Nghiên ứu đa dạng di truyền tập đoàn lúa ó khả năng hịu mặn ủa việt nam bằng hỉ thị ssr

Trang 1 TRƯ NG ĐỜẠI H C BÁỌCH KHOA HÀ N I Ộ********** BÙI VĂN HIỆU NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN LÚA CÓ KHẢ NĂNG CHỊU MẶN CỦA VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ SSR LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌCC

TRƯ NG Đ Ờ Ạ I H C BÁ Ọ CH KHOA H À N I Ộ

**********

BÙI VĂN HIỆU

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN LÚA CÓ KHẢ NĂNG CHỊU MẶN CỦA VIỆT NAM

BẰNG CHỈ THỊ SSR

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2011

TRƯỜNG ĐẠ I HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS KHUẤT HỮU TRUNG

2 TS LÊ QUANG HÒA

HÀ NỘI – 2011

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Lúa gạo là cây lương thực quan trọng đối với con người Trên thế giới cây lúa được xếp vào vị trí thứ hai sau cây lúa mì về diện tích và sản lượng Ở Châu Á, lúa gạo được coi là cây lương thực quan trọng nhất, chiếm diện tích 135 triệu ha trong tổng số 148,4 triệu ha trồng lúa của toàn thế giới Trong tương lai, xu thế sử dụng lúa gạo sẽ còn tăng hơn vì đây là loại lương thực được sử dụng khá phổ biến, dễ bảo quản, dễ chế biến và cho năng lượng khá cao

Theo tính toán của Peng và cộng sự, đến năm 2030 sản lượng lúa của thế giới cần phải đạt 800 triệu tấn mới có thể đáp ứng được nhu cầu lương thực của con người [52] Với tình hình dân số tăng nhanh, thế giới sẽ phải đối mặt với nguy cơ thiếu lương thực Theo một nghiên cứu của Lobell, đến năm 2030 sản lượng lương thực ở châu Á

sẽ giảm khoảng 10%, đặc biệt là sản phẩm lúa gạo [38] Nguyên nhân năng suất và sản lượng lúa gạo giảm đi do ảnh hưởng bởi thiên tai, sâu bệnh và các yếu tố môi trường Trong đó, yếu tố đáng chú ý là hiện tượng đất nhiễm mặn Trên thế giới, đất trồng trọt

bị ảnh hưởng mặn ước khoảng 380 triệu ha, chiếm 1/3 tổng diện tích đất canh tác [3]

Việt Nam với đường bờ biển dài 3.620 km trải dài từ Bắc vào Nam, hàng năm những vùng trồng lúa ven biển chịu ảnh hưởng rất nhiều do sự xâm thực của biển Theo số liệu thống kê, diện tích đất ngập mặn năm 19 2 là 494.000 ha, đến năm 2000 8

là 606.792 ha [9] Theo báo cáo mới nhất của Cục trồng trọt, tại đồng bằng sông Cửu Long, xâm ngập mặn đã ảnh hưởng đến 620.000 ha/1.545.000 ha lúa đông xuân 2009-

2010, chiếm 40% diện tích toàn vùng tại các tỉnh ven biển như Tiền Giang, Trà Vinh, (Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang và Bến Tre Trong đó, diện tích có nguy )

cơ bị xâm ngập mặn cao khoảng 100.000 ha/650.000 ha, chiếm 16% diện tích canh tác lúa của các tỉnh trên Đặc biệt, trong điều kiện khí hậu toàn cầu đang thay đổi, hiện tượng băng tan ở hai cực, nước biển dâng lên đe dọa các vùng đất canh tác thấp ven biển Như vậy, đất nhiễm mặn là một trong những yếu tố chính gây khó khăn cho chiến lược phát triển sản lượng lúa gạo và là một thử thách lớn của mục tiêu đảm bảo

an ninh lương thực và xuất khẩu lúa gạo của Việt nam Chính vì vậy, việc chọn tạo giống lúa chịu mặn đang được đặt ra hết sức cấp bách và cần thiết.là

Trong tập đoàn quĩ gen lúa của Việt Nam có rất nhiều nguồn gen lúa chịu mặnthích nghi với điều kiện sinh thái ở các địa phương khác nhau, nhưng chưa được nghiên cứu và đánh giá một cách đầy đủ Hầu hết các giống chịu mặn có năng suất còn rất thấp Một số giống lúa được cải tiến, lai tạo và chọn lọc vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu của sản xuất Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài : “ Nghiên cứu đa dạng

di truyền tập đoàn lúa có khả năng chịu mặn của Việt Nam bằng chỉ thị SSR”

nhằm cung cấp các thông tin về các nguồn gen a chịu mặn phục vụ công tác bảo tồn lú

và chọn tạo giống lúa chịu mặn

2 Mục đích nghiên cứu

Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của tập đoàn giống lúa chịu mặn bản địa của Việt Nam ở mức phân tử và xác định mối quan hệ di truyền giữa các nguồn gen ở các địa phương khác nhau phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng có hiệu quả các nguồn gen lúa chịu mặn bản địa của Việt Nam

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của Đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Hiểu biết về đa dạng di truyền của các nguồn gen lúa chịu mặ tạo cơ sở lý luận n cho việc chọn lọc, phục tráng để nâng cao tiềm năng di truyền của các giống lúa chịu mặn trong sản xuất

Phát hiện sai khác di truyền của các giống lúa chịu mặn có ý nghĩa quan trọng trong việc ác định x các allele hiếm, allele đặc trưn để nhận dạng chính xác các nguồn g gen ưu tú phục vụ nghiên cứu lai tạo giống và định hướng cho công tác thu thập bảo tồn đa dạng nguồn gen lúa chịu mặn ở mức phân tử

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng :

Đối tượng nghiên cứu là cứu là tập đoàn 38 giống lúa có đặc tính chịu mặn được thu thập ở nhiều địa phương khác nhau, các giống này đang được lưu giữ và bảo tồn tại ngân hàng gen Cây trồng Quốc gia (Trung tâm Tài nguyên Thực vật) và ngân

hàng gen của Viện Lúa đồng bằng sông Cửa Long

4.2 Phạm vi nghiên cứu:

Đề tài nghiên cứu, đánh giá nguồn gen ở mức phân tử bằng chỉ thị SSR; Các thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Kĩ thuật Di truyền Viện Di Truyền Nông nghiệp -

CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU1:

1.1 Vài nét sơ lược về cây lúa

1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố của cây lúa

Tổ tiên cây lúa đã tồn tại từ đầu kỷ Phấn trắng Vào giữa kỷ này, xuất hiện một trong những loại nguyên thuỷ nhất thuộc tộc Oryzae, đó là loại Streptochasta Schrad Đến cuối kỷ Phấn trắng xuất hiện loại tre (Bambusa) và loại lúa (Oryza) Một số loại khác xuất hiện muộn hơn vào kỷ thứ ba, thời kỳ phát triển mạnh nhất của họ Hoà thảo (Gramineae) Các loài lúa Oryza spp có cùng tổ tiên chung vào thời địa cầu Gondwanaland, sau khi trái đất tách rời thành năm lục địa cách đây khoảng 85 90 triệu năm [- 4 ]

Theo Chang lúa trồng , Oryza sativa được tiến hoá từ cây lúa dại hàng năm Oryza nivara Do thích ứng với điều kiện khí hậu, đặc biệt là nhiệt độ, lúa Oryza sativa lại tiếp tục tiến hoá làm ba nhóm: Indica thích hợp với khí hậu nhiệt đới, Japonica thích ứng với khí hậu lạnh và cho năng suất cao và Javanica có đặc tính trung gian [18]

