luận văn thạc sĩ khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen ở 15 locus gen bằng hệ identifiler từ quần thể người dân tộc nùng ứng dụng trong giám định adn

Do đú, bắt buộc phải tiến hành khảo sỏt tần suất cỏc alen của cỏc locus dựng trong giỏm định ADN hỡnh sự đối với mỗi dõn tộc để đảm bảo tớnh khoa học, chớnh xỏc và khỏch quan trong kết l

LƯƠNG THỊ PHÚC

KHẢO SÁT VÀ XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU

TẦN SUẤT CÁC ALEN Ở 15 LOCUS GEN

BẰNG HỆ IDENTIFILER TỪ QUẦN THỂ NGƯỜI DÂN TỘC NÙNG ỨNG DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH ADN

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

LƯƠNG THỊ PHÚC

KHẢO SÁT VÀ XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU

TẦN SUẤT CÁC ALEN Ở 15 LOCUS GEN

BẰNG HỆ IDENTIFILER TỪ QUẦN THỂ NGƯỜI DÂN TỘC NÙNG ỨNG DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH ADN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Người hướng dẫn: PGS, TS Nguyễn Văn Hà

dắt, tạo mọi điều kiện giúp đỡ để tôi hoàn thành luận văn này Đồng thời, tôi xin chân thành cảm ơn Trung tá Trịnh Tuấn Toàn – Phó Giám đốc Trung tâm Giám định Sinh học Pháp lý – Viện Khoa học hình sự và các thành viên trong

dự án Xây dựng tàng thư gen tội phạm Quốc gia đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình làm luận văn

Tôi cũng gửi lời cảm ơn tới các cán bộ thuộc Trung tâm Giám định Sinh học Pháp lý – Viện Khoa học hình sự đã tạo điều kiện giúp đỡ về kỹ thuật và cơ sở vật chất cho tôi trong quá trình làm luận văn

Để hoàn thành luận văn này tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các giảng viên, CBCNV Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam đã tận tình truyền đạt kiến thức và giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp

đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn thạc sĩ này

Hà nội ngày tháng năm 2015

Học viên

Lương Thị Phúc

1.3 Mười lăm (15) locus gen hệ Identifiler trên các nhiễm sắc thể 8

1.3.1 Các tiêu chuẩn cho locus STR dùng trong giám định ADN 8

1.3.2 Ý nghĩa của cơ sở dữ liệu tần suất alen của các locus STR 10

1.3.3 Cơ sở khoa học và thực tiễn của việc nghiên cứu đề tài 11

1.4 Tình hình nghiên cứu và phát triển các bộ kit dùng trong giám định ADN nhân tế bào 12

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 12

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 13

1.5 Dân tộc Nùng sinh sống trên lãnh thổ Việt Nam 15

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Vật liệu nghiên cứu 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Quy trình phân tích ADN 22

2.2.2 Xử lý thống kê số liệu và tính tần suất các locus gen 23

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Phân tích kiểu gen của 15 locus gen từ 120 mẫu thu thập 25

3.1.1 Kết quả thu, bảo quản mẫu và tách chiết ADN 25

3.1.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR, điện di và phân tích kiểu gen 25

3.2 Tính tần suất của 15 locus gen từ 120 mẫu thu thập được 30

3.2.1 Kết quả tính tần suất các alen 30

ADN tại Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an 47

KẾT LUẬN 49

KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

VNTR - Variable Number of Tandem Repeat - Các trình tự lặp ngắn

học hình sự

KHHS - Khoa học hình sự

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU Hình vẽ

Hình 3.1: Hình ảnh kiểu gen dạng peak từ mẫu ký hiệu N14 27

Hình 3.2: Hình ảnh kiểu gen dạng peak từ mẫu ký hiệu N40 28

Bảng biểu Bảng 3.2: So sánh  2 TT và  2 LT 30

Bảng 3.3: Tần suất alen (%) của locus D8S1179 31

Bảng 3.4: Tần suất alen (%) của locus D21S11 32

Bảng 3.5: Tần suất alen (%) của locus D7S820 33

Bảng 3.6: Tần suất alen (%) của locus CSF1PO 34

Bảng 3.7: Tần suất alen (%) của locus D3S1358 35

Bảng 3.8: Tần suất alen (%) của locus THO1 36

Bảng 3.9: Tần suất alen (%) của locus D13S317 37

Bảng 3.10: Tần suất alen (%) của locus D16S539 38

Bảng 3.11: Tần suất alen (%) của locus D2S1338 39

Bảng 3.12: Tần suất alen (%) của locus D19S433 40

Bảng 3.13: Tần suất alen (%) của locus vWA 41

Bảng 3.14: Tần suất alen (%) của locus TPOX 42

Bảng 3.15: Tần suất alen (%) của locus D18S51 43

Bảng 3.16: Tần suất alen (%) của locus D5S818 44

Bảng 3.17: Tần suất alen (%) của locus FGA 45

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Viện Khoa học hình sự là một đơn vị đầu ngành của lực lượng kỹ thuật hình sự, một trung tâm khoa học của ngành Công an Việt Nam Một trong những nhiệm vụ quan trọng của Viện Khoa học hình sự là công tác giám định phục vụ tố tụng hình sự, tố tụng dân sự và các yêu cầu cá nhân, trong đó nổi bật là lĩnh vực giám định ADN

Năm 2006 Viện Khoa học hình sự đã đưa vào ứng dụng hệ Identifiler

D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818 và FGA ) trong giám định ADN

Trong giám định ADN hình sự đòi hỏi bắt buộc phải tính xác suất một người ngẫu nhiên trong quần thể có cấu trúc di truyền trùng lặp với ADN của các mẫu vật giám định Để tính toán được xác suất này thì phải có dữ liệu tần suất của từng alen [5]

Theo lý thuyết di truyền học, mỗi quần thể người (dân tộc) khác nhau

có những đặc điểm di truyền đặc trưng, thể hiện bằng sự phân bố tần suất alen trong mỗi quần thể là khác nhau và không thể áp dụng cơ sở dữ liệu của quần thể này cho một quần thể khác Do đó, bắt buộc phải tiến hành khảo sát tần suất các alen của các locus dùng trong giám định ADN hình sự đối với mỗi dân tộc để đảm bảo tính khoa học, chính xác và khách quan trong kết luận giám định Việc khảo sát tần suất các alen của các locus đang sử dụng trong giám định ADN đối với các dân tộc trên toàn lãnh thổ Việt Nam là một việc làm mang tính cấp bách

