Nghiên cứu chế tạo vật liệu trên cơ sở nanocomposite carbon ứng dụng trong cảm biến glucose

Nghiên cứu chế tạo vật liệu trên cơ sở nanocomposite carbon ứng dụng trong cảm biến glucose Nghiên cứu chế tạo vật liệu trên cơ sở nanocomposite carbon ứng dụng trong cảm biến glucose Nghiên cứu chế tạo vật liệu trên cơ sở nanocomposite carbon ứng dụng trong cảm biến glucose Nghiên cứu chế tạo vật liệu trên cơ sở nanocomposite carbon ứng dụng trong cảm biến glucose Nghiên cứu chế tạo vật liệu trên cơ sở nanocomposite carbon ứng dụng trong cảm biến glucose Nghiên cứu chế tạo vật liệu trên cơ sở nanocomposite carbon ứng dụng trong cảm biến glucose Nghiên cứu chế tạo vật liệu trên cơ sở nanocomposite carbon ứng dụng trong cảm biến glucose Nghiên cứu chế tạo vật liệu trên cơ sở nanocomposite carbon ứng dụng trong cảm biến glucose Nghiên cứu chế tạo vật liệu trên cơ sở nanocomposite carbon ứng dụng trong cảm biến glucose Nghiên cứu chế tạo vật liệu trên cơ sở nanocomposite carbon ứng dụng trong cảm biến glucose Nghiên cứu chế tạo vật liệu trên cơ sở nanocomposite carbon ứng dụng trong cảm biến glucose

Cảmbiếnsinh học

Định nghĩavàcấutạocảmbiếnsinh học

Cảm biến sinh học (biosensor) được định nghĩa bởi Hiệp hội quốc tế về hóa học ứng dụng – IUPAC vào năm 1999 là thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng Cảm biến bao gồm một phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp với một phần tử chuyển đổi tín hiệu (transducer) Chất gắn trên phần tử chuyển đổi gọi là "phần tử dò" và chất cần phân tích trong mẫu được gọi là "phần tử đích" Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học dựa trên các phản ứng đặc hiệu như kháng nguyên/kháng thể, lai hóa DNA-DNA, hoặc enzym/cơ chất Phần tử nhận biết sinh học có nhiệm vụ dò tìm đối tượng đích trong mẫu, trong khi phần tử chuyển đổi chuyển đổi tương tác sinh học thành tín hiệu điện hóa, quang, hoặc nhiệt, sau đó đưa qua bộ phận xử lý tín hiệu để hiển thị kết quả đo.

Có nhiều dạng chuyển đổi tín hiệu, bao gồm chuyển đổi điện hóa, quang, nhiệt, tinh thể áp điện và hệ vi cơ Trong số đó, cảm biến sinh học dựa trên nguyên lý điện hóa có nhiều ứng dụng trong phân tích các đối tượng sinh học nhờ độ nhạy cao và khả năng trích xuất thông tin để chuyển đổi thành các thiết bị cầm tay Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học điện hóa là chuyển đổi tín hiệu phản ứng sinh học giữa phần tử nhận biết sinh học và phần tử đích trong dung dịch điện ly thành các tín hiệu được nhận biết bởi kỹ thuật điện hóa Các kỹ thuật này cho phép đánh giá định lượng nồng độ hoặc định tính sự có mặt của các thành phần sinh học như DNA hay kháng nguyên/kháng thể trong dung dịch Tuy nhiên, cảm biến sinh học điện hóa cũng gặp một số nhược điểm, bao gồm chi phí cao cho thiết bị nghiên cứu và điện cực, cùng với quy trình gia công phức tạp.

Cảm biến sinh học so màu có khả năng phát hiện bệnh thông qua sự chuyển màu của các chất chỉ thị, với phương pháp thực hiện đơn giản và dễ dàng Điều này giúp chúng trở thành công cụ tin cậy trong các xét nghiệm như ELISA cho bệnh ung thư, cúm và các bệnh do virus tại bệnh viện.

Cácthànhphầncủacảmbiếnsinhhọc

Cảm biến sinh học là thiết bị sử dụng các phần tử sinh học như enzym, kháng thể, chuỗi DNA, RNA, hoặc protein để phát hiện các chất cần phân tích Mối quan hệ giữa đầu dò và đối tượng cần phát hiện được phân loại thành ba nhóm chính.

Đầu dò DNA, RNA hoặc axit nucleic peptide có ứng dụng quan trọng trong việc phát hiện các đoạn DNA hoặc RNA, phục vụ cho nghiên cứu sinh học, xét nghiệm huyết thống và bệnh tật Những cảm biến này hoạt động dựa trên các cặp ghép bổ sung, mang lại độ nhạy cao và tính chọn lọc vượt trội Hiện nay, oligonucleotide tổng hợp (ODNs) là loại đầu dò chủ yếu được sử dụng trong cảm biến DNA.

Đầu dò kháng thể (antibody) được sử dụng để phát hiện kháng nguyên (antigen) trong cảm biến miễn dịch (immunosensor) Kháng thể sẽ liên kết đặc hiệu với một đối tượng kháng nguyên, tạo ra độ chọn lọc cao, giúp phân tích hiệu quả hơn Cảm biến này rất phổ biến với nhiều bộ kit phát triển để phân tích các mẫu thực phẩm, nước uống và bệnh phẩm, trong đó bộ kit ELISA là một ví dụ điển hình.

D(chấtđộcmàudacam);cácphụgiatrongsảnxuấtgiấygóicóảnhhưởngđếnsứckhỏenhưbisphenolA; các loại thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu như atrazine hoặc các loại protein bệnh như viruscúm,bệnhungthư.

Đầu dò enzym là công cụ quan trọng để phát hiện các phân tử đích đặc trưng, hay còn gọi là cơ chất của enzym Nhiều cảm biến enzym đã được phát triển và ứng dụng, như enzym glucose oxidase (GOx) để phát hiện glucose và enzym cholesterol oxidase để phát hiện cholesterol Với tính nhạy bén, phản ứng nhanh và khả năng chọn lọc cao, cảm biến enzym còn được sử dụng để khuếch đại tín hiệu, nâng cao giới hạn phát hiện cho các loại cảm biến khác Luận án này sử dụng đầu dò enzym GOx để nhận biết cơ chất tương ứng là glucose, một chỉ số sinh hóa quan trọng trong máu, thông qua phản ứng oxy hóa glucose thành gluconic và giải phóng H2O2.

Có nhiều phương pháp để đo nồng độ H2O2 được giải phóng theo tiêu chuẩn PT 1.1, và nồng độ H2O2 này sẽ tương ứng với nồng độ glucose trong mẫu Hiện nay, việc phân tích glucose bằng enzym GOx đã được cải tiến với sự kết hợp của enzym Horseradish peroxidase (HRP), một loại enzym có khả năng phân hủy hiệu quả.

H2O2tạogốc OH tự do và giải phóng electron qua đó có thể đo nồng độ H2O2bằng phương phápđiệnhóa hoặc somàutrởthànhmộtcấutrúc cảmbiếnsinhhọckinhđiển.

Hình 1.2Phânloại cảmbiến trêncơsởbộ phậnchuyển đổi(transducer)[2]

Bộphậnchuyểnđổitrongcáccảmbiếnsinhhọclàbộphậnchuyểnđổitínhiệucủaviệcbắtcặpnh augiữađầudòvàđíchthànhcáctínhiệucóthểđođược[30-32].Tùyvào tín hiệu đầu ra (output signal) mà chúng ta có thể gọi tên là cảm biến điện hóa hay cảmbiếnquang…

Nhưtómtắtởhình1.2,hầuhếtcácloạicảmbiếnsinhhọccóthểphânthành5loạibộphậnchuyển đổitínhiệukhicóphảnứng(bắtcặpgiữađầu dòvàđích)thànhtínhiệuđođạcđược,gồmtín hiệuđiệnhóa(electrochemical),điện(electrical),quang(optical),cơhoặcápđiện(piezoelectric)hoặc nhiệt(thermal).Trongluậnánnàychúngtôisửdụngbộphậnchuyểnđổiquanghọchaycòngọilàcảmbi ếnquangvớisựđổimàucủachấtchỉthịnêncòncóthểgọilàcảmbiếnsomàu.

Cảmbiếnso màu

Ngành hóa học đã phát triển và sử dụng các chất chỉ thị, chất chỉ thị màu để phân tích môi trường một cách nhanh chóng, và hiện nay, các chất chỉ thị vẫn được áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau Để nâng cao tính tiện dụng và ứng dụng trong đời sống, người ta đã chế tạo các bộ kit so màu nhằm xác định nồng độ của một số chất, thậm chí để chẩn đoán tình trạng bệnh tật Một ví dụ điển hình là bộ so màu pH, cùng với các bộ thử nghiệm như kiểm tra 10 chỉ tiêu trong nước tiểu, bao gồm pH và tỷ trọng.

(hình1.3bvà1.3c),giấythửhànthetrongthựcphẩmnhưchả,bún,phở (hình 1.3d); bộ kit xét nghiệm sự có mặt của methanol trong rượu (hình 1.3e) và caocấplàquethử thai(hình1.3f).

Cảm biến so màu phổ dụng bao gồm nhiều ứng dụng hữu ích như giấy đo độ pH, hộp que thử 10 thông số của nước tiểu với các màu sắc tương ứng với nồng độ, giấy thử hàm lượng trong thực phẩm, bộ kit xác định hàm lượng methanol trong rượu, và que thử thai.

Nguyên tắc hoạt động của cảm biến so màu ở dạng giấy chỉ thị khá đơn giản, đó làtrêncơsởgiấycóđộtrothấp,ngườitasẽtẩm cáchóachấtđóngvaitròlàchấtchỉthịlên.Khithử,gặpcáctácnhâncầnkiểmtraởtrongmẫuthìchỉt hịsẽbiếnđổimàu,tùythuộc

Cảm biến so màu là công nghệ quan trọng trong việc xác định nồng độ của các tác nhân cần kiểm tra, từ cao đến thấp Trong số đó, cảm biến hóa học chiếm ưu thế, trong khi một số ít là cảm biến sinh học, như que thử thai, dựa trên phản ứng kháng nguyên - kháng thể để xét nghiệm hormone HCG (Human Chorionic Gonadotrophin) Hiện nay, ngày càng có nhiều cảm biến sinh học được phát triển dựa trên phương pháp so màu, nhờ vào tính tiện lợi và đơn giản trong quy trình xét nghiệm Không chỉ giới hạn trong việc kiểm tra các hóa chất hay các phần tử sinh học, loại cảm biến này còn đang được phát triển để xét nghiệm quản lý môi trường và kiểm tra chất lượng nước.

Một sốứngdụngcủacảmbiếnsinhhọc

Cáccảmbiếnsinhhọctỏracónhiềuưuđiểmsovớicácphươngpháptruyềnthốngnhư tính chọn lọc cao, đáp ứng nhanh, đơn giản và chính xác Chính vì vậy, nó được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống, đặc biệt là trong các lĩnh vực khoa học, y tế và công nghệ sinh học.

1.1.4.1 Ứngdụng trong kiểmnghiệmantoànthực phẩm vàkiểm soát môitrường

Bộ kit cảm biến sinh học được thiết kế để xác định phân tử nấm aflatoxin B1 trong thực phẩm dựa trên nguyên lý cảm biến miễn dịch ELISA, cùng với bộ kit xét nghiệm dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong nước.

Ngày nay, vấn đề môi trường và vệ sinh an toàn thực phẩm đang thu hút sự quan tâm lớn từ toàn xã hội Các hệ cảm biến hiện đại được phát triển nhằm phân tích nhanh dư lượng thuốc trừ sâu, kháng sinh và nấm mốc độc hại trong thực phẩm như sabutamon và aflatoxin Tuy nhiên, các bộ kit này thường yêu cầu kỹ thuật cao và cần thiết bị đo chuyên dụng để đảm bảo độ chính xác trong quá trình kiểm tra.

