Nghiên ứu điều kiện lên men và táh hiết hoạt hất kìm hãm α gluosidase từ dịh đậu đen lên men bởi vi khuẩn baillus subtilis m1

Trang 1 B ỘGIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI H C BÁCH KHOA HÀ NỘI Ọ=======* & *====== DƯƠNG THỊ NGỌC QUỲNHNGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ TÁCH CHIẾT HO T ẠCHẤT KÌM HÃM – α GLUCOSIDASE TỪ Ị

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜ NG Đ Ạ I H C BÁCH KHOA HÀ NỘI Ọ

=======* & *======

DƯƠNG THỊ NG Ọ C QUỲ NH

NGHIÊN C Ứ U ĐI Ề U KIỆN LÊN MEN VÀ TÁCH CHI Ế T HO T Ạ CHẤT KÌM HÃM – α GLUCOSIDASE TỪ Ị D CH ĐẬ U ĐEN LÊN

MEN BỞI VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS M1

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THU T Ậ CÔNG NGHỆ SINH H C Ọ

Hà Nội - 2013

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜ NG Đ Ạ I H C BÁCH KHOA HÀ NỘI Ọ

=======* & *======

DƯƠNG THỊ NG Ọ C QUỲ NH

NGHIÊN C Ứ U ĐI Ề U KIỆ N LÊN MEN VÀ TÁCH CHI Ế T HOẠT CHẤT KÌM HÃM – α GLUCOSIDASE TỪ Ị D CH ĐẬU ĐEN LÊN

MEN BỞI VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS M1

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH H C Ọ

LUẬN VĂN TH C SĨ Ạ K Ỹ THUẬ T

HƯỚ NG D N KHOA H Ẫ Ọ C: PGS.TS LÊ THANH HÀ

Hà Nội – 2013

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi là Dương Thị Ngọc Quỳnh xin cam đoan nội dung trong luận văn này với

đề tài Nghiên cứ“ u đi ề u ki n ệ lên men và tách chi t ho t ch t kìm hãm – ế ạ ấ α glucosidase từ ị d ch đậu đen lên men bởi vi khu n Bacillus subtilis M1” là công ẩ

trình nghiên c u và sáng tứ ạo do chính tôi thực hiện dướ ựi s ớng dẫn của PGS.TS Lê hưThanh Hà Các số liệu, k t quả trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung th c và chưa ế ựcông bố trong bấ ứt c công trình khoa học nào khác

L I C Ờ ẢM ƠN

Để hoàn thành được luận văn này, ngoài sự ố ắ c g ng n l c c a b n thân, tôi ỗ ự ủ ả

đã nhận đượ ự ủc s ng hộ, giúp đỡ ậ t n tình c a thủ ầy cô giáo, gia đình và b n bè ạ

Tôi xin bày t lòng biỏ ết ơn sâu sắ ớc t i PGS.TS Lê Thanh Hà - Vi n Công ệngh sinh hệ ọc & Công nghệ ực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận thtình ch b o tôi trong su t quá trình th c hiỉ ả ố ự ện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo thu c Vi n Công nghộ ệ ệ sinh

học & Công nghệ ực phẩ th m – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong su t quá trình h c t p và th c hi n luố ọ ậ ự ệ ận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đã tạo điều ki n, quan tâm, ệ

động viên và góp ý cho tôi trong su t quá trình h c t p, nghiên c u và hoàn thành ố ọ ậ ứ

luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

H c viên ọ

Dương Th ị Ngọc Qu nh ỳ

MỤ C L C Ụ

Trang bìa ph ụ

Lời cam đoan

L i cờ ảm ơn

Mục lục

Danh m c các ký hiụ ệu, các chữ ế ắ vi t t t

Danh mục hình

Danh mục bảng

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về bệnh đái tháo đườ ng (ti u đường) ở ườ ể ng i 3

1.1.1 Giới thiệu về bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) 3

1.1.2 Phân loại bệnh đái tháo đường 3

1.1.3 Biến ch ng cứ ủa bệnh đái tháo đường 4

1.1.4 Phương pháp điề ịu tr bệnh đái tháo đường 5

1.1.5 Tình hình bệnh đái tháo đường trên thế giới và ở Việt Nam 7

1.2 Enzyme chuyển hóa - Alpha glucosidase (EC 3.2.1.20) 8

1.2.1 Giới thiệ ề α - glucosidase 8u v 1.2.2 Cấu trúc hóa học α – glucosidase 9

1.2.3 Tính chất của α-glucosidases 10

1.3 Chất kìm hãm alpha – glucosidase (alpha - glucosidase inhibitors – AGIs) 10

1.3.1 Giới thiệu về chất kìm hãm alpha – glucosidase 10

1.3.2 Phân loại các hoạt chất kìm hãm alpha – glucosidase 11

1.3.2.1 Nhóm Disaccharides 11

1.3.2.2 Nhóm Iminosugars 12

1.3.2.3 Carbasugars và pseudoaminosugars 14

1.3.2.4 Thiosugars 15

1.3.3 Cơ chế kìm hãm α – glucosidase của AGIs và tác dụng trong đi u tr đái tháo ề ị đường type 2 15

1.3.4 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng AGIs 18

1.3.4.1 Tình hình nghiên c u và ng d ứ ứ ụ ng AGIs trên thế ớ gi i 18

1.3.4.2 Tại Việt Nam 19

1.4 Nguồn thu nhận và công nghệ sả n xu t AGIs 20 ấ 1.4.1 S n xu t AGIs theo phả ấ ương pháp tổng hợp hóa học 20

1.4.2 S n xuả ất AGIs theo con đường t nhiên 20ự 1.4.2.1 S n xu ả ấ t AGIs từ độ ng v t ậ 20

1.4.2.1 S n xu ả ấ t AGIs từ thực vậ t 21 1.4.2.3 S n xu ả ấ t AGIs từ vi sinh v t ậ 24

1.5 S n xuả ất AGIs từ đậ u đen lên men bởi vi khuẩn Bacillus subtilis 25

1.5.1 Ngu n cồ ơ chất đ u đenậ 25

1.5.2 Ngu n ch ng vi khuồ ủ ẩn Bacillus subtillis 26

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Nguyên liệu 29

2.2 Môi trường 29

2.3 Hóa chất 30

2.4 Thiết bị 30

2.5 Phương pháp 31

2.5.1 Xác định mộ ốt s tính chất của nguyên liệu đ u đenậ 31

2.5.2 Lên men và khảo sát điều kiện lên men thích h p thu hoợ ạt chất kìm hãm α - glucosidase 33

2.5.3 Xác định hoạt tính kìm hãm α-amylase của dịch chiết sau lên men 33

2.5.4 Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase 35

2.5.5 Phương pháp xây dựng phương trình động học của quá trình lên men thu hoạt chất kìm hãm α – glucosidase 362.5.6 Thu hồi hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ ịch đậu đen lên men bằng chủng dBacillus subtilis M1 372.5.7 Kh ả o sát khả năng l ại màu dịch lên men bằ o ng than ho t tính ạ 382.5.8 Xác định giá trị IC50 382.5.9 Tính toán thống kê 382.5.10 Hiệu suất thu hồi 38

PHẦ N 3 K T QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 Ế 3.1 Khảo sát đặc tính công nghệ nguyên liệu đ u đen ậ 40 3.2 Nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp cho sinh tổng hợp hoạ t ch t ấ kìm hãm α – glucosidase bởi Bacillus subtilis M1 40

3.2.1 Nghiên c u môi trứ ường dinh dưỡng thích hợp 403.2.2 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng h p ho t ch t kìm hãm α – ợ ạ ấ

glucosidase 423.2.3 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến kh năng sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – ảglucosidase 433.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng tổng h p hoạt chất ợkìm hãm α –glucosidase 443.2.5 Nghiên c u thứ ời gian lên men thích hợp cho sinh t ng h p hoổ ợ ạt chất kìm hãm α – glucosidase 45

3.3 Độ ng h c quá trình sinh t ng h p ho ọ ổ ợ ạ t chất kìm hãm α – glucosidase và

mố i tương quan v i m t độ vi khuẩn Bacillus subtilis M1 trong quá trình ớ ậ lên men 46 3.4 Nghiên c ứ u đi ề u kiện thu hồ i và t ạ o chế ẩ ph m chứa hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ ịch lên men bởi vi khuẩn Bacillus subtilis M1 d 50

3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng c a quá trình kết tủa cồn đến hoạt tính kìm hãm α – ủ

glucosidase của dịch lên men 50

3.4.2 Khảo sát quá trình cô đặc dịch lên men chứa hoạt chất kìm hãm α - glucosidase

52

3.4.3 Khảo sát phương pháp s y tấ ạo sản phẩm dạng bột chứa hoạt chất kìm hãm α – glucosidase 55

3.5 Nghiên cứu khả năng kìm hãm α – amylase của chế phẩm chứa AGI 57 3.6 Khảo sát khả năng t y màu của than hoạt tính v i s n phẩ ớ ả ẩm lên men 58

3.7 Đề xuất qui trình lên men và tạo ch phẩm chứa hoạt chất kìm hãm α – glucosidase ế từ đậu đen lên men bởi vi khu n Bacillus subtilis ẩ M1 61

PHẦN 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

KẾT LUẬN 64

KIẾN NGHỊ 64

TÀI LI U THAM KH Ệ Ả O 66

IC50 (half maximal inhibitory concentration ) N50% ho t tính -glucosidase ồng độạchấ kìm hãmt α kìm hãm

