Nghiên ứu điều kiện lên men và táh hiết hoạt hất kìm hãm α gluosidase từ dịh đậu đen lên men bởi vi khuẩn baillus subtilis m1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI =======* & *====== DƯƠNG THỊ NGỌC QUỲNH NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT KÌM HÃM α – GLUCOSIDASE TỪ DỊ CH ĐẬ U ĐEN LÊN MEN BỞI VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS M1 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2013 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17061131940801000000 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI =======* & *====== DƯƠNG THỊ NGỌC QUỲNH NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆ N LÊN MEN VÀ TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT KÌM HÃM α – GLUCOSIDASE TỪ DỊ CH ĐẬU ĐEN LÊN MEN BỞI VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS M1 CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS LÊ THANH HÀ Hà Nội – 2013 LỜI CAM ĐOAN Tôi Dương Thị Ngọc Quỳnh xin cam đoan nội dung luận văn với đề tài “Nghiên cứu điều kiện lên men tách chiết hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ dịch đậu đen lên men vi khuẩn Bacillus subtilis M1” cơng trình nghiên cứu sáng tạo tơi thực hướng dẫn PGS.TS Lê Thanh Hà Các số liệu, kết trình bày luận văn hồn tồn trung thực chưa cơng bố cơng trình khoa học khác LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận ủng hộ, giúp đỡ tận tình thầy giáo, gia đình bạn bè Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Thanh Hà - Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình bảo tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội giảng dạy giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè tạo điều kiện, quan tâm, động viên góp ý cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Học viên Dương Thị Ngọc Quỳnh MỤC LỤC Trang bìa phụ Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục hình Danh mục bảng MỞ ĐẦU PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh đái tháo đường (tiểu đường) người 1.1.1 Giới thiệu bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) 1.1.2 Phân loại bệnh đái tháo đường 1.1.3 Biến chứng bệnh đái tháo đường 1.1.4 Phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường .5 1.1.5 Tình hình bệnh đái tháo đường giới Việt Nam 1.2 Enzyme chuyển hóa - Alpha glucosidase (EC 3.2.1.20) 1.2.1 Giới thiệu α - glucosidase 1.2.2 Cấu trúc hóa học α – glucosidase .9 1.2.3 Tính chất α-glucosidases 10 1.3 Chất kìm hãm alpha – glucosidase (alpha - glucosidase inhibitors – AGIs) 10 1.3.1 Giới thiệu chất kìm hãm alpha – glucosidase 10 1.3.2 Phân loại hoạt chất kìm hãm alpha – glucosidase 11 1.3.2.1 Nhóm Disaccharides 11 1.3.2.2 Nhóm Iminosugars 12 1.3.2.3 Carbasugars pseudoaminosugars 14 1.3.2.4 Thiosugars 15 1.3.3 Cơ chế kìm hãm α – glucosidase AGIs tác dụng điều trị đái tháo đường type 15 1.3.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng AGIs .18 1.3.4.1 Tình hình nghiên cứu ứng dụng AGIs giới 18 1.3.4.2 Tại Việt Nam 19 1.4 Nguồn thu nhận công nghệ sản xuất AGIs 20 1.4.1 Sản xuất AGIs theo phương pháp tổng hợp hóa học .20 1.4.2 Sản xuất AGIs theo đường tự nhiên .20 1.4.2.1 Sản xuất AGIs từ động vật 20 1.4.2.1 Sản xuất AGIs từ thực vật 21 1.4.2.3 Sản xuất AGIs từ vi sinh vật 24 1.5 Sản xuất AGIs từ đậu đen lên men vi khuẩn Bacillus subtilis 25 1.5.1 Nguồn chất đậu đen 25 1.5.2 Nguồn chủng vi khuẩn Bacillus subtillis 26 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Nguyên liệu 29 2.2 Môi trường 29 2.3 Hóa chất 30 2.4 Thiết bị 30 2.5 Phương pháp 31 2.5.1 Xác định số tính chất nguyên liệu đậu đen 31 2.5.2 Lên men khảo sát điều kiện lên men thích hợp thu hoạt chất kìm hãm α glucosidase 33 2.5.3 Xác định hoạt tính kìm hãm α-amylase dịch chiết sau lên men .33 2.5.4 Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase 35 2.5.5 Phương pháp xây dựng