sinh trùng Đã có một số loài vi khuẩn được xác nhận đã từng gây bệnh cho cá rô phi nuôi như: Streptococcus agalactiae, S.inae, Flavobacterium columnare, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda và một số ký sinh trùng thường gây hại cho cá rô phi ở giai đoạn cá con: trùng quả dưa Ichthyophitirius multifillis, trùng bánh xe Tricodhina spp và sán lá đơn chủ 18 móc Gyrodactylus niloticus [13].

Người ta đã phát hiện ra mười loài vi khuẩn gây bệnh trên cá rô phi gồm: Arthrobacter sp; Enterococcus sp; Staphylococcus sp; Micrococcus sp; Streptococcus sp; Aeromonas sp; Pseudomonas sp; Edwardsiella sp; Flexibacter

sp và Flavibacterium sp Trong đó, nhiễm khuẩn Streptococcus agalactiae đang

là mối đe dọa lớn cho nghề chăn nuôi cá rô phi vì tỷ lệ nhiễm bệnh và tử vong sau khi nhiễm bệnh là rất cao [14]

Liên cầu khuẩn gram (+) Streptococcus spp đã được xác nhận là tác nhân gây cảm nhiễm hệ thống và gây viêm não ở cá rô phi và cá hồi nuôi tại Isr l vào aenăm 1986, sau đó bệnh này nhanh chóng lan rộng ra các quốc gia khác và gây ra tổn thất lớn về kinh tế cho nghề nuôi cá rô phi ở các quốc gia này [15]

Các nghiên cứu đầu tiên về bệnh viêm não ở cá rô phi đã xác định tác nhân gây ra bệnh này là loài cầu khuẩn Streptococcus shiloi và Streptococcus difficile, sau đó 2 loài vi khuẩn này được đổi tên thành iniae và S S.agalactiae Trong thực tế, có nhiều tác nhân có thể gây chết cá rô phi nuôi, trong đó liên cầu khuẩn Streptococcus spp là tác nhân gây bệnh thường gặp, đặc biệt hay xuất hiện trong các trang trại nuôi cá rô phi thâm canh với mật độ cao, quản lý kém Khi cá

rô phi bị cảm nhiễm cầu khuẩn Streptococcus spp, thường bộc lộ các dấu hiệu chính như: cá bệnh có dấu hiệu vận động không định hướng, mất thăng bằng, bơi vòng, bơi xoắn, mắt bị lồi rất to và giác mạc bị đục, đôi khi kèm xuất huyết Khi giải phẫu bên trong nhận thấy xoang cơ thể của cá bệnh chứa nhiều dịch, gan, lá lách và thận bị sưng to Năm 2000, tại một số hồ chứa của Malaysia đã ghi nhận được hiện tượng cá rô phi nuôi lồng bị chết, kết quả thu mẫu đã phân lập được vi khuẩn từ các nội quan như mắt, não, thận của cá bệnh Trong đó, vi khuẩn Streptococcus agalactiae chiếm 70 % tổng số các chủng vi khuẩn phân lập được

từ những mẫu cá bệnh [16]

Bệnh dịch Streptococcosis ở cá rô phi nuôi tại Thái Lan đã được quan sát thấy trong lồng nuôi trên sông Mekong tại thành phố Mukudahan, phía đông Bắc

Thái Lan vào tháng 5 năm 2001 Tỷ lệ cá chết do dịch bệnh vào khoảng 40 –60% sau hai tuần xuất hiện bệnh lý Dấu hiệu điển hình của cá bị bệnh là chướng bụng, trong xoang bụng chứa dịch và hậu môn bị sưng [17]

Trong năm 2002 và 2003, tại thành phố Lubuk Linggan, miền Nam Sumatra, Indonesia cá rô phi nuôi lồng cũng đã xuất hiện hiện tượng cá bị chết với dấu hiệu bệnh lý hai mắt đục, lồi và đổi màu Vi khuẩn phân lập từ não và các cơ quan khác của cá rô phi bị bệnh từ Thái Lan và Indonesia đã được xác định là S.agalactiae và S.iniae [16] Trong những năm qua, đã có nhiều đợt dịch bệnh do nhiễm vi khuẩn Streptococcus agalactiae đã được ghi nhận ở các trang trại nuôi cá rô phi ở khu vực châu Á[18] [19]

Từ tháng 7 đến tháng 12 năm 2009 bệnh xuất huyết trên cá rô phi đã bùng phát tại bốn tỉnh Guangdong, Guangxi, Hainan và Fujian, nơi nuôi cá rô phi chủ yếu, chiếm tới 90% sản lượng nuôi đối tượng này tại Trung Quốc, gây ra thiệt hại nặng nề cho người nông dân nuôi đối tượng này tại địa phương [20 ]

Trong khi đó, Wongtavatchai và Maisak (2008) đã thông báo rằng, tại Thái Lan, khi cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus) bị bệnh xuất huyết, các chủng vi khuẩn phân lập và định danh được chủ yếu là loài Streptococcus agalactiae (112 chủng), tuy nhiên thỉnh thoảng cũng có gặp loài Streptococcus iniae phân lập từ cá rô phi vằn (8 chủng) [20]

Nghiên cứu về dịch tễ học của bệnh xuất huyết trong 8 năm ở cá rô phi đã thể hiện rằng, tần suất gặp loài Streptococcus agalactiae cảm nhiễm ở cá bị bệnh chiếm 82%, trong khi đó loài Streptococcus iniae chỉ có 18%, trong tổng số 500 chủng phân lập từ 13 nước thuộc châu Á và châu Mỹ La Tinh (Sheehan và ctv, 2009) Trên cá rô phi đỏ (Oreochromis sp), các kết quả đã nghiên cứu đều kết luậnrằng, tác nhân chính gây bệnh Streptococcosis ở loài cá này là Streptococcus agalactiae [21] [22] [23]

Nghiên cứu về sự phân bố của tác nhân gây bệnh treptococcosis trên cá S

rô phi đã chứng tỏ rằng, vi khuẩn Streptococcus iniae và Streptococcus agalactiae có thể tồn tại ngoài môi trường quanh năm Vi khuẩn này có thể phân lập được từ đất, từ các chất hữu cơ lắng tụ hoặc từ chất nhầy của những con cá bệnh Ngoài ra, vi khuẩn Streptococcus spp có thể được thải ra môi trường từ

những con cá bị bệnh hoặc đã khỏi bệnh Do vi khuẩn này thích hợp với điều kiện nhiệt độ cao nên mùa đông ít khi phân lập được các loài vi khuẩn này [24]