Việt Nam có 54 dân tộc, trong đó dân tộc Kinh chiếm tỉ lệ lớn nhất (gần 90%) [1], còn lại là các dân tộc thiểu số Tính đến năm 2014, Viện Khoa học

hình sự đã công bố bảng tần suất các alen hệ Identifiler đối với các dân tộc Kinh, H’mông, Tày và Khmer Do điều kiện về cơ sở vật chất cũng như con người chưa đáp ứng được nên chưa thể tiến hành khảo sát tần suất alen cho tất cả các dân tộc

Theo Tổng điều tra dân số và nhà ở năm 2009, người Nùng ở Việt Nam

có dân số 968.800 người, là dân tộc có dân số đứng thứ 7 tại Việt Nam, có mặt trên tất cả 63 tỉnh, thành phố Người Nùng cư trú tập trung tại các tỉnh: Lạng Sơn (314.295 người, chiếm 42,9% dân số toàn tỉnh và 32,4% tổng số người Nùng tại Việt Nam), Cao Bằng (157.607 người, chiếm 31,1% dân số toàn tỉnh và 16,3% tổng số người Nùng tại Việt Nam), Bắc Giang (76.354 người), Đắk Lắk (71.461 người), Hà Giang (71.338 người), Thái Nguyên (63.816 người), Bắc Kạn (27.505 người), Đắk Nông (27.333 người), Lào Cai (25.591 người), Lâm Đồng (24.526 người), Bình Phước (23.198 người) Người Nùng chủ yếu phân bố ở các tỉnh đông bắc Bắc Bộ như Lạng Sơn, Cao Bằng, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Bắc Giang, Tuyên Quang v.v (chiếm tới 84%) Đây là các tỉnh gần với biên giới Trung Quốc, là những điểm nóng về tình hình An ninh và trật tự an toàn xã hội Hiện nay, số lượng vụ án có đối tượng là người dân tộc Nùng có xu hướng ngày càng tăng (số lượng vụ việc trong các năm gần đây được trưng cầu giám định AND tại Viện khoa học hình sự cụ thể như sau: Năm 2013 số vụ là 25 vụ, năm 2014 là 32 vụ, 6 tháng đầu năm của năm

2015 là 20 vụ) Tuy nhiên, ở Việt Nam cho đến nay chưa có một nghiên cứu hoàn chỉnh nào được công bố về khảo sát sự phân bố tần suất các alen của các gen hình sự hệ Identifiler (gồm 15 gen) đối với quần thể người dân tộc Nùng Yêu cầu thực tế đặt ra đòi hỏi phải có tần suất các alen của các locus gen hệ Identifiler để dùng trong tính toán, đưa ra kết luận trong các vụ án có

mẫu của đối tượng là người dân tộc Nùng ngày càng cấp bách Đề tài “Khảo

sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen của 15 locus gen hệ Identifiler từ quần thể người dân tộc Nùng ứng dụng trong giám định ADN” được hoàn thành

sẽ đáp ứng yêu cầu cấp thiết của giám định ADN và đóng góp dữ liệu vào hệ thống gen hình sự quốc tế Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học vững chắc để phân tích, đánh giá và kết luận giám định đối với những vụ án liên quan đến người thuộc dân tộc Nùng và là điều kiện để xây dựng cơ sở pháp lý cho quy trình giám định AND

2 Mục tiêu của đề tài

Khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen của 15 locus gen (ADN) hệ Identifiler từ dân tộc Nùng phục vụ cho công tác giám định ADN trong các vụ án liên quan đến người dân tộc Nùng Trên cơ sở đó, tính tần suất xuất hiện của mỗi alen trong từng locus của dân tộc Nùng, làm cơ sở khoa học để phân tích, đánh giá và rút ra kết luận giám định xác định quan hệ huyết thống hoặc truy nguyên cá thể là người dân tộc Nùng

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu tần suất các alen theo hệ Identifiler của 120 cá thể người

Nùng không có quan hệ họ hàng, sống rải rác trên các tỉnh trung du và miền núi phía Bắc

4 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Để thực hện mục tiêu nghiên cứu đề tài sẽ bao gồm một số nội dung chính với các vấn dề cần giải quyết sau:

- Thu mẫu máu của 120 cá thể người Nùng Theo nguyên tắc thu ngẫu nhiên từ những người không có quan hệ họ hàng huyết thống trực hệ ở

các tỉnh khác nhau (có thông tin cá nhân)

- Tách chiết AND bằng phương pháp tách chiết vô cơ, sử dụng chelex 100 ( hãng Bio – Rad, Mỹ)

- Định Lượng bằng phương pháp Real-time PCR sử dụng bộ Kít

- Nhân bội AND trên máy tạo chu trình nhiệt ABI- 9700 bằng bộ Kit Identifiler ( hãng ABI, Mỹ)

- Điện di và phân tích kết quả trên máy Phân tích gen ABI- 3130 với phần mềm GeneMapper ID của hãng ABI (Mỹ)

- Phân tích kiểu gen (AND) của các locus hệ Identifiler (15 locus gen) của

120 cá thể người dân tộc Nùng Từ cơ sở đó, tính tần suất xuất hiện của mỗi alen của từng locus trong quần thể, kiểm định tính chính xác của số lượng mẫu trong khảo sát với độ tin cậy p =0,05

- Tính tần suất các alen của mỗi locus theo số liệu thu được trong nghiên cứu

- Kết quả là bảng tần suất các alen của từng locus trong quần thể người Nùng làm cơ sở khoa học để các cơ quan giám định, các cơ quan tố tụng hình sự, dân sử dụng phân tích và đưa ra kết luận trong giám định gen