WHO World Health Organization) ( T ổchức y t th gi i ế ế ớ

DANH M C HÌNH Ụ

Hình 1.1 T l phỷ ệ ần trăm bệnh nhân đái tháo đường trong độ ổ tu i 20 – 79 phân chia theo khu v c trên th i 7 ự ếgiớHình 1.2 Công thức cấ ạ ủa mộ ố ạu t o c t s ho t chất kìm hãm α – glucosidase có bản chất là disaccharide……… …12 Hình 1.3 Công thức cấ ạ ủa mộ ố hoạu t o c t s t chất kìm hãm α – glucosidase thu ộc

l p ớ Piperidines 13Hình 1.4 Công thức cấ ạ ủa mộ ố hoạu t o c t s t chất kìm hãm α – glucosidase có bản

chất là Iminosugars 14

Hình 1.5 Công thức cấ ạ ủa mộ ố hoạu t o c t s t chất kìm hãm α – glucosidase có bản chất là Carbasugars 15 Hình 1.6 Công thức cấ ạ ủa mộ ố hoạu t o c t s t chất kìm hãm α – glucosidase có bản chất là Thiosugars 15 Hình 1.7 Ảnh hưởng của chất kìm hãm α glucosidase đến quá trình trao đổi đườ- ng trong cơ thể 16

Hình 1.8 Cơ chế kìm hãm α glucosidase của acarbose- 17Hình 1.9 Cấu trúc hóa học của salacinol và kotalanol tách chiết từ cây Salacia 21 Hình 1.10 Khuẩn lạc B subtilis trên môi trường TSA (A) và hình thái t bào, bào ế

t ử dưới kính hiển vi điệ ử độn t phóng đại 1000 l n (B) 27 ầHình 2.1 Phương trình tạo màu giữa đường kh và DNS acid 34 ửHình 3.1 Ảnh hưởng của môi trư ng dinh dườ ỡng và thời gian lên men đến khả năng sinh tổng h p hoạợ t tính kìm hãm α – glucosidase 41 Hình 3.2 Ảnh hưởng c a pH ủ ban đầu của môi trường đế khả năng sinh tổn ng h p ợ

ho t t kìm hãm – glucosidase 43 ạ chấ α

Hình 3.3 Ảnh hưởng của tốc độ ắc đế l n kh ả năng sinh t ng h p hoổ ợ ạt chất kìm hãm

α – glucosidase 44 Hình 3.4 Ảnh hưởng c a thủ ời gian lên men đến kh ả năng sinh tổng h p ho t tính ợ ạkìm hãm – glucosidase cα ủa dịch lên men 46 Hình 3.5 Động h c quá trình sinh t ng h p ho t ch t kìm hãm – glucosidase 48ọ ổ ợ ạ ấ α Hình 3.6 Chế ẩ chứ ph m a AGI sau sấy đông khô 56Hình 3.7 Khả năng kìm hãm α – amylase tụy tạng l n cợ ủa chế phẩm chứa AGI 57 Hình 3 Ho8 ạt tính kìm hãm α – glucosidase trước và sau khi lọc than hoạt tính 59

Hình 3.9 Sản phẩm lên men trước và sau khi l c than ho t tính 60 ọ ạHình 3.10 Quy trình s n xu t ch ả ấ ếphẩm ho t ch t ạ ấ kìm hãm α-glucosidase t u ừ đậđen lên men bởi vi khu n ẩ Bacillus subtilis M1 61

Bảng 2.1 Thành phân dinh dưỡng các môi trường s d ng 29 ử ụ

B ng 2.2 Nghiên cả ứu các điều ki n lên men 33 ệ

B ng 3.1 Khả ảo sát đặc điểm nguyên liệu đậu đen 40

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nhiệ ột đ lên men đến khả năng sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm – glucosidase……… 45 α

B ng 3.3 S ả ự tương quan ữgi a mật độ vi khu n và ho t tính kìm hãm - glucosidase ẩ ạ α

B ng 3.4 ả Ảnh hưởng c a quá trình k t tủ ế ủa cồn đến hoạt tính kìm hãm α –

glucosidase của dịch lên men 51

B ng 3.5 ả Ảnh hưởng của kế ủa cồn đết t n IC50 và hi u su t thu h i DNJ…………52 ệ ấ ồ

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nhiệ ột đ đến hoạt tính kìm hãm của dịch lên men khi cô

M Ở ĐẦ U

Cùng với sự phát triển của nền kinh t , mế ức đô thị hóa nhanh c biđặ ệ ởt các nướ đang phát triểc n trên th gi i là nh ng ế ớ ữ thay đổ ề ố ối v l i s ng, ch ế độ dinh dưỡng,

ô nhiễm môi trường dẫn đến sự gia tăng nhanh chóng của các căn bệnh mang tính

xã h i Bên cộ ạnh các căn bệnh đang là mối đe dọa sức khỏe của nhân loại như bệnh tim mạch, ung thư thì đái tháo đường là m t trong nh ng bộ ữ ệnh hiểm nghèo v i tớ ỷ ệ l

t ửvong chiếm vị trí thứ ba chỉ sau hai căn bệnh kể trên Chính vì vậy T ổchức Y tế

Th giế ới đã khuyến cá đái tháo đường l ệnh đặc biệt nghiêm trọng đe dọ ếo à b a đ n

s c khứ ỏe v ựà s phát tri n kinh t t t c cáể ế ở ấ ả c quốc gia trên th gi i ế ớ

Theo th ng kê c a Hi p hố ủ ệ ội đái tháo đường quốc tế, năm 2010 có khoảng

285 triệu người mắc bệnh trong đó đái tháo đường type 2 chi m kho ng 85 ế ả - 95%

tổng số ệnh nhân đái tháo đường trên thế ới Ước tính đến năm 2030 con số đó b gităng lên 438 triệu người Vi t Nam là m t quệ ộ ốc gia đang phát triển và cũng là m t ộtrong nh ng ữ quốc gia t l có ỉ ệ gia tăng bệnh đái tháo đường nhanh nhất thế ớ gi i T ỷ

l dân s mệ ố ắc đái tháo đường hi n tệ ại tăng lên hơn 6% so v i ch ớ ỉcó 2,7% trong năm

2001 Theo T ng h i Y h c Vi t Nam d báo sổ ộ ọ ệ ự ẽ tcó 7 - 8 tri u bệừ ệ nh nhân đái tháo đường vào năm 2025, hơn 90% trong s thu c type 2 ố đó ộ

Bệnh đái tháo đường là bệnh mãn tính v i nhi u bi n ch ng nguy hiớ ề ế ứ ểm như

bệnh tim mạch vành, suy thận, tai biến mạch máu não, mù mắt, liệt dương, hoại thư… Vì vậy phòng và điều tr bị ệnh đái tháo đường là m t vộ ấn đề ứ b c thi t Ngày ếnay, y học đã tìm ra nhiề hướng điều u trị căn bệnh mãn tính này như tiêm insulin, dùng các lo i thu c nhóm ạ ố sulphonylureas, glinides, metformin, thiazolidinedione và

hoạt chất kìm hãm α glucosidase (AGIs) rên thị trường có một số dược phẩm có – Tbản chất là các hoạt chất kìm hãm -α glucosidase như acarbose, miglitol và voglibose được sử dụng rộng rãi 1-deoxynojirimycin (DNJ) là hoạt chất kìm hãm α– glucosidase có công thức cấu tạo tương tự miglitol

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu sản xuất AGIs nói chung và DNJ nói riêng từ nguồn đậu tương lên men Tuy nhiên, những nghiên cứu về tổng

hợp AGIs từ đậu đen vẫn còn hạn chế và là hướng đi mới ở Việt Nam Trong khi

đó, các chế phẩm có chất kìm hãm α – glucosidase dùng cho bệnh nhân đái tháo đường ở nước ta đều là nhập khẩu với giá thành cao

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên c ứ u đi ề u kiện lên men và tách chiế hoạ t t ch t ấ kìm hãm α – glucosidase t d ừ ị ch đậu đen lên men bở i vi khu ẩn Bacillus subtilis M1”

Đề tài th c hi n v i mự ệ ớ ục đích và nội dung sau:

-2 N i dung cộ ủa đềtài, các vấn đề ầ c n gi i quy t: ả ế

- Nghiên cứu điều kiện (ảnh hưởng của nhiệ ột đ , thời gian, các chất bổ sung) nâng cao sinh tổng hợp hoạt chấ kìm hãm αt -glucosidase khi lên men đậu đen bằng vi khu n ẩ Bacillus subtilis M1

- Nghiên cứu lựa chọn điều kiện tách chiết, thu hồi và tạo chế ẩm chứa h ạ chất ph o t kìm hãm -glucosidase t α ừ đậu đen len men bởi vi khu n ẩ Bacillus subtilis M1

PH N 1 Ầ TỔNG QUAN 1.1 T ổ ng quan về ệnh đái tháo đường (tiể b u đư ờ ng) ở ngườ i

1.1.1 Gi ớ i thiệu về ệnh đái tháo đườ (ĐTĐ) b ng

Theo Tổ chức Y tế Th gi i (WHO), “ế ớ Đái tháo đường là một hội ch ng có ứ

đặc tính bi u hi n b ng s ể ệ ằ ự tăng đường máu do h u qu c a vi c m t hoàn toàn ậ ả ủ ệ ấinsulin ho c là do ặ có liên quan đến s suy y u trong bài tiự ế ết ho c hoặ ạt động của insulin [2] "