Cá rô phi nuôi có thể bị cảm nhiễm nhiều loại tác nhân khác nhau, nhưng mỗi loại tác nhân lại thường bùng phát ở các giai đoạn phát triển khác nhau trong chu kỳ sản xuất giống và nuôi thương phẩm của cá rô phi Trong đó bệnh Streptococcosis thường xuất hiện khi cá nuôi đạt khối lượng ≥ 100g đến 1kg, do vậy với tỷ lệ chết tích lũy của bệnh này có thể gây ra tới 70%, tác hại của bệnh

này lên cá nuôi là rất lớn [25]

1.3.2 Tình hình dịch bệnh xuất huyết trên cá rô phi do Streptococcus

agalactiae gây ra tại Việt Nam

Cá rô phi là loài có sức đề kháng cao hơn so với các loài cá khác, tuy nhiên với mô hình nuôi thâm canh, mật độ cao, đầu tư thức ăn lớn, nên cũng dễ làm phát sinh dịch bệnh

Xuất huyết là một bệnh thường gặp trong hệ thống nuôi cá thâm canh và gây thiệt hại lớn về kinh tế cho người nuôi Trong những năm gần đây, nuôi cá rô phi nuôi thâm canh ở Hải Phòng thường xuất hiện bệnh xuất huy do vi khuẩn ết Streptococcus agalactiae gây ra Qua nghiên cứu cho thấy, ở Hải Phòng bệnh xuất huyết trên cá rô phi nuôi thường bùng phát vào mùa hè hoặc hè thu khi nhiệt

độ nước ≥ 300C Năm 2009 2010, đã xảy ra dịch bệnh gây chết hàng loạt cá rô phi nuôi thương phẩm (tới 90 100% trong ao), tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam -như Hà Nội, Hải Phòng, Hải Dương, Bắc Ninh, Quảng Ninh và Hà Giang Đây được coi là đợt dịch lớn nhất kể từ trước đến nay đối với nghề nuôi cá rô phi ở nước ta và những nghiên cứu bước đầu đã xác định rằng, đây là bệnh xuất huyết

-do liên cầu khuẩn Gram (+), Streptococcus spp gây ra[26]

Đồng Thanh Hà và cộng sự, năm 2010, đã công bố những nghiên cứu sâu hơn về bệnh này ở cá rô phi nuôi ở Việt Nam như những quan sát ở mức siêu hiển

vi đối với vi khuẩn Streptococcus spp và dựa trên các đặc điểm sinh vật, hóa học

để xác định rằng liên cầu khuẩn gây bệnh ở cá rô phi chính là loài S agalactiae Ngoài ra, một số đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn này cũng đã được công bố: loài S.agalactiae phân lập từ cá rô phi nuôi ở Việt Nam có khả năng phát triển ở độ mặn 30 – 35‰, ở nhiệt độ 370C và ở pH = 12 có thể ức chế và tiêu diệt vi khuẩn này Những nghiên cứu này đã cảnh báo khả năng vi khuẩn này có thể lây lan và gây tác hại cho các loài cá nuôi nước mặn và cả con người [27]

Dấu hiệu của bệnh xuất huyết ở cá rô phi nuôi ở phía Bắc Việt Nam cũng đãđược một số tác giả mô tả khá rõ ràng: dấu hiệu đầu tiên là cá yếu bơi lờ đờ, kém ăn hoặc bỏ ăn, hậu môn, gốc vây chuyển màu đỏ, mắt, mang, cơ quan nội tạng và cơ xuất huyết, thận, gan, lá lách mềm nhũn Đặc biệt, cá bệnh thường bơi vòng hoặc bơi xoắn, không định hướng, mắt đục với tròng mắt lồi ra ngoài [26] [27]

Một số đặc điểm dịch tễ của cá rô phi cũng đã được đề cập đến trong các công bố gần đây: Bệnh xuất huyết ở cá rô phi thường xảy ra vào mùa hè, đặc biệt khi nhiệt độ nước cao, mùa đông và mùa xuân, mật độ vi khuẩn thường thấp và không đủ ngưỡng gây bệnh [26]

Tại hai tỉnh An Giang và Vĩnh Long, bệnh thường xuất hiện trong các ao nuôi thâm canh, chủng vi khuẩn Streptococcus spp có tần suất từ 95 – 100% vào mùa khô (tháng 1) và vào giai đoạn giao mùa (tháng 5, tháng 11) [26] Khi diện tích nuôi cá rô phi thâm canh được mở rộng, người nuôi cá rô phi đã phải đối mặt với nhiều loại dịch bệnh khác nhau, dịch bệnh có thể bùng phát gây chết cá hàng loạt, ảnh hưởng không nhỏ tới năng suất, sản lượng và hiệu quả kinh tế của nghề này Qua nghiên cứu, đã chỉ ra rằng các bệnh thường gặp ở cá rô phi nuôi thương phẩm ở Hải Phòng gồm: Các bệnh do vi khuẩn, nấm, hoặc ký sinh trùng, trong đó bệnh streptococcosis do liên cầu khuẩn gram (+) Streptococcus agalactiae, đã gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá rô phi và nghề nuôi cá nước ngọt ở địa phương [28]

Theo khóa phân loạ ủi c a Bergey, vi khuẩn Streptococcus agalactiae được phân loại như sau:

Loài: Sreptoccocus agalactiae

Là liên cầu khuẩn, gram dương, có dung huyế βt [29]

Hình 1.8 Dung huyế β của khuẩn lạct Streptococcus agalactiae, blood agar 18h

ở 36°C [29]

Các triệu chứng mắt lồi, xuất huyết, trướng bụng, cá bơi lờ đờ cũng được

mô tả ở nhiều loài cá bị nhiễm Streptococcus sp trong các nghiên cứu trước đó[30] [31] [32]

Cá bơi lờ đờ Bụng trướng to và xuất huy t ế

M t b lắ ị ồi, đục N i t ng xu t huy t ộ ạ ấ ếHình 1.9 Dấu hi u bệ ệnh lý của cá nhiễm b nh xu t huy t do S.aglactiae ệ ấ ế

