luận văn thạc sĩ nghiên cứu điều kiện lên men và phương pháp tách chiết chất kháng nấm gây bệnh thực vật từ vi khuẩn bacillus amyloliquefaciens cp16 04

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN PHƢƠNG LIÊN NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT TỪ VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens CP16.04 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2016 z ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN PHƢƠNG LIÊN NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT TỪ VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens CP16.04 Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRỊNH THÀNH TRUNG TS TRẦN THỊ THANH HUYỀN Hà Nội – 2016 z LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn cao học này, tơi xin chân thành cảm ơn TS Trịnh Thành Trung TS Trần Thị Thanh Huyền động viên, hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ suốt q trính học tập Tơi xin chân thành cảm ơn cán bộ, anh chị làm việc Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội giúp đỡ q trình hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học nói riêng Khoa Sinh học nói chung dạy dỗ tơi q trình học tập Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ, hỗ trợ để tơi hồn thành luận văn Hà Nội, tháng 05 năm 2016 Học viên Nguyễn Phương Liên z MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU 1 Chƣơng - TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Bacillus 1.1.1 Giới thiệu chung chi vi khuẩn Bacillus 1.1.2 Hệ thống phân loại chi vi khuẩn Bacillus .4 1.1.3 Hệ thống phân loại Bacillus đại 1.1.4 Phương pháp phân lập phân loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus 1.2 Chất kháng sinh từ vi khuẩn Bacillus 12 1.2.1 Lipopeptide mạch vòng mang điện tích dương 13 1.2.2 Lipopeptide mạch vịng khơng mang điện tích dương 15 1.2.3 Lipopeptide mạch thẳng mang điện tích dương 17 1.3 Ứng dụng vi khuẩn Bacillus 18 1.4 Mục đích nghiên cứu 19 Chƣơng - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu .20 2.1.1 Chủng vi sinh vật 20 2.1.2 Môi trường nghiên cứu 20 i z 2.2 Phương pháp nghiên cứu .22 2.2.1 Xác định khả sinh chất kháng nấm chất kháng khuẩn 22 2.2.2 Xác định khả sinh enzyme ngoại bào 22 2.2.3 Xác định khả phân giải phosphate khó tan 23 2.2.4 Xác định khả sinh chất kích thích sinh trưởng IAA 23 2.2.5 Dấu vân tay rep-PCR phân tích tính tương đồng kiểu gen 23 2.2.6 Phân tích trình tự đa gen xây dựng phát sinh chủng loại 24 2.2.7 Tách chiết chất kháng nấm kháng khuẩn 24 2.2.8 Tinh chất kháng nấm kháng khuẩn 25 2.2.9 Xác định đặc tính sinh hóa lý chất kháng nấm kháng khuẩn 26 2.2.10 Thử nghiệm tính an tồn chất kháng nấm kháng khuẩn 27 Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .28 3.1 Lựa chọn chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum đánh giá đặc tính sinh học chủng nghiên cứu 28 3.1.1 B amyloliquefaciens subsp plantarum phân lập vùng sinh thái khác Việt Nam 28 3.1.2 Hoạt tính kháng nấm vi khuẩn 28 3.1.3 Enzyme ngoại bào 32 3.1.4 Khả phân giải phosphate khó tan sinh chất kích thích sinh trưởng IAA 33 3.2 Phân tích đa dạng kiểu gen chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum .34 3.2.1 Phân tích dấu vân tay rep-PCR .34 3.2.2 Phân tích trình tự đa gen .36 ii z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04 3.3 Tách chiết, tinh xác định chất sinh học chất kháng nấm chất kháng khuẩn từ chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum CP 1604 39 3.3.1 So sánh hiệu tách chiết chất kháng nấm chất kháng khuẩn 39 3.3.2 Tinh chất kháng nấm kháng khuẩn 40 3.3.3 Xác định tính chất chất kháng nấm kháng khuẩn .41 3.4 Thử nghiệm tính an tồn chất kháng nấm chất kháng khuẩn 46 3.4.1 Thử nghiệm nẩy mầm hạt .47 3.4.2 Thử nghiệm khả sinh trưởng 47 KẾT LUẬN 49 KIẾN NGHỊ .49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 57 iii luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04 z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Thông tin 15 chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum Bảng 3.2 Hoạt tính kháng nấm vi khuẩn Bảng 3.3 Khả sinh loại enzyme ngoại bào Bảng 3.4 Khả phân giải phosphate khó tan sinh chất kích thích sinh trưởng IAA Bảng 3.5 Hoạt tính kháng nấm vi khuẩn dịch chiết thô Bảng 3.6 Khả bền nhiệt chất kháng nấm