luận văn thạc sĩ nghiên cứu điều kiện nuôi trồng và đánh giá hoạt tính sinh học của nấm cordyceps cicadae phân lập tại việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Dƣơng Nghĩa Bình NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NI TRỒNG VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM Cordyceps cicadaePHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 z ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Dƣơng Nghĩa Bình NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NI TRỒNG VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM Cordyceps cicadaePHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Lê Hồng Điệp Hà Nội, 2017 z LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn thạc sĩ mình, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Lê Hồng Điệp, Trƣởng môn Sinh lý thực vật Hoá sinh, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - ngƣời tận tình hƣớng dẫn, dạy cho em suốt trình học tập nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn tồn thể thầy giáo mơn Sinh lý thực vật Hoá sinh, Khoa Sinh học - Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên nhiệt tình bảo, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ nhƣ tạo điền kiện thuận lợi cho em suốt trình học tập Em xin gửi lời cảm ơn tới Thầy thuốc nhân dân TS.BS Nguyễn Đình Dũng - Giám đốc Bệnh viện Dệt May, tập thể cán Khoa Sinh hóa Bệnh viện Dệt May, NCS Vũ Xuân Tạo - Trung tâm Nghiên cứu Chuyển giao Công nghệ Sinh học (CBRTT) Phịng Genomic, Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym Protein hỗ trợ em trình thực nghiên cứu Cuối em xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè động viên, khuyến khích em suốt trình học tập thực luận văn Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2017 Dƣơng Nghĩa Bình z MỤC LỤC MỞ ĐẦU .2 Chƣơng TỔNG QUAN 13 1.1 Tổng quan chi nấm ký sinh côn trùng Cordyceps 13 1.1.1 Lịch sử phát nấm Cordyceps .13 1.1.2 Phân bố nấm Cordyceps .14 1.1.3 Đặc điểm xâm nhiễm nấm ký sinh côn trùng 14 1.1.4 Hoạt tính sinh học nấm Cordyceps .16 1.2 Giới thiệu chung nấm C cicadae 18 1.2.1 Đặc điểm sinh học phân bố nấm C cicadae 18 1.2.2 Thành phần hoạt chất nấm C cicadae .20 1.2.3 Hoạt tính sinh học nấm C cicadae .23 1.3 Sơ lƣợc tình hình nghiên cứu ni trồng nấm Cordyceps 25 1.3.1 Tình hình nghiên cứu nuôi trồng nấm Cordyceps giới 25 1.3.2 Tình hình nghiên cứu ni trồng nấm Cordyceps Việt Nam 27 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 31 2.1 Vật liệu nghiên cứu 31 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 31 2.1.2 Hóa chất thiết bị .31 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 34 2.2.1 Phân lập nấm C.cicadae 34 2.2.2 Phƣơng pháp định danh nấm .34 z 2.2.2.1 Chuẩn bị dịch bào tử nấm 34 2.2.2.2 Xác định hình thái nấm dƣới kính hiển vi 34 2.2.2.3 Định danh nấm giải trình tự vùng ITS 35 2.2.3 Xác định ảnh hƣởng số yếu tố trình nuôi trồng thể nấm C.cicadae .37 2.2.3.1 Ảnh hƣởng số yếu tố giai đoạn nhân giống 37 2.2.3.2 Ảnh hƣởng số yếu tố giai đoạn ƣơm sợi .38 2.2.3.3 Ảnh hƣởng số yếu tố tới hình thành sinh trƣởng thể nấm C.cicadae .39 2.2.4 Xác định số hoạt chất quan trọng thể nấm C.cicadae 40 2.2.5 Nghiên cứu tác động dịch chiết thể nấm lên chuột thí nghiệm .40 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 Phân lập định danh nấm C.cicadae .42 3.1.1 Phân lập chủng nấm C.cicadae 42 3.1.2 Định danh chủng Cordycepssp.bằng giải trình tự vùng ITS .43 3.2 Ảnh hƣởng số yếu tố nuôi trồng thể nấm C.cicadae BG01 45 3.2.1 Ảnh hƣởng số yếu tố giai đoạn nhân giống 45 3.2.1.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên sinh trƣởng hệ sợi nấm 45 3.2.1.2 Ảnh hƣởng chế độ lắc tạo giống dịch thể 46 3.2.2 Ảnh hƣởng số yếu tố giai đoạn ƣơm sợi 47 3.2.2.1 Ảnh hƣởng thành phần dinh dƣỡng lên sinh trƣởng hệ sợi nấm 47 3.2.2.2 Ảnh hƣởng nồng độ bào tử dịch giống lên sinh trƣởng hệ sợi nấm 48 z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.nam 3.2.2.3 Ảnh hƣởng lƣợng giống cấy lên sinh trƣởng hệ sợi nấm 49 3.2.3 Ảnh hƣởng số yếu tố tới hình thành sinh trƣởng thể nấm 51 3.2.3.1 Ảnh hƣởng thành phần dinh dƣỡng mơi trƣờng tới hình thành sinh trƣởng thể nấm 51 3.2.3.