1.3.3 Thực trạng việc sử dụng các phương pháp phòng và điều trị bệnh

xuất huyết trên cá rô phi do Streptoccus agalactiae gây ra

Ngày nay, trong chăn nuôi cá rô phi thương phẩm, ngoài việc kiểm soát chất lượng nước nuôi, thì việc đối phó với b nh xu t huy t do vi khu n ệ ấ ế ẩStreptococcus spp gây ra cũng vô cùng cấp bách Để kiểm soát dịch bệnh, phương pháp truyền thống thường dùng là hóa chất, kháng sinh, giảmchoăn

Tuy nhiên, các hóa chất diệt khuẩn như Chlorin ngoài việc làm tăng mật độ Vibrio sau khi sử dụng, các dẫn xuất của nó như Chloroform, Bromodichloromethane, Dibromodichloromethane và Bromoform còn là những chất gây đột biến gen và ung thư [33]

Giảm cho ăn: Trong thời gian dịch bệnh bùng phát ở giai đoạn cấp tính nên giảm một phần thức ăn hoặc giảm hoàn toàn thức ăn có thể giúp kiểm soát và giảm tỷ lệ tử vong Một trong những giả thuyết giải thích cho việc này là vi khuẩn có mặt trong nước và xâm nhập thuận lợi vào cơ thể theo đường thức ăn

Giảm mật độ nuôi: Khi tỷ lệ tử vong tăng thì việc giảm mật độ nuôi sẽ giúp giảm bớt đi sự căng thẳng và sự chuyển tải của mầm bệnh trong đàn cá Luôn giữ mức oxy hoà tan ở mức tối ưu bằng cách sử dụng quạt nước thường xuyên

Giảm nhiệt độ của nước: Khi nhiệt độ nước cao dễ tạo căng thẳng cho cá

và là điều kiện thuận lợi để vi khuẩn phát triển Vì vậy việc hạ thấp nhiệt độ , nước có thể được thực hiện trong hệ thống nuôi nước tuần hoàn nơi mà nhiệt độ nước được kiểm soát Đối với những ao nuôi có kích thước nhỏ có thể dùng lưới che nắng để giảm bớt nhiệt độ nước Sử dụng máy quạt nước vào ban đêm cũng

là cách làm giảm nhiệt độ nước và tăng lượng oxy

Điều trị bằng kháng sinh: Kháng sinh chỉ có thể điều trị bệnh ở giai đoạn sớm của bệnh (mới bị bệnh) Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp cho cá ăn kháng sinh không hiệu quả bởi cá bị nhiễm bệnh sẽ chán ăn, giảm ăn Hơn nữa những người nuôi cá cho biết thuốc kháng sinh chỉ có thể làm giảm tỷ lệ tử vong trong thời gian sử dụng và khi thuốc kháng sinh đã hết thì tỷ lệ chết lại tăng trở lại Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh cần được chú ý vì sử dụng kháng sinh liên tục với liều lượng cao dần sẽ gây ra hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn và ảnh hưởng đến dư lượng kháng sinh tồn dư trong thịt cá

Tiêm phòng vắc xin: Hiện nay đã có vắc xin phòng bệnh xuất huyết gây ra

do Streptococcus agalactiae gây ra nhưng việc áp dụng còn hạn chế đặc biệt là thói quen chăn nuôi dẫn đến việc ứng dụng biện pháp kĩ thuật này còn nhiều hạn chế

Ngoài giải pháp sử ụng kháng sinh với chi phí cao, thì việ d c s dử ụng các chủng vi khu n pẩ robiotic cho ao nuôi thủy sản đang là một xu hướng b n v ng ề ữ

nhằm giúp nâng cao chất lượng nước, cũng như hỗ trợ tăng cường h ệ miễn d ch ịphòng bệnh và tăng trưởng cho vật nuôi thủy s n ả

1.4 a ch ph m sinh h c v ng th y s n 1.4.1. Các nghiên cứu trên thế ớ gi i

H p ch t cợ ấ ủa nitơ là thành phần dinh dưỡng và là đố tượng gây ô nhiễm inghiêm trọng đến nguồn nước được thải ra thông qua các quá trình sản xuất trong lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp hi xả thải nước có chứa hàm lượn nitơ K g vượt mức cho phép vào nguồn tiếp nhận thường xảy ra các hiện tượn phú g dưỡng (eutrophication) Đó là nguyên nhân góp phần làm cho hệ sinh thái bị phá hủy, sự biến mất các vùng ngập nước, hệ sinh thái nước, chất lượng nước bị xấu

đi rất nhanh ảnh hưởng các thủy vực nuôi trồng thủy sản, Trong đó, xử lý sinh học là giai đoạn chính để loại các chất ô nhiễm hữu cơ và các chất dinh dưỡng chứa nitơ Hiện nay, các loài vi sinh vật đã được phân lập và tuyển chọn như vi khuẩn Pseudomonas stutzeri và Bacillus subtilis đã thể hiện tính ưu việt trong quá trình loại bỏ đạm

Các vi sinh vật probiotic là nhân tố ứ c ch ế tác nhân gây bệnh t ch t th i ừ ấ ả

c a vủ ật nuôi thủy sản ra môi trường sống, phân giải các chất hữu cơ dư thừa trong ao nuôi, khử mộ ốt s chất độc hại trong môi trường, điều ch nh mỉ ật độphytoplankton và giảm tác nhân gây bệnh có trong môi trường: Vibrio, Aeromonas…Hơn nữa, các sản ph m thẩ ức ăn bổ sung probiotic dùng cho tôm, cá

có khả năng kích thích hấp thu dinh dưỡng và kích thích sinh trưởng

Theo Mahdhi và cộng sự, năm 2012, đã chỉ ra Bacillus brevis có khả năng

ức ch Vibrio ế gây bệnh Burbank và cộng sự, năm 2011, đã chỉ ra Enterobacter amnigenus và Enterobacter sp có tác dụng ch ng lố ại Flavobacterium psychrophilum gây bệnh trên cá hồi khi b ổ sung vào thức ăn với hàm lượng 108

t ế bào/g thức ăn [34]