Theo Oka (1988) lại cho rằng Oryza sativa có nguồn gốc từ cây lúa dại lâu năm Oryza rufipogon [50]

Tác giả Cheng khi nghiên cứu di truyền tiến hoá của 101 giống lúa, bao gồm cả lúa trồng và lúa dại cho thấy loài lúa trồng Oryza sativa chia thành hai nhóm tương ứng với hai loài phụ là Indica và Japonica Trong khi đó Oryza rufipogon chia thành bốn nhóm, một nhóm là Oryza rufipogon hàng niên và ba nhóm Oryza rufipogon đa niên Kết quả cho thấy các giống lúa Japonica có quan hệ gần gũi với một nhóm Oryza rufipogon đa niên, còn các giống lúa Indica có quan hệ gần với nhóm lúa Oryza rufipogon hàng niên [20]

Ở châu Phi cả hai loài lúa dại Oryza longistaminata (đa niên) và Oryza brevigulata (hàng niên) đều hiện diện vì vậy, nhiều tác giả cho rằng , Oryza breviligulata là nguồn gốc của Oryza glaberrima [4]

Hiện nay, nhiều chuyên gia lúa gạo đồng ý rằng lúa glaberrima và lúa sativa

có cùng chung nguồn thủy tổ vào thời kỳ lục địa nguyên thuỷ Gondwanaland, nhưng sau khi các lục địa tách rời nhau, lúa sativa và glaberrima tự tiến hoá từ các loài lúa dại bản địa ở hai châu lục là châu Á và châu Phi (Khush, 1997) [36]

Hình 1.1 Sơ đồ tiến hoá của hai loài lúa trồng (Khush, 1997) [36]

Việc thuần hoá cây lúa diễn ra ở bán đảo Trung Ấn và được bắt đầu khoảng 10.000 - 15.000 năm trước, còn cây lúa trồng đã xuất hiện ở châu Á cách đây khoảng 8.000 năm [19,39]

Theo tác giả Chang thì O sativa được thuần hóa ở Nam Himalaya, vùng núi Đông Nam Á và Đông Nam Trung Quốc

Từ trung tâm phát sinh, cây lúa theo thời gian đã được di thực đi nhiều vùng sinh thái mới Qua quá trình chọn lọc tự nhiên và nhân tạo, cây lúa có khả năng thích nghi ngày càng rộng Hiện nay cây lúa được trồng trong những điều kiện , sinh thái và khí hậu rất khác nhau Lúa được trồng ở Tây Bắc Trung Quốc (50P

o

P

vĩ Bắc), ở miền Trung Xumatra trên đường xích đạo và ở cả New South Wales, châu

1.1.2 Phân loại

Cây lúa trồng thuộc họ Poaceae, trước đây gọi là họ Hoà thảo (Gramineae), họ phụ Pryzoideae, tộc Oryzae, chi Oryza, loài Oryza sativa và Oryza glaberrima Loài Oryza sativa là lúa trồng ở châu Á và Oryza glaberrima là lúa trồng ở châu Phi Năm

1753, Lineaeus là người đầu tiên đã mô tả và xếp loài lúa sativa thuộc chi Oryza Dựa vào mày hạt và dạng hạt tác giả đã phân chi Oryza thành bốn nhóm là sativa, granulata, coarctala, rhynchoryza và chi Oryza gồm tất cả 19 loài [4]

Morinaga là người đầu tiên đã sử dụng kỹ thuật phân tích genome để định danh các loài lúa dại Công trình nghiên cứu dựa trên cơ sở khoa học này đã giúp phân tích các loài lúa được chính xác hơn [4]

Hội nghị Di truyền lúa Quốc tế họp tại Philippines năm 1963 đã thống nhấtchia chi Oryza thành 19 loài Tại Hội nghị di truyền lúa Quốc tế tiếp theo ở Viện nghiên cứu lúa Quốc tế tại Philippines năm 1967) lại khẳng định chi ( Oryza có 22 loài trong đó có 20 loài lúa dại và hai loài lúa trồng [19]

Sau này, Vaughan phát hiện thêm một loài lúa dại mới ở Papua New Ginea là loài Oryza rhizomatis, đưa số loài của chi Oryza lên 23 loài và chia thành bốn nhóm genome Danh sách các loài, số lượng nhiễm sắc thể, bộ gen của từng loài ở Bảng 1.1 (Vaughan, 1994) [62]

Ngày nay, các nhà phân loại học đều nhất trí là chi Oryza có 23 loài trong đó 21 loài hoang dại và hai loài lúa trồng là Oryza sativa và Oryza glaberrimathuộc loại nhị bội 2n = 24 có bộ gen AA Loài Oryza glaberrima phân bố chủ yếu ở Tây và Trung Phi còn loài Oryza sativa được gieo trồng khắp thế giới và được chia thành hai loài phụ

là Indica và Japonica

Tác giả Vitte cũng cho rằng hai loài phụ Indica Japonicavà được phân hoá độc lập với nhau, cách đây khoảng 200.000 năm [63] Trong khi đó tác giả Jianxin dựa vào kết quả phân tích ADN nhân tế bào lại cho rằng lúa Indica và lúa Japonicađược tách

ra từ một tổ tiên chung, cách đây khoảng 440.000 năm [34]

Theo Tateoka (1963, 1964) Oryza được phân thành 22 loài rong đó, tác giả Tcũng thống nhất 2 loài lúa trồng O sativa L và O glaberrima Steud, nhưng xem dạng lúa Châu Phi (O perennis Moench) như là một loài riêng, dạng lúa Châu Á và Châu

Mỹ thuộc về loài O rufipogon Griff Tateoka cũng bổ sung 2 loài mới là O longiglumis Jansen và O angustifolia Hubbard(Bảng 1) [59,60 ]