Hiện tại cảm biến sinh học được dùng nhiều nhất trong trong xét nghiệm, theo dõicácchỉsốsinhhóacủamáu(nhưtheodõinồngđộglucose,cholesterol,axituric…);ứng

Các phương pháp phát hiện protein ung thư và siêu vi tiềm ẩn, cùng với xét nghiệm DNA, cho phép bệnh nhân theo dõi tình trạng sức khỏe mà không cần đến trung tâm y tế Hiện nay, các công nghệ này không chỉ gia tăng độ tin cậy mà còn rút ngắn thời gian hồi đáp, đồng thời ngày càng trở nên nhỏ gọn, tiết kiệm và dễ sử dụng hơn.

Hình 1.5(a)Bộxét nghiệmvirusHIV tuýp1,2 dựatrêncảm biếnsinh học kiểuELISA[33]và

(b)máyđo đường huyếtcá nhân theo dõi nồngđộ glucosetrong máu

Chẳng hạn các bộ cảm biến xét nghiệm các dấu hiệu các bệnh nguy hiểm như lâynhiễmHIV(hình1.5a)hayxétnghiệmmộtsốchỉsốsinhhóamáunhưglucose,cholesterol,axituri c(hình1.5b)đểtheodõisứckhỏevàpháthiệnsớmnguycơbệnhtật.

1.1.4.3 Kiểm traan ninh,phòng chốngmatúy,đảmbảoan ninh-quốcphòng

MộtsốbáocáogầnđâychothấyđãchếtạothànhcôngmũiđiệntửpháthiệnthuốcnổTNT,phát hiệncácvụtấncônghóasinhvàcácchấtphóngxạvới độnhạycao.Cácbộkit ELISA để xét nghiệm hàm lượng cafein; hàm lượng nicotin; morphin…cũng ngàyđượcđadạnghóabằngkitsomàuhoặckitđiệnhóa[33].

Enzym

Cấutrúcphântửvàđặctính xúctácưu việtcủaenzym

Enzym là những protein đặc hiệu có cấu trúc phân tử phức tạp, đóng vai trò quan trọng trong các phản ứng hóa học Chúng có khả năng xúc tác mạnh mẽ và tính đặc hiệu cao, đảm bảo chức năng sinh học của enzym Để thực hiện nhiệm vụ này, cấu trúc của enzym cần phải rất tinh vi và phức tạp Enzym là các phân tử lớn, và nghiên cứu đã chỉ ra rằng chúng có vai trò thiết yếu trong nhiều quá trình sinh hóa.

Đặcđiểmxúc táccủaenzym

Chất xúc tác là chất tăng cường phản ứng hóa học mà không bị biến đổi hay tiêu hao trong quá trình phản ứng Chỉ cần một lượng nhỏ chất xúc tác cũng có thể làm tăng tốc độ phản ứng lên nhiều lần Enzym, một loại chất xúc tác sinh học, có hiệu quả xúc tác cao hơn nhiều so với các chất xúc tác hóa học thông thường, giúp giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng Hoạt tính của enzym chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất và enzym, cũng như sự hiện diện của chất ức chế hoặc chất hoạt hóa Enzym có những ưu điểm vượt trội như hiệu quả xúc tác cao, hoạt động ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường, tính đặc hiệu cao, không mất hoạt tính trong dung môi hữu cơ và mang lại hiệu quả kinh tế lớn mà không gây hại cho môi trường Việc điều chỉnh các yếu tố vật lý và hóa học phù hợp giúp tối ưu hóa hoạt động của enzym, mở ra nhiều ứng dụng trong nghiên cứu, công nghiệp và y dược.

Tínhđặchiệu của enzym

Enzym là những chất xúc tác sinh học có tính chọn lọc cao, giúp xúc tác cho các phản ứng hóa học cụ thể Tính chất này, được gọi là tính đặc hiệu của enzym, cho phép mỗi enzym chỉ hoạt động hiệu quả với một loại phản ứng nhất định Điều này có nghĩa là, đối với mỗi phản ứng hóa học khác nhau, cần có một enzym đặc hiệu tương ứng để xúc tác Ví dụ, axit amin có thể tham gia vào nhiều phản ứng như phản ứng khử cacboxyl, phản ứng oxy hóa khử amin và phản ứng trao đổi nhóm amin, do đó mỗi phản ứng này cần một enzym riêng biệt như decarboxylase, axit amin oxydase và amino transferase để thực hiện.

EnzymHorseradishPeroxidase(HRP)

HRP chứa hai loại trung tâm kim loại: sắt (III) protoporphyrin IX và hai nguyên tử canxi, cả hai đều cần thiết cho cấu trúc và chức năng của enzym Nhóm heme gắn vào enzyme tại His170 thông qua liên kết phối trí giữa nguyên tử NE2 của histidine và nguyên tử sắt heme Vị trí phối hợp thứ hai không bị chiếm giữ trong trạng thái nghỉ của enzym nhưng có thể tiếp nhận hydrogen peroxide trong quá trình chuyển enzym Các phối tử như carbon monoxide, cyanide, fluoride và azide liên kết với nguyên tử sắt heme tại vị trí xa, tạo ra phức peroxidase với số phối trí là 6 Một số liên kết proton hóa được ổn định thông qua liên kết hydro với chuỗi axit amin ở bên cạnh nhân heme, cụ thể là Arg38 và His42.

Hình 1.6 minh họa cấu trúc ba chiều của tinh thể peroxidase isoenzym C từ cây cải ngựa (mã truy cập Brookhaven 1H5A) qua phương pháp nhiễu xạ tia X Nhóm heme (màu đỏ) nằm giữa miền xa và miền gần, mỗi miền chứa một nguyên tử canxi (hình cầu màu xanh lam) Các vùng xoắn (α-Helix) và tấm β (β-sheet) của enzym được thể hiện bằng màu tím và vàng Các cấu trúc này xuất hiện ở góc phần tư phía dưới bên phải của phân tử.

Hình 1.7 trình bày các gốc axit amin chính trong vùng liên kết heme của HRP C, với nhóm heme và nguyên tử sắt heme được hiển thị bằng màu đỏ Các gốc axit amin còn lại được thể hiện bằng màu nguyên tử His170, là dư lượng histidine gần nhất, kết hợp với nguyên tử sắt heme, trong khi vị trí phối trí xa tương ứng trên mặt phẳng của heme là trống rỗng.

HầuhếtcácphảnứngđượcxúctácbởiHRPCvàcácisoenzymperoxidasecủacâycảingựakhá ccóthểđượcbiểuthịbằngphươngtrìnhsau,trongđóAH2v àAH∙lầnlượt đạidiệnchocơchấtkhửvàsảnphẩmgốccủanó.Cácchấtkhửđiển hìnhbaogồmphenolthơm,axitphenolic,indol,aminvàsulfonat.

Chuyển đổi hydrogen peroxide thành nước không phải là chức năng chính của peroxidase thực vật cấp III như HRP C; thay vào đó, thực vật sử dụng các enzym khác như ascorbate peroxidase (class I) để điều chỉnh mức độ hydrogen peroxide nội bào Sự hình thành các sản phẩm gốc trong phản ứng HRP cho thấy một số chức năng in vivo có thể tồn tại trong cây, liên quan đến các phản ứng liên kết ngang như hình thành các liên kết trễ từ polysaccharide hoặc pectin, liên kết dityrosine, và sự oxy hóa của các hợp chất phenolic trong quá trình tổng hợp lignin Các peroxidase xúc tác phản ứng liên kết ngang có thể phản ứng với các yếu tố bên ngoài như vết thương của mô thực vật, giúp hạn chế mất nước và xâm nhập của mầm bệnh bằng cách tạo ra hàng rào bảo vệ như suberin Mặc dù vai trò in vivo của isoenzyme HRP vẫn chưa được xác định rõ, nhưng hoạt động của peroxidase đã được ghi nhận trong ngăn chặn tổn thương (Kawaoka và cộng sự, 1994).

Cơ chế xúc tác của enzym HRP đã được nghiên cứu kỹ lưỡng, như được trình bày trong các tài liệu của Dunford (1991, 1999) và Veitch cùng Smith (2001) Một số đặc điểm quan trọng của quá trình xúc tác này được minh họa với axit ferulic làm cơ chất khử Việc tạo ra các gốc tự do qua hai bước khử một điện tử có thể dẫn đến sự hình thành các sản phẩm phản ứng phức tạp, bao gồm dimer, trimer và oligomer, mà những chất này cũng có thể hoạt động như chất khử trong các chuyển tiếp tiếp theo.

Hình 1.8Chu trình xúc tác của peroxidase củ cải ngựa (HRP) với ferulate là chất khử. Cáchằngsố tốcđộ k 1 ,k 2 vàk 3 lầnlượt thểhiệntốcđộhình thànhhợp chấtI, tốcđộkhửhợpchất

Ivàtốcđộ khửhợp chất IItương ứng.[37]

Cảmbiếnsinh họcxácđịnhnồngđộglucose

Cácphươngphápxétnghiệmnồng độglucose

Xét nghiệm nồng độ glucose đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện sớm và điều trị bệnh Do đó, nghiên cứu trong lĩnh vực này đã phát triển đa dạng nhằm chế tạo cảm biến glucose, cholesterol và axit uric với độ nhạy cao, chọn lọc tốt, nhanh chóng, phân tích đơn giản và chi phí thấp Các nhà khoa học đang tìm tòi vật liệu, thiết bị và thiết kế cảm biến, đạt được những kết quả nhất định Các hướng nghiên cứu chính để phát triển cảm biến loại này bao gồm việc cải tiến công nghệ và tối ưu hóa quy trình sản xuất.

1.3.1.1 Phươngphápsomàutrêncơsởsửdụngenzymđặcchủng Đâylàphươngphápđangápdụngphổbiếnđểxétnghiệmtrongcácbệnhviệnhiệnnay Nguyên tắc của phương pháp, lấy xét nghiệm glucose làm ví dụ, là sử dụng enzymglucose oxidase (thường được ký hiệu là GOD hoặc GOx) để oxy hoá glucose trong mẫuthành gluconic acid và giải phóng peroxide hydrogen (H2O2) Sau đó peroxide hydrogentạothànhbịenzymperoxidase(POD)- thôngthườngenzymhorseradishperoxidase(HRP)đượcsửdụngphổbiến,đểphânhuỷH 2 O2vàgiảiphóng oxy.Oxygiảiphóngoxyhoáchấtchỉthị,phổbiếnlàhệ4–aminophenzon(4-

Tetramethylbenzidine (TMB) là một chất tạo ra sản phẩm có màu đặc trưng, với cơ chế được minh họa trong hình 1.6a Các phản ứng chính diễn ra được mô tả trong hình 1.6b, như hệ 4-AAP và phenol, tạo ra chất quinonimin có màu đỏ hồng (Hình 1.6c) TMB cũng tạo ra dạng oxi hóa có màu xanh lá cây Cường độ màu của sản phẩm tỷ lệ thuận với hàm lượng glucose, cho phép sử dụng đường chuẩn để xác định nồng độ glucose.

Hình 1.9(a) Cơ chế hoạt động của các enzym trong hệ cảm biến 2 enzym phát hiện glucosebằngphương pháp somàu(trắcquang);

1.3.1.2 Xétnghiệm bằng máy đo sử dụng cảm biến sinh học điện hóa sử dụngcácenzym đặcchủng

Phương pháp so màu và phương pháp điện hóa đều sử dụng enzym đặc chủng như GOx để chuyển hóa glucosa thành các axit và giải phóng H2O2 Sự khác biệt giữa hai phương pháp này là tín hiệu đầu ra: trong khi phương pháp so màu hiển thị qua sự thay đổi màu sắc, phương pháp điện hóa sử dụng dòng điện để đo nồng độ glucosa trong mẫu Một bộ thiết bị kiểm tra nồng độ glucose trong máu bao gồm máy đọc kết quả, que lấy máu, que thử, hộp chứa que thử chưa sử dụng và hộp đựng máy Que thử được cấu tạo từ các điện cực như điện cực làm việc (WE), điện cực đối (CE) và điện cực so sánh (RE) Dòng điện được sinh ra từ quá trình oxy hóa glucosa, nơi enzym GODx phản ứng với phân tử glucosa để tách hai electron và chuyển chúng đến điện cực làm việc, tạo ra tín hiệu đo được Enzym và môi chất hoạt động như một cơ chế chọn lọc, cho phép tái sử dụng nhiều lần trong quá trình này Nhiều loại môi chất khác nhau có thể được sử dụng để sản xuất que thử đường huyết hoạt động theo cơ chế điện hóa.