Ở ệnh nhân ĐTĐ quá trình vậ b n chuy n glucose không hoể ạt động bình thường, t y t ng không ho c s n xu t thi u hụ ạ ặ ả ấ ế ụt insulin hay cơ thể không điều khi n ể

việc sử ụng insulin để đưa glu d cose vào t ế bào Do đó glucose tồ ạn t i trong máu làm chỉ ố đườ s ng huyết tăng cao hơn mức bình thường, khi đó dẫn đến bệnh ĐTĐ Khi đường huyết tăng cao vượt qua kh ả năng lọc cân b ng c a th n, k t qu ằ ủ ậ ế ả là đường s ẽtheo nước ti u ra ngoài ể

1.1.2 Phân lo ạ i bệnh đái tháo đường

Đái tháo đường type 1

Đái tháo đường type 1 chi m t l kho ng 5 - 10% t ng s b nh nhân ế ỷ ệ ả ổ ố ệ ĐTĐ

th giế ới Nguyên nhân do tế bào beta bị phá hủy, gây nên sự ếu hụt insulin tuyệ thi t đối cho cơ thể ồng độ (n insulin gi m th p ho c m t hoàn toàn) Theo m t s nghiên ả ấ ặ ấ ộ ố

cứu, các kháng nguyên bạch cầu người (HLA) chắc chắn có mối liên quan chặt chẽ

với sự phát triển của ĐTĐ type 1 [10] ĐTĐtype 1 phụ thuộc nhiều vào yếu tố gen

và thường được phát hiện trước 40 tu i Nhi u bổ ề ệnh nhân, đặc bi t là tr em và tr ệ ẻ ẻ

v thành niên biị ểu hiện nhiễm toan ceton là tri u chệ ứng đầu tiên của bệnh [23]

Đái tháo đường type 2

Đái tháo đường type 2 chi m t l kho ng 90 - 95% ế ỷ ệ ả ĐTĐ trên th gi i, ế ớthường g p ặ ở người trưởng thành trên 40 tuổi Đặc trưng củ ĐTĐa type 2 là kháng insulin đi kèm với thi u h t tiế ụ ết insulin tương đối Đặc điểm l n nh t trong sinh lý ớ ấ

c b nh ủa ệ ĐTĐ pe 2 là có sự tương tác giữa yếu tố gen và yếu tố môi trường trong ty

cơ chế ệnh sinh Ngườ b i m c b nh ắ ệ ĐTĐ type 2 có th u tr bể điề ị ằng cách thay đổi thói quen, k t h p dùng thuế ợ ốc để kiểm soát glucose máu, tuy nhiên n u quá trình ếnày th c hi n không t t thì bự ệ ố ệnh nhân cũng sẽ phải điều tr b ng cách dùng insulin ị ằ

Đái tháo đường thai nghén (ĐTĐTN)

Đái tháo đường thai nghén x y ra ph n ả ở ụ ữ có thai, có glucose máu tăng, gặp khi có thai lần đầu Sự ế ti n triển của ĐTĐTN sau sinh theo 3 khả năng: bị đái tháo đường, gi m dung nả ạp glucose và bình thường [4]

Ngoài ra còn m t sộ ố th hiể ếm g p khác lặ iên quan đến mộ ố ệt s b nh, s d ng ử ụthu c hoố ặc tiếp xúc v i hoá ch t ớ ấ

1.1.3 Bi ế n chứng của bệnh đái tháo đường

Biến chứng cấp tính

Biến chứng cấp tính thường là hậu quả ủa chẩn đoán muộn, nhiễm khuẩn c

cấp tính hoặc điều trị không thích hợ Trong đó hôn mê nhiễm toan ceton và hôn p

mê tăng áp lực th m th u là hai bi n ch ng nguy hi m Nhi m toan ceton là bi u ẩ ấ ế ứ ể ễ ể

hiện nặng của rối loạn chuyển hóa gluxit do thiếu insulin gây tăng glucose máu, tăng phân hủy lipid, tăng sinh thể ceton gây toan hóa t ch c v i t l t vong ổ ứ ớ ỷ ệ ử cao

t 5 - 10% ừ Hôn mê tăng áp lực thẩm thấu là tình trạng rối loạn chuyển hóa glucose

nặng, đường huyết tăng cao Hôn mê tăng áp lực thẩm thấu chiếm 5 - 10% b nh Ở ệnhân ĐTĐ type 2 nhi u tu i, t l t vong t 30 - 50% [ ] ề ổ ỷ ệ ử ừ 10

Biến chứng mạn tính

Biến chứng tim - m ch: cạ ác nghiên cứu cho thấy nồng độ glucose máu cao làm tăng nguy cơ mắc các b nh mệ ạch vành, xơ vữa động mạch, tăng huyết áp và các biến ch ng tim mứ ạch khác Ngườ ĐTĐi có b nh tim mệ ạch là 45%, nguy cơ mắc

b nh tim m ch gệ ạ ấp 2 - 4 l n so vầ ới người bình thường

Bi n ch ng th n: b nh th n do ế ứ ậ ệ ậ ĐTĐ kh i phát b ng ở ằ tăng protein niệu, sau đó khi chức năng thận gi m xu ng, ure và creatinin s ả ố ẽtích tụ trong máu B nh th n do ệ ậĐTĐ là nguyên nhân thường g p nh t gây suy thặ ấ ận giai đoạn cu i ố

Bệnh lý mắ : đục thủy tinh thể và bệnh lý võng mạc là những bệnh lý về ắt t m

do bi n ch ng cế ứ ủa bệnh ĐTĐ hay g p nhặ ất Trong đó đục thu tinh th là tỷ ể ổn thương thường gặp và tương quan với th i gian m c bờ ắ ệnh cũng như mức độ tăng đường huy t kéo dài B nh lý võng m c ế ệ ạ ĐTĐ bi u hi n nh bể ệ ẹ ằng tăng tính thấm mao mạch, ở giai đoạn muộn hơn bệnh ti n triế ển đế ắn t c mạch máu, tăng sinh mạch máu v i thành m ch y u d xu t huy t gây mù loà ớ ạ ế ễ ấ ế

Bệnh lý thần kinh: ến chứng thần kinh do ĐTĐ được chia thành các ội bi hchứng lớn như viêm đa dây th n kinh, bầ ệnh đơn dây thần kinh, b nh th n kinh th c ệ ầ ự

v t, b nh th n kinh vậ ệ ầ ận động g c chi ố

Bệnh lý bàn chân là ự ối hợp của tổn thương mạch máu, thần kinh ngoại : s ph

vi và cơ địa d nhi m khuễ ễ ẩn do glucose máu tăng cao Tỷ ệ ắ ụ l c t c t chân của người

b biị ến chứng bàn chân ĐTĐ ủa Việt Nam cũng khá cao, khoảng 40% tổng số cngười có b nh lý bàn chân ệ ĐTĐ [9]

1 1.4 Phương pháp điề u trị ệnh đái tháo đường b

Đái tháo đường là căn bệnh m n tính, vì vạ ậy quá trình điều tr c a ị ủ người

b nh nhệ ằm mục đích ổn định đường huyế ở ức bình thườ và hạn chế đến mức t m ng

thấp nhất các biến chứng Phương pháp điều trị ụ ph thuộc vào dạng thức bệnh mắc

ph i ả

Đái tháo đường type 1: ĐTĐtype 1 còn g i là ọ ĐTĐ ph thu c insulin, vì v y ụ ộ ậ

v i bớ ệnh nhân mắc bệ ĐTĐ type 1 thì việc tiêm insulin là ải pháp bắt buộ ểnh gi c đduy trì chỉ ố đườ s ng huyế ởt mức cho phép và hạn chế các bi n chứng đặc bi t là ế ệnhiễm cetone máu Việc áp dụng liều lượ ng insulin c n thi t ph thuầ ế ụ ộc vào tình

tr ng bạ ệnh cũng như chế độ dinh dưỡng và vân độ ng của mỗ ệi b nh nhân

Đái tháo đường type 2: quá trình điều tr c a b nh nhân ị ủ ệ ĐTĐ type 2 ch y u ủ ế

dựa vào các loại thuốc hạ đường huyết và kết hợp tiêm bổ sung insulin trong một sốtrường h p c n thiợ ầ ết như biến ch ng, ứ hôn mê hay th i k b nh n ng Hi n nay có 6 ờ ỳ ệ ặ ệnhóm thu giúp c i thi n quá trình chuy n hóa glucose cho bốc ả ệ ể ệnh nhân ĐTĐ type 2

g mồ : sulphonylureas, glinides, metformin, thiazolidinedione, ch t kìm hãm ấ

dipeptidyl peptidase IV và hoạt ch kìm hãmất – glucosidase α Việc lựa chọn sử

dụng thuốc có chứa loại hoạt chấ nào tùy thuộc vào bản chất của quá trình rối loạn t

hấp thu glucose theo hướng kháng insulin hay suy gi m bài ti t insulin ả ế

- Sulphonylureas: là hoạt chấ ực tiếp kích thích ết tr ti t insulin của các tế bào beta Sulphonylureas giúp giảm chỉ ố đường huyết s HbA1c t 1- và gi m s ừ 2% ả ự

tiến triển của các ế chứbi n ng vi mạch đế n 25% Tuy nhiên, việc sử ụ d ng sulphonylureas thường dẫn đến các tác dụng phụ như tăng cân và có thể gây ạ h đường huy t c bi t ế đặ ệ là ở người cao tu i, b nh nhân suy thổ ệ ận ho c bệnh gan Do ặ

v y sulphonylureas ậ thường được sử ụ ở các thế ệ d ng h thu c th 2 ho c th 3 [41] ố ứ ặ ứ