Bảng 1.1 Các loài Oryza theo Takeoka (1963) với số nhiễm sắc thể,

kiểu gen và phân bố địa lý

Nhóm/loài 2n Kiểu gen Phân bố địa lý

Nhóm Oryzae

Sativa L 24 AA Khắp thế giới, lúa trồng Rufipogon Griff 24 AA Châu Á, Châu Mỹ

Barthii A Chev 24 AA Châu Phi

glaberrima Steud 24 AA Châu Phi, lúa trồng

breviligulata A Chev et Roehr 24 AA Châu Phi

australiensis Domin 24 EE Châu Úc

eichingeri A Peter 24 CC Châu Phi

punctata Kotschy 24, 48 BB, BBCC Châu Phi

officinalis Wall 24 CC Châu Á

minuta J.S Presl 48 BBCC Châu Á

latifolia Desv 48 CCDD Châu Mỹ

alta Swallen 48 CCDD Châu Mỹ

grandiglumis Prod 48 CCDD Châu Mỹ

ridleyi Hook F 48 Châu Á

longiglumis Jansen 48 New Guinea

Nhóm Angustifoliae

brachyantha A Chev et Roehr 24 FF Châu Phi

perrieri A Camus 24 Malagasy

Tisseranti A Chev 24 Châu Phi

Nhóm Coarctatae

Coarctata Roxb 48 Châu Á

Nguồn: Oka, 1988

Bảng 1.2 Đặc trưng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa

Đặc tính INDICA JAVANICA JAPONICA

Thân - Thân cao - Thân cao trung bình - Thân thấp

Chồi - Nở bụi mạnh - Nở bụi thấp - Nở bụi trung bình

Lá - Lá rộng, xanh nhạt - Lá rộng, cứng, xanh

nhạt - Lá hẹp, xanh đậm Hạt - Hạt thon dài, dẹp

- Hạt hầu như không

- Trấu có lông dài

- Tính quang cảm rất thay đổi

Nguồn: Chang, 1965

Hiện nay, diện tích trồng lúa chiếm hơn 1/10 diện tích đất trồng trọt trên thế giới và có 15 nước trên thế giới trồng lúa với diện tích hơn hơn 1 triệu ha (trong đó có tới 13 nước thuộc Châu Á Riêng Trung Quốc và Ấn Độ chiếm khoảng 50% diện tích )trồng lúa và 56% sản lượng lúa toàn cầu Bangladesh, Indonexia, Thái Lan mỗi nước đều có diện tích trồng lúa lớn hơn tổng diện tích trồng lúa của tất cả các nước Mĩ La tinh Cả châu Phi có diện tích trồng lúa gần bằng diện tích trồng lúa của Việt Nam, nhưng sản lượng lúa lại thấp hơn Việt Nam từ 2 3 lần - [12]

1.2 Đất nhiễm mặn

Đất mặn được xem là một trong những vấn đề cần quan tâm trên thế giới, bởi

nó ảnh hưởng rất lớn đến diện tích và năng suất cây trồng Tính chất vật lý và hoá học của đất mặn rất đa dạng, biến thiên tuỳ thuộc vào nguồn gốc của hiện tượng mặn, độ

pH của đất, hàm lượng chất hữu cơ trong đất, chế độ thuỷ văn và nhiệt độ [24]

Đất mặn chứa một lượng muối hoà tan trong nước ở vùng rễ cây, làm ảnh hưởng đến hoạt động sinh trưởng của cây trồng Mức độ gây hại của đất mặn tuỳ thuộc vào loài cây trồng, giống cây, thời gian sinh trưởng, các yếu tố môi trường đi kèm và tính chất của đất Do đó, người ta rất khó định nghĩa đất mặn một cách chính xác và đầy đủ Hội Khoa học Đất của Mỹ (SSSA) đã xác định đất mặn là đất có độ dẫn điện (EC) lớn hơn 2 dS/m, không kể đến hai giá trị khác: tỉ lệ hấp thu sodium (SAR) và pH

Tuy nhiên, hầu hết các định nghĩa khác đều chấp nhận đất mặn là đất có độ dẫn điện

EC cao hơn 4 dS/m ở điều kiện nhiệt độ là 25P

ẩm, cận nóng ẩm trên thế giới trong điều kiện thích hợp như vùng ven biển; hoặc mặn

do nước biển xâm nhập khi triều cường, lũ lụt; hoặc mặn do nước thấm theo chiều đứng hay chiều ngang từ thủy cấp bị nhiễm mặn [53]

Đất bị ảnh hưởng mặn chiếm 7% diện tích đất toàn thế giới (ước tính hơn 1 tỷ ha) Đất bị ảnh hưởng mặn ở đại lục thuộc châu Âu và Bắc Mỹ rất ít có khả năng trồng trọt Ở châu Phi và Nam Mỹ, khoảng 30% đất bị nhiễm mặn có khả năng trồng trọt Ở châu Á, hơn 80% đất bị ảnh hưởng mặn có khả năng trồng trọt và đã được khai thác cho sản xuất nông nghiệp iện tượng đất nhiễm mặn là mối đe dọa lớn nhất đến việc Hgia tăng sản lượng lúa gạo [24]

1.3 Các vùng lúa nhiễm mặn ở Việt Nam

Ở Việt Nam, do tác động của biển, các vùng nhiễm mặn tập trung chủ yếu ở hai vùng châu thổ lớn là đồng bằng sông Hồng (ĐBSH) và đồng bằng sông Cửu Long ( BSCL)Đ Ảnh hưởng của nước biển ở vùng cửa sông và đất liền ở ĐBSH chỉ khoảng

15 km, nhưng ở vùng ĐBSCL có thể xâm nhập tới 40 50 km Nhóm đất mặn có diện tích khoảng 1 triệu ha Căn cứ vào nồng độ muối hoà tan với tỷ lệ clo trong đó, Hội Khoa học Đất Việt Nam chia đất mặn ra theo bảng sau

1.3.1 Vùng lúa nhiễm mặn ở vùng đồng bằng sông Hồng

Ở đồng bằng sông Hồng trong mùa khô, sự xâm nhập mặn trở nên phổ biến đã

ảnh hưởng xấu đến sản xuất nông nghiệp, làm trở ngại cho nuôi trồng thủy hải sản Các con sông bị xâm nhập mặn hàng năm rất lớn (bảng 1.là 4)

Các vùng lúa nhiễm mặn ở ĐBSH thuộc các tỉnh: Thái Bình, Hải Phòng, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hóa Một số vùng ven biển thuộc Hải Phòng bị nhiễm mặn khoảng 20.000 ha ở cả hai dạng nhiễm mặn tiềm tàng và nhiễm mặn xâm nhiễm từ 0,3-0,5%, chủ yếu tập trung tạo các huyện: Kiến Thuỵ, Tiên Lãng, Thủy Nguyên, Vĩnh Bảo Tỉnh Thái Bình có khoảng 18.000 ha nhiễm mặn chủ yếu ở các huyện Thái Thụy, Tiền Hải, Kiến Xương Tỉnh Nam Định có khoảng 10.000 ha chủ yếu ở các huyện Nghĩa Hưng, Xuân Trường, Giao Thủy Tỉnh Thanh Hóa có khoảng 22.000 h a đất nhiễm mặn ở các huyện Hậu Lộc, Nga Sơn, Hoằng Hóa, Hà Trung riêng huyện Hậu Lộc có 8.000 ha do nước biển tràn vào sau mùa lũ năm 2005 [3]

Bảng 1 Tình hình xâm nhập mặn một số con sông ở châu thổ sông Hồng4Tên sông 0,1 L max.(km)* 0,1 L min.(km) 0,4 L max.(km)

* 0,1%; 0,4% = độ mặn; Lmax = chiều dài xâm nhập tối đa;

Lmin = Chiều dài xâm nhập tối thiểu

Dọc theo ven biển các tỉnh miền Trung đất cũng bị nhiễm mặn như Hà Tĩnh có khoảng 17.919 ha, Quảng Bình có hơn 9.300 ha bị nhiễm mặn và Ninh Thuận có gần 2.300 ha đất bị nhiễm mặn

1.3.2 Vùng lúa nhiễm mặn ở vùng đồng bằng sông Cửu Long

Diện tích tự nhiên khoảng 3,96 triệu ha, chiếm 12% diện tích cả nước, đồng bằng sông Cửu Long giữ một vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc dân Đây là vùng đất có ưu thế lớn về nông nghiệp với diện tích đất sản xuất nông nghiệp khoảng 2,9 triệu ha (sản lượng lương thực chiếm 50% tổng sản lượng lương thực của cả nước)