Bộ kit thử glucose dựa trên nguyên lý điện hóa đã được thương mại hóa, nhưng khả năng tiếp cận của người dân, đặc biệt ở các nước đang phát triển như Việt Nam, vẫn còn hạn chế do giá thành cao Do đó, nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đang nỗ lực phát triển công nghệ này nhằm giảm giá thành, giúp sản phẩm có thể phổ cập đến những người có thu nhập thấp.

Bộ dụng cụ và thiết bị của máy đo đường huyết bao gồm: máy phân tích và đọc kết quả, dụng cụ lấy máu, que thử, hộp đựng que thử và hộp đựng thiết bị Cấu tạo của que thử và nguyên tắc hoạt động của điện cực làm việc đóng vai trò quan trọng trong quá trình xét nghiệm Hệ thống này còn sử dụng nguyên lý truyền và xử lý tín hiệu để đảm bảo độ chính xác trong việc xác định chỉ số trong nước tiểu.

Que thử bằng giấy có thể được sử dụng để kiểm tra nồng độ đường trong nước tiểu, đồng thời phát hiện nhiều thông số khác như pH và axit ascorbic Que thử này hoạt động dựa trên nguyên lý phản ứng hóa học, làm thay đổi màu chất chỉ thị Tuy nhiên, độ nhạy của que thử thường không cao, chỉ phù hợp để kiểm tra sơ bộ.

Hình 1.11Bộ que thử glucose trong nước tiểu Uriscan và bảng màu chuẩn để sosánh[38]. Đỏ Vàng

Cácxuhướng pháttriểncảm biếnglucose

1.3.2.1 Tổng hợp và ứng dụng các vật liệu thay thế enzym glucose oxidase(GOx)trong chếtạocảmbiến

Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng việc thay thế cả hai enzym trong cảm biến phát hiện glucose bằng phương pháp so màu là khả thi Nhóm tác giả Tangsong Li đã áp dụng hệ nanobạc/nanovàng cấu trúc lõi vỏ để phát hiện glucose theo cơ chế nêu trên.

Hình 1.12Nguyênlý phát hiệnglucosebằngphương pháp somàukhông sử dụng enzym[39]

Phản ứng tráng gương giữa ion Ag+ và glucose trong mẫu phân tích được hỗ trợ bởi hạt nano vàng (nano Au), dẫn đến sự hình thành bạc (Ag0) bám lên bề mặt hạt nano vàng, tạo ra cấu trúc lõi là nano Au và vỏ là bạc (Ag0) Quá trình này làm thay đổi phổ hấp thụ của dung dịch từ đỉnh đặc trưng của hạt nano vàng ở 520 nm sang đỉnh của hạt nano bạc ở 425 nm, với nồng độ glucose trong mẫu tỷ lệ thuận với cường độ đỉnh hấp thụ tại bước sóng 425 nm Cảm biến này có khả năng phát hiện glucose trong khoảng nồng độ từ 0,04 mM đến 1 mM, với giới hạn phát hiện bằng mắt thường là 10 nM Tuy nhiên, độ đặc hiệu của cảm biến này không cao do không sử dụng đầu dò đặc hiệu (enzym GOx), vì các tác nhân khác như formaldehyde hay axit ascorbic cũng có thể gây ra sự thay đổi màu sắc tương tự Hơn nữa, cảm biến này không sử dụng đầu dò là phân tử sinh học, do đó không được coi là cảm biến sinh học theo định nghĩa của IUPAC.

1.3.2.2 Tổng hợp và sử dụng các vật liệu có hoạt tính xúc tác thay thế enzymperoxidase(POD) Đã có một số nghiên cứu đã thay thế enzym HRP (một loại enzym POD phổ biếnnhất)bằng cácvật liệucóhoạt tính xúctáctương tựnhưenzym HRP, cácvật liệu thường đượcsửdụnglàcácoxitkimloạichuyểntiếpnhưCo3O4[40];Fe3O4[41-44],Prussianblue(Fe7(CN)18)

[45]haycácvậtliệutrêncơsởcarbonnhưC60[46].Cácvậtliệutổhợptrêncơsởcácoxittrênvớicácvậtli ệunhưốngnanocarbon(CNTs),graphen/graphenoxitnhưFe 3 O4/graphen [41, 42, 47],

Fe2O3/graphen được sử dụng để nâng cao hoạt tính thông qua khả năng chuyển điện tích nhanh, giúp phản ứng diễn ra nhanh chóng và nhạy bén hơn Việc thay thế enzym HRP giúp giảm thời gian bảo quản và dễ dàng hơn, bởi enzym HRP mất hoạt tính khi tiếp xúc với ánh sáng, yêu cầu thao tác trong điều kiện tối Ngoài ra, các kim loại quý và vật liệu tổ hợp dựa trên cách hạt nano kim loại cũng có hoạt tính xúc tác tương tự như enzym HRP, đã được nghiên cứu để thay thế HRP trong phát hiện glucose, bao gồm nano bạc (nanoAg), nano platin (nanoPt), nano paladi (nanoPd) và nano PtPd.

Nguyên lý phát hiện glucose dựa trên enzym GOx kết hợp với cấu trúc C60, bao gồm vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β-sheet) của enzym carboxy, cùng với việc thay thế enzym HRP.

Nhóm nghiên cứu của Ruimin Li đã sử dụng quả cầu C60 fullerenes được chức năng hóa bằng các nhóm -COOH để thay thế HPR trong quá trình phân hủy H2O2, với cơ chế được mô tả trong hình 1.10 Trong nghiên cứu này, TMB được sử dụng làm chất chỉ thị, cho thấy màu xanh tỷ lệ thuận với nồng độ glucose trong mẫu, với khoảng phát hiện glucose từ 1-40 mM và giới hạn phát hiện là 0,5 mM Để nâng cao độ nhạy của cả biến phá thiệt glucose theo phương pháp điện hóa, nhiều vật liệu mới đã được ứng dụng và nghiên cứu, bao gồm các vật liệu có hoạt tính xúc tác cho quá trình phân giải H2O2 (sản phẩm chính do GOD chuyển hóa glucose) Các vật liệu này có thể bao gồm oxit kim loại chuyển tiếp như Fe3O4, CuO, NiO, hoặc các hạt nano kim loại quý như nano Ag, nano Pt, nano Pd, cũng như các vật liệu tổ hợp của chúng với CNTs và graphene nhằm tăng cường hiệu năng phản ứng, nâng cao độ nhạy và giảm thời gian.

Jia và các cộng sự đã phát triển một quy trình tổng hợp vật liệu mới dạng sợi bằng cách sử dụng các hạt paladi (Pd) gắn trên sợi carbon xoắn nano Vật liệu này được phủ lên điện cực, sau đó thêm enzyme GOx và sử dụng nafion làm chất kết dính để định vị trên bề mặt điện cực, nhằm ứng dụng trong việc phát hiện glucose Cảm biến này có khả năng hoạt động trong khoảng nồng độ glucose từ 0.06 đến 6.0 mM, với giới hạn phát hiện lên tới 0.03 mM.

Cấu tạo của điện cực làm việc để phát hiện glucose sử dụng enzym GOx kết hợp với vật liệu Pt/sợi carbon helical, cùng với cơ chế phản ứng khi điện cực hoạt động.

Claussenvàcáccộngsự[59]đãphátminhramộtbộcảmbiếnsinhhọcmớicóthểthaythếmộtphầnhoặ choàntoànchopinprick(kimchíchmáu)đểkiểmtratiểuđường.Bộcảmbiến này có thể phát hiện nồng độ glucose trong nước bọt, nước mắt và nước tiểu

Công nghệ cảm biến mới sử dụng các tấm nano graphen hình cánh hoa hồng để đo nồng độ glucose trong máu, cho phép phát hiện glucose ở nồng độ thấp từ 0,3 μM Các cạnh của tấm nano có liên kết hóa học không đầy đủ, tạo điều kiện cho enzym glucose oxidase gắn vào, từ đó enzym này chuyển đổi glucose thành peroxide, tạo ra tín hiệu trên các điện cực của cảm biến.

Hình 1.15Cấu trúc cảm biến phát hiện nồng độ glucose trong nước bọt, nước mắt và nước tiểutrêncơsởcáctấm graphen/hạt nano Pd [59]

Cảm biến phát hiện H2O2 và glucose sử dụng phương pháp điện hóa với hệ vi lưu làm từ giấy, bao gồm vùng xoắn α (α-Helica) và vùng tấm β (β-sheet) của các thiết bị vi lưu dựa trên enzym.

Ngoài việc áp dụng vật liệu mới để nâng cao hoạt tính xúc tác của GOx trong phản ứng phân hủy H2O2 nhằm tạo ra tín hiệu điện đo nồng độ glucose, một hướng nghiên cứu mới đang được phát triển là chế tạo các hệ vi lưu (microfluidic) để giảm lượng mẫu cần thiết và tăng độ nhạy của phản ứng Chẳng hạn, nhóm nghiên cứu của Noiphung đã phát triển hệ microfluidic dạng giấy để phát hiện glucose, cho thấy khả năng phát hiện glucose trong máu với độ lặp lại tốt, mặc dù độ nhạy vẫn chưa đạt yêu cầu cao Tuy nhiên, các cảm biến này có tiềm năng lớn do chi phí thấp, rất phù hợp cho việc tự xét nghiệm tại nhà.

Cácvật liệunanotiêntiếntrênnềncarbonđượcnghiêncứutrongluậnán

Vậtliệunanobạc(silvernanoparticles-AgNPs)

Hạtnanobạc(AgNPs)làcáchạtbạccókíchthướctừ1nmđến100nm.Docódiệntích bề mặt lớn nên

AgNPs có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với các vật liệu khối dokhảnănggiảiphóngnhiềuionAg + hơn.

Khẩu trang chứa nano bạc, dược phẩm sử dụng nano bạc, bình sữa làm bằng nhựa pha thêm nano bạc, ảnh SEM của các hạt nano bạc kết hợp với phim polyolefin, và bàn chải đánh răng có chứa nano bạc là những ứng dụng nổi bật của công nghệ nano bạc trong đời sống.

DothểhiệntínhkhángkhuẩntốtnênAgNPsthườngđượcsửdụngđểlàmchấtkhửtrùng,khángk huẩn,khửmùi…CóthểkểmộtvàisảnphẩmchứaAgNPsnhư:

Các dụng cụ chứa thực phẩm bằng nhựa có chứa AgNPs có tác dụng khử trùng, cho thấy khả năng diệt 99.9% vi khuẩn AgNPs cũng được tẩm vào các loại sợi trong đồ may mặc để diệt khuẩn và khử mùi Ngoài ra, AgNPs còn được ứng dụng trong các thiết bị điện tử như điều hòa, tủ lạnh, và máy giặt Trong y tế, khẩu trang AgNPs được thiết kế với 3 - 4 lớp, bao gồm 2 lớp vải và một lớp vật liệu tẩm.

AgNPs và than hoạt tính ở giữa, loại khẩu trangnàycókhảnăngdiệtkhuẩn,diệtvirus,lọckhôngkhírấttốt.Lớpvảitẩmnanobạccóchứcnăngdiệtv ikhuẩn,virus,nấmbịgiữlạitrênkhẩutrangđồngthờicótácdụngkhửmùi;

Sản xuất thuốc chữa bệnh và ứng dụng trong màng hô hấp là những lĩnh vực quan trọng Màng hô hấp là một tấm màng mỏng có khả năng cho khí và hơi nước qua nhưng không cho chất lỏng đi qua, với nhiều lỗ khí nhỏ Gần đây, các hạt nano bạc (AgNPs) đã được kết hợp với film polyolefin, mang lại đặc tính kháng khuẩn rất tốt Ngoài ra, còn có các sản phẩm tiêu dùng khác như dung dịch xịt khử mùi cho tủ lạnh, giày dép, nước súc miệng và bàn chải đánh răng Các ứng dụng này được tóm lược trên hình 1.17.

