Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền một số giống chè đặc sản trồng tại thái nguyên bằng kĩ thuật ssr

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LÊ QUANG THƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ GIỐNG CHÈ ĐẶC SẢN TRỒNG TẠI THÁI NGUYÊN BẰNG KĨ THUẬT SSR LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2014 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LÊ QUANG THƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ GIỐNG CHÈ ĐẶC SẢN TRỒNG TẠI THÁI NGUYÊN BẰNG KĨ THUẬT SSR Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS HOÀNG THỊ THU YẾN THÁI NGUYÊN - 2014 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu chúng tơi Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình khác Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả Lê Quang Thƣơng ii LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Hồng Thị Thu Yến Giảng viên Khoa Khoa học Sự sống - Trƣờng Đại học Khoa học - ngƣời tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm q báu để tơi hồn thành luận văn Tôi xin cảm ơn thầy cô tập thể cán phịng thí nghiệm Khoa Khoa học Sự sống, cảm ơn lãnh đạo Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn tới cán công tác Viện Khoa học sống - Đại học Thái Nguyên nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Nhân dịp xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ, Công ty chè Sông Cầu - Huyện Đồng Hỷ - Thành Phố Thái Nguyên, nhân dân vùng chè Trại Cài - Minh Lập - Đồng Hỷ Vùng chè Tân Cƣơng Thành Phố Thái Nguyên giúp đỡ thời gian thu thập vật liệu nghiên cứu làm đề tài Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới tồn thể gia đình, cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp nhóm nghiên cứu di truyền ln cổ vũ, động viên suốt thời gian qua Tác giả Lê Quang Thƣơng iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây chè 1.1.1 Nguồn gốc phân loại chè 1.1.2 Đặc điểm di truyền chè 1.1.3 Tình hình sản xuất chè giới Việt Nam 1.1.4 Đặc điểm số dòng chè trồng Thái Nguyên 1.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng genome chè Việt Nam giới 13 1.2.1 Tình hình nghiên cứu đa dạng genome chè giới 13 1.2.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng genome chè Việt Nam 15 1.3 Một số phƣơng pháp sinh học phân tử sử dụng nghiên cứu tính đa dạng genome sinh vật 17 1.3.1 Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms - đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn) 17 1.3.2 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - đa hình độ dài đoạn đƣợc nhân chọn lọc) 18 1.3.3 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 18 1.3.4 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat - trình tự lặp lại đơn giản) 19 iv Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu nghiên cứu 22 2.1.1 Nguyên liệu 22 2.1.2 Hóa chất 22 2.1.3 Thiết bị 23 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Phƣơng pháp thu thập mẫu chè 23 2.2.2 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số 23 2.2.3 Phƣơng pháp điện di DNA gel agarose 25 2.2.4 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng kiểm tra độ tinh DNA tổng số 26 2.2.5 Phƣơng pháp PCR - SSR 26 2.2.6 Phân tích số liệu 28 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Tách chiết DNA tổng số từ chè 29 3.2 Phân tích thị SSR mẫu chè nghiên cứu 31 3.3 Mối quan hệ di truyền mẫu chè nghiên cứu dựa phân tích PCR - SSR 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 53 v NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT Nghĩa tiếng Việt Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh bp Cặp base base pair đtg Cộng et al DNA Axit Deoxynucleic Deoxyribonucleic acid EDTA EDTA Ethyen Diamin Tetraacetic Acid kb Kilo base Kilobase = 1000 bp PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp Polymerase Chain Reaction RNA Axit Ribonucleic Ribonucleic Acid TAE TAE Tris acetat EDTA VNTR VNTR Variable Number of Tandem Repeat RAPD DNA đa hình đƣợc khuếch đại ngẫu nhiên Random Amplify Polymorphism DNA Primer F Mồi xuôi Primer Forward Primer R Mồi ngƣợc Primer Reverse SSR Trình tự lặp lại đơn giản Simple Sequence Repeat Đa hình độ dài đoạn đƣợc Amplified Fragment Length nhân chọn lọc Polymorphism AFLP RFLP Đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn Restriction Fragment Length Polymorphism EtBr EtBr Ethidium Bromide dNTP dNTP Deoxynucleoside triphosphate PIC PIC Polymorphism Information Content vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Sản lƣợng chè số nƣớc gới Bảng 1.2 Khối lƣợng xuất chè số nƣớc xuất giai đoạn 2006-2010 Bảng 1.3 Diện tích, sản lƣợng, xuất chè Việt Nam Bảng 1.4 Cơ cấu giống chè tỉnh Thái Nguyên giai đoạn 2001 - 2010 10 Bảng 2.1 Danh sách tên đị a điểm thu mâũ 25 mẫu chè nghiên cứu 22 Bảng 2.2 Danh mục thiết bị, dụng cụ đƣợc sử dụng 23 Bảng 2.3 Danh sách cặp mồi SSR đƣợc sử dụng nghiên cứu 27 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR - SSR 28 Bảng 2.5 Chu trì nh nhiệt phản ƣ́ng PCR - SSR 28 Bảng 3.1 Phổ hấp thụ DNA bƣớc sóng 260nm 280nm nồng độ DNA tổng số 25 mẫu chè 30 Bảng 3.2 Tổng số phân đoạn DNA sản phẩm PCR - SSR với cặp mồi 32 Bảng 3.3 Số phân đoạn DNA xuất số phân đoạn DNA đa hình mồi 33 Bảng 3.4 Bảng hệ số tƣơng đồng di truyền 25 mẫu chè nghiên cứu 42 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh số giống chè đặc sản trồng Thái Nguyên 10 Hình 1.2 Đa hình DNA SSR cá thể có motif (AT)n 21 Hình 3.1 Ảnh điện di DNA tổng số gel agarose 0.8% 25 mẫu chè nghiên cứu 29 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm SSR 25 mẫu chè với mồi YS28 34 Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR 25 mẫu chè với mồi YS64 35 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR 25 mẫu chè với mồi YS27 36 Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR 25 mẫu chè với mồi YS98 37 Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR 25 mẫu chè với mồi YS83 37 Hình 3.7 Điện di sản phẩm PCR - SSR với mồi YTS104 38 Hình 3.8 Điện di sản phẩm PCR - SSR với mồi YS3 39 Hình 3.9 Sơ đồ quan hệ di truyền 25 mẫu chè nghiên cứu 44 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Cây chè (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) thuộc họ chè Theaceae loại trồng lƣu niên có thời gian thu lợi kinh tế kéo dài đến 60 năm Sản xuất chế biến chè trở thành ngành kinh tế nông nghiệp quan trọng nhiều quốc gia với sản phẩm tạo có giá trị xuất cao Chè (trà) không thức uống giải khát hàng ngày mà nét văn hóa đặc trƣng, thứ nghệ thuật (Trà đạo) ngƣời dân châu Á Từ kinh nghiệm dân gian nghiên cứu khoa học gần khẳng định giá trị chè sức khỏe Ở Việt Nam, phát triển chè 10 chƣơng trì nh trọng điểm về phát triển nông nghiệp nông thôn, nƣớc ta có một số vùng trồng chè lớn nhƣ : vùng chè Tây Bắc, vùng chè Việt Bắc, vùng chè trung du Bắc Bộ, vùng chè Bắc Trung Bộ , vùng chè Tây Nguyên… [13] Theo thống kê Việt Nam có khoảng 120 giống chè, bên cạnh giống chè lai có suất cao đƣợc trồng phổ biến nhiều vùng nƣớc