kháng khuẩn Bảng 3.7 Khả bền pH chất kháng nấm chất kháng khuẩn Bảng 3.8 Khả bền với enzyme thủy phân Bảng 3.9 Khả nẩy mầm hạt xử lý với chất kháng sinh Bảng 3.10 Khả sinh trưởng non xử lý với chất kháng sinh iv luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04 z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Mối quan hệ phát sinh chủng loại lồi Bacillus nhóm lớn Hình 1.2 Kết phân loại vi khuẩn Bacillus phần mềm ApiwebTM Hình 1.3 Cấu trúc chuỗi peptide chất kháng sinh polymyxin Hình 1.4 Cấu trúc chất kháng sinh iturin Hình 1.5 Cấu trúc nhóm kháng sinh fengysin Hình 1.6 Cấu trúc lipopeptide mạch thẳng mang điện tích dương ceraxin Hình 3.1 Sơ đồ mối tương đồng kiểu gen xây dựng kỹ thuật dấu vân tay rep - PCR sử dụng mồi ERIC Hình 3.2 Sơ đồ mối tương đồng kiểu gen xây dựng kỹ thuật dấu vân tay rep - PCR sử dụng mồi GTG5 Hình 3.3 Mối quan hệ chủng SP 1901 CP 1604 phát sinh chủng loại lồi vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis Hình 3.4 Sắc ký đồ HPLC chất kháng nấm chất kháng khuẩn tinh từ dịch nuôi cấy chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum CP 1604 Hình 3.5 Khối phổ phân đoạn chất có hoạt tính kháng nấm phân đoạn chất có hoạt tính kháng khuẩn Hình 3.6 Hoạt tính chất kháng nấm chất kháng khuẩn xử lý nhiệt nhiệt độ khác v luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04 z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04 CÁC CHỮ VIẾT TẮT API: Thanh định danh API (Anatical Profile Index) D: Đường kính ( Diameter) Da: Daton Dab: 2,4 - diaminobutyric acid GTTB: Giá trị trung bình HPLC: Sắc ký lỏng hiệu cao IAA: Hóc môn thực vật IAA (Indole-3-Acetic Acid) KBT: Khoảng biến thiên MIC: Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal Inhibitory Concentration) MS: Khối phổ (Mass Spectrometry) NA: Thạch dinh dưỡng (Nutrient Agar) NRPSs: Enzyme sinh tổng hợp peptide không phụ thuộc ribosome (NonRibosomal Peptide Synthetases) PCR: Phản ứng khuếch đại ADN PDA: Thạch khoai tây (Potato Dextrose Agar) vi luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04 z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04 MỞ ĐẦU Chi Bacillus nhóm lồi vi khuẩn hiếu khí, Gram dương, hình que, phân bố rộng rãi hệ sinh thái Bacillus có khả sinh nội bào tử, dạng nghỉ tế bào để giúp vi khuẩn chống chịu tồn trước điều kiện bất lợi môi trường khô hạn thiếu dinh dưỡng Theo hệ thống phân loại nay, chi Bacillus có khoảng gần 300 loài loài phụ loài Trong số đó, Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum (hay cịn gọi B velezensis, B methylotrophicus B oryzicola) tám lồi vi khuẩn thuộc nhóm B subtilis Đây lồi vi khuẩn an tồn, sở hữu nhiều đặc tính quý có lợi cho trồng khả sinh chất kháng nấm kháng vi khuẩn gây bệnh cây, sản sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật, sản sinh enzyme thủy phân có khả tăng cường tính miễn dịch chống lại xâm nhiễm loại vi sinh vật gây bệnh Do sở hữu đặc tính quý, vi khuẩn B amyloliquefaciens subsp plantarum nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu cấp độ từ giải mã hệ genome đến nghiên cứu chất trao đổi, nghiên cứu phân loại, nghiên cứu ứng dụng nhà kính thực địa; nhiều chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens subsp plantarum phân lập, đánh giá đặc tính có lợi ứng dụng đấu tranh sinh học để phòng ngừa loại dịch bệnh hại trồng Một số chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum FZB42 sản xuất thương mại sử dụng làm chế phẩm phân sinh học chế phẩm phòng trừ bệnh Nhiều báo cáo công bố hiệu sử dụng chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum phòng trừ làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh mức độ nhiễm bệnh vi khuẩn nấm gây bệnh gây Sản lượng nông sản thu hoạch tăng lên đáng kể bổ sung chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum FZB42 vào phân bón B amyloliquefaciens subsp plantarum sản sinh nhiều loại chất trao đổi bậc hai có hoạt tính kháng nấm kháng vi khuẩn gây bệnh Các chất trao đổi bao gồm lipopeptide, polyketide, dipeptide, siderophore protein kháng khuẩn Đa số chất tổng hợp không cần ribosome (nonribosomally synthesized luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.len.men.va.phuong.phap.tach.chiet.chat.khang.nam.gay.benh.thuc.vat.tu.vi.khuan.bacillus.amyloliquefaciens.cp16.04 z