[1] Theo Trần Thanh Cảnh (1998), vùng ĐBSCL có các nhóm đất chính sau: (1) Đất phù sa có diện tích khoảng 1.180.000 ha, chiếm 30,1% diện tích toàn vùng; (2) Đất phèn mặn có diện tích khoảng 1.600.000 ha, ước tính 40,7% diện tích toàn vùng; (3) Đất mặn có diện tích là 744.000 ha, chiếm 18,9%, có độ phì tự nhiên cao nhưng bị nhiễm mặn nên việc tăng vụ, tăng năng suất trong sản xuất bị hạn chế; (4) Đất xám có diện tích khoảng 134.656 ha, chiếm 3,4% bao gồm đất xám trên phù sa cổ, đất xám đọng mùn gley trên phù sa cổ Toàn bộ diện tích tự nhiên của 8 tỉnh ven biển đồng bằng sông Cửu Long là 2,86 triệu ha, trong đó được phân bố ra 4 loại đất: phù sa cổ,

phù sa mới, đất mặt acid và đất mặn (hình 1.2)

Hình 1.2 Sự Phân bố tình trạng đất ở đồng bằng ông Cửu longs

Do ảnh hưởng của thủy triều, nước mặn từ biển thường tràn vào sâu trong đất liền vào mùa khô Các vùng lúa ven biển ĐBSCL thuộc các tỉnh: Sóc Trăng, Bến Tre, Tiền Giang, Trà Vinh, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang đều bị nhiễm mặn, nhiều hay ít tùy thuộc vào ảnh hưởng của thủy triều và hệ thống kênh ngòi, đê ngăn mặn của từng

vùng Độ mặn lớn nhất trong sông theo quy luật thường xuất hiện trùng với kỳ triều cường trong tháng, nước biển mặn vào sâu trong đất liền ở các vùng triều mạnh và có

ít nước thượng nguồn đổ về Do vậy, mức độ xâm nhập mặn tùy thuộc vào sự xâm nhập của nước biển và tùy vào mùa trong năm Cao điểm vào các tháng có lượng mưa thấp, khoảng tháng 3 dương lịch -4 [12]

Trước đây, diện tích bị xâm nhập mặn ở vùng ven biển ĐBSCL ở mức 1g/l là 2,1 triệu ha, mức 4 g/l là 1,7 triệu ha Gần đây, diện tích này đã giảm và đang biến đổi

do sự phát triển hạ tầng thủy lợi Qua chuỗi số liệu thực đo 10 năm (1991 000) ở -2ĐBSCL, Lê Sâm đã phân tích diễn biến nồng độ mặn, xác định đường đẳng trị mặn ứng với các trị số: 0,4 g/l, 2 g/l, 4 g/l, 16 g/l theo thời gian từng tháng trong mùa khô, tìm ra diễn biến mặn trung bình tháng 4 (tháng có nồng độ mặn cao nhất trong năm) trong thời gian 10 năm diện tích bị xâm nhập mặn >0,4 g/l là 2.126.635 ha (bảng 1.5) [6]

Bảng 1 Diện tích bị nhiễm mặn ở ĐBSCL trung bình tháng 4 (19915 -2000) STT Khu vực Độ mặn (g/l) Diện tích (ha) Tỷ lệ (%)

và tiềm ẩn các hậu quả xấu về môi trường

1.4 Tính chống chịu mặn của cây lúa

Đối với cây lúa, tính chống chịu mặn là một tiến trình sinh lý phức tạp, thay đổi

theo các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của cây [28] Tính trạng bất thụ của bông lúa khi bị stress do mặn được điều khiển bởi một số gen trội, nhưng các gen này không tiếp tục thể hiện ở các thế hệ sau Phân tích diallel về tính trạng chống chịu mặn, người

ta ghi nhận cả hai hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính với hệ số di truyền thấp (19,18%) và ảnh hưởng của môi trường rất lớn [54]

Rất nhiều nghiên cứu cho rằng, yếu tố di truyền tính chống chịu mặn biến động rất khác nhau giữa các giống lúa Vì vậy, muốn chọn giống lúa chống chịu mặn có hiệu quả, cần nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền tính chống chịu mặn, từ đó loại bỏ ngay từ những thế hệ đầu những dòng không đáp ứng được yêu cầu của nhà chọn giống Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn cho thấy, cả hai ảnh hưởng hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính đều có ý nghĩa trong di truyền tính chống chịu mặn [25]

Hiện nay, chúng ta có rất ít thông tin về kiểu hình chống chịu mặn ở giai đoạn trưởng thành của cây lúa Hầu hết các thí nghiệm đều được tiến hành trên giai đoạn mạ với quy mô quần thể hạn chế và chỉ số Na/K thường được dùng như một giá trị chỉ thị [28,44] Cây lúa nhiễm mặn có xu hướng hấp thu Na nhiều hơn cây chống chịu Ngược lại, cây chống chịu mặn hấp thu K nhiều hơn cây nhiễm Ngưỡng chống chịu NaCl của cây lúa là EC = 4 dS/m [44] Trong quá trình bị nhiễm mặn, nồng độ ion K+ trong tế bào được điều tiết tương thích với cơ chế điều tiết áp suất thẩm thấu và khả năng tăng trưởng tế bào Nhiều loài thực vật thuộc nhóm halophyte và một phần của nhóm glycophyte thực hiện hoạt động điều tiết áp suất thẩm thấu làm cản trở ảnh hưởng gây hại của mặn Hoạt động này sẽ giúp cây duy trì một lượng lớn K+ và hạn chế hấp thu Na+ [45]

1.4.1 Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa

Ảnh hưởng của mặn đến hoạt động sinh trưởng và phát triển của cây lúa, ở từng giai đoạn khác nhau thì mức độ thiệt hại khác nhau [54] Nhưng việc hám phá ra cơ kchế và những tổn hại trên cây lúa do mặn thì rất phức tạp, ngay cả dưới những điều kiện ngoại cảnh kiểm soát được Do đó, để nghiên cứu một cách đầy đủ về cơ chế chống chịu mặn của cây lúa phải chia ra nhiều giai đoạn về sự sinh trưởng và phát

triển Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa được biết thông qua nhiều công trình nghiên cứu [45]

Nhiễm mặn gây tổn hại đến cây lúa là do mất cân bằng thẩm thấu và tích lũy quá nhiều ion ClP

lá non duy trì sự sống và xanh Trong điều kiện thiệt hại nhẹ, trọng lượng khô có xu hướng tăng lên trong một thời gian, sau đó giảm nghiêm trọng do giảm diện tích lá Trong điều kiện thiệt hại nặng hơn, trọng lượng khô của chồi và rễ suy giảm tương ứng với mức độ thiệt hại [30]

Nhiều nghiên cứu còn cho thấy rằng, cây lúa chống chịu mặn trong suốt giai đoạn nẩy mầm lại trở nên rất nhiễm trong giai đoạn mạ non (giai đoạn 2 3 lá), sau đó -chống chịu trong giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, rồi lại nhiễm trong suốt giai đoạn thụ phấn và thụ tinh, cuối cùng trở nên chống chịu hơn trong giai đoạn chín [50,56]

Theo một nghiên cứu khác của Aslam và cs (1993), thấy rằng tại giai đoạn trổ bông cây lúa không mẫn cảm với mặn [16]

Ở cây lúa, hàm lượng muối đi vào chồi được điều chỉnh rất thấp Điều này có thể là do sự hấp thu chọn lọc rất hiệu quả đối với KP

nồng độ của Zn cao hơn so với dòng nhiễm IR28 Vai trò của Zn khi tham gia vào tính chống chịu mặn có thể là do nó làm gia tăng hàm lượng N trong chồi [44] Điều này dẫn tới việc sinh trưởng nhanh hơn và năng suất lúa cao hơn trong điều kiện mặn Như vậy, có sự liên quan giữa tính chống chịu mặn của cây với sự ngăn chặn hiệu quả các ion NaP