5 Ý nghĩa Khoa học và thực tiễn của đề tài

Đề tài này khi được hoàn thành sẽ đáp ứng yêu cầu giám định gen ở Việt Nam nói chung và đóng góp vào nhiệm vụ giám định AND cho các lực lượng thi pháp pháp luật trên toàn cầu nhất là trong bối cảnh toàn cầu hóa giữa cảnh sát các nước thông qua Iterpol.Thực tế quần thể người Nùng ở Việt Nam cho đến thời điểm này chưa có một công bố nào về tần suất các alen của các locus gen hệ Identifiler Từ yêu cầu của thực tiễn, nhóm nghiên cứu sẽ tiến hành thu mẫu ngẫu nhiên của 120 cá thể người Nùng, phân tích kiểu gen

hệ Identifiler, xây dựng bảng tần suất để sử dụng trong giám định gen

6 Bố cục của luận văn

Ngoaì phần mở đầu, kết luận, kiến nghị, danh mục tài liệu tham khảo

và phụ lục, luận văn được kết cấu thành 3 chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các phương pháp truy nguyên cá thể dùng trong Khoa học hình sự

Có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định cá thể người như:

- Nhận biết qua vân tay, tiếng nói

- Nhận biết bằng các yếu tố huyết thanh như: xác định các nhóm kháng nguyên hồng cầu (nhóm máu), xác định một số yếu tố protein trong huyết thanh, xác định một số enzym, nhưng khả năng phân biệt còn thấp

1.2 Phương pháp phân tích ADN để xác định cá thể

Những năm cuối thế kỷ 20, đặc biệt là thập kỷ 80, 90 các nhà khoa học hình sự ứng dụng công nghệ gen (DNA- Technology) vào trong xác định tội phạm

Trong nhân tế bào người (tế bào lưỡng bội) có 46 nhiễm sắc thể (NST) được xếp thành 23 cặp đồng dạng: 22 cặp nhiễm sắc thể thường và một cặp nhiễm sắc thể giới tính Riêng tế bào trứng và tinh trùng có 23 nhiễm sắc thể (tế bào đơn bội) Thế hệ con cái, thông thường nhận từ mẹ 23 nhiễm sắc thể thông qua tế bào trứng và 23 nhiễm sắc thể từ cha thông qua tế bào tinh trùng

Sự kết hợp giữa trứng và tinh trùng đã duy trì được số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào thường là 46 Bộ nhiễm sắc thể được bảo tồn và truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác và mang tính đặc trưng cho người [25, 27]

Năm 1984 Alec Jeffreys và các cộng sự ở trường đại học Leicester (Anh) khi nghiên cứu các đoạn ADN mã hoá cho myoglobin trong máu người

đã phát hiện ra trình tự của các bazơnitơ được lặp lại một số lần với chiều dài đoạn lặp từ 10-15 bp (base pair), các đoạn lặp này được gọi là tiểu vệ tinh

(minisattelite) Ông cũng phân lập được hai đoạn và nhân bội chúng, sử dụng làm mẫu dò (probe) để phát hiện những vùng mà Jeffreys gọi là vùng siêu biến (hypervariable region) ở các vật liệu di truyền khác nhau [25] Đây được coi là bước ngoặt lớn trong lịch sử phát triển của Khoa học hình sự thế giới nói chung và Sinh học pháp lý nói riêng Các tiểu vệ tinh được phát hiện thấy trong mọi tế bào và ở những vị trí khác nhau trong hệ gen người Điều đáng chú ý là số lần lặp lại các đoạn lặp này ở các cá thể khác nhau thì khác nhau Alec Jeffreys coi đây là đặc điểm rất quan trọng để phân biệt sự khác nhau giữa các cá thể (truy nguyên cá thể) Giám định ADN cho mục đích tư pháp ra đời từ đây Giám định ADN ra đời không chỉ khắc phục được những hạn chế của các phương pháp huyết thanh học mà còn giải quyết được những vụ án bế tắc trước đây- những vụ án mà ADN là bằng chứng duy nhất Tính ưu việt của giám định ADN là truy nguyên được cá thể người, xác định quan hệ huyết thống cha - mẹ - con, xác định hài cốt [17, 27]

Tháng 10 năm 1990, tại Mỹ, Dự án hệ gen người (Human Genome Project-HGP) chính thức được bắt đầu Đến ngày 12 tháng 02 năm 2001, HGP và Celera đã công bố trình tự đầy đủ của hệ gen người - một sự kiện trọng đại trong sự phát triển của sinh học phân tử nói chung và trong việc nghiên cứu gen người nói riêng Theo công bố này, số lượng gen trong bộ gen người có khoảng 35 000 gen, trong đó có hàng chục gen được nghiên cứu ứng dụng để xác định huyết thống và truy nguyên cá thể [25]

Cũng như ADN ở sinh vật nhân chuẩn khác, ADN nhân ở người gồm những trình tự mã hoá (các exon) xen kẽ với những trình tự không mã hoá (các intron) [10, 12] Tuỳ mức độ hiện diện của chúng trong nhân, các trình tự ADN được chia làm 3 loại:

- Các trình tự duy nhất: là các gen mã hoá cho các protein có trình tự đặc trưng cho từng gen

- Các trình tự có số lần lặp lại trung bình: chiếm khoảng 25- 40% bộ gen

người, chúng có kích thước từ 100-1000 kb, đa dạng hơn các trình tự lặp lại nhiều lần Các trình tự này không tập trung mà phân tán trên toàn bộ hệ gen Chúng có thể là những trình tự không mã hoá với chức năng chưa rõ hoặc còng cã thÓ lµ nh÷ng tr×nh tù m· ho¸ (c¸c gen m· ho¸ cho ARN riboxom, ARN vËn chuyÓn )

- Các trình tự lặp lại nhiều lần: Chiếm 10-15% bộ gen Đó là những trình

tự ADN ngắn (10-200 kb), không mã hoá, thường tập trung ở những vùng chuyên biệt trên nhiễm sắc thể (vùng tâm động, vùng đầu nhiễm sắc thể) Các gen được sử dụng trong giám định hình sự là các gen nằm ở vùng