thì, giống chè địa phƣơng suất khơng cao nhƣng lại có chất lƣợng tốt, đƣợc coi đặc sản Hiện có nhiều phƣơng pháp để nghiên cứu đa dạng di truyền giống trồng nói chung chè nói riêng nhƣ RADP, RFLP, AFLP, SSR,… Các phƣơng pháp khắc phục đƣợc nhƣợc điểm phƣơng pháp chọn giống truyền thống đánh giá đƣợc hệ gen trồng Trong năm gần đây, diện tích trồng giống chè địa phƣơng có xu hƣớng giảm, nhiều giống chè quí bị dần Nhƣ vậy, việc tìm hiểu nghiên cứu giống chè đặc sản địa phƣơng góp phần bảo tồn nguồn gen chè cần thiết Nghiên cứu đa dạng di truyền mức độ DNA sở khoa học để đề xuất việc lựa chọn giống chè có suất cao, chất lƣợng tốt, góp phần bảo tồn phát triển nguồn gen Từ tuyển chọn giống chè đặc sản 43 Hệ số tƣơng đồng di truyền phản ánh quan hệ di truyền mẫu chè nghiên cứu với Hai mẫu chè gần mặt di truyền hệ số tƣơng đồng chúng lớn ngƣợc lại hai mẫu chè có hệ số tƣơng đồng di truyền thấp mối quan hệ di truyền chúng xa Bảng 3.4 thể hệ số tƣơng đồng di truyền cặp mẫu chè nghiên cứu Từ kết ta thấy, hệ số di truyền 25 mẫu chè nghiên cứu đƣợc thu thập từ địa điểm khác dao động khoảng từ 0,44 đến 0,97 Trong đó, hai giống M1 (chè Keo Am Tích - C.ty chè Sơng Cầu) M2 (chè Hùng Đỉnh Bạch - C.ty chè Sông Cầu), mẫu M10 (chè Bát Tiên Công ty chè Sông Cầu) M11 (Yakatamidozi - Cơng ty chè Sơng Cầu) có hệ số tƣơng đồng lớn 0,97; cặp giống M18 (chè LDP2 - Xã Tân Cƣơng) M20 (chè Trung Du - xã Tân Cƣơng), mẫu M18 (chè LDP2 Xã Tân Cƣơng) M22 (chè Kim Tuyên - Xã Trại Cài), mẫu M8 (chè Yabukita - Công ty chè Sông Cầu) M24 (chè LDP1 - Xã Trại Cài) có hệ số tƣơng đồng thấp 0,44 Sau phân tích hệ số đồng dạng, chúng tơi tiến hành xây dựng sơ đồ hình thể hình 3.9 để sai khác di truyền mẫu chè nghiên cứu Mức độ khác đƣợc biểu hệ số sai khác mẫu chè nghiên cứu Các mẫu nghiên cứu có hệ số di truyền cao đƣợc xếp vào nhóm nhóm lại có liên kết với 44 Hình 3.9 Sơ đồ quan hệ di truyền 25 mẫu chè nghiên cứu Biểu đồ hình (hình 3.9) tạo đƣợc phân tích 25 mẫu chè nghiên cứu với cặp mồi SSR chia làm nhóm chính:  Nhóm I: gồm mẫu chè M18 (chè LDP2 - xã Tân Cƣơng) mẫu nghiên cứu có hệ số di truyền sai khác so với mẫu khác nghiên cứu thuộc nhóm II 0,43 (1 - 0,57)  Nhóm II: bao gồm 24 mẫu chè lại tiếp tục phân thành nhánh phụ: + Nhánh phụ I: bao gồm 12 mẫu chè M9, M10, M11, M12, M13 (thu thập Công ty chè Sông Cầu), M19, M20 (thu thập Xã Tân Cƣơng), M21, M22, M23, M24, M25 (thu thập Xã Trại Cài) Các mẫu thuộc nhánh có hệ số di truyền sai khác so với mẫu thuộc nhánh phụ II 0,18 (1 - 0,82) Trong nhánh phụ lại chia thành cụm (cụm cụm 2): Cụm 1: gồm mẫu M9, M19, M12, M25, M13 Hệ số di truyền sai khác mẫu so với mẫu chè cụm 0,18 (1 - 0,82) Cụm 2: gồm mẫu M10, M11, M20, M22, M23, M24, M21 Trong đó, cặp mẫu M10 M11 (thu thập Cơng ty chè Sơng Cầu) có hệ số tƣơng đồng di truyền cao 0,97 Tiếp theo cặp mẫu M20 (thu thập Xã 45 Tân Cƣơng) M22 (thu thập Xã Trại Cài) có hệ số tƣơng đồng di truyền cao thứ hai 0,94 + Nhánh phụ II: gồm 12 mẫu lại chia thành cụm (cụm 1’ cụm 2’): - Cụm 1’: gồm mẫu chè M1, M2, M7, M8 (thu thập Công ty chè Sông Cầu), M16, M15, M17 (thu thập Xã Tân Cƣơng) Hệ số di truyền sai khác cụm so với mẫu chè cụm 2’ 0,08 (1 - 0,92) Điều đáng ý cụm có cặp mẫu M1 M2 có hệ số di truyền tƣơng đồng cao 0,97 - Cụm 2’: gồm mẫu M3, M4, M14, M5, M6 (thu thập Công ty chè Sơng Cầu), mẫu có hệ số tƣơng đồng di truyền 0,88 Từ kết phân nhóm trên, chúng tơi nhận thấy tính đa hình 25 mẫu chè nghiên cứu phạm vi phân tích cặp mồi SSR phản ứng PCR SSR chứng minh