Rhodopseudomonas palustris G06 có tác dụng t t trong viố ệc kích thích tăng trọng và nâng cao hệ mi n d ch cễ ị ủa cá rô phi Bacillus subtilis nâng cao chỉtiêu sức khỏe và tốc độ sinh trưởng của cá chép Ấ Độn trong 2 tu n vầ ới hàm lượng 1,5x107 CFU/g [35] Nâng cao tốc độ tăng trưởng và chỉ tiêu miễn dịch ở

cá rô phi Bacillus subtilis ch ng AB1 khi b ủ ổ sung vào thứ ăn cho cá hồ ầc i c u vồng trong 14 ngày với li u 10ề 7 CFU/g giúp tăng tỷ ệ ống khi gây cả l s m nhiễm

với Aeromonas [36] Bacillus subtilis ổ sung vào thức ăn vớ b i li u 8x10ề 7 CFU/g trong 14 ngày cho cá nheo Ictalurus punctatus và cá tra Pangasianodon hypophthalmus giúp gia tăng tỷ ệ ống khi gây cả l s m nhi m v i Edwardsiella ễ ớictaluri gây bệnh gan th n mậ ủ Enterococcus faecium SF 68 giúp chống l i vi ạkhu n ẩ Edwardsiella tarda trên cá trình Châu Âu Lactobacillus acidophilus nâng cao tốc độ tăng trưởng, kích thích miễn dịch, tăng khả năng kháng bệnh doPseudomonas fluorescens và Streptococcus iniae khi gây cảm nhiễm trên cá rô phi [37] Bacillus subtilis có khả năng nâng cao tốc độ sinh trưởng, gia tăng hoạt

động của enzyme tiêu hóa, gia tăng sức đề kháng với Vibrio harveyi và gia tăng

bi u hi n cể ệ ủa gen có liên quan đến h ệ miễn d ch cị ủa tôm thẻ chân trắng khi b ổsung v i li u 10ớ ề 8 CFU/g thức ăn trong 8 tuầ [38] Bacillus subtilis BT23, n Bacillus subtilis S11 có khả năng kiểm soát vi khuẩn Vibrio harveyi gây bệnh phát sang trên tôm sú Bacillus megaterium b ổ sung vào thức ăn giúp nâng cao

hoạt động c a h ủ ệ vi sinh đường ruột, tăng khả năng miễn dịch và đề kháng với

b nh ệ ở tôm thẻ chân trắng c m nhiả ễm virus đốm tr ng ắ Bacillus pumilus giúp nâng cao tỷ ệ ố l s ng c a ủ ấu trung tôm he Nh t B n ậ ả [36]

B sung ổ Streptomyces vào thức ăn tôm sú trong 25 ngày với hàm lượng 10g t ế bào/kg giúp gia tăng tốc độ tăng trưởng của tôm và cải thi n chệ ất lượng nướ Ấu trùng tôm sú cho ăn thức ăn có bổc sung Streptomyces với hàm lượng 1% trọng lượng thức ăn trong 15 ngày giúp gia tăng tỷ ệ ống và tốc độ l s tăng trưởng khi gây cảm nhi m vễ ới V.harveyi

1.4.2. Các nghiên cứ ạu t i Vi t Nam ệ

Uddin và cộng s 2015 ự đã khảo sát tại đồng bằng sông Cửu Long, 91% h ộdân sử ụng probiotic cho nuôi trồ d ng th y sủ ản Trong đó, 84% sử ụ d ng tr c ti p ự ếprobiotic cho ao, đầm tôm để ả c i thi n chệ ất lượng nước và giảm ô nhiễm môi

Trên thị trường chế phẩm Biochie d ng dung dạ ịch từ vi khuẩn Bacillus và Lactobacillus với mật độ 108 CFU/ml có tác dụng c i thiả ện môi trường nuôi tôm, cá

Lê Tấn Hưng, Võ Thị ồ H ng Hạnh và cộng sự, năm 2003, đã nghiên cứu

s n ph m BIO II gả ẩ ồm các chủng Bacillus, Latobacillus ấm men và enzyme bổ, nsung vào thức ăn cho tôm, cá

1.5 Vi khu n Bacillus

1.5.1. Đặc điểm sinh h c c a ch ng Bacillus ọ ủ ủ

a Đặc điểm phân loại

Theo khóa phân loạ ủi c a Bergey, chi Bacillus là một chi lớn và đa dạng, được phân loại như sau:

Hinh 1.10 Tr c khu n Bacillus ự ẩ

Vi khu n ẩ Bacillus được Ehrenberg mô tả ần đầu tiên năm 1835 là “Virbrio lsubtilis” Năm 1872, Chon đặt tên lại là B.subtilis H ọBacillaceae được chia làm

5 chi gồm: Bacillus, SporolactoBacillus, Clostridium, Sporsarcina, Desulfortomaculum, đặc trưng của h ọ này là hình thành nội bào tử

Đặc điểm hình thái ế bào hình que, thẳ: t ng ho c g n thặ ầ ẳng, kích thước 2.2 x1.2-1.7µm Các tế bào thường xếp thành cặp hay chuỗi, đầu tròn hoặc hơi vuông Là vi khuẩn gram dương, hầu hết có ph n ng catalase dương tính ả ứChúng thường di động nh roi M t t ờ ộ ế bào chỉ có thể hình thành duy nhất m t ộ

0.3-nội bào tử ội bào tử có hình oval hoặc hình trụ Bào tử có khả năng chị, n u nhiệt

và axit, s ự hình thành nội bào tử không bị ngăn cản b i tiở ếp xúc không khí Các loài thuộc chi Bacillus đặc trưng cho trực khuẩn sinh bào tử mà vẫn gi ữ nguyên hình que khi mang bào tử, trong m t s ộ ố trường h p ch ợ ỉ hơi phình to lên một chút Tùy theo loại, bào tử có thể ằ n m gi a, g n cu i, ho c cu i ữ ầ ố ặ ở ố