định gen, người ta áp dụng các kỹ thuật phân tích các gen có đoạn lặp trung bình (Variable Number of Tandem Repeat-VNTR hay Minisatellite) Nhưng những kỹ thuật này chỉ áp dụng được với từng gen riêng lẻ (single locus) và phụ thuộc vào thao tác kỹ thuật của người giám định nên dễ xảy ra sai sót Từ năm 1990 tới nay các nhà Khoa học hình sự sử dụng các kỹ thuật phân tích các gen có trình tự lặp ngắn (Short Tandem Repeat-STR hay Microsatellite)

vì chúng khá bền vững, có khả năng phân tích đồng thời nhiều gen, ít phụ thuộc vào thao tác kỹ thuật của người giám định Các cấu trúc VNTR hay STR đều mang tính bảo thủ cao, được di truyền qua các thế hệ và mang tính đặc trưng cho cá thể Đó là nền tảng khoa học cho giám định gen Các gen này thường có tính đa hình cao, ít đột biến, tương đối bền vững và cho phép đồng thời thực hiện được phản ứng nhân gen của nhiều gen khác nhau [25]

Tính đa hình của các gen này được thể hiện ở hai dạng: đa hình về trình

tự các nucleotid và đa hình về chiều dài

- Đa hình về trình tự: các gốc nucleotide ngẫu nhiên trong đoạn ADN không theo một trình tự nào Ví dụ: tại locus A,

- AGCCTGCGAG- Như vậy tại vị trí số 3 và vị trí số 8 của dãy thứ nhất đã được thay thế A bằng C và T bằng G ở dóy thứ 2

- Đa hình về chiều dài: Một số gốc nucleotid được lặp đi lặp lại nhiều lần trên chiều dài của đoạn ADN

Ví dụ: tại locus D7S820,

1.3 Mười lăm (15) locus gen hệ Identifiler trờn các nhiễm sắc thể

1.3.1 Các tiêu chuẩn cho locus STR dùng trong giám định ADN

Giám định ADN hiện nay chủ yếu sử dụng các locus STR Phương pháp giám định ADN có độ tin cậy rất cao bởi các locus STR có tính đa alen (tính

đa hình) rất cao, mỗi alen chỉ xuất hiện trong quần thể với tần số rất thấp [17, 31] Locus STR ngắn nên có thể đồng thời phân tích được nhiều STR trong cùng một thời điểm Việc phân tích đa hệ rất có giá trị vì chúng có kết quả phân biệt lớn và thành công ngay cả một số trường hợp mẫu lẫn hoặc đó bị phân hủy phần nào [10, 12]

Một locus STR được sử dụng cho mục đích nhận dạng và xác định cá thể phải đảm bảo các thông số sau:

- Có tính bền vững cao (tần suất đột biến thấp)

- Locus STR phải có tính đa hình và mức độ dị hợp tử cao Điều này giúp các nhà phân tích chỉ sử dụng một số locus tối thiểu đó đạt được sự phân biệt cá thể một cách tốt nhất

- Các locus STR có kích thước ngắn, trung bình từ 100 - 400 bp Các đoạn ADN ngắn có độ bền vững cao, ít bị đứt gẫy dưới tác động của điều kiện ngoại cảnh

- Các locus chứa đoạn STR phải đảm bảo yếu tố di truyền độc lập, do vậy nên lựa chọn tổ hợp các locus nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau là rất quan trọng

Nhiều đoạn đa hình có trình tự lặp lại chứa các đơn vị lặp lại từ 4 nucleotide đã được nghiên cứu và đáp ứng được yêu cầu của quy trình phân tích cá thể người Các đoạn này có đặc tính như sau:

- Có tính đa hình và mức độ dị hợp tử cao (>70%)

- Dễ dàng phối hợp thành bộ phức khi thực hiện PCR

- Sản phẩm PCR ổn định, ít xảy ra trường hợp khi PCR đoạn lặp bị thiếu Năm 2006, Viện Khoa học hình sự đưa vào triển khai giám định ADN bằng bộ kit Identifiler (15 locus gen: D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, THO1, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818 và FGA) Với bộ kit mới này, công tác giám định đạt hiệu quả cao hơn so với bộ kit 9 locus gen Nineplex II được sử dụng trước đây

Bảng 1.1: Các locus gen hệ Identifiler [20]

1.3.2 Ý nghĩa của cơ sở dữ liệu tần suất alen của các locus STR

Mỗi cá thể người có cấu trúc di truyền riêng biệt, trừ những trường hợp sinh ra cùng một trứng [5] Nếu xét rộng trong cả một quần thể thì một số đặc điểm di truyền (ADN) ở các cá thể khác nhau vẫn có thể giống nhau (trùng lặp) Mặt khác mỗi một quần thể người (tộc người) khác nhau cũng có những đặc điểm di truyền đặc trưng thể hiện bằng sự phân bố tần suất alen trong mỗi quần thể [29, 36] Do vậy, trong giám định ADN các nhà khoa học hình sự ngoài lựa chọn, nghiên cứu những locus (vị trí trên nhiễm sắc thể) có tính đa hình cao thì cần khảo sát tần suất phân bố các alen trong quần thể của từng locus để sử dụng Quần thể được nghiên cứu khảo sát phải đạt được các yêu

cầu trong thống kê là các mẫu dùng trong nghiên cứu phải đảm bảo tính ngẫu nhiên, không có quan hệ huyết thống trong 3 đời [20, 35]

Để có được tần suất của mỗi alen, trước hết phải tìm được số lần xuất hiện của mỗi alen trong quần thể nghiên cứu sau đó tính tần suất lý thuyết của alen đó theo quy luật di truyền quần thể [36] Khi có được tần suất thực tế và tần suất lý thuyết của mỗi alen, chúng ta tiến hành kiểm định xem tần suất alen có phù hợp hay không với mức xác suất đã chọn

Giám định ADN đòi hỏi cơ sở khoa học vững chắc để tính toán xác suất một người ngẫu nhiên trong quần thể là người có cấu trúc di truyền đặc trưng trùng lặp với ADN trong các mẫu vật (thu thập trong quá trình điều tra, phá án) Nếu không có tần suất alen thì không tính toán được tần suất xuất hiện của một kiểu gen nào đó trong một quần thể nhất định [15, 28, 31]