Dung dịch chứa hạt nano bạc (AgNPs) có hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt, tạo ra màu sắc từ vàng nhạt đến đen tùy thuộc vào nồng độ và kích thước hạt Tính quang học của dung dịch AgNPs phụ thuộc vào hình dạng, kích thước và nồng độ hạt, cho phép sử dụng phương pháp UV-VIS để xác định các thuộc tính này Hạt nano bạc có kích thước nhỏ hơn 50 nm thường chỉ có một đỉnh hấp thụ trong phổ UV-Vis, và đỉnh này có thể thay đổi khi có tác nhân tương tác, dẫn đến sự biến đổi màu sắc của dung dịch Gần đây, nhiều nghiên cứu đã áp dụng tính chất này để chế tạo cảm biến hóa học và sinh học Tuy nhiên, để đáp ứng các ứng dụng, AgNPs cần có độ sạch cao, không chứa sản phẩm phụ ảnh hưởng đến hệ ứng dụng Các phương pháp truyền thống tổng hợp AgNPs gặp hạn chế trong việc sản xuất cho các ứng dụng này Để khắc phục, nghiên cứu này trình bày phương pháp "xanh" để tổng hợp AgNPs, sử dụng carbon nano hoặc chất lượng tử graphen-CQDs làm chất khử và chất ổn định AgNPs được tổng hợp sẽ được sử dụng để chế tạo cảm biến H2O2 và kết hợp với enzym GOx để phát triển cảm biến glucose theo phương pháp so màu, mang lại ý nghĩa thực tiễn và mới mẻ trong nghiên cứu.

HạtnanoFe 3 O 4bọc carbon(cấutrúclõi/vỏ)(core-shell)

Cách mạng nano oxit sắt (Fe3O4) đã trở thành vật liệu quan trọng nhờ vào tính siêu thận từ và kích thước nano của nó Vật liệu này bền, dễ dàng tập hợp lại khi có từ trường bên ngoài, nhưng lại phân tán dễ dàng khi không còn từ trường Với những đặc tính nổi bật, nano oxit sắt được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong y sinh, bao gồm tách sinh học, tinh chế, cảm biến sinh học, chụp cộng hưởng từ (MRI) và điều trị tăng thân nhiệt.

Vào năm 2007, các hạt nano Fe3O4 đã được phát hiện có hoạt tính tương tự như enzym peroxidase tự nhiên, đánh dấu lần đầu tiên ứng dụng nano vô cơ trong vai trò enzym nhân tạo Sự phát hiện này đã mở ra cơ hội cho việc phát triển nhiều vật liệu nano khác với tính chất xúc tác giống như peroxidase, bao gồm các kim loại, oxit kim loại và hợp chất carbon-kim loại Hạt nano sắt từ sau khi chế tạo sở hữu diện tích bề mặt lớn, sức căng bề mặt cao, nhưng lại không ổn định và dễ bị kết tụ Để cải thiện tính chất bề mặt, các hạt này thường được bọc bằng nhiều lớp nguyên tử của các polymer hữu cơ, kim loại, và oxit vô cơ như SiO2, Al2O3, cùng với các polymer tự nhiên như gelatin, dextran, và chitosan.

Cácpolymetổnghợpnhưpolyvinylpyrrolidone(PVP),polyetylenglycol(PEG),polyvinylalco hol (PVA), polystyren (PS)… Polyme vô cơ như oxide của silica và titania.Chấthoạtđộngbềmặt như oleic,alkylphotphonatesvàphotphatessulfonates.

Các hạt nano được bọc bởi một lớp chất hoạt động bề mặt, cho phép chúng phân tán đồng nhất trong dung môi, tạo thành chất lỏng từ Lớp vỏ này không chỉ bảo vệ phần lõi mà còn làm giảm độc tố của hạt từ, đồng thời dễ dàng chức năng hóa bằng cách gắn các phân tử sinh học khác nhau Để tạo ra cấu trúc lõi/vỏ đa chức năng, phương pháp chủ yếu được sử dụng là bọc hạt nano từ bằng lớp silica, sau đó thêm các thành phần chức năng như vàng, tăm màu hoặc chất lượng tử lên lớp silica để tạo thành hạt đa lớp với nhiều chức năng.

Hạt nano đa lớp là các hạt nano có cấu trúc gồm hai hoặc ba lớp, ví dụ như hạt có lõi điện môi và vỏ kim loại quý Những hạt này thường được ứng dụng trong chẩn đoán huỳnh quang, xúc tác, nâng cao độ tương phản hình ảnh, tạo tinh thể quang tử, trị liệu và phân phối thuốc, cũng như điều trị quang nhiệt Hạt nano core-shell đầu tiên được phát triển bởi Shoubao, với lõi điện môi Au2S được bao quanh bởi một lớp vỏ vàng Kích thước của hạt nano ảnh hưởng đến các đỉnh cộng hưởng plasmon, có thể thay đổi trong dải từ vùng nhìn thấy đến bước sóng 900 nm Hạt nano core-shell thường có hai thành phần chính là lõi và vỏ, và hình dạng cũng như tính chất của chúng có thể được điều chỉnh thông qua việc kiểm soát các thành phần và thông số chế tạo.

Hạt nanoshell có nhiều dạng khác nhau: (a) Hạt nano với nhiều nhân giống nhau, (b) Hạt nano chứa nhiều nhân khác nhau, (c) Hạt nano có một lõi đồng nhất, và (d) Hạt nano được bao quanh bởi nhiều lớp vỏ.

Trong các dạng cấu trúc hạt nano core-shell, vật liệu chọn làm lõi và vỏ, tỉ lệ và kiểu liên kết giữa chúng là những yếu tố quan trọng quyết định tính chất cuối cùng của sản phẩm Việc lựa chọn các thành phần cho lõi và vỏ phải phù hợp với các tính chất mong muốn, ứng dụng và quy trình chế tạo Nhiều vật liệu vô cơ và hữu cơ như chất keo, carbon hoạt hóa, hợp chất hữu cơ, chất xúc tác, dược phẩm, và enzym được sử dụng làm lõi Tỷ lệ lõi/vỏ và độ dày của vỏ ảnh hưởng trực tiếp đến tính chất của hạt nano, trong đó độ dày của vỏ có thể thay đổi tính chất của lõi và thời gian tồn tại của sản phẩm Kiểu liên kết giữa lõi và vỏ có thể là liên kết hóa học hoặc liên kết tĩnh điện.

Một trong những dạng nano core-shell đang phát triển mạnh hiện nay là cấu trúc lõi là các hạt kim loại như sắt từ, vàng (Au), bạc (Ag), trong khi vỏ được làm từ các chất khác nhau với các chức năng đa dạng như từ/vàng, từ/vàng/chất huỳnh quang, vàng/chấm lượng tử, và từ/chấm lượng tử.

Vật liệu Fe@C là một loại vật liệu hấp phụ mới, bao gồm lõi nano Fe3O4 và vỏ cacbon, mang lại hiệu suất hấp phụ cao nhờ vào diện tích bề mặt lớn và khả năng tương thích tốt Lõi nano Fe3O4 không chỉ cung cấp bề mặt nền cho cacbon mà còn cho phép thu hồi vật liệu dễ dàng qua nam châm Với khả năng tái sinh và sử dụng lại, vật liệu này có tiềm năng ứng dụng lớn, quy trình chế tạo đơn giản, chi phí thấp và có khả năng hoạt hóa bề mặt cacbon cho nhiều mục đích khác nhau như hấp phụ kim loại nặng, kim loại quý và hydrocarbon Do đó, vật liệu này đang được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới nghiên cứu và phát triển.

Việc sử dụng hạt nano Fe3O4 làm lõi giúp tạo ra tính từ cho vật liệu, cung cấp ion Fe 3+ để xúc tác cho phản ứng oxi hóa khử Tỉ lệ lõi/vỏ và độ dày của lớp vỏ là hai yếu tố quan trọng trong quá trình chế tạo tiểu cầu Luận án này trình bày việc sử dụng lớp vỏ cacbon vô định hình để bọc hạt sắt từ, tạo ra vật liệu Fe 3 O4/C nanocomposite (vật liệu Fe@C) với cấu trúc lõi vỏ, trong đó lõi là Fe3O4 và lớp vỏ là cacbon Vật liệu này sẽ được ứng dụng để thay thế enzym HRP trong cảm biến sinh học enzym nhằm phân tích glucose.

Mục đích của việc chết tạo vật liệu này là để bảo vệ độ bền cho vật liệu, vì trong thực tế, Fe 2+ rất dễ bị oxi hóa thành Fe 3+, dẫn đến sự thay đổi hoạt tính xúc tác Việc này có thể làm mất tính chọn lọc do Fe 3+ có hoạt tính xúc tác rất mạnh Do đó, việc tạo ra vật liệu có cấu trúc lõi/vỏ là rất quan trọng để giảm thiểu tác động của môi trường đến lõi vật liệu và nâng cao tính chất từ tính của vật liệu Tùy theo từng tỷ lệ, có thể điều chế ra lớp vỏ carbon dày hoặc mỏng khác nhau.

VậtliệuFeOOH/chấmcarbonlượngtửphatạpnitơ

Hợp chất oxy-hydroxit sắt (FeOOH), còn gọi là "gỉ sắt", được nghiên cứu nhiều trong lĩnh vực hấp phụ và xử lý nước nhờ vào tính chất xúc tác cao Việc tạo ra các oxy-hydroxit sắt không quá phức tạp và mang lại hiệu quả cao Chúng sở hữu các đặc tính nổi bật như diện tích bề mặt lớn, cấu trúc xốp, bền hóa và bền nhiệt, điều này thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên toàn thế giới trong việc phát triển vật liệu ứng dụng làm xúc tác và hấp phụ FeOOH có thể tồn tại dưới nhiều dạng hình thái khác nhau, phụ thuộc vào cấu trúc tinh thể của vật liệu, bao gồm α-FeOOH (goethite), β-FeOOH (akaganeite), δ-FeOOH (feroxyhyte) và γ-FeOOH.

γ-FeOOH, hay còn gọi là lepidocroxite hoặc hydrohermatite, có cấu trúc tinh thể phân tầng với nhiều lớp oxit Fe(III liên kết bằng liên kết hydro của các nhóm hydroxyl Các nguyên tử sắt được thể hiện bằng những quả cầu màu nâu, oxy màu đỏ và các nguyên tử oxy của các nhóm hydroxyl là những quả cầu màu tím hồng Lepidocroxite có màu vàng hoặc đỏ, hình thành từ sắt gỉ trong môi trường nước, và xuất hiện ở hầu hết các mỏ khoáng chứa sắt trên thế giới, cũng như trong gỉ của các thiết bị làm từ sắt.

Chấm lượng tử carbon (CQDs) là các hạt nanocarbon có kích thước nhỏ hơn 10 nm với bề mặt đã được thụ động hóa Chúng thuộc nhóm vật liệu nano cacbon và đã được phát hiện lần đầu tiên bởi

Xu và các cộng sự vào năm 2004 đã vô tình phát hiện ra ống nano cacbon đơn tường, từ đó thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong việc nghiên cứu và khai thác tính chất phát huỳnh quang của các chấm lượng tử carbon (CQDs) Nhiều tiến bộ đã đạt được trong quá trình tổng hợp, tính chất và ứng dụng của CQDs Chúng là cấu trúc nano carbon huỳnh quang với khả năng dẫn điện tốt, độc tính thấp, thân thiện với môi trường, và dễ dàng tổng hợp CQDs nổi bật với tính chất quang học vượt trội so với các chấm lượng tử khác, đặc biệt nhờ vào khả năng phát xạ mạnh, mở ra nhiều ứng dụng tiềm năng trong y sinh học, thiết bị quang điện tử, xúc tác và cảm biến.

Khả năng phát huỳnh quang của CQDs vẫn chưa được làm sáng tỏ, với nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng tính chất này phụ thuộc vào kích thước Một số tác giả cho rằng sự phát xạ xảy ra do quá trình chuyển đổi điện tử và chịu ảnh hưởng của hiệu ứng giam giữ lượng tử Đồng thời, cũng có những công trình khác đề xuất rằng nguyên nhân phát huỳnh quang có thể liên quan đến cấu trúc hợp tác của năng lượng bề mặt hoặc các mối liên kết giữa lõi và bề mặt của các hạt Huỳnh quang của CQDs phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng kích thích, dẫn đến sự phát xạ đặc trưng, được cho là liên quan đến sự phân bố không đồng nhất của các đặc điểm phát quang.