Bằng những thí nghiệm đánh giá tính chống chịu mặn ở giai đoạn mạ, trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida có độ mặn EC = 12 dS/m, các yếu tố môi trường được kiểm soát trong 19 ngày Kết quả cho thấy, sự tăng khả năng hấp thu KP

rễ Giá trị này là số lượng thực của những ion được di chuyển tới chồi trên đơn vị trọng lượng của rễ trong một đơn vị thời gian

Quan sát kiểu chết của lá lúa trong điều kiện nhiễm mặn cho chúng ta thấy rằng, có sự khác nhau về hàm lượng NaP

+

P

trong những lá khác nhau, tại bất cứ thời gian nào Những lá già bị chết trong khi những lá non hơn vẫn giữ màu xanh và sinh trưởng Đây là đặc điểm đặc trưng nhất trong cơ chế chống chịu mặn ở họ hòa thảo Cây lúa là một tập hợp gồm lá cây, đốt, bộ rễ, những nhánh có khả năng sống độc lập được tách ra Dạng sinh trưởng này giúp cây một lá mầm tự hủy những phần, bộ phận của cây dễ dàng hơn so với những cây hai lá mầm Vì vậy, rụng lá là một hiện tượng thông thường ở những cây một lá mầm có khả năng chống chịu mặn Do đó, khi phân tích trên những lá lúa sống trong môi trường mặn cho thấy rằng: có sự chênh lệch hàm

lượng muối từ lá này tới lá khác, muối luôn được tích lũy với nồng độ cao trong những

lá già và hiện tượng chết của những lá già là một cơ chế loại muối ra khỏi cơ thể Tất

cả những cơ chế này đều nhằm hạ thấp nồng độ NaP

1.4.2 Nghiên cứu di truyền về giống lúa chống chịu mặn

1.4.2.1 Nghiên cứu di truyền số lượng về tính chống chịu mặn của cây lúa

: Rất nhiều nghiên cứu cho rằng yếu tố di truyền tính chống chịu mặn biến động rất khác nhau giữa các giống lúa Vì vậy, muốn chọn giống lúa chống chịu mặn có hiệu quả, cần nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền tính chống chịu mặn, từ đó loại bỏ ngay từ những thế hệ đầu những dòng không đáp ứng được yêu cầu của nhà chọn giống Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn cho thấy, cả hai ảnh hưởng hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính đều có ý nghĩa trong di truyền tính chống chịu mặn [25]

Bằng những thí nghiệm đánh giá tính chống chịu mặn giai đoạn mạ của cây lúa trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida có độ mặn tương đối cao (EC = 12 dS/m) trong môi trường kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh, người ta thấy rằng, tính trạng chiều dài chồi, hàm lượng Na và K ở trong chồi, khối lượng khô của chồi và rễ thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa giống chống chịu và giống nhiễm, tính trạng này chủ yếu được điều khiển do hoạt động của một nhóm gen cộng tính Hệ số di truyền tính chống chịu thông qua các tính trạng này rất thấp [61]

Theo Mishra và cs (1990), trong giai đoạn trưởng thành của cây lúa, tính trạng chiều cao cây, năng suất, trong điều kiện mặn được điều khiển bởi nhóm gen cộng tính [42]

Do ảnh hưởng rất lớn của môi trường bên ngoài, sự thể hiện di truyền là rất thấp trong các tính trạng Bằng phương pháp lai diallel đầy đủ Gregorio và Senadhira (1993) cho rằng: có thể tìm ra một số cặp lai tốt phục vụ cho chương trình ưu thế lai Nghiên cứu về di truyền số lượng tính chống chịu mặn thông qua lai diallel 6 x 6, năng

suất thể hiện hoạt động của một nhóm gen cộng tính không có ý nghĩa trong điều kiện bình thường, nhưng trở nên có ý nghĩa trong điều kiện xử lý mặn Năng suất lúa bị giảm là do ảnh hưởng của mặn Trong một số giống lúa, ưu thế hoạt động của gen cộng tính đối với năng suất là điều kiện thuận lợi cho chọn lọc giống cho môi trường mặn [30]

Nghiên cứu về các thông số di truyền Mishra và cs (1996) cho rằng, chiều dài bông và khối lượng hạt chịu tác động rất ít bởi các yếu tố môi trường, nếu như chọn giống chống chịu mặn dựa vào hai tính trạng này sẽ không hiệu quả Khối lượng bông,

số hạt chắc trên bông, chiều cao cây có hệ số path rất cao trong môi trường mặn Chính ba tính trạng này đóng góp phần lớn trong việc tăng năng suất lúa trong môi trường mặn [42] Thêm nữa, theo nghiên cứu của Narayanan và cs (1990), số hạt chắc trên bông, chiều dài bông là tính trạng chính đóng góp vào năng suất của các giống lúa trong những vùng đất bị nhiễm mặn [46]

1.4.2.2 Nghiên cứu di truyền phân tử về tính chống chịu mặn của cây lúa

Bản đồ QTL (Quantitative Trait loci) được áp dụng trong trường hợp những tính trạng mục tiêu do đa gen điều khiển (tính chống chịu mặn, hạn, lạnh, .) Di truyền số lượng truyền thống không thể phát hiện QTL trên những loci riêng biệt gắn với tính trạng số lượng đang nghiên cứu, vị trí của nó trên nhiễm sắc thể và liên kết của nó với những gen khác Bản đồ di truyền phân tử với mật độ cao số lượng marker phủ trên toàn bộ nhiễm sắc thể trong hệ gen cây trồng có thể cung cấp cho chúng ta công cụ có khả năng nghiên cứu tính trạng di truyền số lượng phức tạp, định vị gen trên những nhiễm sắc thể và xác định các gen mục tiêu liên kết với gen khác

Teng (1994) đã sử dụng quần thể cận giao tái tổ hợp (RI) thế hệ F8 bao gồm

324 cá thể thuộc tổ hợp lai giữa IR29/Nona Broka để nghiên cứu di truyền tính chống chịu mặn của cây lúa Các dòng RI được thanh lọc mặn trong nhà lưới ở điều kiện EC

= 15 dS/m và điều kiện đồng ruộng Phân tích RFLP với 5 enzyme phân cắt hạn chế (Dra EcoI, RV, HindIII, Sca XbaI) cho thấy trong 266 RFLP marker, có 117I, RFLP marker thể hiện đa hình (43,98%), phủ trên hệ gen cây lúa với mật độ 15 cM/quãng RG100 và RZ323 được ghi nhận cho đa hình rõ nhất Có13 marker định vị gần RG100

và RZ323 trên nhiễm sắc thể số 3 cũng được sử dụng để xem xét liên kết gen Phân

tích ANOVA một chiều chứng minh Nona Broka mang allele (allele) kháng liên kết với RG100 và RZ323 tại các loci số lượng Khi phân tích ANOVA hai chiều, tác giả phát hiện thêm RZ323 (trên nhiễm sắc thể số 3) và RG333 (trên nhiễm sắc thể số 8) liên kết với QTL chống chịu mặn Các cá thể tái tổ hợp mang allele từ Nona Broka ở locus RZ323 và từ IR29 ở locus RG333 có kiểu hình sống sót lâu hơn trong môi trường mặn so với những tổ hợp khác [61]

