Nghiên ứu hiết xuất một số hợp phần từ lá đu đủ ariapapayal và khảo sát hoạt tính gây độ tế bào ung thư ủa á phân đoạn hất hiết

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ***** ĐỖ SƠN TÙNG NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT MỘT SỐ HỢP PHẦN TỪ LÁ ĐU ĐỦ CARICA PAPAYA L VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN CHẤT CHIẾT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Đỗ Thị Hoa Viên Hà Nội, 2014 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17061131992141000000 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Đặt vấn đề: .1 Mục đích yêu cầu: Mục đích nghiên cứu: Yêu cầu: ………………………………………………………………………… CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU I.1 Giới thiệu chung đu đủ I.1.1 Nguồn gốc phân bố [26]…………………………………………………… I.1.2 Phân loại:……………………………………………………………………… I.1.3 Tình hình diện tích trồng sản xuất đủ đủ……………………… I.1.4 Đặc tính thực vật giống đu đủ trồng Việt Nam [12]………………… I.1.5 Thành phần hóa học tính chất dược lý đủ đủ………………… I 1.5.1 Thành phần hóa học đủ đủ [6][23]……………………………… I.1.5.2 Một số dược tính đủ đủ [6]………………………………… I.2 Giới thiệu chung hợp chất: flavonoid alkaloid 10 I.2.1 Tổng quan flavonoid [2][3][13]…………………………………………… 10 I.2.1.1 Khái niệm:…………………………………………………………… .10 I.2.1.2 Phân bố:………………………………………………………………… 10 I.2.1.3 Phân loại:………………………………………………………………… 11 I 2.1.4 Tính chất flavonoid……………………………………………………11 I.2.2 Tổng quan alkaloid [9][13][19] 13 I.2.2.1 Khái niệm:………………………………………………………………… 13 I.2.2.2 Phân bố:………………………………………………………………… 13 I.2.2.3 Phân loại:………………………………………………………………… 13 I.2.2.4 Tính chất alkaloid…………………………………………………… 14 I.3 Tình hình nghiên cứu chống ung thư đu đủ 16 I.3.1 Các nghiên cứu giới………………………………………………… 16 I.3.2 Các nghiên cứu nước…………………………………………………… 17 I.4 Các phương pháp chiết xuất hợp chất tự nhiên từ thực vật[1][28] 17 I.4.1 Phương pháp ngâm dầm dung môi………………………………… … 19 I.4.2 Phương pháp ngâm kiệt đơn giản…………………………………………… 20 I.4.3 Phương pháp ngâm kiệt phân đoạn…………………………………………… 21 I.4.4 Phương pháp chiết xuất Soxholet:…………………………………………… 22 I.4.5 Phương pháp chiết xuất hỗ trợ từ Siêu Âm 22 I.4.6 Phương pháp chiết xuất hỗ trợ từ vi sóng…………………………………… 23 I.5 Phương pháp chiết phân đoạn dung môi có độ phân cực tăng dần 24 I.6 Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống ung thư hợp chất 25 I.6.1 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào [14][15]……………… 25 CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 II.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 26 II.1.1 Nguyên liệu………………………………………………………………… 26 II.1.2 Hóa chất…………………………………………………………………… 26 II.1.3 Thiết bị……………………………………………………………………… 27 II.2 Phương pháp nghiên cứu 27 II.2.1 Phương pháp thiết kế thí nghiệm………………………………………… 27 II.2.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình triết xuất…………………… 27 II.2.2.1 Khảo sát trạng thái chiết xuất hợp phần từ đu đủ phương pháp chiết ngâm dầm……………………………………………………………… 27 II.2.2.2 Khảo sát tỷ lệ ngun liệu/dung mơi chiết xuất thích hợp……………….… 29 II.2.2.3 Khảo sát thời gian chiết xuất thích hợp…………………………….……… 29 II.2.2.4 Khảo sát nhiệt độ chiết xuất thích hợp………………………………… 30 II.2.3 Phân đoạn chất chiết dung môi phân cực………… ………………… 31 II.2.4 Khảo sát hoạt tính chống ung thư phân đoạn chất chiết…………… 32 II.2.4.1 Vật liệu…………………………………………………………………… 32 II.2.4.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro………………………………… 32 II.2.4.3 Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay)………… 33 II.2.5 Định tính flavonoid alkaloid phân đoạn chất chiết………………… 35 II.2.5.1 Định tính flavonoid:………………………………………………….