Cấu trúc và thành phần của CQDs xác định tính đa dạng của chúng Nếu trên bề mặt CQDs có nhiều gốc, khả năng phân tán trong nước sẽ rất tốt và tính tương thích sinh học cũng cao Tuy nhiên, CQDs có thể bị biến tính và thụ động hóa bề mặt bởi nhiều tác nhân hữu cơ, polymer, vật liệu vô cơ hoặc sinh học, dẫn đến sự thay đổi trong tính chất huỳnh quang và vật lý Dựa vào các tính chất quý giá của carbon, CQDs sở hữu độ dẫn điện tốt, thành phần hóa học ít độc hại, tính tương thích sinh học cao và tính chất quang hóa ổn định, khiến chúng trở thành vật liệu lý tưởng cho các ứng dụng trong dược sinh học, cảm biến sinh học và phân phối thuốc.

(b) tínhchấtquanghọcvàtínhdẫnđiệntửtốt,CQDscũngcóthểđượcứngdụnglàmchấtxúctác,ứngdụngtro ngchếtạocảmbiến,vàlinh kiệnđiệntử,linhkiện quanghọc.

Có hai phương pháp chính để tổng hợp CQDs: (i) phương pháp "top-down", sử dụng các vật liệu cacbon lớn như graphit, graphene, ống nano cacbon và các polyme tự nhiên như chitosan, gelatin thông qua các kỹ thuật cắt nhỏ như tia laze và phương pháp thủy nhiệt; và (ii) phương pháp "bottom-up", trong đó CQDs được tổng hợp từ các hóa chất nhỏ hơn như carbohydrate, citrate qua phương pháp thủy nhiệt hoặc vi sóng Gần đây, việc sử dụng nguyên liệu "xanh" từ thiên nhiên đã thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học, vì phương pháp "bottom-up" giúp giảm thiểu hóa chất dư thừa, đảm bảo an toàn cho ứng dụng trong lĩnh vực y tế và sinh học.

CQDs là vật liệu có kích thước nhỏ nhưng lại có diện tích bề mặt lớn, khiến chúng dễ bị nhiễm tạp chất từ môi trường, ảnh hưởng đến tính chất xúc tác và quang học Do đó, việc xử lý bề mặt và phát tán các nguyên tố khác là cần thiết để điều chỉnh các đặc tính của CQDs Nhiều báo cáo trước đây đã chỉ ra rằng bề mặt CQDs có thể được xử lý bằng các vật liệu polymer.

Phương pháp phát triển các nguyên tố khác và CQDs được áp dụng phổ biến nhờ vào quy trình tổng hợp đơn giản, thường sử dụng các nguyên tố như N, P, S Trong đó, CQDs pha tạp Nitơ (N-CQDs) là lựa chọn phổ biến nhất vì khả năng cải thiện và điều chỉnh tính chất của CQDs Chúng tôi cũng đã công bố các kết quả về nghiên cứu tổng hợp và ứng dụng CQDs trong các công trình trước đây.

Mô hình hóa học của enzym CQDs thể hiện rõ cấu trúc N-Vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β-sheet), như được trình bày trong hình 1.21(a) Hình 1.21(b) cho thấy ảnh TEM của N-Vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β-sheet) của enzym CQDs, được nhóm nghiên cứu tổng hợp bằng phương pháp "bottom-up" [65].

CQDs sở hữu nhiều đặc điểm ưu việt như độc tính thấp, khả năng xúc tác hiệu quả, tính tương thích sinh học cao, cùng với khả năng hấp thụ và phát xạ ánh sáng Nhờ vào những đặc tính này, CQDs trở thành vật liệu có tiềm năng ứng dụng lớn trong các lĩnh vực như xúc tác, cảm biến, quang học trong y học và sinh học.

Trong nghiên cứu này, vật liệu lai FeOOH/chấm cacbon lượng tử pha tạp nitơ (FN-CQDs) được tổng hợp qua hai giai đoạn: đầu tiên, Fe3O4 được tổng hợp bằng phương pháp đồng kết tủa, sau đó FN-CQDs hình thành từ quá trình thủy nhiệt hỗn hợp chitosan-Fe3O4 FN-CQDs có khả năng xúc tác phản ứng oxy hóa khử giữa H2O2 và 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB), tạo ra màu xanh đặc trưng của TMB ở dạng oxy hóa Dựa vào việc tạo ra H2O2 từ phản ứng chuyển hóa glucose của enzym GOx, chúng tôi đã kết hợp FN-CQDs với GOx để chế tạo cảm biến so màu glucose có độ chọn lọc và độ nhạy cao.

GOx/FN-CQDs đã được ứng dụng thành côngchomụcđíchkiểmtranồngđộglucosetrongmáuvànướctiểungười.

Nguyênvậtliệu,hóachất,dụng cụvàthiếtbị

Nguyên vậtliệu,hóachất

- Chitosanđượcchiếttách,xửlý,deaxetylhoávàđãđượcxácđịnhcácthôngsốnhưđộdeacetyl; khốilượngphântửbởicácnghiêncứutrước đâycủanhóm nghiêncứu;

- Muốisắt clorua(Fe@Cl 3 6H2O),(A.R,TrungQuốc);

- MuốiMorh((NH 4 )2Fe(SO4)2.6H2O)(A.R,TrungQuốc);

- Glucoseoxidase(GOx,149800 U/g)(Sigma Aldrich-Đức);

Dụngcụvàthiếtbị

- Máylytâmtốcđộ caoTommy(Nhật),(tốcđộtốiđa15.000vòng/phút);

- Bìnhthủynhiệt(autoclave):teflon,dung tích250ml.

- Cácdụng cụthủy tinhkhácnhưcốc, ốngđong,bìnhtamgiác,…

Tổnghợpvật liệuAgNPs/CQDsvàứngdụngtrongchếtạocảm biếnsinhhọc

TổnghợpvậtliệuAgNPs/CQDs

Để tổng hợp các hạt carbon lượng tử (CQDs), hỗn hợp gồm 3,44g acid citric và 3,005g ureahòa tan trong 100mL nước được cho vào autoclave và tiến hành gia nhiệt ở 160°C trong 4 giờ Sau khi làm nguội tự nhiên đến nhiệt độ phòng, hỗn hợp được ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút trong 30 phút để thu được chất rắn dạng bột nano carbon Bột này sau đó được sấy khô ở 80°C trong 10 giờ để thu được CQDs dưới dạng bột màu nâu đen, và cuối cùng được phân tán trong nước để thu được dung dịch CQDs Sơ đồ quy trình tổng hợp được thể hiện trong hình 2.1.

Hình 2.1Cơchếhìnhthành hạtCQDs dotstheo phươngpháp từ dưới lên(bottom-Vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β –sheet) của enzymup)

2.2.1.2 ChếtạovậtliệunanoAg/Carbon dots(AgNPs/CQDs)

Quy trình tạo vật liệu này được công bố, bắt đầu bằng cách lấy 100 µL dung dịch CQDs pha vào 3 mL nước cất Sau đó, pH dung dịch được điều chỉnh từ 3 đến 11 bằng NaOH 0,1 M và CH3COOH 1 M Tiếp theo, cho 20 μL dung dịch AgNO3 0,1 M vào dung dịch trên Hỗn hợp được gia nhiệt đến 90°C trong 3 giờ để khử Ag+ thành nanoplat bạc (AgNPs) Sau khi nguội, hỗn hợp chứa vật liệu nanoplat bạc được bảo quản ở 4°C để sử dụng.

Chếtạocảmbiếnpháthiệnhydrogenperoxide(H 2 O 2 )trêncơsởvậtliệuAgNPs/

Pha dung dịch H2O2 với nồng độ từ 0,5 μM đến 100 μM, sau đó cho 200 μL dung dịch H2O2 vào ống Eppendorf 1,5 mL Tiếp theo, thêm 1000 μL dung dịch AgNPs/CQDs, lắc trộn trên máy vortex trong 10 giây và ngâm ống Eppendorf trong bể ổn nhiệt ở 40 °C trong 30 phút Sau khi để nguội đến nhiệt độ phòng, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 425 nm (OD 425 nm) Phần trăm chênh lệch độ hấp thụ quang ở 425 nm (ΔA/A) giữa dung dịch có và không có H2O2 được sử dụng làm tín hiệu cảm biến để xác định nồng độ.

Trong nghiên cứu này, độ hấp thụ quang A được xác định bằng công thức ΔA = A0 - AC, trong đó A0 và AC lần lượt là độ hấp thụ quang ở bước sóng 425 nm (OD425) của dung dịch AgNPs/CQDs trước và sau khi có mặt H2O2 ở nồng độ C (mM) Để tối ưu hóa điều kiện phản ứng, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như pH, nhiệt độ và nồng độ của xúc tác Quy trình thực nghiệm được thực hiện tương tự như trước, chỉ thay đổi điều kiện hoặc nồng độ của các tác nhân khi khảo sát phản ứng.

Đầu tiên, 100 μM dung dịch glucose với các nồng độ khác nhau từ 0,5 mM đến 8 mM được pha trong đệm PBS (pH=7) và cho vào ống Eppendorf Sau đó, thêm 100 μM dung dịch GOx với nồng độ 2 mg/mL vào hỗn hợp.

Trong thí nghiệm, 1 phẩng đệm PBS nồng độ 0.001M được thêm vào ống nghiệm và hỗn hợp được khuấy trộn bằng máy trong 10 giây Sau đó, hỗn hợp được ủ ở 37°C trong 30 phút Tiếp theo, 1000 μM dung dịch AgNPs/CQDs được thêm vào ống, trộn đều và ủ ở 40°C trong 30 phút Sau khi làm nguội đến nhiệt độ phòng, mẫu được chuyển vào cuvet để đo độ hấp thụ A ở bước sóng 425 nm Phần trăm chênh lệch độ hấp thụ ở bước sóng 425 nm (ΔA/A) được sử dụng làm tín hiệu để xác định nồng độ glucose trong mẫu theo công thức, với ΔA = A0 - AC, trong đó A0 và AC lần lượt là độ hấp thụ quang ở bước sóng 425 nm của hỗn hợp không có và có mặt glucose ở nồng độ C (mM).

2.2.4 Ứng dụng cảm biến glucose trên cơ sở vật liệu AgNPs/CQDs cho mẫuthực

Cảm biến được sử dụng để xác định nồng độ glucose trong mẫu nước tiểu của người Mẫu nước tiểu được lấy từ các tình nguyện viên và pha loãng với dung dịch đệm PBS nồng độ 0,001 M theo tỷ lệ 1:4 Sau đó, 100 μL dung dịch nước tiểu được pha loãng để làm mẫu glucose và thực hiện các bước tương tự như với dung dịch glucose ở mục 2.2.3.

2.2.5 Chếtạohệthốngxétnghiệmhàngloạt,ứngdụngđểpháthiệnhydrogen peroxide (H 2 O 2 ) trên cơ sở vật liệu AgNPs/CQDs sử dụng phầnmềnImageJ

Hệ thống được chế tạo dựa trên các thiết bị và sản phẩm quy chuẩn gồm điện thoạithôngminh(smartphone),ipad,và khayElisa 96giếng Quytrìnhchếtạonhưsau:

Buồng tối được thiết kế với kích thước dài x rộng x cao (19cm x 14 cm x 30cm) và hình dạng hộp kín hai đầu, với đầu trên được thiết kế hở có kích thước 12,5cm x 8,5cm để phù hợp với mặt lưng chứa camera của điện thoại thông minh, đồng thời phần chân dưới được thiết kế hở để đặt nguồn sáng từ màn hình ipad mini như hình minh họa.

Hệ thống phân tích được chế tạo gồm các thành phần như vùng xoắn α-Helica và vùng tấm β (β-sheet) của enzymview Sơ đồ bố trí thiết bị tích nồng độ H2O2 trong giếng Elisa được thực hiện qua phần mềm ImageJ.

- Phần mềm phân tích hình ảnh ImageJ được sử dụng để đánh giá cường độ màu của ảnh[15].Đểđịnhlượngmàuvàng,cườngđộkênhxanhlamđượcchọnvì nómanglạikếtquảtốtnhất.Quytrìnhchụpảnhvàxửlýảnhđểthusốhiệuđượcsơđồhoánhưtrênhình2. 4.