Bản đồ QTL (trên cơ sở AFLP và STS marker) cho thấy gen chủ lực điều khiển tính trạng chống chịu mặn định vị trên nhiễm sắc thể số 1 (saltol) Bên cạnh gen chủ lực, 3 QTL được ghi nhận có quan hệ với tính trạng hấp thu K cao, 4 QTL có quan hệ với tính trạng hấp thu Na thấp và 3 QTL có quan hệ với tính trạng tỷ số Na/K thấp Những QTL này định vị trên nhiễm sắc thể số 1, 3, 4, 10 và 12 [14, 23 33 , ]

Kawasaki và cs (2001) đã sử dụng kĩ thuật microarray để theo dõi sự thể hiện của phân tử transcript và từng quá trình thể hiện gen điều khiển tính chống chịu mặn trong cây lúa Trên cơ sở thư viện cDNA ly trích từ rễ lúa và bộ marker EST của hệ gen cây lúa chống chịu mặn pokkali, người ta đã áp dụng kỹ thuật microarray để kiểm soát những transcript trong việc so sánh với nghiệm thức không xử lý mặn, thời gian thay đổi từ 15 phút đến 1 tuần lễ trong điều kiện gây mặn nhân tạo Vật liệu được sử dụng là giống lúa pokkali (chuẩn kháng) và giống IR29 (chuẩn nhiễm) Nhóm tác giả này tập trung xem xét phản ứng đối với stress do mặn trong quần thể lai có 1782 transcript dẫn suất từ rễ của cây bị xử lý mặn (NaCl ở nồng độ 150mM) Kết quả này cho thấy một tiến trình điều tiết gen chức năng với nhiều mức đồ khác nhau của transcript Trong giai đoạn đầu tiên, đáp ứng của IR29 chậm hơn so với pokkali Sau 3-6 giờ xử lý mặn, mức độ phong phú của transcript thay đổi nhanh trong Pokkali, còn IR29 có sự suy giảm trong vòng 3 giờ đầu gây nên cái chết của giống này ngay sau đó [22]

1.5 Chỉ thị phân tử SSR và ứng dụng trong nghiên cứu, xác định gen chống chịu mặn

1.5.1 Chỉ thị phân tử SSR

Simple sequence repeat (SSR) là một trong những chỉ thị phân tử quan trọng nhất SSR marker được sử dụng rộng rãi trong dấu chuẩn phân tử ADN, lập bản đồ,

MAS, và trong những nghiên cứu về đá dạng di truyền và di truyền quần thể SSR hay microsatelites (các vi vệ tinh) là trình tự ADN lặp tồn tại trong hệ gen sinh vật, có chiều dài khác nhau, phân bố một cách ngẫu nhiên Mỗi đơn vị lặp thường có số lượng không vượt quá 5 nucleotit (có tài liệu nói đoạn lặp có thể có từ 1-6 nucleotit) [61] Số lần lặp lại của mỗi đơn vị có thể từ 10 đến 100 lần Ở lúa người ta đã phát hiện ra các kiểu trình tự lặp như: GA, GT, CAT, CTT

Các đoạn ADN nhắc lại có trình tự hai đầu rất đặc trưng Bởi vậy trình tự đặc trưng ở hai đầu của đoạn nhắc lại được sử dụng để thiết kế mồi cho phản ứng PCR Do

có sự khác nhau về chiều dài giữa các đoạn nhắc lại mà kỹ thuật này rất phù hợp trong nghiên cứu đa hình, lập bản đồ và phân lập gen Cũng giống như kỹ thuật RADP, kỹ thuật SSR đơn giản, thuận tiện, không tốn kém Mặt khác, SSR là chỉ thị đồng trội nên

nó được sử dụng để phát hiện các cá thể dị hợp tử, và lập bản đồ gen khi sử dụng quần thể F2 [5]

1.5.2 Ứng dụng của chỉ thị SSR trong xác định gen chống chịu mặn

Trên thực tế, việc chọn giống chống chịu stress mặn dựa trên kiểu hình rất khó

do có sự tương tác giữa các gen Nhờ chỉ thị phân tử mà công việc xác định gen chống chịu mặn, chọn, tạo giống chống chịu trở lên dễ dàng, chủ động và chính xác hơn

Xác định gen kháng bằng chỉ thị phân tử nghĩa là sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết chặt với các gen kháng và các QTLs để chọn được các cá thể mang gen kháng trong quần thể phân li Độ chính xác của phương pháp này có thể lớn hơn 99,75% khi gen kháng kẹp giữa hai chỉ thị liên kết với gen kháng đó và khoảng cách di truyền từ chỉ thị phân tử đến gen kháng nhỏ hơn 5cM Bằng cách chọn lọc này, các tổ hợp gen kháng khác nhau được chọn lọc là dựa trên kiểu gen thay vì dựa trên kiểu hình [68]

Về cơ bản các loại chỉ thị trên đều có thể được ứng dụng để lập bản đồ di truyền hoặc nghiên cứu sự đa dạng di truyền hoặc phân lập gen, hoặc xác định gen,… Tuy nhiên, mỗi loại chỉ thị có ưu nhược điểm riêng vì thế tuỳ vào mục đích, yêu cầu và điều kiện cụ thể của mỗi nghiên cứu mà lựa chọn sử dụng chỉ thị nào cho thích hợp

Trong số các chỉ thị phân tử, thì SSR có nhiều ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, nhanh, chính xác, độ đa hình cao và kinh tế

Sự phát triển của marker phân tử và bản đồ gen cây lúa trong những năm gần đây đã được ứng dụng vào mục đích xác định các QTL điều khiển tính chống chịu mặn của cây, hiện diện trên các nhiễm sắc thể khác nhau Các nghiên cứu của Gregorio (1997) và Niones (2004) đã lập được bản đồ gen rất chi tiết cho QTL

“Saltol” hiện diện trên nhiễm sắc thể số 1, quyết định tới khoảng 40 65% tính chống chịu mặn của lúa [26 47] ,

-Mohammadi và cs (2008) [43] thí nghiệm 33 SSR marker đa hình trên đoạn Saltol của nhiễm sắc thể số 1 nhằm xác định mức độ liên kết và hữu dụng của các marker này trong chọn giống chống chịu mặn Các SSR marker này được dùng để thử nghiệm trên 36 giống lúa được phân loại thành 5 nhóm: rất chống chịu, chống chịu, chịu mặn trung bình, nhiễm mặn và rất nhiễm mặn qua thanh lọc mặn nhân tạo Trong

số 33 marker, 6 marker: RM10745, RM1287, RM8094, RM3412, RM493 và RM140 liên kết chặt với đoạn Saltol ở vị trí 10.8-12.28 Mb Đoạn Saltol được có thể nằm trong vị trí có chứa các marker RM8094, RM3412, RM493 Các giống lúa: IR70023, IR65858, IR69588, IR74105, IR71832, IR74099, Cherivirrupo và IR66946-3R-178-1-

1 (FL478) có sản phẩm PCR giống như sản phẩm PCR của Pokkali khi được nhân bản bởi marker RM 8094 và cho tính chống chịu rất tốt hoặc tốt đối với mặn Do đó, marker RM8094 thể hiện liên kết thuận và chặt chẽ với tính kháng mặn ở giai đoạn

mạ Mohammadi và cs (2008) càng khuyến cáo việc sử dụng hai marker RM8094 và RM10745 trong xác định kiểu gen của cây lúa chống chịu mặn có mang đoạn QTL Saltol trong các chương trình lai tạo giống lúa chịu mặn [43]