- Glinides: là mộ thế hệ mới của sulphonylurea có tác dụng kích thích tiết t insulin sớm giúp giảm tăng đường huyết sau bữa ăn do vậy được sử dụng đều đặn sau mỗi bữa ăn Glinides không gây ra các tác dụng phụ như sulphonylureas do vậy

nó được khuyến cáo sử dụng cho các bệnh nhân suy th n và b nh gan ậ ệ

- Thiazolidinediones: thiazolidinediones giúp cải thiện độ nhạy cảm của insulin bằng cách cải thiện hoạt động đáp ứng tế bào của chúng, tuy nhiên không tăng cư ng s n xu t insulin M t tác d ng ph ph bi n c a thiazolidinediones là ờ ả ấ ộ ụ ụ ổ ế ủgây tích lũy chất béo dư i da ớ

- Metformin: giống như thiazolidinediones, metformin giúp tăng hoạt tính cho insulin, có th làm giể ảm HbA1c hi u quả như ệ sulphonylureas và insulin mà không gây h ạ đường huyết hoặ tăng cân tuy nhiên thường xuyên gây ra tình trạng c

ph thuụ ộc liều dùng sau nhiều năm điề u tr [ ] ị 40

- Hoạt chất kìm hãm -glucosidase: hiện nay trên thị trường có một số dược α

phẩm có bản chất là các hoạt chất kìm hãm -glucosidase α như acarbose (U.S Pat

No 5643874), miglitol (U.S Pat No 4639436) và voglibose (U.S Pat No 6200958) Các hoạt chất này làm chậm lại quá trình hấp thụ carbohydrate từ ruột do

đó giúp chỉ số đường huyết ổn định cả lúc trước và sau ăn Một số tài liệu đã được chứng minh rằng hoạt chất kìm hãm -α glucosidase như acarbose có khả năng ngăn chặn hoặc trì hoãn sự tiến triển của tình trạng suy giảm dung nạp glucose (IGT) đến

bệnh ĐTĐ Đây là một hướ ng mới đang được chú ý nghiên c u và ng d ng kh ứ ứ ụ ảquan trong điều tr b nh ị ệ ĐTĐ

1.1.5 Tình hình b ệ nh đái tháo đường trên thế ớ gi i và Vi t Nam ở ệ

Trong những năm gần đây, tỷ ệ ĐTĐ l gia tăng mạnh m trên toàn c u, WHO ẽ ầ

đã lên tiếng báo động vấn đề nghiêm tr ng này trên toàn th gi i ọ ế ớ

Theo thống kê ủa Hiệp hội đái tháo đườ c ng quốc tế, năm 20 có10 kho ng ả

285 triệu người mắc bệ và 344 người suy giảm hấp thu glucose, trong đó bệnh nh ĐTĐ type 2 chi m kho ng 85 95 % tế ả - ổng s b nh nhân ố ệ ĐTĐ trên th giế ới Ước tính đến năm 2030 con số đó tăng lên 438 và 472 triệu người [55]

Theo đánh giá của hi p h i ệ ộ đái tháo đường qu c t , các nư c ố ế ớ đang phát tri n ể

có tỷ ệ ngườ l i mắc b nh ệ ĐTĐ cao hơn các nước phát triển và chưa phát triển Trong

đó, nơi có ố lượs ng b nh nhân ệ ĐTĐ cao nh t là khu v c ấ ự Đông Thái Bình Dương (26,9 %) và Đông Nam Á (20,6%), th p nh t là khu v c châu Phi (4,2%) [55] ấ ấ ự

Hình 1.1 T l ỷ ệ phần trăm bệnh nhân ĐTĐ trong độ tuổ i 20 – 79 phân

chia theo khu vự c trên th gi i ế ớ

0 5 10 15 20 25 30

4.2

9.3 20.6

Vi t Nam ệ là một quốc gia đang phát triể có ố ộn t c đ gia tăng bệnh ĐTĐnhanh nhất thế ớ gi i T l ỷ ệdân số ắ m c ĐTĐ ệ hi n tại tăng lên hơn 6% so với ch có ỉ2,7% trong năm 2001 Theo Tổng hộ Y học Việt Nam dự báo sẽ có ừi t 7 - 8 tri u ệngườ ị ệi b b nh ĐTĐ vào năm 2025, hơn 90% trong s thu c type 2 ố đó ộ

1.2 Enzyme chuyể n hóa - Alpha glucosidase (EC 3.2.1.20)

1.2.1 Gi ớ i thiệu về α - glucosidase

Alpha glucosidase (EC 3.2.1.20) là m t enzyme thộ ủy phân thuộc nhóm glucosidase (α β-, -, và α-1,3-glucosidase), có tác d ng chuyụ ển hóa các cơ chất là oligo hay polysaccharite thành glucose [ ] Alpha – 19 glucosidase thường được chia thành ba nhóm I, II và III d a trên nguự ồn cơ chất đặc hi u Nhóm I bao gệ ồm maltase

và isomaltase thủy phân các cơ chất đồng thể như maltooligosaccharides thành glucose chậm hơn so vớ các cơ chấ ị ể như các ạt chấ glucosides vòng thơm i t d th ho t điển hình là phenyl α – glucopyranoside hay p – nitrophenyl α – glucopyranoside Ngược l i, nhóm II th y phân m nh các hơp chạ ủ ạ ất maltooligosaccharides như maltose và isomaltose α – glucosidase thu c nhóm III, ngoài maltooligosaccharides ộcòn có th ểthủy phân α – glucan thành đường đơn [21]

Alpha glucosidase có thể thu nh n tậ ừ nhiều nguồn khác nhau, trong đó, enzym thuộc nhóm I thu được từ vi khuẩn, nấm men và m t sộ ố àlo i côn trùng, nhóm II t n m m c và nhóm III t thừ ấ ố ừ ực vật hoặc động v t [21] ậ

Các chế ẩ ph m α- glucosidase trên th ị trường có nhi u ngu n g c khác nhau ề ồ ốnhư: từ vi khu n (ẩ Bacillus stearothermophilus …), từ ấ n m men (Saccharomyces cerevisiae) hoang dại ho c tái t h p, t th c v t (g o, lúa m ch, kê …), t ru t non ặ ổ ợ ừ ự ậ ạ ạ ừ ộ

động v t (chu t, th , l n …) ậ ộ ỏ ợ

H GH13 ọ có nguồn gốc từ vi khuẩn, nấm men và côn trùng trong trình tự gen cùng

có b n ố trình tự tương đồ được coi là vùng bảo thủ ồm vùng 1, 2 ,3 và 4 mã hóa ng gcho các acid amin quan trọ tham gia vào quá trình xúc tác ả ứng ph n ng H GH31 ọthuộc về nhóm II và III với nguồn thu nhận từ ấm mốc, thực vật và động vậ n t Trong nhóm họ này không tìm th y sấ ự tương đồng trong c u trúc gen ấ của vùng xúc tác phản ứng Tuy nhiên theo nghiên c u c a Nakai và c ng sứ ủ ộ ự cho thấy có s khác ự

biệt trong sắp xếp các acid amin ở vùng C terminal của các enzyme thuộc nhóm –

II và III, điều đó quyết định đến cơ chất đặc hi u c a các enzyme [ệ ủ 19]

Hiện nay mới chỉ có ba cấu trúc hoàn chỉnh của α – Glucosidase được gửi

trên ngân hàng dữ ệ li u protein (PDB) Các cấu trúc đó là GH31 Mal từ Sulfolobus solfataricus với mã số 2g3m và 2g3n, GH4 Ag1A của Thermotoga maritime với mã

s ố 1lwj và 1lwh, GH97 Susb của Bacteroides thetaiomicron ới mã vpi 5482 và v – vpi – 2d73 [56]

1.2.3 Tính ch ấ t của α -glucosidases

Alpha glucosidase hoạt động ở pH tối ưu từ 4 - 4,5, là enzyme có khả năng phân cắt các liên kết ở ị v trí -1,4, -1,3 và -1,α α α 2 D-glycoside ở đầu không khử ủa ccác di-, oligo , polysaccharide và giải phóng ra D glucose có thể ấp thu trực tiế- - h p vào máu [ ] 27

Alpha glucosidase có tác d ng thụ ủy phân đường maltose, đường sucrose nhưng không thủy phân được tinh b t ộ

1.3 Ch t ấ kìm hãm alpha – glucosidase (alpha - glucosidase inhibitors – AGIs) 1.3.1 Gi ớ i thiệu về chấ kìm hãm t alpha – glucosidase

Chất kĩm hãm enzyme là chất làm giảm hoạ độ enzyme nhưng không bịt chuyển hóa bởi enzyme Các chất này có thể là những ion, các phân tử vô cơ và hữu

cơ [12]

Chất kìm hãm enzyme được chia thành hai loại là kìm hãm cạnh tranh và kìm hãm không cạnh tranh Các hoạt ch AGIs là các ho t ch kìm hãmất ạ ất c nh ạtranh Với bản chất là các disaccharides, pseudooligosaccharide, thiosugars, polyhydroxylated alkanoid, carbasugar, pseudoaminosugar,…[14]