Đặc điểm phân bố: nh kh ờ ả năng sinh bào tử nên Bacillus có thể ồ t n t i ạtrong th i gian rờ ất dài dưới các điều kiện khác nhau Chúng rất ph bi n trong t ổ ế ựnhiên nên có thể phân lập t nhi u nguừ ề ồn khác nhau như đất, nước, không khí, phân, trầm tích biển, thức ăn, sữa, mùn… chủ ếu là đất nơi mà đóng vai trò yquan tr ng chu k ọ ỳ Carbon và Nitơ [39]

b Dinh dưỡng và tăng trưởng

H u hầ ết các loài thuộc chi Bacillus là những sinh vật hóa dị dưỡng, thu năng lượng nh s ờ ự oxi hóa các hợp ch t hấ ữu cơ như đường, amino axit, axit hữu cơ… Mộ ốt s vi khu n quang ẩ dưỡng không bắt bu c (B.schlegelliộ ) có khả năng phát triển trong môi trư ng ch ờ ỉ có CO2 M t s ộ ố loài Bacillus B.subtilis) có khả (năng sử ụng các chấ d t hữu cơ, trong khi mộ ố loài khác như t s B.sphaericus, B.cereus cần các hợp ch t hấ ữu cơ đầy đủ (vitamin, axit amin) cho s ự phát triển

Đặc bi t Bacillus ệ gây bệnh cho côn trùng như B.thuringiensis, B.popllae, B.lentimorbus, B.cerus, B.anthracis (trong đó B.cerus, B.anthracis gây bệnh trên người) có nhu cầu dinh dưỡng ph c tứ ạp, chúng không phát triển được trong môi trường vi khuẩn thông thường như Nutrient broth, Nutrient agar theo Aronson và

c ng sộ ự, năm 1976

1.5.2 M t s ộ ố loài Bacillus phổ ế bi n trong t ự nhiên

B.subtilis (trực khu n c ẩ ỏ khô) được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa (1941) b i t ở ổ chức y h c Nazi cọ ủa Đức Lúc đầu, loài này đượ ử ụng để phòng c s d

b nh l ệ ỵ cho các chiến sĩ Đức chiền đấ ở ắc Phi Chúng có khuẩu B n lạc khô, không màu hoặc có màu xám nhạt, trắng, hơi nhăn hay tạo ra các lớp màng mịn, lan trên bề ặ m t th ch Khu n lạ ẩ ạc có mép nhăn bám vào môi trường th ch Tr c ạ ựkhuẩn hình que, ngắn, nh , t ỏ ế bào đứng riêng rẽ ho c chu i Nhiặ ỗ ệt độ ối ưu cho tsinh trưởng là 36-500C, tối đa là 600C Bào tử chịu được nhiệt độ khá cao, có hình bầu dục, phân bố ệch tâm Nhờ l kh ả năng sinh mộ ốt s enzyme ngoại bào (amylase, cellulase, protease,…) và sinh tổng hợp được nhi u loề ại kháng sinh

như subtilin, subtilosin A, sublancin,… mà B.subtilis được ứng d ng r t rụ ấ ộng rãi trong chăn nuôi, y học, th c ph m ự ẩ [40].

B.amyloliquefaciens có hình thái khuẩn lạc và tế bào tương tự B.subtilis Nhưng khác nhau về đặc tính sinh hóa, có khả năng lên men đường lactose nhanh

và lên men glucose chậm, thành phần G+C c a B.subtilis kho ng 41,5-ủ ả 43,5% còn trong ch ng ủ B amyloliquefaciens là 43,5-44,9%

Chúng phân bố ph biổ ến trong đất, nước Do có khả năng sinh tổng h p ợmạnh các enzyme như amylase, protease, lipase, phytase, xenlulase và xylanase nên đượ ức ng d ng nhiụ ều trong công nghiệp s n xuả ất enzyme, công nghiệp thu c ộ

da Ngoài ra, B.amyloliquefaciens còn đượ ức ng dụng trong các lĩnh vực khác như nông nghiệp, y h c b i kh ọ ở ả năng sinh các chất chuyển hóa như vitamin, nucleoside purine (inosine, guanosine), chất kháng khuẩn (bacteriocin), chất kháng nấm (bacimin), hoocmon tăng trưởng th c vật IAA Đặự c bi t, nhi u ệ ềnghiên cứu cho thấy các chế ph m probiotic t ẩ ừ Bacillus amyloliquefaciens đã góp phần c i thi n chả ệ ất lượ g môi trường nước, tăng cườn ng các ph n ng mi n ả ứ ễ

d ch, kiị ểm soát sự phát triển quá mức c a vi sinh vủ ật gây bệnh cho tôm, cá

B.licheniformis là vi khuẩ ại sinh, bào tử hình ovan, phát tán chủ ếtrong đất, k c ể ả đất nghèo dinh dưỡng như đất hoang hay sa m c Khu n l c nh , ạ ẩ ạ ỏmàu trắng đục, b mề ặt nhăn nheo Tế bào chuyển động nh ờ tiêm mao và loài này

B.polymyxa có khuẩn không màu, phẳng, lồi, trơn, lan ầ d n ra xung quanh, mép đôi khi có thùy Tế bào đứng riêng rẽ ho c xặ ếp thành đôi, chuỗi ngắn Bào

t ử hình bầu dục kéo dài Loại vi khuẩn này làm giảm pectin và polysaccarit trong cây Ngoài ra, chúng còn có khả năng cố định đạm Đây là mộ ốt s vi khu n r t ẩ ấ

ph biổ ến trong đất

B.cereus có khuẩn l c phạ ẳng, khá khuếch tán, hơi lõm, trắng đục, t ế bào đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi Bào tử hình bầu d c, n m lụ ằ ệch tâm, tế bào chất có chứa các hạt và không bào nhỏ Chúng thường phát tán khắp nơi, sinh sôi, nảy n ở trên thực phẩm và có thể sinh t ng c th c ph m ố ộ độ ự ẩ

1.5.3 Cơ sở khoa học của việc chọn chủng Bacillus dùng cho nuôi trồng thủy sản

Trong quá trình sinh t ởrư ng, B.subtilis, B.licheniformis và B.pumilus có khả năng sinh tổng hợp các chất kháng khuẩn có tác dụng c ch , cạnh tranh sinh ứ ếtrưởng hoặc tiêu diệt m t s vi sinh vộ ố ật có hại, tác dụng lên cả vi khu n Gram (-), ẩGram (+) và nấm gây bệnh

Ngoài ra, nhóm vi khuẩn này còn có khả năng sinh enzyme ngoại bào như amylase, cellulase, protease, xylanase giúp phân hủy các chất hữu cơ, thức ăn thừa trong ao nuôi Đặc bi t, nh ng ch ng vi khu n pệ ữ ủ ẩ robiotic này không gây độc cho vật nuôi thủy sản Các chủng vi khu n Gẩ ram dương này, có khả năng chuyển hóa các hợp ch t hữu cơ thành COấ 2 hi u qu ệ ả hơn các chủng vi khuẩn Gram âm