Hình 1.3 Đoạn gen Saltol trên nhiễm sắc thể số 1 của lúa, vị trí xác định

của các SSR marker [46]

Lang và cs (2001) đã sử dụng 74 chỉ thị RFLP kết hợp với 91 cặp mồi SSR trên quần thể RIL F8 của tổ hợp lai Tenasai 2 / CB và đã lập được bản đồ QTL của một số tính trạng mục tiêu liên quan đến hiện tượng chống chịu mặn ở cây lúa (Hình 1.4) [3]

Bùi Chí Bửu và (2000) đã sử dụng 30 SSR marker để lập bản đồ gen cho tính cs chống chịu mặn của quần thể F3 gồm 257 cá thể phân ly, phát triển từ tổ hợp lai IR28/Đốc Phụng Các tác giả đã xác định 10 SSR marker cho đa hình của các sản phẩm PCR giữa các cá thể phân ly và bố mẹ Tuy nhiên chỉ có marker RM223 liên kết với gen chống chịu mặn với khoảng cách là 6,3 cM trên nhiễm sắc thể số 8 RM223 nhân bản đoạn ADN có kích thước 120 bp, liên kết với gen chống chịu mặn, từ giống Đốc Phụng và sản phẩm PCR có kích thước 160 bp từ giống nhiễm IR28 [3] Nguyễn Thị Lang và cs (2001) báo cáo marker OSR1 và RM315 liên kết với QTL cho tính chống chịu mặn ở lúa, định vị trên nhiễm sắc thể số 1 [3]

27T

1.6 Chọn tạo giống lúa chịu mặn

27T

1.6.1 Chọn tạo lúa chịu mặn trên thế giới

Các quốc gia trên thế giới, đã và đang tiến hành chọn tạo và canh tác có hiệu quả một số giống lúa chịu mặn Nhiều nguồn giống lúa mùa địa phương như Nona Broka, Burarata chống chịu tốt với điều kiện mặn tương đương với giống Pokkali đã được xác định

Những năm cuối thế kỷ 20, các nhà chọn tạo giống đã sử dụng những biến đổi

di truyền để tạo ra những giống lúa có tiềm năng năng suất cao, chất lượng gạo tốt, kháng một số sâu bệnh chính và chống chịu với những điều kiện bất lợi như khô hạn, ngập úng, mặn Trong chiến lược chọn tạo giống lúa chống chịu mặn, Viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI), từ năm 1977 1980 đã tiến hành chọn được những dòng lúa chống -chịu mặn tốt như IR42, IR4432-28-5, IR4595-4-1, IR463-22-2, IR9884-54-3 Năng suất đạt 3,6 tấn/ha trung bình cho tất cả 25 thí nghiệm Những giốn lúa cải tiến này g cho năng suất cao hơn những lúa cổ truyền 2 tấn/ha [53]

Gregorio và cs (2002) đã báo cáo kết quả nuôi cấy tế bào soma lúa để tạo ra các biến dị soma chống chịu mặn Từ giống lúa Pokkali (lúa mùa cao cây, cảm quang, yếu

rạ, lá dài to bản và rũ, đẻ chồi ít, gạo màu đỏ, phẩm chất gạo xấu), tác giả đã thu được dòng biến dị soma TCCP226-2-49-B-B-3 là giống lúa cao sản, thấp cây, sinh trưởng

mạnh, chống chịu mặn cao như Pokkali, gạo có màu trắng và phẩm chất gạo tốt hơn giống gốc, cho năng suất cao hơn nhiều so với Pokkali Giống lúaTCCP226-2-49-B-B-

3 đã được sử dụng trong các chương trình tạo giống lúa chịu mặn tại nhiều trung tâm nghiên cứu lúa trên thế giới [27]

Năm 1993, IRRI phát triển giống lúa IR66946, một giống lúa chống chịu mặn khá tốt từ tổ hợp lai của Pokkali/IR29 Từ đó hướng lai tạo tập trung vào lai chuyển gen chống chịu mặn từ Pokkali và một số giống lúa mùa địa phương có tính chống chịu mặn bằng phương pháp hồi giao vào các nguồn giống lúa cao sản thích nghi với từng vùng sinh thái trồng lúa riêng biệt [30] Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp lai tạo truyền thống là mất nhiều thời gian Thông thường thì 6 8 lần hồi giao cần -được thực hiện, tương đương với 3 4 năm lai tạo Một khó khăn khác thường gặp -trong lai tạo giống mới là đôi khi có mối liên kết khá chặt chẽ giữa tính trạng chống chịu mặn với các tính trạng xấu, không mong muốn, thường được lai chuyển vào con lai cùng lúc Các gen điều khiển tính trạng không mong muốn này ảnh hưởng xấu đến biểu hiện của con lai Do đó, lai tạo cho tính trạng chống chịu mặn trong vài trường hợp mất đến 10 hoặc 15 năm để phát triển một giống lúa mới [22]

Ngoài ra, việc lai tạo giống lúa chống chịu mặn còn gặp khó khăn do bản chất

đa gen của tính trạng chống chịu mặn Biểu hiện tính chống chịu mặn của một giống lúa bị ảnh hưởng rất lớn của điều kiện ngoại cảnh Theo Islam (2004) thì hệ số di truyền của tính chống chịu mặn thấp (<19,18%), nên tính chống chịu mặn của các dòng con lai thường không cao như bố me có gen sẵn có [31]

Để khắc phục một phần nhược điểm của phương pháp lai tạo truyền thống, người ta kết hợp với các phương pháp sinh học phân tử

(1996)

Xu và cs đã chuyển gen hvaI của lúa mạch vào giống lúa Nipponbare Cây lúa chuyển gen và không chuyển gen sau 3 tuần tuổi được xử lý mặn 2 vòng: lần đầu với 200 mM NaCl trong 10 ngày, tiếp theo là không xử lý mặn 10 ngày; lần hai xử

lý mặn 30 ngày với 50 mMNaCl Tác giả ghi nhận là cây lúa chuyển gen có tốc độ sinh trưởng và phục hồi tốt hơn cây lúa không chuyển gen khi bị xử lý mặn và không

xử lý mặn [65]

-Jang và cs đã chuyển gen trehalose 6 phosphate synthase và trehalose

6-phosphate phosphatase dưới sự kiểm soát của promoter ubiquitine của bắp, đã làm gia tăng sự tích luỹ của treholose trong cây lúa chuyển nạp gen và làm tăng tính chống chịu mặn, hạn, lạnh [54]

(2002) Ohta và cs cũng đã chuyển gen Na+/H+ antipoter vào giống lúa mẫn cảm với mặn Kinhuikari Cây lúa chuyển nạp gen sống sót sau khi thanh lọc mặn ở mức 300 mM NaCl trong 3 ngày, các cây lúa không được chuyển gen đều chết [49]

Nagamiya và cs (2007) lại chuyển nạp gen kat E, một catalase gen, vào giống lúa japonica Các cây lúa được chuyển gen sống và phát triển hơn 14 ngày trong môi trường mặn có hàm lượng muối 250 mM, trổ bông và cho hạt ở nồng độ muối 100

mM Khi đánh giá mức độ biểu hiện của gen catalase trong cây lúa được chuyển gen, hoạt động của enzyme Catalase tăng lên khoảng 1,5 2,5 lần so với cây lúa không được -chuyển gen [47]