AGIs là hoạt chất có thể thu nhậ ừn t nhi u con đường khác nhau như nguồn ề

thực vật, động vật hay nuôi c y vi sinh v t và bấ ậ ằng phương pháp tổng h p hóa h c ợ ọ

Năm 1970, người ta nh n ra r ng vi c s d ng các ch t kìm hãm – ậ ằ ệ ử ụ ấ αglucosidase có thể kiểm soát sự ấ h p th carbohydrat và hụ ỗ ợ điề tr u tr cho nhị ững người m c b nh ắ ệ ĐTĐ ộ m t cách hi u qu ệ ả

α-glucosidase

1.3.2 Phân lo ạ i các hoạ t ch t kìm hãm alpha – glucosidase ấ

Hiện nay có nhiều tiêu chí khác nhau để phân loại các ạt chấ kìm hãm αho t – glucosidase, tuy nhiên phân lo i d a vào công thạ ự ức cấ ạo được sử ụu t d ng nhiều hơn

cả Theo tiêu chí này các ạt chấ kìm hãm α glucosidase được chia ra làm bốn ho t – nhóm chính g m có: ồ disaccharides, minosugarsi , carbasugars và pseudoaminosugars,

cuối cùng là thiosugars

1.3.2.1 Nhóm Disaccharides

Kojibiose, nigerose và trehalose là nhưng hoạt chất có b n chất là ảdisaccharides Vi c nghiên c u và tách chiệ ứ ết được các hoạt chất này đã mở ra những

hư ng đi mớ ới trong s n xu t thu c ả ấ ố điều trị ệ b nh ĐTĐtype 2

Kojibiose: holà ạt chấ có chứa liên kế α 1, 2 t t - glycoside được tách chiết lần

đầu tiên vào năm 1953 ừ ị t d ch chi t có tên là ế koji, mộ ảt s n ph m c a quá trình lên ẩ ủmen g o b i ạ ở Aspergillus oryzae và là ho t ch t kìm hãm - glucosidase nhóm I ạ ấ α

Nigerose: là các sản phẩm thủy phân bằng acid của amylopectin, trong công

thức cấu tạo có liên kế α 1, 2 glycoside, có khả năng kìm hãm αt - - glucosidase nhóm II

Trehalose: là m t disaccharide ộ có chứa m t ộ liên kế αt - 1, 1 của hai phân tửglucose, trehalose được chiết xuất từ ạ ủ h t c a cây mướp đắng (Mormodica charantia) và nấm múa (Grifola frondosa) Trehalose còn được ứng dụng trong công nghệ ự th c phẩm và sản xuất m phỹ ẩm và gần đây đã được sử ụ trong điều d ng

tr ị loãng xương [14]

Hình 1.2 Công thức cấu tạ ủ o c a m t s ộ ố hoạ t ch t ấ kìm hãm α – glucosidase có

b ả n chấ t là disaccharide 1.3.2.2 Nhóm Iminosugars

Iminosugars là các polyhydroxylated alkaloid, trong đó các đơn phân là monosaccharide mà vòng pyranoza có một oxy được thay thế ởi nito do đó vẫn bthường g i là các ho t ch t “gi ọ ạ ấ ả đường”, C u trúc alkaloid polyhydroxylated ch a ít ấ ứ

nh t hai nhóm hydroxyl và m t nguyên t ấ ộ ử nitơ ị d vòng [ ] 36

Iminosugars thu nhận từ ự ậ th c v t hoặc vi sinh vật là nh ng hoữ ạt chấ có tiềm t năng to lớn trong y dược h c b i kh ọ ở ả năng kìm hãm glucosidase Iminosugars có

trọng lượng phân tử ấ và có khả năng kìm hãm α glucosidase bởi có cấu trúc th p –

và điện tích tương tự như oxacarbenium ion – m t s n ph m trung gian c a quá ộ ả ẩ ủtrình c t liên k t glycoside các nguắ ế ồn cơ chất cacbonhydrat b i glucosidase [14] ở

Dựa vào cấu trúc iminosugars được chia làm năm lớp sau: piperidines, pyrrolidines, indolizidines, pyrrolizidines và nortropanes

- Piperidines: Nojirimycin, 1-deoxynojirimycin, glycosylated deoxynojirimycin

và isofagomine là những hoạt chất được chú ý nghiên cứu và ứng dụng sản xuất thuốc điều tr bị ệnh ĐTĐ type 2 thuộc lớp piperidines

Nojirimycin: là các endocyclic u đầ tiên có cấu trúc tương tự glucose được phát hi n ệ vào năm 1966, là sản phẩm tạo thành trong quá trình sinh trưởng của các chủng Bacillus, Streptomyces, d ch chiết ị lá dâu tằ , được biết đế như ột chấm n m t kháng sinh và t kìm hãm -và -glucosidases [14] chấ α β

Kojibiose Nigerose Trehalose

1-deoxynojirimycin (DNJ): là hoạt chất có b n ch t iminosugar ả ấ đang được chú ý m nh mạ ẽ trong ngành y học, công ngh sinh h c và th c ph m b i các hoệ ọ ự ẩ ở ạt tính sinh h c mà nó mang l i D a vào khọ ạ ự ả năng kìm hãm , – α β glucosidase, mà

hoạt chấ này có tác dụng điều trị ự ất s m t cân đối của quá trình trao đổi chất có liên quan đến carbonhydrat như ĐTĐ, DNJ còn được biết đến với vai trò là ộ hoạ m t t chấ ềm năng trong việc điề ịt ti u tr các bệnh hiểm nghèo như ung thư, bệnh liên quan

đến virus (HIV, HBV ) [1]

Glycosylated deoxynojirimycin: là sản phẩm glycosyl hóa của 1deoxynojirimycin đã được th nghiử ệm lâm sàng trong điều tr ị tăng đường huy t sau ế

-ăn ở ệnh nhân đái ĐTĐ b [32]

Isofagomine: có hoạt tính kìm hãm (HTKH) -β glucosidases rất mạnh, gấp khoảng 440 ầ so với 1 l n - deoxynojirimycin, nhưng hoạt tính không cao với α-glucosidases [32]

Hình 1.3 Công th ứ c cấu tạ ủ o c a m t s ộ ố hoạ t ch t ấ kìm hãm α – glucosidase

- Pyrrolizidines: là các hoạt chấ ị vòng của hai vòng năm cạ có khả năng t d nhkìm hãm c -glucosidase và amyloglucosidase ả α

- Nortropanes: là mộ ớt l p ho t ch t t nhiên có b n chạ ấ ự ả ất là bicylic được bi t ế

đến v i HTKH – glucosidase mớ β ạnh hơn nhiều so v i – glucosidase ớ α

Hình 1.4 Công thức cấu tạ ủ o c a m t s ộ ố hoạ t ch t ấ kìm hãm α – glucosidase có

b ả n chấ t là Iminosugars 1.3.2.3 Carbasugars và pseudoaminosugars

Carbasugars là các ạho t ch t ấ trong đó nguyên tử oxy c a vòng pyranose ủ được thay thế ằ b ng carbon Trong đó pseudoaminosugars là nhóm hoạt chấ đượt c quan tâm chú ý v công thới ức cấ ạu t o có nguyên tử oxy của vòng pyranose được thay thế

b ng ằ cacbon, nguyên tử oxy trong liên kết glycoside được thay thế ằ nitơ ới b ng vcông thức tương ự t D - glucose

M t ộ trong những đại diệ quan trọng nhất củ ớp này là ạt chấn a l ho t acarbose

với khả năng kìm hãm α glucosidase trên phạm vi rộng từ – nhiều nguồn thu nhận khác nhau như vi khuẩn, n m m c và th c v t ấ ố ự ậ

Voglibose là một ví d cụ ủa lớp pseudoaminosugars đã được sử ụng để điều d

tr b nh ị ệ ĐTĐ ở Nhật Bả ừ năm 1994 Người ta thấy rằn t ng hoạt chất này có hoạt

lực mạnh hơn từ 20 n 30 l n so v i acarbose và ít tác d ng ph đế ầ ớ ụ ụ hơn [32]

Pyrrolidines Castanospermine Pyrrolizidines Nortropanes

Hình 1.5 Công thức cấu tạ ủ o c a m t s ộ ố hoạ t ch t ấ kìm hãm α – glucosidase có

b ả n chấ t là Carbasugars 1.3.2.4 Thiosugars

Thiosugars là một nhóm các ạt chất cacbonhydrate mà trong đó nguyên ho

t ử oxy trong vòng pyranoza được thay thế ở ộ nguyên tử lưu huỳnh Thio b i m t 5- D-xylopyranose là thiosugar u đầ tiên đượ tổ h p c ng ợ vào năm 1961 và 5-Thio-D-glucopyranose được tổng hợp vào năm 1962 với khả năng tăng cường tiết insuline 14] [

-Hình 1.6 Công thức cấu tạ ủ o c a m t s ộ ố hoạ t ch t ấ kìm hãm α – glucosidase có

Acarbose Voglibose

5-Thio-D-xylopyranose 5-Thio-D-glucopyranose

c a - glucosidase, maltose b thủ α ị ủy phân thành các monosaccharide tại ruột non Các nghiên c u trên thứ ế giới đã chứng minh rằng AGIs có th kìm hãm ể α – glucosidase nên ngăn cản sự ạo thành monosaccharide từ disaccharide làm cho quá ttrình tổng hợp insulin di n ra d ễ ễ dàng hơn [33 ].