Các chất thải trong ao nuôi (mùn bã, thức ăn dư thừa) là một nguyên nhân quan tr ng dọ ẫn đến tăng hàm lượng khí độc amoni và nitrit trong ao, gây ảnh hưởng đến s c s ng cứ ố ủa cá Việc s dử ụng các chủng Bacillus spp có khả năng sinh enzyme phân hủy các chất thải và sử ụng các khí độc để sinh trưởng là rấ d t

c n thi t ầ ế [41]

Nhiều nghiên cứu ch ra rỉ ằng nhóm Bacillus spp là nhóm vi khuẩn thân thiện với môi trường, giúp cải thi n chệ ất lượng nước Điển hình là chủng vi khuẩn Bacillus subtilis ử ụng trong nước giúp làm giả s d m nồng độ ammonia,

gi m t l ả ỷ ệ chế ủa cá Chủt c ng vi khu n probiotic ẩ Bacillus licheniformis không

những làm giảm nồng độ am onia trong nước mà còn làm giảm lượm ng tinh b t ộ

và protein dư thừa trong nước Có nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra vi khuẩn B.licheniformis có khả năng khử Nitrit lên đến trên 95%, trong điều kiện hóa dị dưỡng [42]

Năm 2011, Jngjing Xiao và cộng sự đã chỉ ra Bacillus subtilis AYC có thể hấp thu đến 99,55% NH4+ [43].

Các loài Bacilus được coi là thích nghi với quá trình xử lý nước thải Do khả năng thích nghi tốt cả trong điều kiện hiếu khí và kị khí tùy tiện Hơn nữa các dòng Bacilus không sinh độc tố và chống chịu tốt với nhiệt độ, pH, độ mặn Bacillus licheniformis trong điều kiện hóa tự dưỡng kị khí và phản nitrite hiếu khí có thể khử NH4+ từ 10 đến 30 mg/L trong 30 phút [44] [45]

1.5.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các chế phẩm có thành phần Bacillus trong nuôi trồng th y s n ủ ả

Đã có n ều nghiên cứhi u ch ra rỉ ằng, các sản ph m b ẩ ổ sung nhóm vi khuẩn B.subtilis, B.licheniformis, B.pumilus có nhiều tác dụng trong việc ổn định chất lượng nước nuôi trồng th y sủ ản nói chung và nuôi cá rô phi nói riêng, đặc bi t ệcác chủng vi khu n B.subtilis, B.licheniformis, B.pumilus ẩ có khả năng sinh ra chất kháng khuẩn giúp cạnh tranh với các nhóm vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt là nhóm vi khuẩn Streptococcus spp gây bệnh trên cá rô phi

s d ng ử ụ B.subtilis, B.licheniformis, B.pumilus giúp kháng lại Streptococcus iniae như một nhân tố giúp tăng tỷ ệ ố l s ng của cá trong ao nuôi [47]

Tạp chí Fish and Shelfish immunology của Parapansak và Nonthawit đưa

ra k t lu n r ng, khi s d ng ch ng vi khuế ậ ằ ử ụ ủ ẩn B.pumilus ới hàm lượng 1×10 v 8 - 1×109 CFU/kg trong kh u phẩ ần ăn giúp tăng cường h ệ miễn dịch và tăng khả năng kháng Streptococcus agalactiae K t qu cế ả ủa nhóm nghiên cứu cũng đưa ra nhi u s u ch ng minh vi c s d ng ch ng vi khu n ề ố liệ ứ ệ ử ụ ủ ẩ B.pumilus như một ch ng ủ

vi khu n pẩ robiotic kháng lại các bệnh gây ra do Streptococcus trong phòng thí nghi m l n trong ệ ẫ điều ki n th c t ệ ự ế [45]

B ng 1.1 M t s s n phả ộ ố ả ẩm Probiotic dùng trong thủy sản trên thị trường Việt

CM Bio Co Ltd Hàn Quốc

B.licheniformis;

B.megaterium B.mesentericus;

Nitrosomonas; Nitrobacter Yucca schidigera

ANOVA

PondPlus Xử lý đáy ao

nuôi trồng thủy sản

B megaterium; B.subtilis

B licheniformis

B amyloliqueafaciens

NOVOZYME ( Trung Quốc )

u Các thí nghiệm trong quá trình nghiên cứu tại phòng nghiên cứu và sản

xuất chế phẩm thuộc phân xưởng Probiotic – công ty TNNH Dược Hanvet

Thời gian nghiên cứu từ tháng 10 năm 2018 đến hết tháng 05 năm 2020

2.1.1 Ngu n vi sinh v t ồ ậ

Vi sinh v t l y t ậ ấ ừ các mẫu nước ao nuôi cá rô phi khỏe mạnh, giai đoạn

nuôi 5 8 tháng và lấ ừ ộ sưu tậ- y t b p gi ng cố ủa công ty Hanvet

Chủng vi khu n kiẩ ểm định dùng làm kháng khuẩn Streptococcus

agalactiae là chủng HV-Strep O2 thu c b ộ ộ giống công ty Hanvet

2.1.2 D ng c ụ ụ

Các dụng cụ sử dụng được phòng thí nghiệm của công ty Hanvet gồm :