cho khác cấu trúc DNA mẫu chè nghiên cứu Qua việc phân tích biểu đồ quan hệ di truyền bảng hệ số tƣơng đồng di truyền thấy giống chè mức độ đa dạng di truyền cao thể mức độ sai khác di truyền dao động từ 0,03 đến 0,43 chứng minh đƣợc sai khác cấu trúc gen mẫu chè nghiên cứu Trong 25 mẫu chè nghiên cứu đƣợc thu từ địa điểm trồng chè khác (xã Tân Cƣơng, xã Trại Cài, Công ty chè Sông Cầu) Tuy nhiên, mẫu chè từ giống nhƣng thu thập từ địa điểm khác có sai khác hệ số di truyền Do đó, để tìm đƣợc thị SSR đặc trƣng cho giống chè cần nghiên cứu nhiều mẫu nhiều mồi 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Đã tách chiết đƣợc DNA tổng số 25 mẫu chè nghiên cứu thu thập tỉnh Thái Nguyên Qua kiểm tra cho thấy, mẫu DNA tổng số tách chiết đƣợc có chất lƣợng tốt, đảm bảo dùng thí nghiệm Với cặp mồi việc thực kỹ thuật PCR - SSR nhân đƣợc 254 phân đoạn DNA từ hệ gen 25 mẫu chè nghiên cứu Trong số cặp mồi đƣợc sử dụng thể tính đa hình Xây dựng đƣợc sơ đồ quan hệ di truyền cho thấy 25 mẫu chè nghiên cứu chia thành nhóm chính, hệ số tƣơng đồng di truyền nhóm 57% Kiến nghị Cần kết hợp thị SSR với thị phân tử nhƣ RFLP, AFLP, RAPD thị hình thái… để phân tích đa dạng di truyền mẫu chè nhằm đạt độ tin cậy cao hơn, mở rộng nghiên cứu đa dạng di truyền giống địa phƣơng nhằm phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen chè 47 CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Hoàng Thị Thu Yến, Lê Quang Thƣơng, Dƣơng Thị Nhung, Hà Thị Loan (2014), "Nghiên cứu thị phân tử SSR số giống/dòng chè trồng Thái Ngun", Tạp chí khoa học & cơng nghệ Thái Nguyên, tập 120, số 06, tr 93-99 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học cải tiến giống trồng, NXB Nông nghiệp Đƣờng Hồng Dật (2004), Cây chè các biện pháp nâng cao suất và chất lượng sản phẩm, NXB Lao động - Xã hội, tr:5-53 Chu Thúc Đạt (2003), Đánh giá tiềm phát triển chè nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng, phát triển, suất chất lượng số giống chè Thái Nguyên, Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Trịnh Đình Đạt (2007), Cơng nghệ sinh học - tập 4, NXB Giáo dục Hiệp hội chè Việt Nam (2011), “Báo cáo Tổng kết công tác năm 2010 phương hướng công tác năm 2011” Nguyễn Thị Thu Hƣơng, Nguyễn Thị Thu Phƣơng, Hoàng Văn Chung, Hoàng Thị Thu Yến (2010), “Bƣớc đầu nghiên cứu đa dạng di truyền số dòng chè Shan (Camellia sinensis var Assamica (Mast) Pierre sec Phamh) kỹ thuật RAPD”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Thái Nguyên, 65, tr:149-157 Lê Tất Khƣơng (1997), Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng, phát triển số giống chè biện pháp kĩ thuật nâng cao suất chất lượng chè vụ Đông - Xuân Bắc Thái, Luận án PTS Khoa học Nông nghiệp Lê Tất Khƣơng, Hoàng Văn Chung, Đỗ Ngọc Oanh (1999), Giáo trình chè, NXB Nơng nghiệp Nguyễn Hữu La, Lê Trần Bình (2004), “Nghiên cứu đa dạng di truyền số dòng chè Shan Phú Hộ thị RAPD”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nơng thôn, 10, tr:31-33 10 Nguyễn Hữu La (1998), “Thu thập, bảo quản, đánh giá tập đoàn giống chè Phú Hộ”, Tuyển tập cơng trình nghiên cứu chè 1988 - 1997, Nhà xuất Nông nghiệp, tr:191-207 49 11 Trần Đì nh Long , Mai Hoàng Thạch , Hồng Tuyết Minh (1997), Chọn giớng trờng, Giáo trình cao học Nơng Nghiệp, NXB Nơng nghiệp 12 Lã Tuấn Nghĩa, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý (2004), Cơ sở lý thuyết ứng dụng công nghệ gen chọn tạo giống trồng, NXB Nông nghiệp 13 Đỗ Ngọc Quý , Đỗ Thị Ngọc Oanh (2008), Kỹ thuật