Trong trường hợp cần xác định huyết thống, để kết luận một người có phải là cha đẻ hoặc mẹ đẻ của người con không, phải dựa vào khả năng cho nhận của các alen và phải căn cứ vào tần suất alen để tính ra chỉ số quan hệ huyết thống (Paternity Index - PI), từ đó tính độ tin cậy đạt được Mặt khác,

đó cũng là cơ sở khoa học để so sánh độ tin cậy trong trường hợp phân tích được nhiều locus gen hoặc ít locus gen hơn [30]

1.3.3 Cơ sở khoa học và thực tiễn của việc nghiên cứu đề tài

Mỗi một dân tộc có một phân bố tần suất kiểu gen khác nhau Do nhu cầu sử dụng tần suất của mỗi dân tộc khi tính toán để đưa ra kết luận giám định ADN của các giám định viên về Sinh học, trong các vụ án có đối tượng

là cá thể người dân tộc nào thì đều cần phải có tần suất phân bố các alen của các locus gen trong quần thể dân tộc đó để sử dụng Việc khảo sát, xây dựng tần suất các alen cho mỗi dân tộc là nhu cầu cấp thiết cho công tác giám định ADN Thực tế quần thể người Nùng ở Việt Nam cho đến thời điểm này chưa

có một công bố nào về tần suất các alen của các locus gen hệ Identifiler Từ

yêu cầu của thực tiễn, nhóm nghiên cứu sẽ tiến hành thu mẫu ngẫu nhiên của

120 cá thể người Nùng, phân tích kiểu gen hệ Identifiler, xây dựng bảng tần suất để sử dụng trong giám định gen

1.4 Tình hình nghiên cứu và phát triển các bộ kit dùng trong giám định ADN nhân tế bào

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Từ những năm 1990, các nhà Khoa học hình sự trên thế giới sử dụng các

kỹ thuật phân tích các gen có trình tự lặp ngắn (Short Tandem Repeat-STR hay Microsatellite) cho mục đích giám định ADN hình sự [22, 28]

Ứng dụng các thành tựu của Công nghệ sinh học nói chung và kết quả của Dự án hệ gen người (Human Genome Project-HGP) nói riêng, các tập đoàn nghiên cứu khoa học trên thế giới đã sản xuất các bộ kit phân tích tổ hợp các locus có trình tự lặp lại ngắn:

- Kit 2 locus (TPOX/CSF1PO),

- Kit 3 locus (THO1/F13A1/FES)

- Kit 9 locus (hệ Profiler Plus của hãng Perkin-Elmer, Mỹ),

- Kit 15 locus (hệ Identifiler của hãng AB, hệ Power Plex 16 của hãng Promega)

- Kit 24 locus (hệ Golbalfiler của hãng AB, hệ PowerPlexđ Fusion System của hãng Promega[15]

Mỗi phòng thí nghiệm giám định gen (ADN) đều phải đạt những chỉ tiêu chất lượng trang thiết bị máy móc cũng như con người và đều phải có các nghiên cứu, khảo sát và công bố kết quả của mình về tần suất các alen trong

hệ locus gen của từng quần thể người để ứng dụng trong giám định truy nguyên cá thể hay xác định quan hệ huyết thống Để đảm bảo tính chính xác, các phòng thí nghiệm giám định gen thường dùng hệ thống phân tích 15 locus gen như hệ Identifiler hoặc hệ Power Plex 16

Tại Mỹ, cảnh sỏt liờn bang Mỹ đó khảo sỏt và sử dụng tần suất dữ liệu ADN theo hệ Identifiler của nhiều chủng tộc người khỏc nhau: 191 người gốc

Mỹ, 290 người Mỹ gốc Tõy Ban Nha và Bồ Đào Nha, 349 người Mỹ da trắng

và 357 người Mỹ gốc Phi [18, 21]

Với chủng tộc người lai Âu - Á (Eurasia), tại mỗi quốc gia khỏc nhau lại

cú những khảo sỏt khỏc nhau về tần suất cỏc alen theo hệ Identifiler của cộng đồng người Eurasia tại quốc gia đú: 384 người tại Nga, 300 người tại Hy Lạp,

139 người tại Rumani [37, 38]

Tại Singapore, Cảnh sỏt Singapore sử dụng tần suất cỏc alen theo hệ Identifiler của dõn tộc người Hoa, dõn tộc người Mó Lai, dõn tộc người Ấn Độ để phục vụ cụng tỏc giỏm định [5]

1.4.2 Tỡnh hỡnh nghiờn cứu trong nước

Ở Việt Nam, giỏm định gen được triển khai từ thỏng 4 năm 1999, tại Viện Khoa học hỡnh sự - Bộ Cụng an Toàn bộ quy trỡnh giỏm định gen được chuyển giao từ Viện Khoa học hỡnh sự bang Victoria - Úc cựng đội ngũ giỏm định viờn được đào tạo cơ bản tại Úc Cho đến nay, đã triển khai

5 phòng thí nghiệm giám định ADN: 03 phòng thí nghiệm tại Hà Nội (01 phòng thí nghiệm cho tàng thư ADN tội phạm Quốc gia, 01 phòng thí nghiệm giám định ADN hài cốt, 01 phòng thí nghiệm giám định ADN phục vụ tố tụng và các yêu cầu cá nhân); 01 phòng thí nghiệm tại Phân Viện KHHS tại Đà Nẵng; 01 phòng thí nghiệm tại Phân viện KHHS tại TP Hồ Chí Minh Trong qua trình phát triển, trình độ năng lực cán bộ ngày càng được nâng cao, trang thiết bị được bổ sung và nâng cấp, đã

đáp ứng và phục vụ hữu hiệu cho công tác đấu tranh

phòng chống tội phạm cða lực lượng Công an và công tác truy tố xét xử cða ngành Tư pháp

Năm 2000, đề tài cấp Bộ "Nghiờn cứu, khảo sỏt và xõy dựng tần suất cỏc

alen của cỏc gen trong hệ NinePlex II (9 locus gen) trờn đối tượng người Kinh" được triển khai và năm 2002 được nghiệm thu, kết quả là bảng tần suất

cỏc alen của người Kinh được sử dụng hiệu quả trong cỏc bản kết luận giỏm định truy nguyờn cỏ thể, xỏc định quan hệ huyết thống giỳp cỏc cơ quan tố tụng giải quyết cú hiệu quả rất nhiều vụ việc [5]