Bảng 2.1 Các thiết bị dùng trong quá trình thí nghiệm

TQ Hanvet Cân môi trường, hóa chất

4 Cân phân tích TQ Hanvet Cân dung môi, nguyên liệu

5 Máy bơm hút khí TQ Hanvet Nén và bơm khí lọc dịch

6 Máy ly tâm Mỹ Hanvet Ly tâm thu sinh khối

7 Buồng an toàn

sinh học

Việt Nam Hanvet Thao tác vô trùng

8 Máy đo quang

UV VIS

-TQ Hanvet Nuôi cấy giống nhỏ

10 Kính hiển vi Đức Hanvet Kiểm tra vi khuẩn

11 Máy đo pH Singapore Hanvet Đo pH môi trường,

dung môi

12 Tủ lạnh -800C Đan Mạch Hanvet Bảo quản giống

13 Máy đông khô Hàn Quốc Hanvet Đông khô giống

Hình 2.1 Hệ thống lên men 5 lít Hình 2.2 Hệ thống bể nuôi cá thí

nghiệm

2.1.3 Hóa chất

Môi trường dùng cho quá trình phân lập và tuyển chọn chủng giống : Nutrient agar, code 1.05450.0500, Merk; Nutrient broth, code 1.05443.0500, Merk; Carboxymethylcellulose sodium salt, code 9004-32-4, Himedia ; Tinh bột tan, code 1.01252.0100, Merk; Casein from bovine milk, code C7078, Sigma; Xylan from beechwood, code MB141, Himedia; API 50CH, code 50300, Biomeriuex; Môi trường 50CHB code 50430, Biomeriuex; Môi trường MT1 (chiết suất từ đậu tương, cà chua trùn quế), Hanvet; Streptococcus selective , supplement, code SR0126E, Oxide; Sodium nitrite (NaNO2), code 1065490500, Merk; Ammonium nitrate, code 221244, Sigma; Sera aqua test, Sera; Tris hydrochloride, code 3719202, Serva; Cá rô phi đơn tính giống Đường ghiệp có Ntrọng lượng từ 38 40 gram Mua tại viện nuôi trồng thủy sản I – Đình Bảng – Từ -Sơn – Bắc Ninh, anti foam 204, Merk

Hóa chất dùng cho giải trình tự gen: Nuclease free water, code P1197, Promega; TE 1X pH 8.0, code V6232, Promega; Gotaq mix green, code M7123, Promega; Marker 100bp, code 15628-050, Invitrogen; Agarose, code A9539, Sigma; TAE 50X, code 24710-030, Thermo Scientific; Thuốc nhuộm gel Redsafe, code 21141, Intron; EDTA, code E5134-100G, Sigma; NaCl tinh khiết, code S7653-250G, Sigma; CTA code 219374-100GM, Merck; SDS, code B.L3771-100G, Sigma; Chloroform-isoamin, code 25668-100ML, Sigma; Isopropanol, code I9516-4X25ML, Sigma; Ethanol, code 1009900500, Merck;

16S rRNA Forward: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG, code Catalog #

51-01-19-06, Intergrated DNA Technologies 16S rRNA Reverse: ACGGCTACCTTGTTACGACTT , code Catalog # 51-01-

19-07, Intergrated DNA Technologies

Hình 2.3 Sơ đồ ố trí thí nghiệ b m tổng quát

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu

Tiến hành thu thập mẫu nước ao nuôi được lấy từ các ao nuôi cá khỏe mạnh, không bị bệnh và ở giai đoạn cuối của quá trình nuôi (ao đã nuôi cá được 5-8 tháng) tại các vùng Nam Định, Hải Phòng, Hải Dương, Bắc Ninh, Hưng Yên Mẫu được đựng trong ống falcol đã khử trùng bảo quản lạnh trong thùng bảo ôn trong quá trình đưa mẫu từ thực địa về phòng thí nghiệm và tiến hành phân lập trong vòng 48h đối với các mẫu ở phía ắc Một số mẫu phía am thì B Nbảo quản lâu hơn 3 5 ngày -

2.2.2 Phương pháp phân lập vi khu n Bacillus ẩ

Phân lập vi sinh v t ậ và nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để

mọc thành các khuẩn lạc riêng rẽ, tách biệt riêng ấ 10ml mỗi mẫu được đun L y nóng ở 800C trong 30 phút kết hợp lắc nhẹ, để nguội về nhiệt độ phòng rồi tiến hành pha loãng và trải trên đĩa môi trường thạch NA sao cho thu được các khuẩn lạc đơn Các đĩa môi trường thạch sau đó được ủ ở 370C trong 24 giờ Các khuẩn lạc đơn có hình thái khác nhau được tách riêng và làm thuần bằng cách cấy ria lặp lại nhiều lần từ 1 khuẩn lạc đơn trên môi trường NA Sau đó chọn các khuẩ n

lạc riêng rẽ ấ c y chuy n sang ng thể ố ạch nghiêng để ả b o quản và nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa

L y mấ ột vòng que cấy khu n lẩ ạc trên ống thạch nghiêng, gạt 3-4 lần trên

m t th ch NA mặ ạ ở ột góc Quay đĩa thạch sang hướng khác và ria từ m t v ch ộ ạthành 3 4 đường khác sao cho không trùng với các đường trướ- c L p l i theo m t ặ ạ ộhướng th ứ ba để pha loãng hơn nữa vi khuẩn dính trên que cấy Chú ý không nhấc tay lên và không thay đổi hướng của vòng que cấy Đặt m u nhiẫ ở ệt độthích h p trong 24 gi ợ ờ để chọn khu n l c mẩ ạ ọc riêng rẽ

Tiến hành quan sát các khuẩn lạc này từ các phía (từ trên xuống, t ừ bên

cạnh), chú ý về hình dạng khu n lẩ ạc, hình dạng mép, bề ặt, độ dày, có núm hay mkhông, độ trong, màu sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra môi trường hay không)

Dựa trên khả năng bắt màu của t ế bào chất và màng tế bào với thu c ốnhuộm tím ết tinh và iod mà hình thành nên hai loạ k i ph c chứ ất khác nhau

Loại ph c ch t th nh t v n gi ứ ấ ứ ấ ẫ ữ nguyên màu thuốc nhuộm do không bị

rửa trôi khi xử lý cồn Vi sinh vật có phức chất này thuộc gram dương

Loại ph c ch t th ứ ấ ứ hai không giữ được màu thuốc nhuộm nên mất màu khi

x ử lý bằng cồn và bắt màu thuốc nhuộm b sung Vi sinh vổ ật này thuộc gram âm

c

Nhỏ dung dịch H2O2 3% trực tiếp lên sinh khối tế bào vi khuẩn kết hợp nhuộm Gram và quan sát hình thái tế bào vi khuẩn cũng như sự bắt màu gram để lựa chọn chủng và tiến hành sàng lọc