Hình 1.7 Ả nh hư ở ng củ a ch t kìm hãm - ấ α glucosidase đến quá trình trao đổ i

đường trong cơ thể

AGIs có cấu trúc tương tự các sản phẩm trung gian của quá trình thủy phân tinh bột, bên cạnh đó các hoạt chất này còn có những liên kết đặc trưng khác biệt so với các oligosaccharride tự nhiên tạo ra bởi hệ enzyme đường ruột, chính nhờ những liên kết đó mà AGIs không bị thủy phân bởi hệ enzyme đường ruột Acarbose là một ví dụ với cấu trúc như một oligosaccharid, e có liên kết nitơ trong phân tử giúp acarbose không bị thủy phân đồng thời nó cũng tạo ái lực với α – glucosidase nên có tác dụng cạnh tranh vị trí tiếp xúc trung tâm hoạt động của α - glucosidase với oligosaccharide từ tinh bột Do vậy động học quá trình kìm hãm của AGIs với α – glucosidase là kìm hãm cạnh tranh [14, 17 ]

Hình 1.8 Cơ chế kìm hãm α glucosidase của - acarbose

Các kết quả nghiên cứu cho thấy, chất kìm hãm α-glucosidase có tác dụng gia tăng nồng độ peptit - 1 dạng glucagon (GLP-1) và peptit-2 dạng glucagon (GLP 2)- trong huyết tương GLP-1 và GLP-2 là các hormon được sinh ra từ tế bào Langerhans nội tiết nằm trong vùng ngoại biên của ruột non và ruột kết GLP-1 kích thích sự tiết insulin phụ thuộc glucose và sự sinh sôi tế bào beta GLP-2 cải thiện cấu trúc, chức năng của ruột non bằng cách tăng cường cấu trúc của lông nhung và tăng hoạt tính vận chuyển vào enzym GLP-2 làm giảm viêm ruột GLP-1 và GLP-2 được tạo ra khi có sự kích thích thần kinh, hormon hoặc các yếu tố dinh dưỡng Chất kìm hãm -α glucosidase tự nhiên có khả năng ngăn cản sự phá hủy carbonhydrat nên kéo dài thời gian có mặt của carbonhydrat trong ruột Do vậy một lượng lớn carbonhydrat sẽ đến vùng ngoại biên của ruột non và tương tác với tế bào Langerhans làm tăng sự tiết GLP-1 và GLP 2 Người -

ta cho rằng khi có mặt glucose ở ngoại biên ruột non, glucose sẽ bị lên men tạo các acid béo chuỗi ngắn kích thích sự sản xuất và tiết GLP-1 và GLP- oặc quá 2 htrình vận chuyển glucose phụ thuộc vào Na+ khi qua màng tế bào L sẽ kích thích

sự tiết GLP-1 và GLP-2 Nồng độ GLP 1 trong huyếttương tăng sẽ thúc đẩy quá trình kiểm soát glycemic và cản trở sự có mặt glucose trong máu [ ] 16

-1.3.4 Tình hình nghiên c u và ng d ứ ứ ụ ng AGIs

1 3.4.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng AGIs trên thế giới

Song song với sự ra tăng số bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ trên thế giới là mối quan tâm của các nhà khoa học cũng như các hãng dược phẩm đến việc nghiên cứu

và ứng dụng AGIs Có hai hướng nghiên cứu và ứng dụng AGIs, đó là tạo các sản phẩm dược phẩm tinh khiết sử dụng theo đường uống và thực phẩm chức năng có chứa AGIs

Acarbose được sản xuất đầu tiên từ những năm 1970, tuy nhiên đ n năm ế

1990 hãng Glucobay của Đức mớ ầ ầi l n đ u tiên đưa ra thị trường m t lo i thuộ ạ ốc có chứa acarbose được sử ụ d ng điều trị ĐTĐ type 2 Năm 1996, acarbose đã được

giới thi u trên thệ ị trường Mỹ ớ v tên là Precose [46] Hi n nay,i ệ các sản phẩm dược

phẩm chứa acarbose vẫn chi m thế ị ần l n trong các s n ph m thuph ớ ả ẩ ốc điều trị ĐTĐ type 2 ở trên thế giới và tại Việt Nam, i nhivớ ều tên thương m i như: ạGlucobay (Đức), Precose (Bắc Mỹ), Prandase (Canada), Dorobay (Việt Nam)

Nhật Bản và Trung Quốc là hai nước đi đầu trong sản xuất các sản phẩm

thực phẩm chức năng có tác dụng hỗ ợ điều trị ệ ĐTĐ type 2 Công ty Nippon tr b nh

của Nhật Bản – một công ty nổi tiếng chuyên cung cấp chất bổ sung cho sản xuất

thực phẩm chức năng đã sản xuất được AGIs từ đậu tương lên men [34] Tháng 6

năm 2008, ạho t ch t chi t t ấ ế ừ touchi đã được cấp phép lưu hành tại th ị trường Châu

Âu Đã có nhiều công trình nghiên c u v thu nh n AGIs ng d ng cho s n xu t ứ ề ậ ứ ụ ả ấ

thực phẩm chức năng từ các nguồn đậu tương, đậu đen lên men của các nhà khoa

học và tạo ra các sản phẩm như douchi, tochi 1-DNJ…[18, 35]

1.3 4.2 Tại Việt Nam

Hi n nay, Vi t Nam tệ t i ạ ệ ỷ ệ l người mắc bệnh ĐTĐ ngày càng tăng Tuy nhiên, việc sản xu t thuốấ c ch a lo i b nh này theo hư ng kìm hãm -glucosidase v n chưa ữ ạ ệ ớ α ẫ

có bất kỳ ả s n ph m nào [ẩ 11] Những loại thuốc hay th c phự ẩm chức năng có chứa AGIs trên thị trư ng Việt Nam đềờ u là các sản ph m nhẩ ập kh u hoàn toàn từ ớẩ nư c ngoài, được quảng cáo có khả năng chữa bệnh ĐTĐ với giá thành cao Các loại thuốc này là: Salfamid hạ đường huyết, Biguanide, nhóm Thiazolidinediones , viên giáp xác Tianshi, t o xoả ắn Tianshi, …

Trong những năm gần đây đã có mộ ốt s công trình nghiên c u và s n xuứ ả ất

thực phẩm chức năng cho người bệnh tiều đường như rau má hòa tan XOS có chứa xylooligosaccharides (XOS), chanh leo hòa tan-XOS, đường chức năng bổ sung protein giàu crom hữu cơ từ ấ n m men Saccharomyces cerevisiae có tác dụng phòng chống b nh ệ ĐTĐ type 2 cũng đã và đang được nghiên c u [8] ứ

-Trương Hương Lan và cộng s ự đã xác định được m t s nguyên li u có ho t ộ ố ệ ạtính sinh học từ đạ i mạch, v ng trừ ắng, mướp đắng sử ụ d ng cho sản xuấ ực phẩm t thchức năng có tác dụng là giảm hàm lượng đường trong máu

Nghiên c u công nghứ ệ ả s n xu t b t lá dâu tấ ộ ằm ứng d ng s n xu t trà dâu ụ ả ấ

uống liền, trà dâu túi lọc chứa 1 deoxynojirimicin (DNJ) là đề tài nghiên cứu của

-Đặng H ng Ánh và c ng s ồ ộ ự đã thu được nh ng k t qu nh t đ nh v tác d ng kìm ữ ế ả ấ ị ề ụhãm – α glucosidase của DNJ [ ] Hiện nay đã có nhiều đề tài nghiên cứ ản xuất 1 u sAGIs t ừcác loài vi sinh vật khác nhau trên môi trường đậu tương, tuy nhiên nghiên

cứu công nghệ lên men sản xuất AGIs từ đậu đen là một hướng đi mớ ần thiết có i, c

nh ng nghiên c u sâu và hoàn thi n ữ ứ ệ

1.4 Ngu ồ n thu nhậ n và công ngh s ệ ả n xuất AGIs

1.4.1 S ả n xuất AGIs theo phương pháp tổ ng h ợ p hóa họ c

Dựa vào cấu trúc của AGIs trong tự nhiên, các nhà khoa học đã nghiên cứu

và t ng hổ ợp thành công AGIs theo con đường hóa học từ nhiều năm nay

Năm 1986, dihydroacarbose đã đượ ổc t ng h p cho th y kh ợ ấ ả năng kìm hãm α– glucosidase tương tự acarbose v i ho t lớ ạ ực cao [34]

Năm 2005, Woo Duck Seo và cộng s ự đã tổng hợp được 20 ho t ch t có kh ạ ấ ảnăng kìm hãm – glucosidase d a vào c u trúc hóa h c c a Chalcones (AGIs t α ự ấ ọ ủ ừ

m t s loộ ố ại lá ăn được ở Hàn Qu c) ố

Voglibose là d n xuẫ ất chứa nito của valiolamine được tổng hợp để làm tăng

kh ả năng kìm hãm α glucosidase Chất này còn có khả năng kìm hãm maltase và – sucrase [ ].20

Ngoài ra m t sộ ố chất hóa học cũng được ghi nh n có khậ ả năng kìm hãm – αglucosidase như: sulfonamide, các dẫn xu t c a xanthone và deoxy salaccious Tuy ấ ủnhiên các hoạt chấ ổt t ng hợp theo con đường hóa học thường gây tác d ng phụ ụ như

rối loạn chức năng gan và các triệu chứng liên quan đến đau dạ dày, rối loạn tiêu hóa Vì vậy tổng hợp AGIs theo con đường tự nhiên được quan tâm nhiều hơn do tính an toàn cao, chi phí th p ấ