Năm 2004, Việt Nam đó thụng bỏo bảng tần suất cỏc alen của cỏc locus gen hệ Nineplex II trờn đối tượng người Kinh cho Interpol, đõy là một cột mốc đỏnh dấu sự phối hợp toàn cầu trong đấu tranh phũng chống tội phạm dựa vào lĩnh vực giỏm định ADN

Trường Đại học Y Hà Nội phối hợp với Viện Kỹ thuật húa sinh và tài

liệu nghiệp vụ đó tiến hành “Khảo sỏt tần suất của 3 locus D5S818, D7S820 và

D13S317 trờn đối tượng người Mường” bằng cỏc bộ kit phõn tớch ADN theo cụng

nghệ điện di nhuộm bạc

Năm 2006, Viện Khoa học hỡnh sự đưa vào triển khai hệ Identifiler trong giỏm định ADN Với bộ kit mới này, cụng tỏc giỏm định đạt hiệu quả cao hơn

so với bộ kit 9 locus gen Nineplex II trước đõy

Năm 2008, Viện Khoa học hỡnh sự đó triển khai đề tài cấp Bộ "Khảo sỏt

tần suất cỏc alen theo hệ Identifiler (ID) trờn đối tượng người Kinh" Đề tài tiến

hành khảo sỏt số mẫu là 170 cỏ thể người Kinh và kết quả đó được triển khai ứng dụng trong cụng tỏc giỏm định ADN

Năm 2014, Viện Khoa học hỡnh sự đó cụng bố bảng tần suất cỏc alen theo

hệ Identifiler của cỏc dõn tộc Khmer, H'Mụng và Tày

Đây là cơ sở khoa học và cơ sở pháp lý vững chắc để đưa ra các bản kết luận giám định về truy nguyên cá thể và xác định huyết thống phục vụ

tố tụng hình sự và dân sự đối với những vụ án, vụ việc liên quan đến người Việt Nam [15]

1.5 Dân tộc Nùng sinh sống trên lãnh thổ Việt Nam

Việt Nam là quốc gia đa dân tộc, đa ngôn ngữ, trong đó có 54 dân tộc

cư trú đan xen nhau và phân bố rải rác ở các vùng miền của đất nước Mỗi dân tộc là một bức tranh đầy màu sắc, đa dạng không chỉ về ngôn ngữ mà còn cả những nét đặc trưng về truyền thống văn hóa, lịch sử hình thành phát triển, …[2]

Dân tộc Nùng (tên gọi khác là Xuồng, Giang, Nùng An, Nùng Lài, Phần Sinh, Nùng Cháo, Nùng Inh, Quý Rịn, Nùng Dín, Khen Lài) thuộc nhóm ngôn ngữ Tày-Thái của hệ ngôn ngữ Thái-Kađai Người Nùng có quan

hệ gần gũi với người Tày và người Choang sống dọc biên giới Trung Quốc Riêng đối với địa bàn Trung Quốc, người Nùng và người Tày được xếp vào dân tộc Choang Vì vậy mà thủ lĩnh Nùng Trí Cao của người Nùng cũng được coi là thủ lĩnh của người Choang [8] Tuy không phải là dân tộc chiếm số lượng đông nhất trong 54 dân tộc nhưng dân số người Nùng ngày càng gia tăng đáng

kể Theo Tổng điều tra dân số và nhà ở năm 2009, người Nùng ở Việt Nam có dân số 968.800 người, là dân tộc có dân số đứng thứ 7 tại Việt Nam, có mặt trên tất cả 63 tỉnh, thành phố Người Nùng cư trú tập trung tại các tỉnh: Lạng Sơn (314.295 người, chiếm 42,9% dân số toàn tỉnh và 32,4% tổng số người Nùng tại Việt Nam), Cao Bằng (157.607 người, chiếm 31,1% dân số toàn tỉnh và 16,3% tổng số người Nùng tại Việt Nam), Bắc Giang (76.354 người), Đắk Lắk (71.461 người), Hà Giang (71.338 người), Thái Nguyên (63.816 người), Bắc Kạn (27.505 người), Đắk Nông (27.333 người), Lào Cai (25.591 người), Lâm Đồng (24.526 người), Bình Phước (23.198 người) [1]

Ngôn ngữ: Ngôn ngữ người Nùng chỉ tồn tại ở phía đông sông Hồng nối

liền với trung tâm của Việt Bắc Tiếng Nùng và Tày có chung một nguồn gốc nhưng có sự khác biệt Nhóm ngôn ngữ người Nùng Lòi, Nùng An, Nùng Dín

mang nhiều đặc điểm riêng, nên cũng khác khá xa so với người bản địa

Chữ viết: Giai đoạn cổ đại người Nùng không có chữ viết, đến giai đoạn

cận đại (từ thế kỷ XVII.) người Nùng dùng chữ Nôm gọi là chữ Nôm Nùng, thời kỳ hiện nay người Nùng vừa dung chữ Nôm (Nùng) và vừa dùng chữ La Tinh Tuy nhiên hiện nay chữ Nôm Nùng đang dần bị mai một đi bởi chữ quốc ngữ và hầu như nó không được sử dụng, chỉ có một số người già và người làm nghề thầy cúng còn biết

Nhân chủng: Căn cứ vào các kết quả nghiên cứu gần đây, xem xét sự

hình thành các dân tộc Việt Nam trong sự hình thành các dân tộc khác trong khu vực thì có thể nói rằng tất cả các dân tộc Việt Nam đều có cùng một nguồn gốc, đó là chủng Cổ Mã Lai Quá trình hình thành các dân tộc Việt Nam có thể chia thành ba giai đoạn [1, 2, 8]:

- Vào thời kỳ đồ đá giữa (khoảng 10.000 năm trước đây), có một bộ phận thuộc Đại chủng Á, sống ở vùng Tây Tạng di cư về phía đông nam, tới vùng ngày nay là Đông Dương thì dừng lại Tại đây, bộ phận của Đại chủng