Hình 2.4Sơđồ xửlýtínhiệu đo từhệthống 2.2.5.2 Quytrìnhthaotáctrênhệthống

- ChovàocácgiếngtrongkhayElisa96200LdungdịchAgNPs/CQDs.Sauđó,lấy50

Dung dịch H2O2 với các nồng độ khác nhau (50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM) đã được chuẩn bị và để ở nhiệt độ phòng trong 40 phút Mỗi nồng độ được đưa vào 12 giếng trong cùng một hàng của khay Elisa.

Dung dịch NaOH 10% dư pH =9-10 11,89 g và 8.63 g (NH 4 )Fe(SO 4 ) 2 6H 2 O

2.3 TổnghợpvậtliệuFe 3 O 4 bọccarbon(Fe@C)vàứngdụngtrongchếtạocảm biếnsinhhọc

Khuấyvàthủynhiệt160 o Cvà8h Để nguội đến nhiệt độ phòng 1 hLọc,rửabằngnướcvàsấy24h

- Câncácmuối(NH 4 )2Fe(SO4)2.6H2O,Fe@Cl3.6H2O,glucosetheotỷlệkhốilượngvàphad ungdịchNaOH10 %.

- CácmuốiđượctrộntheođúngtỷlệmolFe 2+ :Fe 3+ =2:1(trênbảng2.1)theophươngtrình phản ứng (PT 2.1,

PT 2.2) trong cốc 500 mL Hỗn hợp được hòa tan khi đặt lên máykhuấytừ,gianhiệtchophảnứnglênđến80 o C.Dùngnhiệtkếxácđịnhnhiệtđộcủadungdịch, khi dung dịch đạt 80 o C, nhỏ từ từ dung dịch NaOH 10 % vào hỗn hợp hai muối,khuấytrộnvớitốcđộổnđịnhchođếnkhipHđạt9hoặc10thìngưnglạivàtiếptụckhuấytrộnvàgia nhiệtchophảnứngở80 o Ctrong2hđểphảnứnghoàntoàn.

Quy trình tổng hợp hạt sắt từ được mô tả theo các phương trình phản ứng:NaOH®Na + +OH – (PT2.1)

Fe2++2Fe3++8OH-®Fe3O4+4H2O (PT2.2)

- Thusảnphẩm,khikếtthúcbước2,dùngnamchâmhútcáchạtnanoFe 3 O4lại,gạnbỏnướctrong, tháobỏnamchâm;thêmnướccấtvàorồiđemsiêuâm.LạidùngnamchâmhútgiữcáchạtnanoFe 3 O4lại,g ạnbỏnướctrongđi,tháobỏnamchâm;thêmnướccấtrồiđemsiêuâm.LặplạiquytrìnhđếnkhipHcủan ước trongđạtpHtừ7-7,5thìkếtthúc.

Từ hạt nano Fe3O4 đã tổng hợp, chuẩn bị lượng glucose cần thiết theo loại mẫu (bảng 2.1) và hòa tan glucose trong nước cất Hỗn hợp được trộn đều và siêu âm trong 20 phút, sau đó đem vào autoclave để xử lý nhiệt ở 160°C trong 8 giờ Sau khi nguội về nhiệt độ phòng, hỗn hợp được lấy ra và dùng nam châm để tách các hạt nano Fe3O4 bọc carbon (Fe@C), rồi rửa và sấy ở 80°C trong 24 giờ Kết quả thu được là chất rắn màu đen, được nghiền mịn thành hạt nano Fe@C, sau đó tiến hành phân tích XRD, SEM, TEM, VSM, IR để xác định cấu trúc vật liệu.

Lấy 1 mL dung dịch đệm axetat (pH4) cho vào ống eppendorf 1,5 mL; lấy vào đú20àldungdịchxỳctỏcFe@C(2mg.mL -1 );20àLdungdịchTMB(20mg.mL -

Hỗn hợp 100 à LH 2 O2 với nồng độ thay đổi từ 0.01 mM đến 1 mM được khuấy trộn bằng máy vortex trong 10 giây, sau đó ủ ở nhiệt độ 40 oC trong 30 phút Sau khi để nguội về nhiệt độ phòng, mẫu được đo phổ UV-Vis, trong đó pic hấp thụ tại bước sóng 652 nm được sử dụng làm tín hiệu để đánh giá và xử lý số liệu Để tối ưu hóa điều kiện phản ứng, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như pH, nhiệt độ và nồng độ của xúc tác Quy trình thực nghiệm được thực hiện tương tự, chỉ thay đổi điều kiện hoặc nồng độ của các tác nhân khi khảo sát phản ứng.

2.3.2.2 Chếtạocảm biếnxácđịnh nồngđộglucosetrêncơ sởvậtliệu Fe@C

Cho 100 μL dung dịch đệm PBS (0,01M), 100 μL dung dịch glucose (với nồng độ khác nhau) và 50 μL GOx (2 mg/mL) vào ống Eppendorf Hỗn hợp được lắc đều và ủ ở nhiệt độ 40 °C trong 30 phút Sau đó, thêm 20 μL dung dịch Fe@C (2 mg/mL), 20 μL dung dịch TMB (20 mg/mL) và 1 mL dung dịch đệm axetat (pH 4) vào ống Eppendorf Cuối cùng, hỗn hợp được ủ ở 40 °C trong 30 phút trước khi chuyển đến cuvet để đo phổ UV-Vis.

2.3.2.3 Ứng dụng vật liệu Fe@C trong chế tạo cảm biến xác định glucose trongdungdịchvàmẫuthực a) Xácđịnhglucosetrongdungdịch

Dung dịch glucose truyền tĩnh mạch 5 %: tức có nồng độ glucose là khoảng

Dung dịch glucose 277 mM được pha loãng với các tỷ lệ 1:100, 1:200 và 1:300 để sử dụng làm mẫu cho cảm biến Mẫu so sánh là dung dịch glucose pha sẵn với nồng độ 0,55 mM Kết quả đo nằm trong vùng tuyến tính, cho phép tính toán nồng độ glucose trong mẫu 4 dựa theo mẫu chuẩn S1.

As1/Cs1=Amẫu/Cmẫu (CT2.2) Kết quả tính toán nồng độ glucose trong các mẫu đo, suy ra nồng độ trong mẫu gốctheokếtquảđođạc Từđótínhtoán saisố so vớitrong mẫugốctheocôngthức:Saisố

Mẫu máu được cung cấp bởi một Trung tâm Y tế tại Hà Nội với sự đồng ý của trung tâm, không tiết lộ danh tính mẫu, chỉ cung cấp thông số nồng độ glucose trong mẫu Mẫu đã được ly tâm để tách hết hồng cầu, bạch cầu và các đại phân tử, thu được dung dịch serum (huyết thanh).

Trong nghiên cứu, mẫu huyết thanh được sử dụng để xác định nồng độ glucose, được bảo quản trong ống Geppendorf để tránh ánh nắng trực tiếp và phải được phân tích trong vòng 4 giờ sau khi lấy mẫu Phương pháp so sánh được áp dụng, trong đó mẫu chuẩn là dung dịch có nồng độ glucose đã biết và mẫu phân tích là huyết tương cần kiểm tra Sau khi hoàn tất các phản ứng, độ hấp thụ quang được đo ở bước sóng 652 nm bằng máy UV-Vis, từ đó xác định nồng độ glucose trong mẫu máu.

Trongđó:Asamplelàđộquanghấpthụtại652nmcủamẫuthửlàdungdịchcầnphântích;Astandardl àđ ộquanghấpthụtại652nmcủamẫuthửlàdungdịchchuẩn.

Chếtạocảmbiến glucosetrêncơsởvậtliệuAgNPs/CQDs

Đầu tiên, dung dịch glucose 100 μM với các nồng độ khác nhau (từ 0,5 mM đến 8 mM) được pha trong đệm PBS (pH=7) và cho vào ống Eppendorf Sau đó, thêm 100 μL dung dịch GOx với nồng độ 2 mg/mL.

Trong nghiên cứu này, 1 phatrong đệm PBS nồng độ 0.001M được thêm vào ống và khuấy trộn bằng máy vortex trong 10 giây Sau đó, hỗn hợp được ủ ở 37°C trong 30 phút Tiếp theo, 1000 μM dung dịch AgNPs/CQDs được thêm vào, trộn đều và ủ ở 40°C trong 30 phút Sau khi để nguội đến nhiệt độ phòng, hỗn hợp được chuyển vào cuvet để đo độ hấp thụ A ở bước sóng 425 nm Phần trăm chênh lệch độ hấp thụ ở bước sóng 425 nm (ΔA/A) được sử dụng làm tín hiệu để xác định nồng độ glucose trong mẫu theo công thức (CT2.1), với ΔA = A0 - AC, trong đó A0 và AC lần lượt là độ hấp thụ quang A ở bước sóng 425 nm (OD425) của hỗn hợp chứa AgNPs/CQDs khi không có và có mặt glucose ở nồng độ C (mM).

ỨngdụngcảmbiếnglucosetrêncơsởvậtliệuAgNPs/CQDschomẫuthực

Cảm biến được sử dụng để xác định nồng độ glucose trong nước tiểu Mẫu nước tiểu được lấy từ các tình nguyện viên và pha loãng với dung dịch đệm PBS nồng độ 0,001M theo tỷ lệ 1:4 Sau đó, 100μL dung dịch nước tiểu được pha loãng để làm mẫu glucose và thực hiện các bước tương tự như trong phần 2.2.3.

Chếtạohệthốngxétnghiệmhàngloạt,ứngdụngđểpháthiệnhydrogenperoxide(

Hệ thống được chế tạo dựa trên các thiết bị và sản phẩm quy chuẩn gồm điện thoạithôngminh(smartphone),ipad,và khayElisa 96giếng Quytrìnhchếtạonhưsau:

Buồng tối được làm bằng gỗ hoặc tấm nhựa, có kích thước dài 19cm, rộng 14cm và cao 30cm, với hai đầu rỗng Đỉnh buồng có kích thước 12,5cm x 8,5cm, phù hợp với mặt lưng chứa camera của điện thoại thông minh Phía dưới chân buồng được thiết kế hở để đặt nguồn sáng từ mànhìn hipadmin.

Hệ thống phân tích được chế tạo bao gồm (a) hình ảnh của thiết bị, (b) cấu trúc vùng xoắn α-Helica và vùng tấm β-sheet của enzymview, và (c) sơ đồ bố trí thiết bị tích nồng độ H2O2 trong giếng Elisa thông qua phần mềm ImageJ.

- Phần mềm phân tích hình ảnh ImageJ được sử dụng để đánh giá cường độ màu của ảnh[15].Đểđịnhlượngmàuvàng,cườngđộkênhxanhlamđượcchọnvì nómanglạikếtquảtốtnhất.Quytrìnhchụpảnhvàxửlýảnhđểthusốhiệuđượcsơđồhoánhưtrênhình2. 4.

Hình 2.4Sơđồ xửlýtínhiệu đo từhệthống 2.2.5.2 Quytrìnhthaotáctrênhệthống

- ChovàocácgiếngtrongkhayElisa96200LdungdịchAgNPs/CQDs.Sauđó,lấy50

Dung dịch H2O2 với các nồng độ khác nhau (50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM) đã được chuẩn bị và để ở nhiệt độ phòng trong 40 phút Mỗi nồng độ được đưa vào 12 giếng trong cùng một hàng của khay Elisa.

Dung dịch NaOH 10% dư pH =9-10 11,89 g và 8.63 g (NH 4 )Fe(SO 4 ) 2 6H 2 O

Tổng hợp vật liệu Fe 3 O 4bọc carbon (Fe@C) và ứng dụng trong chế tạo cảm biến sinh học 35 1 Tổnghợp vậtliệuFe@C

Khuấyvàthủynhiệt160 o Cvà8h Để nguội đến nhiệt độ phòng 1 hLọc,rửabằngnướcvàsấy24h

- Câncácmuối(NH 4 )2Fe(SO4)2.6H2O,Fe@Cl3.6H2O,glucosetheotỷlệkhốilượngvàphad ungdịchNaOH10 %.