trồng chế biến chè suất cao - chất lượng tốt, NXB Nông nghiệp, tr:7-66 14 Đỗ Ngọc Quý, Lê Thất Khƣơng (2000), Giáo trình chè sản xuất, chế biến và tiêu thụ, NXB Nông nghiệp 15 Vũ Thị Quý (2013), “Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học biện pháp kỹ thuật canh tác cho số giống chè nhập nội Thái Nguyên”, Luận án Tiến sĩ nông nghiệp, tr:70-71 16 Trần Đức Trung (2009), “Nghiên cứu đa dạng di truyền giống/ dòng chè (Camellina sinensis(L.)O Kuntze) Việt Nam thị hình thái thị phân tử microsatellite(SSR)”, Luận văn Thạc sĩ, Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội TÀI LIỆU TIẾNG ANH 17 Chen L., Yamaguchi S (2005), “RAPD markers for discriminating tea germplasms at the inter-specific level in China”, Plant Breeding, 124, pp:404-409 18 Dikshirt H.K., Jhang T., Kondal N.K., Bansal K.C., Chandra N., Tickoo J.N., Ksharma T.R (2006), “Genetic differentiantion of Vigna specie by RAPD, URP and SSR marker”, Biology Plantarum journal, pp:451-457 19 Holton T.A (2001), “Plant genotyping by analysis of microsatellite”, Plant Genotyping: the DNA fingerprinting of plant, CAB International 20 Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J (1990) ,“PCR protocol: Aguile to methods and ampilication” Academic Press, pp:482 21 Jeffrey A., Thompson, Nelson R.L (1998), “Identification of diverse soybean germplasm using RADP markers”, Crop Sci, pp:1348-1355 50 22 Kondo K (1979), “Cytological studies in cultivated species of camellia”, Japan J Breed, 29(3), pp:205-210 23 Lee S., Kim J., Sano J (2003), “Phylogenetic relationships among tea cultivars based on AFLP analysis”, Journal of Faculty of Agriculture, Kyushu University, 47(2), pp:289-299 24 Legesse B.W., Myburg A.A., Pixley K.V., Botha A.M (2007), “Genetic diversity of African maize inbred lines revealed by SSR markers”, Hereditas, 144(1), pp:10-17 25 Ma J.Q., Zhou Y.H., Ma C.L., Yao M.Z., Jin J.Q., Wang X.C., Chen L (2010)“ identification and characterization of 74 novel polymorphic EST - SSR markers in the tea plant, Camellia sinensis (Theaceae)”, American Journal of Botany: 97(12), pp:153-156 26 Miranda O.K., Rios L.P., Augusto F.G.A., Zagatto Paterniani M.E., de Souza A.P (2004), “Evaluating genetic relationships between tropical maize inbred lines by means of AFLP profiling”, Hereditas, 140(1), pp:24-33 27 Mishra R.K., Mandi S.S (2004), “Molecular profiling and development of DNA marker associated with drought tolerance in tea clones growing in Darjeeling), Current Science, 87 (1), pp:60-66 28 Mondal T.K (2004), “Biotechnological improvement of tea”, ISB new report 29 Qilun Y., Kecheng Y., Guangtang P., Tingzhao R (2007), Genetic Diversity of Maize (Zea mays L.) Landraces from Southwest China Based on SSR, Genetic Diversity of Maize (Zea mays S.) Landraces from Southwest China Based on SSR, 34(9), pp:851-860 30 Raina S.N.V., Kojima T., Ogihara Y., Singh K.P., Devarumath R.M (2001), “RAPD and SSR figerprints as useful genetic marker for analysis of genetic diversity, varietal identification, and phylogenetic relationships in peanut (Arachis hypogaea L.) cultirs and wild species”, Genome, 44(5), pp:763-772 51 31 Sain S.M., Priyadarshan, P.M., (2009), Breeding Plantation Tree Crops: Tropical Species, pp:545-589 32 Scott K.D (2001), “Microsatellite derived from ESTs, and their comparison with those derived by other methods”, Plant Genotyping: the DNA fingerprinting of plant, CAB International 33 Sharma R.K., Bhardwaj P., Negi