27T

1.6.2 Chọn tạo giống lúa chống chịu mặn ở Việt Nam

Từ năm 1992 1995 Viện Khoa học Nông nghiệp Miền Nam đã tiến hành thanh lọc mặn cho 88 giống lúa địa phương và 100 giống lúa nước của IRRI với giống Pokkali làm đối chứng chống chịu mặn Kết quả chọn được 14 giống triển vọng, trong

-đó có 2 giống từ bộ giống của IRRI là: FRG67, ROHYD15 và 12 giống lúa từ tập đoàn giống của cổ truyền là: lúa Tiêu, Ba Lê, Đốc Đỏ, Nàng Thước Dài, Chân Hương, Tam sắc, Nàng Quốc Nhuyễn, Nưng Hương 2, Nàng Hương 3, Nàng Co đỏ, Bảy Dảnh, Một Bụi trong đó đặc biệt chú ý đến giống FRG67, có nguồn gốc từ Pakistan, cho năng suất cao, chống chịu mặn tốt, phẩm chất gạo tốt [12]

Nguyễn Thị Lang và , 2002 đánh giá tính chống chịu mặn của 62 giống lúa cổ cstruyền, với Pokkali là giống chuẩn kháng và giống IR29 là giống chuẩn nhiễm đã thu được các giống chống chịu mặn là: Nếp áo Già, Trắng Điệp, Móng Chim, Móng Chim Rơi và Nếp Bờ Giếng [7]

Đặng Minh Tâm và Nguyễn Thị Lang (2003) đã nuôi cấy mô 10 giống, bao gồm lúa mùa địa phương và cao sản chống chịu mặn khá (cấp 3 5) Kết quả cho thấy- : trong môi trường có chứa NaCl ở mức 1,0 và 1,5% cho tỷ lệ tái sinh cao [10]

Đỗ Hữu Ất (2005) đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong cải tạo một

số giống lúa địa phương vùng đồng bằng ven biển Bắc Bộ Kết quả gây đột biến nguồn

Coban (Co60) đã cho ra những biến dị có lợi cho chọn giống Các giống lúa CM1, CM5, là những giống tạo ra cho vùng mặn, kết hợp được những đặc tính chống chịu mặn, kháng đổ ngã, kháng bệnh và cho năng suất cao [2]

Ngô Đình Thức (2006) cũng đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và nuôi cấy túi phấn trong chọn tạo giống lúa chịu mặn đạt được kết quả khả quan Tác giả tạo được 8 dòng biến dị soma từ OM576, IR64, Basmati và VD20 có khả năng chống chịu mặn ở cấp 5 khi thanh lọc ở giai đoạn mạ với EC = 12 dS/m [13]

Viện 24TLúa đồng bằng sông Cửu Long từ năm 2009 đến nay đã bước đầu tìm 30 24T

dòng 24Tlúa có triển vọng chịu mặn là những dòng lúa kế thừa, được phát hiện chịu mặn24T 24T 24T 24T 24T 24T 24T

qua nhiều lần thanh lọc trong phòng thí nghiệm và nhà lưới Một số 24Tgiống lúa mới của 24T 24T

Viện 24TLúa đồng bằng sông Cửu Long xác định có khả năng kháng mặn khá cao như: 24T 24T 24T 24T

OM6976, OM6677, OM5464, OM5629, OM5166, OM 5451, OM 4059 và OM 6164

đã và đang được khảo nghiệm ở một số tỉnh như Sóc Trăng, Kiên Giang, Bến Tre, Bạc Liêu Kết quả khảo nghiệm ban đầu ghi nhận khá khả quan, trong đó 24Tgiống lúa 24T 24T 24T

OM5464 đang được đề nghị nhân rộng và trình Bộ Nông nghiệp và PTNT công nhận

là 24Tgiống lúa sản xuất thử trong năm 2010 Hai giống OM6976 và OM5166 đang được 24T 24T 24T 24T

tiếp tục khảo nghiệm, xác định biện pháp kỹ thuật thích hợp để tăng tính chịu 24Tmặn 24Tvànăng suất của 24Tgiống Hai 24T 24Tgiống 24T 24Tlúa 24Tmới này dự kiến xin công nhận trong năm 2011

CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2

2.1 Vật liệu

2.1.1 Vật liệ thự vật u c

Vật liệu nghiên cứu là tập đoàn 38 giống có đặc tính chịu mặn được thu thập ở nhiều địa phương khác nhau, các giống này đang được lưu giữ và bảo tồn tại ngân hàng gen Cây trồng Quốc gia (Trung tâm Tài nguyên Thực vật) và ngân hàng gen của Viện Lúa đồng bằng sông Cửa Long (bảng 2.1)

Bảng 2.1: Danh sách tập đoàn 38 giống lúa nghiên cứu

TT Kí hiệu Tên giống Thu mẫu Nguồn gốc

1 M1 Chiêm đá Hạt Quảng Ninh

2 M2 Lúa mặn Hạt Quảng Nam Đà Nẵng

3 M3 Nếp mặn Hạt Quảng Nam Đà Nẵng

4 M4 Nước mặn Hạt Quảng Nam Đà Nẵng

5 M5 Háu trắng Hạt Thừa Thiên Huế

Bảng 2.1: Danh sách tập đoàn 38 giống lúa nghiên cứu

• Hoá chất tách chiết ADN

Hoá chất tách chiết ADN bao gồm các loại như: Tris HCl, EDTA, SDS, NaCl, CTAB, Chloroform, isopropanol, isoamyl alcohol, Ethanol của các hãng Sigma, Merck, Prolabo, ICN và Labscan

- Đệm tách chiết ADN tổng số (đệm CTAB):

CTAB 1%

Tris-HCl 0,1M

,0 EDTA 0,5M, pH 8NaCl 5M

-β mercapthoethanol 14M

- TBE 5x (Tris-borat buffer):

Tris baseBoric acid EDTA 0,5M, pH 8,0

- TE buffer pH = 8,0

Tris 1M, pH = 8,0NaCl 5M

EDTA 0,5M, pH 8,0

• Hoá chất dùng để chạy phản ứng PCR:

- Đệm PCR 1 (10 mM Tris HCl pH8, 1,5 mM MgCl2 , 5 mM KCl) x hoặc đệm PCR 1x của Quiagen, Invitrogen

MgCl2 của Fermentas, Invitrogen

- dNTPs (dATP, dGTP, dCT, dTTP) của Fermentas, Invitrogen

- Mồi, Marker 1 kb, Marker GeneRulerP

TM

P

ADN Ladder Ultra Low của hãng Fermentas, Invitrogen

- Taq polymerase của Fermentas, Invitrogen

• Hoá chất chạy điện di:

- Điện di gel polyacrylamide gồm các hóa chất: acrylamide, APS,

Temed, hất nhuộm Bromophenol blue, Ethidium bromidec

• Các mồi SSR:

30 cặp mồi SSR được được sử dụng để phân tích thuộc các locus RM được chọn lọc từ 2240 cặp mồi, do hãng Invitrogen cung cấp dựa vào các thông tin về trình tự, kích thước, số allele chuẩn trên mỗi locus, vị trí phân bố của các locus ở trên 12 NST khác nhau đã được McCouch (2002) và cộng sự công bố (bảng 2.1) [40]

Bảng 2 : Thông tin về các cặp mồi nghiên cứu2

TT Tên mồi Trình tự mồi NST Kích thước

Bảng 2 : Thông tin về các cặp mồi nghiên cứu (tiếp theo)2

TT Tên mồi Trình tự mồi NST Kích thước