- CácmuốiđượctrộntheođúngtỷlệmolFe 2+ :Fe 3+ =2:1(trênbảng2.1)theophươngtrình phản ứng (PT 2.1,

PT 2.2) trong cốc 500 mL Hỗn hợp được hòa tan khi đặt lên máykhuấytừ,gianhiệtchophảnứnglênđến80 o C.Dùngnhiệtkếxácđịnhnhiệtđộcủadungdịch, khi dung dịch đạt 80 o C, nhỏ từ từ dung dịch NaOH 10 % vào hỗn hợp hai muối,khuấytrộnvớitốcđộổnđịnhchođếnkhipHđạt9hoặc10thìngưnglạivàtiếptụckhuấytrộnvàgia nhiệtchophảnứngở80 o Ctrong2hđểphảnứnghoàntoàn.

Quy trình tổng hợp hạt sắt từ được mô tả theo các phương trình phản ứng:NaOH®Na + +OH – (PT2.1)

Fe2++2Fe3++8OH-®Fe3O4+4H2O (PT2.2)

- Thusảnphẩm,khikếtthúcbước2,dùngnamchâmhútcáchạtnanoFe 3 O4lại,gạnbỏnướctrong, tháobỏnamchâm;thêmnướccấtvàorồiđemsiêuâm.LạidùngnamchâmhútgiữcáchạtnanoFe 3 O4lại,g ạnbỏnướctrongđi,tháobỏnamchâm;thêmnướccấtrồiđemsiêuâm.LặplạiquytrìnhđếnkhipHcủan ước trongđạtpHtừ7-7,5thìkếtthúc.

Từ các hạt nano Fe3O4 đã tổng hợp, tùy vào loại mẫu cần tạo ra, chuẩn bị lượng glucose khác nhau Sau khi cân glucose, hòa tan trong nước cất và thêm vào cốc chứa hạt nano Fe3O4, hỗn hợp được khuấy trộn và siêu âm trong 20 phút Hỗn hợp này sau đó được trộn với glucose theo tỷ lệ quy định, siêu âm và đưa vào autoclave để xử lý nhiệt ở 160°C trong 8 giờ Sau khi nguội về nhiệt độ phòng, hỗn hợp được lấy ra và sử dụng nam châm để thu hồi hạt nano Fe3O4 bọc carbon, loại bỏ nước và rửa sạch trong môi trường trung tính Cuối cùng, hạt nano Fe@C thu được được sấy ở 80°C trong 24 giờ, nghiền mịn và phân tích bằng các phương pháp XRD, SEM, TEM, VSM, IR để xác định cấu trúc vật liệu.

Lấy 1 mL dung dịch đệm axetat (pH4) cho vào ống eppendorf 1,5 mL; lấy vào đú20àldungdịchxỳctỏcFe@C(2mg.mL -1 );20àLdungdịchTMB(20mg.mL -

Hỗn hợp 100 à LH 2 O2 với nồng độ thay đổi từ 0.01 mM đến 1 mM được khuấy trộn bằng mỏy vortex trong 10 giây, sau đó ủ ở nhiệt độ 40°C trong 30 phút Sau khi để nguội về nhiệt độ phòng, mẫu được đo phổ UV-Vis, trong đó pic hấp thụ tại bước sóng 652 nm được sử dụng làm tín hiệu để đánh giá và xử lý số liệu Để tối ưu hóa điều kiện phản ứng, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như pH, nhiệt độ, và nồng độ của xúc tác Quy trình thực nghiệm được thực hiện tương tự nhưng thay đổi điều kiện hoặc nồng độ của các tác nhân khi khảo sát phản ứng.

2.3.2.2 Chếtạocảm biếnxácđịnh nồngđộglucosetrêncơ sởvậtliệu Fe@C

Cho 100 μL dung dịch đệm PBS (0,01M), 100 μL dung dịch glucose (nồng độ khác nhau) và 50 μL GOx (2 mg/mL) vào ống Eppendorf Hỗn hợp được lắc đều và ủ ở nhiệt độ 40 °C trong 30 phút Sau đó, thêm 20 μL dung dịch Fe@C (2 mg/mL), 20 μL dung dịch TMB (20 mg/mL) và 1 mL dung dịch đệm axetat (pH 4) vào ống Eppendorf Cuối cùng, hỗn hợp được ủ ở 40 °C trong 30 phút trước khi chuyển đến cuvet để đo phổ UV-Vis.

2.3.2.3 Ứng dụng vật liệu Fe@C trong chế tạo cảm biến xác định glucose trongdungdịchvàmẫuthực a) Xácđịnhglucosetrongdungdịch

Dung dịch glucose truyền tĩnh mạch 5 %: tức có nồng độ glucose là khoảng

Dung dịch glucose 277 mM được pha loãng với tỷ lệ 1:100, 1:200 và 1:300 để sử dụng làm mẫu cho cảm biến Mẫu so sánh được sử dụng là dung dịch glucose pha sẵn với nồng độ 0,55 mM Kết quả đo được nằm trong vùng tuyến tính, cho phép tính toán nồng độ glucose trong mẫu 4 dựa theo mẫu chuẩn S1.

As1/Cs1=Amẫu/Cmẫu (CT2.2) Kết quả tính toán nồng độ glucose trong các mẫu đo, suy ra nồng độ trong mẫu gốctheokếtquảđođạc Từđótínhtoán saisố so vớitrong mẫugốctheocôngthức:Saisố

Mẫu máu được cung cấp bởi một Trung tâm Y tế tại Hà Nội, với sự đồng ý của Trung tâm, trong đó không tiết lộ danh tính mẫu mà chỉ cung cấp thông số nồng độ glucose Mẫu đã được ly tâm để tách hoàn toàn hồng cầu, bạch cầu và các đại phân tử, thu được dung dịch serum (huyết thanh) phục vụ cho các xét nghiệm y tế.

Trong nghiên cứu, mẫu được sử dụng trực tiếp là dung dịch chứa glucose và được bảo quản trong ống Eppendorf để tránh ánh nắng chiếu trực tiếp, thời gian sử dụng mẫu để phân tích không quá 4 giờ kể từ thời điểm lấy mẫu Để xác định nồng độ glucose trong các mẫu huyết thanh, phương pháp so sánh được áp dụng, sử dụng hệ cảm biến để tiến hành hai thí nghiệm với mẫu chuẩn (dung dịch chuẩn đã xác định nồng độ glucose) và mẫu phân tích (mẫu huyết tương cần phân tích) Sau khi kết thúc các phản ứng, các mẫu thử được đo độ quang hấp thụ ở bước sóng 652 nm trên máy UV-Vis, từ đó nồng độ glucose trong mẫu máu được xác định.

Trongđó:Asamplelàđộquanghấpthụtại652nmcủamẫuthửlàdungdịchcầnphântích;Astandardl àđ ộquanghấpthụtại652nmcủamẫuthửlàdungdịchchuẩn.

Phương pháp này cho phép xác định nồng độ glucose trong mẫu thử và so sánh nhanh với mẫu chuẩn thông qua độ quang hấp thụ tại 652 nm Nồng độ glucose trong mẫu chuẩn thường được chọn là nồng độ cao nhất có thể đạt được trong máu của người khỏe mạnh, cụ thể là 5,55 mM.

Tuy nhiên để phù hợp với giới hạn đo của thiết bị nghiên cứu, mẫu thử và mẫuchuẩnsẽđượcđồngthờiphaloãng10lần.Nhưvậy,trongnghiêncứunày,nồngđộglucosetrongmẫuth ực đượcxácđịnhnhư sau:

2.4 Tổng hợp vật liệu FeOOH/ chấm carbon lượng tử pha tạp nitơ (FN-CQDs)ứngdụngtrongchếtạocảmbiếnsinhhọc

DungdịchFeOOH/chấmlượngtử phatạpnito(FN-CQDs)

Kết tủa màu đen Hòa 8g chitosan trong

Dung dịch sau thủy nhiệt

Khuấyvàthủynhiệt180 o Cvà8h Đểnguộiđếnnhiệt độphòng1h lytâmđểloạibỏhạtkíchthước lớn vàchỉnhpH=7-8

Hình 2.6SơđồtổnghợpvậtliệuFN-Vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β –sheet) của enzymCQDs

Vật liệu FN-CQDs được tổng hợp từ hạt nano sắt từ Fe3O4 thông qua quy trình đồng kết tủa Đầu tiên, hòa tan 3,39 g (NH4)2Fe(SO4)2.6H2O và 4,69 g FeCl3.6H2O trong 50 ml nước cất, sau đó khuấy và gia nhiệt đến 40°C Tiếp theo, từ từ thêm dung dịch NH3 10% cho đến khi đạt pH = 8,5, dẫn đến sự hình thành hạt nano Fe3O4 dưới dạng kết tủa màu đen Sau 30 phút duy trì khuấy và bảo ôn ở 40°C, thu hồi các hạt Fe3O4 bằng nam châm vĩnh cửu và rửa sản phẩm 5-7 lần với nước có pH = 7, sau đó hòa tan 8 g chitosan vào sản phẩm.

Để tạo ra dung dịch chitosan dạng keo, nhờ vào 400 mL axit axetic 1%, cần khuấy đều với lượng nano sắt tổng hợp cho đến khi thu được dung dịch đồng nhất Sau đó, chuyển dung dịch này vào ống teflon và đưa vào bình phản ứng thủy nhiệt (autoclave), thực hiện thủy nhiệt trong 8 giờ ở nhiệt độ 180 °C trong tủ sấy.

Sau khi kết thúc quá trình thủy nhiệt, bình phản ứng được lấy ra và làm nguội ở nhiệt độ phòng Hỗn hợp thu được sau thủy nhiệt được li tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 20 phút để loại bỏ cách hoạt carbon có kích thước lớn hoặc cách hoạt Fe3O4/carbon Cuối cùng, thu được dung dịch bao gồm Fe(III) và carbon, cùng với các ion phosphate nitơ.

Dung dịch Fe (III) kết hợp với chấm carbon lượng tử pha tạp nitơ được điều chỉnh pH từ 1 M NaOH đến mức 7 – 8 ở nhiệt độ phòng, tạo ra hạt FeOOH/ chấm carbon lượng tử pha tạp nitơ (FN-CQDs) dưới dạng kết tủa lơ lửng Hạt FN-CQDs sau đó được thu hồi bằng cách ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 30 phút và được rửa lại bằng nước cất.

2.4.2.1 Chếtạocảm biếnpháthiệnH 2 O 2 trêncơsởvậtliệu FN-CQDs

Lấy 1 mL dung dịch đệm axetat (pH4) cho vào ống eppendorf 1,5 mL; lấy vào đú100 àL dung dịch xỳc tỏc FN-CQDs (2 mg.mL -1 ); 100 àL dung dịch TMB (20 mg.mL -

Hỗn hợp H2O2 với nồng độ từ 0,04 mM đến 0,15 mM được ủ ở 40°C trong 30 phút, sau đó làm nguội về nhiệt độ phòng và đo phổ UV-Vis Trên phổ UV-Vis, pic hấp thụ tại bước sóng 652 nm được sử dụng làm tín hiệu để đánh giá và xử lý số liệu Để tối ưu hóa điều kiện phản ứng, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như pH, nhiệt độ và nồng độ của xúc tác Quy trình thực nghiệm tương tự được thực hiện với sự thay đổi điều kiện hoặc nồng độ của các tác nhân khi khảo sát phản ứng.

Cảmbiếnglucoseđượcchếtạodựatrênphảnứnggiữaglucosevàoxy,dướisựxúctác của GOx, tạo ra axit gluconic và H2O2.Sản phẩm thu được sau phản ứng, tức H2O2sẽđượcđịnhlượngtươngtựnhư cảmbiếnH2O2n h ư đ ãnêuởtrên.

GOx dạng bột được pha trong dung dịch đệm PBS với nồng độ 2 mg/mL 100 µL GOx 2 mg/mL được trộn đều và phản ứng với 250 µL glucose trong đệm PBS trong 30 phút ở nhiệt độ 37 °C Tiếp theo, thêm 100 µL TMB 20 mg/mL và 100 µL FN-CQDs 2 mg/mL.

Khảosáthoạttínhcủacácnanozyme (Fe@C,FN-CQDs)

Nghiên cứu động học enzym giúp hiểu rõ cơ chế phân tử của các tác động và mối quan hệ lượng trong quá trình enzym Đồng thời, nó cũng đánh giá khả năng và điều kiện hoạt động của enzym.