R., Mohapatra R., Ahuja P.S (2009), “Identification characterization and utilization of unigene derived microsatellite markers in tea (Camellia sinensis L.)”, BioMed Central, pp:7-12 34 Sharopova N., McMullen M.D., Schultz L., Schroeder S., SanchezVilleda H., Gardiner J., et al (2002) “Development and mapping of SSR markers for maize”, Plant Mol Biol 48(5-6), pp:463-481 35 Singh D., Ahuja P.S (2006), “5S rDNA gene diversity in tea (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) and its use for variety identification”, Genome, 49, pp:91-96 36 Somasundaram S.T, Kalaiselvam M (2007), Molecular tool for assessing genetic diversity 37 Tanaka J., Taniguchi F (2006), “Estimation of genome size of tea (Camellia sinensis), Camellia (C japonica), and their interspecific hybrids by flow cytometry”, Chagyo Kenkyu Hokoku, 101, pp:1-7 38 Tautz D (1993), “Notes on the difinition and nomenclature of tandemly repetitive DNA sequences”, DNA fingerprinting: State of science, Birkhauser, Switzerland, pp:21-28 39 Trojanowska M.R., Bolibok H (2004), “Characteris and comparison of three classes of microsatellite-based markers and their application in plants”, Cellular & molecular biology letters, 9, pp:221-238 40 Ujihara T., Ohta, R., Hayashi, N et al (2009), “Identifiaction od Japanese and Chinese green tea cultivars by using simple sequence repeat markers to encourage proper labeling”, Biosci Biotechnol Biochem., 73 (1), pp:15-20 52 41 Welsh J., McClelland M (1990), "Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primer", Nucleic Acids Res, 18, pp:7213-7218 42 Wen S.C., Huan, H.Y et al (2008), “RAPD analysis on genetic diversity of typical tea population in Hunan Province, China”, Journal of Agricultural Biotechnology, 5, (1), pp:67-72 43 William J.G.K, Kubelik A.E., Levak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V (1990), “DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic merers”, Nucleic Acids Res, 18, pp:6531-6535 44 Yao M.Z, Chen L., Liang Y.K (2008), “Genetic diversity among tea cultivars from China, Japan and Kenya revealed by ISSR markers and its implication for parental selection in tea breeding programmes”, Plant Breeding, 127 (2), pp:166-172 53 Phụ lục Bảng Số phân đoạn DNA đƣợc nhân điện di sản phẩm PCR - SSR 25 mẫu chè nghiên cứu với mồi YS28 (M1 - M25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự bảng 2.1) YS28 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 290bp 0 0 0 0 0 0 300bp 1 0 0 1 1 1 310bp 0 1 0 0 0 0 320bp 0 0 1 0 0 0 Tổng 1 1 1 1 1 1 YS28 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 M24 M25 290bp 0 0 1 0 0 0 300bp 1 0 1 1 0 310bp 0 0 0 0 0 320bp 0 0 0 0 0 1 Tổng 1 1 1 1 1 1 Bảng Số phân đoạn DNA đƣợc nhân điện di sản phẩm PCR - SSR 25 mẫu chè nghiên cứu với mồi YS64 (M1 - M25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự bảng 2.1) YS64 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 270bp 0 0 0 0 0 0 280bp 1 0 0 1 300bp 0 1 1 0 310bp 0 0 0 0 0 1 Tổng 1 1 1 1 1 2 YS64 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 M24 M25 270bp 0 0 1 0 0 0 280bp 0 0 1 1 1 300bp 1 0 0 0 0 310bp 0 0 0 0 0 0 Tổng 1 1 1 1 1 1 (M1 - M25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự bảng 2.1) 54 Bảng Số phân đoạn DNA đƣợc nhân điện di sản phẩm PCR - SSR 25 mẫu chè nghiên cứu với mồi YS27 (M1 - M25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự bảng 2.1) YS27 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 130bp 0 0 0 0 0 0 