phương trình động học trình lên men thu hoạt chất kìm hãm α – glucosidase 36 2.5.6 Thu hồi hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ dịch đậu đen lên men chủng Bacillus subtilis M1 37 2.5.7 Khảo sát khả loại màu dịch lên men than hoạt tính 38 2.5.8 Xác định giá trị IC50 38 2.5.9 Tính tốn thống kê 38 2.5.10 Hiệu suất thu hồi 38 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Khảo sát đặc tính cơng nghệ ngun liệu đậu đen 40 3.2 Nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase Bacillus subtilis M1 40 3.2.1 Nghiên cứu môi trường dinh dưỡng thích hợp .40 3.2.2 Ảnh hưởng pH đến khả sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase 42 3.2.3 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase 43 3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến khả tổng hợp hoạt chất kìm hãm α –glucosidase .44 3.2.5 Nghiên cứu thời gian lên men thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase 45 3.3 Động học trình sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase mối tương quan với mật độ vi khuẩn Bacillus subtilis M1 trình lên men 46 3.4 Nghiên cứu điều kiện thu hồi tạo chế phẩm chứa hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ dịch lên men vi khuẩn Bacillus subtilis M1 50 3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng q trình kết tủa cồn đến hoạt tính kìm hãm α – glucosidase dịch lên men 50 3.4.2 Khảo sát q trình đặc dịch lên men chứa hoạt chất kìm hãm α - glucosidase .52 3.4.3 Khảo sát phương pháp sấy tạo sản phẩm dạng bột chứa hoạt chất kìm hãm α – glucosidase 55 3.5 Nghiên cứu khả kìm hãm α – amylase chế phẩm chứa AGI 57 3.6 Khảo sát khả tẩy màu than hoạt tính với sản phẩm lên men 58 3.7 Đề xuất qui trình lên men tạo chế phẩm chứa hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ đậu đen lên men vi khuẩn Bacillus subtilis M1 61 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 KẾT LUẬN 64 KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT KÝ HIỆU TÊN ĐẦY ĐỦ 4-NPG 4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside AGIs (Alpha Glucosidase Inhibitors) Chất kìm hãm alpha - Glucosidase CFU (Colony forming unit) Đơn vị khuẩn lạc DNJ 1-deoxynojirimycin DNS Dinitrosalicylic acid ĐTĐTN Đái tháo đường thai nghén GLP Glucagon peptide HTKH Hoạt tính kìm hãm IC50 (half maximal inhibitory concentration) Nồng độ chất kìm hãm kìm hãm 50% hoạt tính α-glucosidase IGT Rối loạn dung nạp glucose WHO (World Health Organization) Tổ chức y tế giới XOS Xylooligosaccharides DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tỷ lệ phần trăm bệnh nhân đái tháo đường độ tuổi 20 – 79 phân chia theo khu vực giới Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo số hoạt chất kìm hãm α – glucosidase có chất disaccharide…………………………………………………………… …12 Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo số hoạt chất kìm hãm α – glucosidase thuộc lớp Piperidines 13 Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo số hoạt chất kìm hãm α – glucosidase có chất Iminosugars 14 Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo số hoạt chất kìm hãm α – glucosidase có chất Carbasugars 15 Hình 1.6 Công thức cấu tạo số hoạt chất kìm hãm α – glucosidase có chất Thiosugars .15 Hình 1.7 Ảnh hưởng chất kìm hãm α-glucosidase đến trình trao đổi đường thể 16 Hình 1.8 Cơ chế kìm hãm α-glucosidase acarbose 17 Hình 1.9 Cấu trúc hóa học salacinol kotalanol tách chiết từ Salacia 21 Hình 1.10 Khuẩn lạc B subtilis mơi trường TSA (A) hình thái tế bào, bào tử kính hiển vi điện tử độ phóng đại 1000 lần (B) 27 Hình 2.1 Phương trình tạo màu đường khử DNS acid 34 Hình 3.1 Ảnh hưởng mơi trường dinh dưỡng thời gian lên men đến khả sinh tổng hợp hoạt tính kìm hãm α – glucosidase 41 Hình 3.2 Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường đến khả sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase 43