… 36 II.2.5.2 Định tính alkaloid……………………………………………………… 37 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 III.1 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất 40 III 1.1 Khảo sát trạng thái chiết xuất dịch chiết tổng số từ đu đủ phương pháp chiết ngâm dầm 40 III.1.2 Kết khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung mơi chiết xuất thích hợp .41 III.1.3 Kết khảo sát thời gian chiết xuất thích hợp 43 III.1.4 Kết khảo sát nhiệt độ chiết xuất thích hợp 44 III Kết phân đoạn chất chiết dung môi phân cực 45 III.3 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ưng thư phân đoạn chiết 47 III.3.1 Kết xác định hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư KB (ung thư biểu mô)……………………………………………………………………… 47 III.3.2 Kết xác định hoạt tính gây độc tế bào dịng tế bào ung thư LU-1 (ung thư phổi)…………………………………………………………………………… 48 III.6.3 Kết xác định hoạt tính gây độc tế bào dịng tế bào ung thư Hep – G2 ( ung thư gan)…………………………………………………………………… … 49 III.4 Kết thử định tính flavonoid alkanoid phân đoạn 49 III.4.1 Định tính flavonoid………………………………………………………… 49 III.7.2 Định tính alkaloid………………………………………………………… 52 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết MỞ ĐẦU Đặt vấn đề: Từ xa xưa đu đủ (có tên khoa học Carica papaya L.) sử dụng số thuốc dân gian nước ta để chữa số bệnh ho, tiếng, nước sắc đu đủ dùng gột vết máu vải, rửa vết thương…Trong thời gian gần đây, số thuốc sử dụng nước chiết từ đu đủ để hỗ trợ điều trị ung thư nhiều người áp dụng Tuy nhiên, thuốc hoàn toàn dựa kinh nghiệm truyền cho mà chưa có nghiên cứu, kiểm tra hướng dẫn cụ thể thành phần hợp phần có đu đủ quy trình, liều lượng dùng, chế tác động việc hỗ trợ điều trị ung thư từ nước chiết đu đủ Ngày nay, khoa học cơng nghệ ngày phát triển số nước tiên tiến giới như: Nhật Bản, Mỹ, Úc… có nhiều nghiên cứu, thí nghiệm có cơng bố kết hoạt tính chống ung thư từ nước chiết đu đủ kết thực phịng thí nghiệm mà chưa có quy trình thử nghiệm người Chính thế, việc sử dụng nước chiết từ đu đủ việc hỗ trợ điều trị ung thư thể người cịn câu hỏi mà chưa có câu trả lời Theo thống kê Tổ chức nghiên cứu ung thư giới (International Agency for Research on Cancer, IARC) tồn giới hàng năm ước tính có khoảng 11 triệu người mắc bệnh ung thư [30] Hiện nay, nước ta tỷ lệ người dân bị ung thư ngày tăng lên theo năm, nguyên nhân gây ung thư đa dạng như: ôi nhiễm môi trường, lối sống không lành mạnh… Theo số liệu thống kê Hiệp hội Ung thư Việt Nam, năm nước có thêm khoảng 150 000 ca mắc bệnh 75000 ca tử vong ung thư Nếu cộng thêm với số bệnh nhân mắc tính đến thời điểm tại, nước có khoảng 240 000 – 250 000 bệnh nhân bị ung thư điều trị [25] Tại bệnh viện K năm số lượng bệnh nhân ung thư vào viện tăng 10 – 20 % so với năm trước Trước thực trạng việc tìm loại thuốc, Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết phương pháp điều trị ung thư cần thiết cấp bách Hiện nay, có số phương pháp điều trị ung thư song chi phí điều trị cao, số loại thuốc điều trị ung thư phải nhập ngoại Theo xu hướng nay, nhà nghiên cứu hướng tới việc chiết xuất hợp phần có nguồn gốc từ tự nhiên mà hợp phần có hoạt tính chống ung thư chiết xuất từ thảo dược để giảm bớt chi phí điều trị cho bệnh nhân ung thư Trong đó, nước ta đu đủ trồng lâu diện tích ngày mở rộng giá trị kinh tế ngày cao đu đủ mang lại Cây đu đủ dễ trồng, dễ nhân giống, sớm, sản lượng cao, chu kỳ kinh tế ngắn, thích nghi tốt với điều kiện khí hậu vùng miền Diện tích trồng đu đủ nước ước khoảng 10 000 – 17 000 với sản lượng khoảng 200 – 350 ngàn [12] Đây thực nguồn nguyên liệu phong phú để thu nhận, chiết