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới hình thành sinh trƣởng thể nấm 52 3.2.3.3 Ảnh hƣởng độ ẩm tới hình thành sinh trƣởng thể nấm 54 3.2.3.4 Ảnh hƣởng cƣờng độ chiếu sáng tới hình thành sinh trƣởng thể nấm 55 3.3 Hàm lƣợng số hoạt chất quan trọng thể nấm 57 3.4 Ảnh hƣởng dịch chiết thể nấm lên chuột nhắt trắng Swiss 59 3.4.1 Ảnh hƣởng dịch chiết thể nấm lên sức sống tăng trọng chuột 59 3.4.2 Ảnh hƣởng dịch chiết thể nấm lên thể lực chuột 61 3.4.4 Kết giải phẫu chuột nhắt trắng Swiss sau tuần thí nghiệm .62 3.4.5 Ảnh hƣởng dịch chiết thể nấm lên số sinh hóa máu chuột 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 69 luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.nam z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.nam DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT C cicadae : Cordyceps cicadae C jiangxiensis : Cordyceps jiangxiensis C militaris : Cordyceps militaris C nutans : Cordycepsnutans C sinensis : Cordyceps sinensis C oxycephala : Cordyceps oxycephala C takaomontana : Cordyceps takaomontana GOT : Enzyme glutamic oxaloacetic transaminase GPT : Enzyme glutamate-pyruvate transaminase ITS : Internal transcribed spacer ISP-1 : Myriocin HEA : N6- (2-hydroxyethyl) adenosine HCT : Hematocrit HGB : Hemoglobin HPLC : High performance liquid chromatography (sắc ký lỏng hiệu cao) PDA : Potato dextrose agar PDB : Potato dextrose broth PLT : Tiểu cầu RBC : Hồng cầu WBC : Bạch cầu luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.nam z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.nam DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1.Các hóa chất dùng cho nghiên cứu 21 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 3.1 Một số số sinh hóa máu chuột thí nghiệm 54 Bảng 3.2 Một số số sinh hóa gan thận chuột thí nghiệm 54 luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.nam z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.nam DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Nấm C sinensis tự nhiên Tây Tạng - Trung Quốc Hình 1.2 Nấm C cicadae Hình 1.3 Nấm C militaris nuôi trồng nhân tạo Trung Quốc 17 Hình 1.4 Nấm C militaris hình thành phát triển thể nuôi trồng 18 nhân tạo Việt Nam Hình 1.5 Nấm C nutans Isaria tenuipes nuôi cấy Viện Khoa học Lâm 20 nghiệp Việt Nam Hình 3.1 Hình thái chủng nấm nghiên cứu 32 Hình 3.2 Phân loại chủng nấm C.cicadae BG01 34 Hình 3.3 Sinh trƣởng hệ sợi nấm C cicadaeBG01 điều kiện nhiệt 36 độ Hình 3.4 Nồng độ bào tử nấm C cicadaeBG01 ở chế độ lắc 37 Hình 3.5 Thời gian hệ sợi nấm C cicadaeBG01 lan kín mơi trƣờng 38 Hình 3.6 Thời gian hệ sợi nấm C cicadaeBG01 lan kín môi trƣờng với 39 lƣợng giống cấy khác Hình 3.7 Thời gian hệ sợi nấm C cicadaeBG01 lan kín mơi trƣờng với 40 nồng độ bào tử dịch giống cấy khác Hình 3.8 Sự ảnh hƣởng thành phần dinh dƣỡng mơi trƣờng lên hình 42 thành phát triển thể nấm C cicadae BG01 Hình 3.9 Sự ảnh hƣởng nhiệt độ lên hình thành phát triển thể nấm 43 C cicadaeBG01 Hình 3.10 Sự ảnh hƣởng độ ẩm lên hình thành phát triển thể nấm 45 C cicadaeBG01 Hình 3.11 Sự ảnh hƣởng cƣờng độ chiếu sáng lên hình thành phát triển 46 luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.nam z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.nam thể nấm C cicadaeBG01 Hình 3.12 Quả thể nấm C cicadaeBG01 hình thành phát triển điều kiện 47 thích hợp Hình 3.13 Hàm lƣợng adenosine cordycepin thể nấm C cicadae 48 BG01và chất sau 50 ngày ni trồng Hình 3.14 Ảnh hƣởng thời gian thu hoạch tới hàm lƣợng adenosine 48 cordycepin thể nấm C cicadaeBG01 Hình 3.15 Sức sống chuột sau tuần thí nghiệm 50 Hình 3.16 Chuột lơ thí nghiệm 50 Hình 3.17 Sự tăng trọng chuột sau tuần thí nghiệm 51 Hình 3.18 Thời gian bơi chuột sau tuần thínghiệm 52 Hình 3.19 Hình ảnh giải phẫu chuột nhóm thí nghiệm 53 10 luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.trong.va.danh.gia.hoat.tinh.sinh.hoc.cua.nam.cordyceps.cicadae.phan.lap.tai.viet.nam z