Á kết hợp với bộ phận của Đại chủng Úc bản địa và kết quả là sự ra đời của

chủng Cổ Mã Lai (tiếng Pháp: Indonésien)

- Cuối thời kỳ đồ đá mới, đầu thời kỳ đồ đồng (khoảng 5.000 năm trước đây) Tại khu vực mà ngày nay là miền bắc Việt Nam, miền nam Trung Quốc (từ sông Dương Tử trở xuống), có sự chuyển biến do chủng Cổ Mã Lai tiếp xúc thường xuyên với Đại chủng Á từ phía bắc tràn xuống, sự chuyển biến

này hình thành một chủng mới là chủng Nam Á (tiếng Pháp: austro-asiatique)

- Thời kỳ sau đó, chủng Nam Á được chia thành một loạt các dân tộc

mà các cổ thư Việt Nam và Trung Hoa gọi là Bách Việt Ban đầu, họ nói một

số thứ tiếng như: Môn-Khơ me, Việt-Mường, Tày-Thái, Mèo-Dao, Sau đó

quá trình chia tách này tiếp tục để hình thành nên các dân tộc và các ngôn ngữ như ngày nay Trong khi đó, phía nam Việt Nam, dọc theo dải Trường Sơn vẫn là địa bàn cư trú của người Cổ Mã Lai Theo thời gian họ chuyển

biến thành chủng Nam Đảo

Như vậy người Nùng thuộc chủng Nam Á, nhóm ngôn ngữ Tày-Thái của hệ ngôn ngữ Thái-Kađai Đặc điểm nhân học đó là: Da ngăm, mắt và tóc đen, hình tóc thẳng thường cứng, lông trên người ít phát triển, sống mũi ít dô Vóc dáng trung bình, đầu thuộc hai loại dài trung bình và ngắn trung bình Nếp mi góc phát triển (45% trở lên), sống mũi thấp, cánh mũi rộng trung bình, môi hơi dày, môi trên hơi dô

Hôn nhân trong xã hội Nùng

Người Nùng có quy định rất chặt chẽ trong hôn nhân gia đình, cấm lấy người trong dòng tộc với nhau, trừ những người họ xa khác chi Tuy nhiên những trường hợp họ xa lấy nhau cũng rất hiếm

Tiêu chuẩn người chồng trong xã hội Nùng xưa cũng như nay là khỏe mạnh, cần cù, cày bừa thành thạo, săn bắn giỏi Trai Nùng thích tìm vợ là

những người “Nả hang khàng suổi phịn siêng” (con gái mặt vuông chữ điền trông như tiên) và không thích kết hôn với những cô“kiêu sải bố thưng tum,

mì cua tẻ sè lùm sèo móp”( gót chân không chạm đất khổ suốt đời) Nhiều nơi

đồng bào thường đánh giá những đức tính người con dâu tương lai qua cách làm ăn của người mẹ:

Người Nùng Phàn Slinh đôi trai gái đã có tình ý với nhau họ trao đổi

quà tặng cho nhau, con gái tặng con trai cái“con lót” (giỏ đựng chỉ), cái “cưn nả”(khăn đội đầu nam giới) và nhận lại của bạn trai cái “an

sả”, “phooc phum” ( cái lược) Trước kia mặc dù nam nữ thanh niên Nùng

được tự do tìm hiểu, thổ lộ tình cảm nhưng hôn nhân do cha sắp đặt vẫn là hình thức hôn nhân chủ đạo

Hiện tượng ngoại tình, hoang thai cũng hiếm có, theo luật tộc Nùng nếu người vợ ngoại tình sẽ bị đuổi ra khỏi nhà chồng và phải bồi thường tài sản cho nhà chồng Nếu người chồng ngoại tình sẽ phải nộp phạt một con trâu

đẻ bồi thường danh dự cho nhà gái Ỏ người Nùng An sau khi vợ cả tổ chức cưới vợ lẽ cho chồng thì bà ta sẽ làm một ngôi nhà khác hoặc ngăn nhà ra ở riêng cùng với con cái của mình

Theo luật tục của người Nùng Din ở Bắc Giang và Hoàng Su Phì- hà Giang nếu vợ chết, chồng có thể lấy em gái vợ Em trai chết anh trai có thể lấy em dâu “Phú lùng âu mẻ nả” Song hiện nay những hiện tượng như thế rất hiếm

Tuy cùng địa bàn cư trú và cùng sinh hoạt với người Tày nhưng giũa hai tộc ngươi này ít khi kết hôn với nhau, đa phần người Nùng thích kết hôn với người Nùng mà thôi

Tục lệ sinh đẻ

Người Nùng quan niệm gia đình hạnh phúc là gia đình có đông con Trước kia cũng như hiện nay, kén chọn vợ cho con trai, bậc cha mẹ thường tìm hiểu rất kỹ về lai lịch cha mẹ đẻ, nhất là bà mẹ cô dâu Xem người mẹ đẻ

có tốt không và nuôi con có tốt không Những người phụ nữ không chồng, con bị xã hội coi thường

Người Nùng Slin thì cắm cành lá bên trái nếu là sanh con gái, bên phải

là sanh con trai Ở người Nùng Inh (Chi Lăng, Lạng Sơn) bàn thờ mụ đặt bên cạnh bàn thờ tổ tiên, nhưng thấp hơn Bàn thờ mụ của bé trai khác so với bé gái, trong nhà lúc nào người con gái út, trai út lập gia đình thì bàn thờ mụ mới

bỏ đi Hôm làm lễ lập bàn thờ mụ người mẹ bế con ra khỏi buồng để báo cáo

tổ tiên cũng như để giới thiệu hai bên gia đình nội ngoại, khi đứa trẻ đầy tháng, và đủ 12 tháng tuổi người ta làm lễ ăn mừng

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Thu mẫu máu của 120 cá thể người Nùng theo nguyên tắc thu ngẫu nhiên từ những người không có quan hệ họ hàng huyết thống trực hệ:

Việc thu mẫu ngẫu nhiên dựa trên các cơ sở sau:

- Thu mẫu ngẫu nhiên ở nhiều địa phương khác nhau

- Quan sát hình thái học (người dân tộc Nùng có các đặc điểm nhân chủng học đặc trưng)