xuất hợp chất từ đu đủ khảo sát hoạt tính gây độc tế bào hợp chất hồn tồn thực Điều có ý nghĩa khoa tính thực tiễn cao, góp phần vào nghiên cứu khả chống ung thư từ đu đủ làm tăng giá trị kinh tế cho đu đủ việc thu hái Từ lý trên, lựa chọn thực đề tài “Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đu đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết” Mục đích yêu cầu: Mục đích nghiên cứu: Đưa phương pháp chiết xuất, điều kiện chiết xuất, tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng đến q trình chiết từ đưa điều kiện chiết xuất thích hợp khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết Từ mục đích việc đưa điều kiện chiết xuất luận khoa học cho việc sử dụng nước chiết từ đu đủ việc hỗ trợ điều trị ung thư có khả làm sở tiền đề cho hướng nghiên cứu đu đủ Yêu cầu: - Lựa chọn phương pháp chiết xuất, xác định điều kiện chiết xuất tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất hợp phần có đu đủ - Khảo sát khả gây độc tế bào ung thư số dịng tế bào ung thư - Định tính số nhóm chất phân đoạn chất chiết (định tính nhóm chất flavonoid alkaloid) Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU I.1 Giới thiệu chung đu đủ I.1.1 Nguồn gốc phân bố [26] Cây đu đủ có tên khoa học: Carica papaya L Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliolipsida Bộ: Brassicales Họ: Caricaceae Chi: Carica Lồi: Carica papaya L Hình 1: Hình đu đủ Cây đu đủ nguồn gốc từ Trung Mỹ bờ biển nước Panama Colombia nhà báo Oviedo người Tây Ban Nha mô tả vào năm 1526 Cây đu đủ giống lớn, với thân thẳng đứng không phân nhánh với chiều cao từ – m Lá to mọc so le tập trung có kích thước lớn với đường kính từ 50 – 17 cm, hình chân vịt, xẻ sâu với thùy Hoa giống hoa sứ Plumeria nhỏ mọc nách Quả hình bầu dục thon dài có đường kính từ – 15 cm, dài 20 – 40 cm, trọng lượng từ 0,5 – kg Hiện nay, đu đủ trồng chủ yếu nước vùng nhiệt đới vùng nhiệt đới ẩm châu Á phạm vị 32o Bắc 32o Nam, nơi có nhiệt độ bình qn năm khơng thấp 15oC Tuy nhiên, với tiến công tác chọn tạo giống tạo ta số giống tương đối chịu lạnh Trên giới, nước trồng nhiểu đu đủ là: Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Philipin (Châu Á); Tazania, Uganda (Châu Phi); Brazil , Mỹ (Châu Mỹ); Úc, Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012 Nghiên cứu chiết xuất số hợp phần từ đủ đủ Carica papaya L khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn chất chiết Newzealand (Châu Đại Dương) Ở Việt Nam, đu đủ trồng hầu hết miền Bắc miền Nam, chúng trồng nhiều tỉnh đồng Hà Tây, Hà Nam, Hưng Yên, Bình Dương, Tiền Giang [12] I.1.2 Phân loại: Hiện giới giống đu đủ phân biệt theo loại sau [19]: - Candamarcencis Hook (hill papaya) Có tự nhiên dãy núi Columbia Ecuador, cao 2,5 – 3,0m màu vàng nhỏ - Carica Quercifolia Benth and Hook Trồng phía Nam Mỹ cao 1,5 – 2m nhỏ có màu vàng, chiều dài 2,5 – 5,0 cm - Carica microcarpa, Carica monoica, Carica cauliflora… Trên giới trồng chủ yếu giống lai có nguồn gốc để tạo giống cho suất cao, phẩm chất tốt, trồng chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh, bệnh tật…Cây đu đủ du nhập vào Việt Nam từ lâu trồng phổ biến nước I.1.3 Tình hình diện tích trồng sản xuất đu đủ Cây đu đủ nhóm trồng vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Theo báo cáo Carmo Sousa Jr (2003) diện tích trồng đu đủ tăng 151% (16 012 triệu vào năm 1990 lên đến 40 202 triệu vào năm 2000) [20] Năm 2004 tồn giới thu triệu diện tích trồng lên đến 389 990 triệu (FAO 2004) Trong đó, trang trại phía nam Mỹ chiếm đến 47%, Châu Á chiếm 30% 20% Nam Phi Brazil đứng đầu giới chế biến đu đủ ngày phát triển Đỗ Sơn Tùng – CNSH.KT 2012