1.4.2 S ả n xuất AGIs theo con đường tự nhiên

1 4.2.1 Sản xuất AGIs từ động vật

Hiện nay sản xuấ AGIs từ động vật chưa thu nhậ được nhiều kết quảt n ngay

c ảtrên thế ới và ở ệt Nam Năm 2009 các nhà khoa học Việt Nam và Hàn Quốc gi Vi

đã thu nhận được AGIs t ừStichopus Japonicas (Hải Sâm) Quá trình nghiên c u s ứ ử

dụng hexan và methanol làm dung môi tách chiế Kết quả cho thấy khả năng kìm thãm – α glucosidase thu từ ấm men ủa ịch chiế ằng hexan ở ồng độ n c d t b n 10µg/ml

đạt cao nh t là 98% Trong khi n u chi t b ng methanol nấ ế ế ằ ồng độ 0,5mg/ml thì ho t ạ

lực kìm hãm đạt 68% Từ ịch chiết của hải sâm các nhà khoa học đã tìm ra được d

ba hoạt chấ AGIs (1, 2, 3) có khả năng kìm hãm αt – glucosidase củ aSaccharomyces cerevisiae i giá trvớ ị IC50 lần lượt là 1,22; 0,17; 0,36 µg/ml và α – glucosidase của Bacillus stearothemophilus với giá trị IC50 lần lượt là 2,49; 0,24; 0,21µg/ml Từ nh ng kếữ t qu trên tác giả ả đưa ra nhận định AGIs chi t xuế ất từ ả h i sâm có tiềm năng như thực phẩm chức năng và các ạt chấ này có thể được sửho t

dụng để ngăn ngừa bệ ĐTĐ do khả năng kìm hãm α glucosidase của chúng nh – tương đối cao [31]

Hình 1.9 Cấu trúc hóa học của salacinol và kotalanol tách chiết từ cây Salacia

Salacinol và kotalanol có được xếp vào nhóm thiosugars do có phân t ử lưu

huỳnh trong công thức cấu tạo, có khả năng kìm hãm maltase, sucrase và isomaltase

ở chu t v i giá tr ICộ ớ ị 50 lần lượt là 3,2; 0,84; 0,59µg/ml 47] [

Năm 2002, F.Ye và cộng s ự đã nghiên cứu tác d ng h ụ ạ đường huy t c a d ch ế ủ ịchi t thế ảo mộc Trung Quốc có tên là Ramulus mori (Sangzhi) với nước nóng theo t ỷ

l ệ 1:12 (w/v) trong 2h và được thử nghiệm trên chuột cùng so sánh với acarbose

[15] Khi chuột bị gây ĐTĐ ằng alloxan và đượ b c cho ống dịch chiết này kết quả u

là làm giảm lượng đường huyết sau ăn, ổn định lượng đường trong máu lúc đói Tuy nhiên ch t chi t này không gây ấ ế ảnh hưởng đến sự ấ h p th glucose trong ru t non ụ ộ

của những con chuột bình thường Kết quả này cũng tương tự như những thí nghi m v i acarbose ệ ớ

Gần đây Li và cộng sự đã công bố ịch chiết của hoa Punica granatum d (hoa

L u) có kh ự ả năng kìm hãm α – glucosidase cao v i giá tr ICớ ị 50 = 1,8µg/ml [ ] 29

Bên c nh vi c tìm ki m và thu nh n AGIs t các loài thạ ệ ế ậ ừ ực vật hoang d i, các ạnhà khoa học cũng đã tìm ra nhiều hoạt ch AGIs tất ừ nguồn th c ph m quen thuự ẩ ộc trong cuộc sống như các loại trà, hoa quả và các nguồn thực phẩm khác Theo công trình nghiên c u cứ ủa Matsui và cộng sự đã tách chiết và xác định HTKH α – glucosidase từ một số loại th c ph m K t qu cho th y ch t chiự ẩ ế ả ấ ấ ết từ trà xanh có HTKH – α glucosidase từ ấm men bánh mỳ và từ ột non n ru chu t ộ cao nhất với IC50

ng Năm 2007, Trương Tuyết Mai và cộng sự đã công bố năm loại cây thườđược s d ng trong dân gian ử ụ như một lo i trà u ng ạ ố ở nước ta có ch a ho t ch t ứ ạ ấAGIs Trong đó nước chi t t n v i có ho t tính cao nh t là 68,2% ế ừ ụ ố ạ ấ

B ả ng 1.3 Hoạt tính kìm hãm α glucosidase ủa một số loại trà dân gian – c

1 Cleistocalyx operculatus N V i ụ ố N hoa ụ 68,2 ± 3,4

2 Camelia sinensis Trà Xanh Lá 65,2 ± 2,3

5 Sophora japonica Hoa hòe Hoa 47,5 ± 3,4 Trong dân gian, lá dâu t m vằ ẫn được biết đến là m t lo i thuộ ạ ốc với nhiều công d ng chụ ữa bệnh khác nhau như tăng huyết áp, phát ban, đau mắt đỏ, mỡmáu…Một trong những alkaloid chiếm tỷ ệ cao nhất trong lá dâu tằm là 1 l -deoxynojirimycin (DNJ) DNJ kìm hãm hoạ ột đ ng của α glucosidase do vậy ngăn -

cản sự phân hủy tinh bột thành đường đơn làm quá trình giải phóng và hấp thụđường vào máu ch m nên gi m s ậ ả ự tăng nhanh đường trong máu sau ăn Bên cạnh

đó trong thành phần lá dâu t m còn ch a nhiằ ứ ều polyphenol mà điển hình là resveratrol Hoạt chấ này giúp làm tăng tính nhạy cảm của thụ ể insuline, do đó t th tăng vận chuyển đường vào t bàoế Như vậy ho t ch t trong d ch chi t t lá dâu t m ạ ấ ị ế ừ ằ

v kìm hãm s t ng h p m i vừa ự ổ ợ ớ ừa thúc đẩy hấp th ụ đường vào các t bào ế

Ngoài ra còn rất nhiều loài thực vật chứa AGIs đã được các nhà khoa học nghiên c u và công nhứ ận Hi n nay các sảệ n ph m ch a AGIs tẩ ứ ừ th c vậự t chủ ế y u dướ ại d ng th c ph m chự ẩ ức năng, do quá trình tách chiết thu nh n AGIs tinh khi t t ậ ế ừ

thực vật trên qui mô công nghiệp có chi phí cao và không đơn giản

1 4.2.3 Sản xuất AGIs từ vi sinh vật

Nghiên cứu sản xuất AGIs từ vi sinh vật đã và đang thu hút đượ ự chú ý c s

của các nhà khoa học và các nhà sản xuất bởi các ưu điểm sau: tính an toàn khi sử

d ng, hoụ ạt tính AGIs cao, ít có tác dụng phụ ới đối tượng sử ụ , dễ ản xuất trên v d ng squy mô công nghiệp v i ớ chi phí thấp Những nghiên cứu cũng như ứng d ng sụ ản

xuất AGIs chủ ếu thực hiện trên hai đối tượng vi sinh vật là nấm mốc và vi khuẩ y n trong đó ậ t p trung ch y u m t s loài sau: Aspergillus oryzae, Streptomyces, ủ ế ở ộ ốActinoplanes, Penicillium và Bacillus subtilis

Các sản ph m touchi lên men t ẩ ừ đậu tương ởb i Aspergillus oryzae, Actinoplanes Mucor, và Rhizopus đã được chứng minh có ạt chấho t AGIs [46] Theo Jingchen và c ng sộ ự ả s n xu t touchi tấ ừ đậu tương lên men bởi Aspergillus oryzae, Actinoplanes elegans hoặc Rhizopus arrhizus, sau giai đoạ sơ cấn p HTKH α– glucosidase tăng lên nhanh chóng so với đậu tương ban đầu và còn tiếp tục tăng lên ở giai đoạn lên men thứ ấp Tác giả cũng đưa ra kết luận rằ c ng HTKH – αglucosidase của touchi được lên men bở Aspergillus oryzae cao hơn nhiều so với i

s n ph m lên men cả ẩ ủa Actinoplanes elegans và Rhizopus arrhizus

Năm 2002, Kwon và cộng s ự đã công bố CKD-711 và CKD 711a là AGIs

-mới thu được từ ịch lên men của Streptomyces sp CK 4416 d HTKH của hai ạt hochấ này đã đượt c so sánh v i acarbose, k t qu cho th y kh ớ ế ả ấ ả năng kìm hãm maltase

và sucrase c a CKD ủ – 711 tương đương với acarbose, với amylase kém hơn acarbose 2 l n Khầ ả năng kìm hãm các enzyme kể trên c a CKDủ -711a kém hơn CKD-711 [27]

Acarbose (pseudotetrasaccharide được tách chi t t d ch lên men loài ế ừ ịActinoplanes SE50) là chất AGIs được tìm ra đầu tiên trên th gi i v i giá tr ICế ớ ớ ị 50 = 0.5µM [ ] Nó là ch37 ất bột mầu tr ng, có tác d ng kìm hãm c nh tranh ắ ụ ạ α-glucosidase ở niêm mạc ruột, làm chậm quá trình thủy phân các di , oligo , poly- - -saccharide thành monosaccharide là d ng có thạ ể ấ h p thụ được Acarbose không làm

tăng tiết insulin, không gây giảm glucose trong máu lúc đói khi dùng trị ệ ở li u người