- Kiểm tra giấy tờ tùy thân (chứng minh thư nhân dân, giấy khai sinh )

- Hỏi trực tiếp người được thu mẫu, hoạc thông qua chính quyền địa phương Cách thu:

- Dùng kim chích đầu ngón tay lấy khoảng 1 giọt máu và thấm trực tiếp

vào giấy FTA

- Mẫu thu phải đảm bảo chất lượng, không bị lẫn, nhiễm, phơi khô tự nhiên, đóng gói riêng rẽ

2.1.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

a Hóa chất và thiết bị cho tách chiết ADN

b Hóa chất và thiết bị cho định lƣợng ADN

Biosystems)

c Hóa chất và thiết bị cho nhân bội và điện di

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Luận văn sử dụng các phương pháp nghiên cứu sau:

- Phương pháp lấy ý kiến chuyên gia:Tham khảo phương pháp thu mẫu, thu số liệu và sử lý số liệu

- Phương pháp thu mẫu ngẫu nhiên đảm bảo các điều kiện theo định luật Hardy - Weinberg

- Phương pháp thực nghiệm khoa học: phân tích kiểu gen 120 cá thể theo quy trình giám định ADN của Viện Khoa học hình sự

- Phương pháp thống kê số liệu sinh học để tính tần suất các alen trong

hệ Identifiler của dân tộc Nùng

2.2.1 Quy trình phân tích ADN

Chúng tôi tiến hành phân tích theo quy trình giám định ADN của Viện Khoa học hình sự đã được chuẩn hóa theo quy định tại Điều 42, khoản 2, mục

b của Luật Giám định tư pháp 2012, gồm các bước sau:

Tách chiết ADN (phương pháp vô cơ)

Định lượng ADN (phương pháp Real-time PCR)

Nhân bô ̣i ADN (PCR) (bộ Kit Identifiler)

Điện di mao quản (Máy AB3130) Phân tích kết quả

2.2.2 Xử lý thống kê số liệu và tính tần suất các locus gen

2.2.2.1 Cơ sơ ̉ lý thuyết

Để số liê ̣u nghiên cứu về các locus gen sử du ̣ng được cho những ứng du ̣ng

cụ thể, điều cần thiết đầu tiên là cần đánh giá xem mẫu n ghiên cứu với locus gen được phân tích có đảm bảo rằng cấu trúc di truyền của mẫu (tần số tương đối của các alen và tần số các kiểu gen ) là ổn định hay không qua các thế hệ , nghĩa là mẫu có tuân theo định luật Hardy - Weinberg hay không ?[2, 7, 36]

Do đó cần kiểm tra sự phù hợp giữa mẫu với quần thể cân bằng lý thuyết thông qua đánh giá chênh lê ̣ch giữa tần số quan sát thực tế với phân bố lý thuyết của các kiểu gen của mỗi locus gen được ng hiên cứu có sai khác nhau

hay không? [4, 36]

2.2.2.2 Phương pha ́ p xử lý thống kê

2.2.2.3 Cỏc bước tớnh toỏn thống kờ và kiểm định

- 120 kiểu gen cða 120 cá thể người Nùng được thống

kê tần số kiểu gen, tần số alen

locus được giả thiết tuõn theo định luật Hardy - Weinberg)

theo cụng thức

(tra bảng)

tờ́ phù hợp với phõn phụ́i lý thuyờ́t , nghĩa là mẫu phự hợp với quần thể lý thuyờ́t [7, 8, 11, 13]

- Cỏc số liệu thống kờ và tớnh toỏn trờn phần mềm Microsoft Office Excel 2003

Trong chương II luận văn trỡnh bày cỏc bước thu thập và bảo quản mẫu đỳng với qui trỡnh tiờn tiến tại cỏc phũng thớ nghiệm giỏm định ADN của cỏc nước trờn thế giới Cựng với đú là qui trỡnh giỏm định ADN của Viện Khoa học hỡnh sự đó được chuẩn húa theo quy định tại Điều 42, khoản 2, mục b Luật Giỏm định tư phỏp 2012

Sử dụng phương pháp thống kê phổ biến trong nghiên cứu Sinh học, do

là phù hợp.

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1 Phân tích kiểu gen của 15 locus gen từ 120 mẫu thu thập

3.1.1 Kết quả thu, bảo quản mẫu và tách chiết ADN

- Thu ngẫu nhiên được 120 mẫu máu của 120 người Nùng trên thẻ thu

mẫu FTA và bảo quản theo quy định tại phòng thí nghiệm ADN của Viện Khoa học hình sự (phụ lục 1)

- Mẫu máu sau khi thu được tiến hành tách chiết ADN theo phương pháp

vô cơ, định lượng ADN theo phương pháp Realtime PCR Do điều kiện thu mẫu tương đối tương đồng về các mặt khách quan như cán bộ thu mẫu, vật liệu thu mẫu và thời gian thu, bảo quản mẫu và sử dụng máy đục lỗ (Punching) để lấy mẫu với kích thước giống nhau nên trong thực nghiệm chỉ tiến hành định lượng 10 mẫu ngẫu nhiên từ 120 mẫu máu thu trên thẻ FTA và cho kết quả như sau:

Bảng 3.1: Kết quả định lượng ADN bằng phương pháp Realtime PCR

Mẫu N 1 N 5 N 10 N 18 N 26 N 67 N 73 N 87 N 95 N 120 Nồng

3.1.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR, điện di và phân tích kiểu gen

Toàn bộ 120 sau khi tách chiết AND phản ứng PCR với bộ kit Identifiler (thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt theo nhà sản xuất) phản ứng PCR được

thực hiện trên máy PCR 9700 Sau khi chạy phản ứng PCR, toàn bộ 120 mẫu được chạy điện di trên máy giải trình tự ADN ABI 3130 và phân tích kiểu gen bằng phần mềm GenemaperID v3.2

Kết quả chúng tôi đã thu được 120 bảng kiểu gen khác nhau của 120 mẫu

Hình 3.1: Hình ảnh kiểu gen dạng peak từ mẫu ký hiệu N14

Hình 3.2: Hình ảnh kiểu gen dạng peak từ mẫu ký hiệu N40