140bp 0 0 0 0 1 1 150bp 1 1 1 1 0 0 180bp 0 0 1 1 1 Tổng 1 1 2 2 2 YS27 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 M24 M25 130bp 0 0 0 0 0 140bp 0 0 1 1 1 150bp 1 1 0 0 0 180bp 0 0 0 0 0 0 Tổng 1 1 1 1 1 1 (M1 - M25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự bảng 2.1) Bảng Số phân đoạn DNA đƣợc nhân điện di sản phẩm PCR - SSR 25 mẫu chè nghiên cứu với mồi YS98 (M1 - M25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự bảng 2.1) YS98 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 240bp 1 1 1 1 1 1 590bp 0 0 0 0 0 600bp 1 1 1 1 1 Tổng 2 2 2 2 2 2 YS98 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 M24 M25 240bp 1 1 1 1 1 1 590bp 0 0 0 0 0 600bp 1 0 1 0 Tổng 2 2 2 1 (M1 - M25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự bảng 2.1) 55 Bảng Số phân đoạn DNA đƣợc nhân điện di sản phẩm PCR - SSR 25 mẫu chè nghiên cứu với mồi YS83 (M1 - M25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự bảng 2.1) YS83 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 290bp 0 0 0 0 0 0 300bp 1 0 1 1 0 320bp 0 1 0 0 1 Tổng 1 1 1 1 1 1 M24 M25 YS83 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 290bp 0 0 1 0 0 0 300bp 1 0 1 1 0 320bp 0 0 0 0 1 Tổng 1 1 1 1 1 1 (M1 - M25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự bảng 2.1) Bảng Số phân đoạn DNA đƣợc nhân điện di sản phẩm PCR - SSR 25 mẫu chè nghiên cứu với mồi YTS104 (M1 - M25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự bảng 2.1) YTS104 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 280bp 0 0 0 0 0 0 290bp 0 0 0 0 0 0 300bp 0 0 0 1 1 1 310bp 1 1 1 0 0 0 320bp 0 0 0 0 0 0 Tổng 1 1 1 1 1 1 M11 M12 M13 YTS104 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 M24 M25 280bp 0 0 0 0 0 0 290bp 0 0 0 0 0 300bp 1 1 0 1 310bp 0 0 0 0 0 0 320bp 0 0 0 1 1 Tổng 1 1 1 1 1 1 (M1 - M25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự bảng 2.1) 56 Bảng Số phân đoạn DNA đƣợc nhân điện di sản phẩm PCR - SSR 25 mẫu chè nghiên cứu với mồi YS3 (M1 - M25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự bảng 2.1) YS3 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 120bp 1 1 1 1 0 0 140bp 0 0 0 0 1 1 160bp 0 0 0 0 0 0 Tổng 1 1 1 1 1 1 YS3 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 M24 M25 120bp 1 1 0 0 0 140bp 0 0 1 1 1 160bp 0 0 0 0 Tổng 1 1 1 1 1 1 (M1 - M25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự bảng 2.1) Bảng Số phân đoạn DNA đƣợc nhân điện di sản phẩm PCR - SSR 25 mẫu chè nghiên cứu với mồi YS19 (M1 - M25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự bảng 2.1) YS19 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 370bp 0 0 0 0 0 380bp 0 0 0 0 0 0 390bp 0 0 1 0 400bp 0 1 0 0 1 Tổng 1 1 1 1 1 1 YS19 M14 370bp 0 0 0 0 0 0 380bp 0 0 0 0 0 390bp 0 1 0 0 400bp 1 0 0 1 Tổng 1 1 1 1 1 M10 M11 M12 M13 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 M24 M25 (M1 - M25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự bảng 2.1) 57 Bảng Số phân đoạn DNA đƣợc nhân điện di sản phẩm PCR - SSR 25 mẫu chè nghiên cứu với mồi YS46 (M1 - M25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự bảng 2.1) YS46 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 190bp 0 0 0 0 0 200bp 1 1 1 1 1 1 220bp 0 0 0 0 0 0 310bp 0 0 0 0 0 0 Tổng 1 1 1 1 1 1 YS46 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 M24 M25 190bp 0 0 0 0 0 200bp 0 0 1 1 220bp 1 0 0 0 0 310bp 0 0 0 Tổng 1 1 2 (M1 - M25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự bảng 2.1)