Năm 2000, các nhà khoa học Hàn Quốc đã phát hiện ra cyclo L-Leu), một AGIs từ ịch chiế Penicillium sp F70614 có khả năng kìm hãm α d t -glucosidase của nấm men và t ru t non l n v i các giá trừ ộ ợ ớ ị IC50 là 30 và 50µg/ml [25]

(Dehydroala-T ừ năm 1984, Stein và cộng sự đã tìm ra hoạt chất 1-deoxynojirimycin từ

sản phẩm lên men của chủ Bacillus subtilis DSM 704 [ ] Những năm gần đây ng 39các nhà khoa h c Trung Quọ ốc đã nuôi cấy chủng Bacillus subtilis B2 t các nguừ ồn

cơ chất khác nhau và thu nhận được DNJ có ho t tính cao nhạ ất trong môi trường có 4,5% đậu tương nghiền Sau quá trình tinh s ch ạ đã tính được giá tr ICị 50 là 0,2µg/ml Bằng phương pháp khối ph các nhà khoa hổ ọc đã xác định chính xác công thức cấ ạu t o của DNJ thu đượ ừ ịc t d ch lên men đ u tương bởi Bacillus subtilis ậB2 [48, 50]

1.5 S ả n xuấ t AGIs t ừ đậu đen lên men bở i vi khu n ẩ Bacillus subtilis

1.5.1 Ngu ồn cơ chất đậu đen

Đậu đen có tên khoa học là Vigna cylindrica Skeels hay là Vigna unguiculata theo phân loại khoa học đậu đen thuộc: Bộ (ordo): Fabales, họ (familia): Fabaceae, chi (genus): Vigna, loài (species): V.unguiculata [58]

Đậu đen là loài cây họ đậu mọc hằng năm, toàn thân không lông Lá kép gồm 3 lá chét mọc so le, lá chét giữa to và dài hơn lá chét hai bên Hoa màu tím nhạt Quả giáp dài, tròn, trong chứa 7 đến 10 hạt màu đen Đậu đen được trồng rất nhiều tại vùng nhiệt đới như Châu Á, Nam Mỹ như Việt Nam, Trung Quốc, Brazil Đậu đen không chỉ được dùng trong chế biến các loại thực phẩm như nước tương, tương khô và bột đậu mà còn dùng như một loại dược liệu

So với đậu tương, đậu đen có thành phần dinh dưỡng cao, trong h t đạ ậu đen

có chứa hàm lượng protein: 21-24% , lipid: 1,7 – 2,5 %, glucid: 46 - 53%, tro 1, 3 -

2,8% [42] Ngoài ra trong thành phần của đậu đen cũng chứa nhiều nguyên tốkhoáng và vitamin cần thiết như canxi, photpho, s t, ắ vitamin B1, B2, và vitamin PP

C Hàm lượng các axit amin không thay th ế có trong đậu đen cũng khá cao Trong 100g đậu đen có 0,97g lysin, 0,31g metionin, 0,31g triptophan, 1,16g phenylanin, 1,09g alanin, 0,97g valin, 1,26g leuxin, 1,11g isoleusin, 1,72g acginin và 0,75g histidin [ ] 59

Bên c nh các giá trạ ị ề dinh dưỡng, đậu đen còn chứ v a nhi u thành ph n có ề ầ

hoạt tính sinh học hữu ích ới hàm lượng chất xơ hòa tan cao, đậu đen là ực V th

phẩm rất có ích cho quá trình chuyển hóa glucose ở ệnh nhân mắc bệ ĐTĐ Qua b nh nghiên c u các nhà khoa h c phát hi n th y, chứ ọ ệ ấ ất xơ hòa tan có khả năng hấp thụnước trong d ạ dày và hình thành i gel làm gi m quá trình chuy n hóa loạ ả ểcarbohydrate có trong đậu đen do v y không xu t hi n tình trậ ấ ệ ạng tăng đường huy t ếsau khi ăn ự S có m t c a chặ ủ ất xơ còn làm giảm cholesterol, nó liên k t v i acid m t ế ớ ậ

- thành phần làm tăng cholesterol Do không đượ c cơ thể hấp thụ nên khi đào thải

ra ngoài, chất xơ mang theo cả acid m t và k t quậ ế ả hàm lượng cholesterol của cơ

th giể ảm theo Ngoài ra, do có chứa các chất xơ không hòa tan nên đậu đen có tác

d ng gi m thiụ ả ểu nguy cơ mắc bệnh táo bón, r i loố ạn tiêu hóa và các chứng b nh ệ khó chịu có liên quan

Hi n nay trên th ệ ị trường có một số ự th c phẩm chức năng có chứa AGIs là sản

phẩm lên men trên cơ chấ đậu đen bởi nấm mốc Aspergillus oryzae đã được công t

nhận có tác dụng kiểm soát đường huyết, đó là các sản phẩm lên men truyền thống

c a Nh t B n v i tên g i là Touchi và Trung Quủ ậ ả ớ ọ ốc có tên gọi Douchi

1.5.2 Ngu ồn chủng vi khuẩn Bacillus subtillis

Bacillus subtilis được tìm th y lấ ần đầu tiên vào năm 1941 bởi T ổchức y học Nazi của Đức Ban đầu nó được sử ụng để điề ị các chứ d u tr ng b nh viêm ru t, viêm ệ ộ

đại tràng, ch ng tiêu ch y do r i lo n tiêu hoố ả ố ạ á Ngày nay, vi khuẩn Bacillus subtilisđược biết đến là vi khu n b t bu c ẩ ắ ộ ở đường ru t và ng d ng nhi u trong s n xu t ộ ứ ụ ề ả ấchế ẩ ph m probiotic trong y h c, th c phọ ự ẩm, chăn nuôi,

Theo khoá phân loại của Bergey, vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc bộ: Eubacteriales, h : ọ Bacillaceae, gi ng: ố Bacillus, loài: Bacillus subtilis

Bacillus subtilis là trực khuẩn ngắn, hai đầu tròn, Gram (+), kích thước 0,5 - 0,8 µm x 1,8 – 3 µm, đứng thành chu i ngỗ ắn hoặc đơn lẻ, có khả năng di động nhờlông roi Có khả năng sinh nội bào tử ằ n m giữa tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 µmBào t là m t hình th c ti m sinh c a vi khu n, giúp cho vi khuử ộ ứ ề ủ ẩ ẩn vượt qua những điều ki n b t lệ ấ ợi như: môi trường nghèo dinh dưỡng, nhiệt độ, pH không thích h p, ợmôi trường tích lu nhi u s n phỹ ề ả ẩm trao đổi ch t b t l i… M i vi khu n ch t o ấ ấ ợ ỗ ẩ ỉ ạđược m t bào t Khi gộ ử ặp điều ki n thu n l i, bào t s n y mệ ậ ợ ử ẽ ả ầm để ở ề ạ tr v d ng t ếbào sinh dưỡng

Hình 1.10 Khu ẩn lạc B subtilis trên môi trường TSA (A) và hình thái t bào, ế

bào t ử dướ i kính hiển vi điện tử độ phóng đạ i 1000 l n (B) ầ

Bacillus subtilis phát triển trong điều kiện hiếu khí không bắt buộc, nhiệt độtối ưu 37oC, thích h p nh t v i pH = 7,0 ợ ấ ớ – 7,4 Trên môi trường thạch đĩa TSA (Tryptic Soy Agar) tạo khuẩn lạc có dạng hình tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm

sẩm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính 3 5mm Sau 1 4 ngày ề- - b

mặt nhăn Trong môi trườ TSB (Tryptic Soy Broth) Bacillus subtilis phát triển ng làm đục môi trường, t o màng ạ nhăn, lắng c n k t lặ ế ại như vẩn mây ở đáy, khó tan

đều khi l c lên ắ Trong quá trình sinh trưởng Bacillus subtilis cần ngu n dồ inh dưỡng

có ch a ứ các nguyên t C, H, O, N và các nguyên t ố ố khoáng, vi lượng

Bacillus subtilis có khả năng sinh các enzyme ngoại bào như amylase, protease, cellulase, pectinase… trên các nguồn cơ chất tương ứng Ngoài ra chúng còn có tính đối kháng v i các loài vi khuớ ẩn khác trong cùng môi trường s ng do có ố

kh ả năng tiết ra ngoài môi trường xung quanh các ạt chấ kháng sinh như subtilin ho t

và bacitracin Đa số ch ng ủ Bacillus subtilis không gây b nh và ệ được s d ng ph ử ụ ổ

bi n trong t o ch ế ạ ếphẩm probiotic trong y học và chăn nuôi [44]

Phầ ớn l n chúng t n tại ở trong đất, thông thường đấ ồồ t tr ng tr t ch a kho ng ọ ứ ả

10 - 100 tri u CFU/g [44] ệ

Bacillus subtiliscó một lịch sử lâu đời trong ng d ng s n xuứ ụ ả ất các sản phẩm lên men truy n thề ống tạ ộ ố nưới m t s c Châu Á: Nhậ ảt B n, Hàn Qu c, Trung Quố ốc, Thái Lan và Vi t Nam vệ ới các sản phẩm nổ ếng như Natto, ChungKooKjang, i titương bần T u th k ừ đầ ế ỷ XX đến nay, Bacillus subtilisđã được s d ng làm ngu n ử ụ ồ

giống cho sản xuất enzyme ngoại bào và được tổ chức JECFA FAO/WHO 1987 chấp nh n cho phép ng d ng trong th c ph m ậ ứ ụ ự ẩ