2.2.3 Tuyển chọn chủng giống

nh kh Nguyên tắc: Enzyme tác động với cơ chất trong môi trường thạch, cơ chất

b ị phân hủ ạo thành vòng phân giải cơ chấy t t xung quanh khu n lẩ ạc Đường kính

của vòng phân giải cơ chất phản ánh hoạt tính của enzyme

Phương pháp tiến hành: Dùng que cấ ấy l y một lượng khu n l c c a ch ng ẩ ạ ủ ủ

vi khuẩn được ch n c y ọ ấ chấm điể lên đĩa môi trường NA có bổm sung t ng lo i ừ ạ

cơ chất: 1% tinh bột tan, 1% CMC, 1% casein, 1% xylan tương ứng cho kh ả

năng sinh các enzyme amylase, cellulase, protease và xylanase Ủ các đĩa khảo

sát ở 370C trong vòng 24h và quan sát vòng phân giải trên đĩa

b Th nghi m kh 2- NO

Dịch nuôi cấy của các chủng vi khuẩn được kiểm tra khả năng khử NO2-

sử dụng phương pháp Griess

Nguyên lý: phương pháp này được áp dụng để xác định nồng độ khối

lượng của NO2- có mặt trong môi trường Màu hồng của dung dịch có độ hấp thụ

quang cực đại ở bước sóng 520 nm, hình thành bởi dung dịch NO2- tác dụng với

thuốc thử axit sulfanilic và α naphtylamin trong môi trường axit

-c Th nghi m kh 4+ NH

Dịch nuôi cấy của các chủng vi khuẩn được kiểm tra khả năng khử NH4+

sử dụng phương pháp Nesstle

- Nguyên lý: Trong môi trường bazơ mạnh NH4+ chuyển hóa thành NH3

NH3 mới hình thành và sẵn có trong nước tác dụng v i Nesstle t o phớ ạ ức màu

vàng hoặc nâu

- Phương pháp chỉ được áp dụng với lượng amoni r t nh 0,1mg/l ấ ỏ

2 K2HgI4 + NH3 + 3 KOH Hg(HgIONH 2) + 7KI + 2H2O

Màu vàng

K2HgI4 + NH3 + KOH Hg(HgI 3NH2) + 5KI + H2O

Màu nâu

- Dùng muối xenhet cho vào nước phân tích để các muối này kế ợt h p với

các ion gây nhiễu hình thành các hợp chất tan, không màu trong dung dịch

Nguyên tắc: Dựa vào sự khuếch tán ủ c a ch t c ch trong dấ ứ ế ịch nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường th ch, nhạ ững nơi nào có chấ ứt c ch khuế ếch tán thì vi sinh

v t kiậ ểm định không sinh trưởng được và tạo thành vòng vô khuẩn xung quang l ỗthạch

- C y chấ ủng vào môi trường nutient broth, nuôi cấy l c ắ

370C/24h/150rrpm

- Sau 24h, l c dọ ịch nuôi cấy qua màng lọc 0.22 µm thu lấy d ch trong ị

- L y d ấ ịch nuôi vi khuẩn kiểm định có nồng độ ế bào 10 t 6 CFU/ml, trải lên bề mặt môi trường đĩa thạch blood agar Để khô và đụ ỗc l

- Nhỏ ị d ch trong sau lọc vào lỗ thạch sao cho dịch không trà ra ngoài miệng l ỗ

- C t t l nh t 2-4h cho dihcj trong khuấ ủ ạ ừ ếch tán vào môi trường thạch

- C t t m 37ấ ủ ấ 0/24h, đọc k t quế ả Và đo kích thước vòng vô khuẩn

2.2.4 Định danh ch ng gi ng ủ ố

nh danh b

- Chọn khu n l c thu n, nẩ ạ ầ uôi cấy 18-24h đố ới nhóm Bacillusi v

- Trải đều sinh lý lên khay đựng strip, bóc strip đặt vào khay

- M ở ống môi trường 50 CHB/E, thu khu n lẩ ạc đã chọn vào môi trường phù hợ tương ứng độ độp 2 McFarlank Sử ụ d ng ngay

- L ần lượt nh ỏ ống môi trường có chứa khu n lẩ ạc đã thu vào các giếng đầy đến vạch quy định (~150µl), tránh tạo bọt trong các giếng

- Đậy khay đặt vào tủ nuôi 37oC, đọc kết qu sau 24h, 48h b ng ph n ả ằ ầ

mềm Web API do nhà sả xu t cung c p ấ ấ

nh danh b ng sinh hTách chiết ADN

- Ly tâm 1.5ml ịch nuôi vi khuẩ ấ d n l y sinh kh i t ố ế bào

- Hoà sinh khố ế bào trong 100 i t l TE (TE buffer: 15 mM Tris-HCl +1

mM EDTA (pH 7,5)

- Thêm 0,4 mg lysozym Trộn đề ủu, 370C/1 gi Trờ ộn đều 3 phút

- Thêm một th ể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI), trộn đều Ly tâm 15000v/p, 15phút Chuyển l p dớ ịch phía trên sang ống eppendoft khác

- Thêm 8 l ARNaza 3 mg/ml, trộn đề ủ ởu, 370C trong 30 phút

- T hêm 12 l proteinaza K (5 mg/ml), tr ộn đề ủ 15 phút ởu, 560C

- Thêm một th ể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI), trộn đều Ly tâm 15000v/p, 15phút Chuyển l p dớ ịch phía trên sang ống eppendoft khác

- Thêm 1 thể tích tương đương chloroform: isoamyl alcohol, trộ đền u, ly tâm 15000v/p, 15phút Chuyể ớn l p dịch phía trên sang ống eppendoft khác

- Thêm 1/10 V Natri axetat 3M và 1ml Etanol 100%, đảo trộn Đặt trong

đá 30 phút Ly tâm 15000v/p trong 15 phút Bỏ ớ l p dịch trên

- R a t a b ng Etanol 70% ử ủ ằ

- Làm khô ADN bằng máy cô quay chân không

- Hoà tan ADN trong 50-100l nước ho c TE ặ

- Kiểm tra các sản ph m c a PCR bẩ ủ ằng điện di: Đun tan 1% agaroza (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agaroza: 1g) để ấm, đổ vào khuôn,

đợi cho nguội và đặ ấm gel vào trong máy điệt t n di, ng p trong 300ml dung d ch ậ ị1X TAE Tr n 2 l dung d ch 6X loading buffer v i 5 l m u trộ  ị ớ  ẫ ộn đều, nh ỏ vào giếng Chạy điện di bằng dòng điện m t chi u vộ ề ới điện th ế 100V, cường độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 

20 phút vớt ra Quan sát trên máy soi gel

- Phả ứn ng khuếch đại ADN