DocótínhxúctáctươngtựenzymHRP, các vật liệu như Fe@C và FN-CQDs có cơ chế hoạt động tương tự Do đó, cần nghiên cứu động học enzym của Fe@C và FN-CQDs để so sánh khả năng xúc tác của chúng với HRP và các vật liệu khác Hằng số động học enzym là yếu tố quan trọng trong việc đánh giá hiệu suất xúc tác của các vật liệu này.

Hằng số động học Km là giá trị quan trọng trong nghiên cứu động học enzym, phản ánh ái lực giữa enzym và cơ chất Để xác định Km trong phản ứng giữa TMB và H2O2, ta giữ nguyên nồng độ H2O2 và thay đổi nồng độ TMB, từ đó thu được Km với TMB Ngược lại, khi giữ nguyên nồng độ TMB và thay đổi nồng độ H2O2, ta cũng có thể xác định Km với H2O2 Kết quả này cho phép xây dựng đồ thị theo phương trình Michaelis–Menten hoặc phương trình Lineweaver-Burk, với phương trình Lineweaver-Burk là dạng nghịch đảo của Michaelis–Menten.

Vận tốc ban đầu của phản ứng, ký hiệu là v, được xác định từ nồng độ TMB đã bị oxi hóa và thời gian phản ứng, trong khi Vmax là vận tốc lớn nhất của phản ứng Nồng độ chất [C] thay đổi và Km là hằng số Michaelis Phương trình này có thể được biểu diễn dưới dạng tuyến tính y = a + bx, với a = 1/Vmax và b = Km/Vmax Hằng số Km càng nhỏ thì ái lực của xúc tác với chất nền càng cao, do đó, khi Km nhỏ, khả năng xúc tác của vật liệu nanozyme càng tốt.

Cácphươngphápxử lýsốliệu

2.6.1 Độnhạy Đốivớicảmbiếntuyếntính,giữabiếnthiênđầuraΔssvàbiếnthiênđầuvàoΔsmcósựliênhệtuyế ntính: Δss=S.Δsm (CT2.6)

Độ nhạy của cảm biến, ký hiệu là S, được xác định bởi tỷ số giữa biến thiên Δss của đại lượng đầu ra và biến thiên Δsm tương ứng của đại lượng đo ở đầu vào Để đảm bảo độ chính xác cao trong phép đo, cần thiết kế và sử dụng cảm biến sao cho độ nhạy S không thay đổi, tức là ít phụ thuộc vào các yếu tố khác nhau.

- Ảnhhưởngcủacácđạilượngvậtlýkhác(khôngphảilàđạilượngđo)củamôitrườngxungquanh.T hôngthườngnhàsảnxuấtcungcấpgiátrịcủađộnhạyStươngứngvớinhữngđiềukiệnlàmviệc nhấtđịnhcủa cảm biến.

2.6.2 Độ chọnlọc(độđặchiệu) Độ đặc hiệu của một xét nghiệm là tỷ lệ những trường hợp thực sự không có bệnhvàcókếtquảxétnghiệmâmtínhtrongtoànbộcáctrườnghợpkhôngbịbệnh.Độđặchiệuđượctínhth eo công thức sau: Độ đặc hiệu = Số trường hợp âm tính thật/(số trường hợp âm tính thật + số trườnghợpdươngtínhgiả) (CT.2.7) Đốivớimộtxétnghiệmđểxácđịnhxemai mắcbệnhnàođó,độđặchiệu100%cónghĩa là toàn bộ những người khỏe mạnh (không mắc bệnh) được xác định là khỏe mạnh.Một mìnhđộđặchiệukhôngchochúngtabiếttoànbộvềxétnghiệmbởivì100% độ đặc hiệu có thể có được một cách thông thường bằng việc gán cho toàn bộ các trườnghợpkếtquảxétnghiệmâmtính.Chínhvìvậy,chúngtacầnphảibiếtthêmvềđộnhạycủaxétngh iệm.

Giới hạn phát hiện (LOD) là ngưỡng dưới mà tại đó sự hiện diện của chất cần phân tích có thể được nhận biết trong mẫu trắng, tức là mẫu không chứa chất cần phân tích hoặc chất cạnh tranh LOD thường được tính toán theo một công thức cụ thể.

Trongđó:ALOD– tínhiệumẫuứngvớinồngđộthấpnhấtmàcảmbiếncóthểpháthiện(LOD);𝑨̅ 𝐵𝑙𝑎𝑛𝑘: tínhiệutrungbình củamấutrắng;vàϭBlanklàsaisốtuyệtđốicủamẫutrắng.Saisốnàyđượctínhtheocôngthức:

Để đảm bảo ý nghĩa thống kê trong các thí nghiệm với mẫu trắng, số lượng thí nghiệm (N) cần phải lớn, thường là N>5 Tín hiệu mẫu trắng đầu tiên được ký hiệu là 𝐴𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘(𝑖) Dựa vào giá trị ALOD đã tính toán, có thể suy luận hoặc ngoại suy từ đường chuẩn để xác định giá trị LOD.

Bước sóng (nm) Bước sóng (nm)

Tổnghợp,đặctrưngvàứngdụngvậtliệuAgNPs/ CQDstrongchếtạocảmbiếnsinhhọcsomàu pháthiệnglucose

Chúng tôi tiến hành tổng hợp CQDs theo hai cách tiếp cận khác nhau : (i) phươngpháptừtrênxuống,chúngtôidùngchitosanđểthủynhiệt,cắtmạchthànhcácchấmlượngtửcar bon(CQDs)cóphatạpnitơ.TuynhiêncáchnàyhiệusuấttạothànhCQDsthấp,phầnlớn chitosan tạoracácmuộicarbonhạtlớn, chỉmộtphầnrất ítthuđượcở dạngCQDsvà

(ii)phươngpháptừdướilên,chúngtôitổnghợptừaxitcitricvàureakếtquảkhảquanhơnnhiều: không có muội carbon tạo thành, sản phẩm có cường độ phát quang cao, hiệu suấtlớn.Vìvậycách(ii)được lựa chọnđểtổnghợpCQDs.

Hình 3.1(A) trình bày phổ UV của vùng xoắn α (α-Helica) và vùng tấm β (β-sheet) của enzym Vis từ CQDs; (B) cho thấy phổ PL của CQDs với các bước sóng kích thích khác nhau; (C) là ảnh TEM của CQDs; và (D) minh họa màu sắc dung dịch CQDs và mẫu nước dưới ánh sáng thường (trái) và dưới tia UV (phải), thể hiện độ hấp thụ quang (A.U).

Hình 3.1 A cho thấy phổ UV-Vis của dung dịch CQDs, với hai đỉnh hấp thụ tại 220 và 345 nm, tương ứng với chuyển đổi π-π* của C=C và n-π* của C=O Phổ phát xạ huỳnh quang của CQDs ghi nhận tại 520 nm với bước sóng kích thích 380 nm (hình 3.1B, đường (2)) Hình ảnh TEM (hình 3.1C) cho thấy CQDs có hình dạng cầu và kích thước phân bố trong khoảng 5 ± 2 nm, mặc dù ảnh TEM rất mờ do độ tương phản thấp và kích thước nhỏ (2-3 nm) Hình 3.1D minh họa sự phát xạ màu xanh của dung dịch CQDs dưới ánh sáng tím, với sự dịch chuyển màu đỏ khi bước sóng kích thích tăng lên (hình 3.1B) Cơ chế phát huỳnh quang của CQDs vẫn đang được nghiên cứu, với nguồn gốc PL được cho là do hiệu ứng lượng tử, khuyết tật bề mặt, và sự phát quang từ các mức độ khác nhau của π-liên hợp Một nghiên cứu cho thấy khả năng phát quang phụ thuộc vào trạng thái cấu trúc và kích thước của CQDs.

So với phổ UV-vis của CQD, đỉnh hấp thụ mới xuất hiện trong khoảng 420 nm đến 441 nm với hỗn hợp dung dịch CQD + AgNO3 sau quá trình khử Các đỉnh này được quy cho AgNP, hình thành nhờ CQD làm thuốc thử khử Ở độ pH thấp, cụ thể là pH = 5 và pH = 3, đỉnh hấp thụ của AgNP có màu đỏ, cho thấy kích thước của AgNP tăng lên Ảnh hưởng của pH đến vị trí đỉnh plasmon và cường độ của AgNP được tóm tắt trong hình 3.2(B) Ở pH = 9, vị trí đỉnh plasmon của AgNP có bước sóng thấp nhất, tương ứng với kích thước nhỏ nhất của AgNP đã được hình thành.

GQDs pH = 11 pH = 10 pH = 9 pH = 8 pH = 5 pH = 3

Phản ứng được thực hiện ở độ pH 9 cho thấy dung dịch có cường độ cực đại plasmon của AgNP cao nhất, cho thấy nồng độ AgNP hình thành trong dung dịch đạt tối đa Kết quả này chỉ ra rằng pH 9 là môi trường lý tưởng cho phản ứng.

Hình 3.2(A) cho thấy phổ UV của vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β-sheet) của enzym vis trong dung dịch CQD, trong khi các đường cong (b) đến (e) thể hiện sự thay đổi của dung dịch AgNP/CQD sau khi khử ở các độ pH khác nhau Phần (B) nêu rõ ảnh hưởng của pH đến vị trí đỉnh plasmon của AgNP, bao gồm cực đại hấp thụ (λ max) và cường độ cực đại (mật độ quang), cùng với hình ảnh kỹ thuật số của các mẫu tương ứng từ phần (A).

Trong phản ứng tổng hợp vật liệu nano, tốc độ phản ứng cao có thể dẫn đến sự phát triển nhanh chóng của hạt nano và kích thước hạt lớn hơn Tuy nhiên, trong trường hợp này, CQD đóng vai trò như chất khử và chất bảo vệ, do đó chúng ức chế sự phát triển của AgNP Hình 3.2 (A) cho thấy ở nhiệt độ thấp (26°C và 40°C), mật độ quang của AgNP rất thấp, cho thấy nồng độ AgNP hình thành cũng thấp Hình 3.3 (B) chỉ ra rằng mẫu AgNP/CQD ở 90°C có bước sóng cực đại hấp thụ thấp nhất (λmax∼408 nm) và cường độ cực đại cao nhất với mật độ quang.

OD408nm∼1,6.NhữngkếtquảnàychothấykíchthướchạtnhỏnhấtcủaAgNPđượchìnhthànhtrongdun gdịch.PhổDLScủadungdịchAgNP/CQD(Hình3.3(C))chothấyhaivùngphânbốkích thước hạt khi nhiệt độ phản ứng là 26°C, 40°C, 60°C và 80°C Ở 90°C chỉ có mộtvùngp h â n b ố k í c h t h ư ớ c h ạ t , đ i ề u n à y c h o t h ấ y ở n h i ệ t đ ộ n à y , k í c h t h ư ớ c h ạ t c ủ a

Pe ak In te ns it y( a.

Particlesize(nm) s) rticl epa of r m) b e

AgNP/CDQđồngnhấthơn.Vìvậy,nhiệtđộ90°Cđượcsửdụngchocácthínghiệmtiếptheo.

Hình 3.3(A)Phổ UV-Vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β –sheet) của enzymvis củadung dịch AgNP/CQDđượctổng hợpởcácnhiệt độ khácnhau:

Nhiệt độ có ảnh hưởng đáng kể đến vị trí đỉnh plasmon của AgNP (λ max) và cường độ cực đại (OD), với các giá trị nhiệt độ là 26°C, 40°C, 60°C, 80°C và 90°C Hình ảnh kỹ thuật số của các mẫu tương ứng từ các mức nhiệt độ này đã được chèn vào để minh họa Đồng thời, phân bố kích thước hạt của AgNP/CQD được xác định theo phương pháp phân tích cụ thể.

Trong Hình 3.3 (A) thể hiện phổ UV-Vis của dung dịch AgNO3/CQDs sau khi khử ở90°Ctrongcácthờigiankhácnhau.CóthểthấyđỉnhplasmoncủaAgNP(λ max )vàcườngđộcựcđại( Độhấpthụ quang(A.U)

Pe ak 'si nt e ns it y (a

OD λmax )củaAgNPlàtươngtựnhauđốivớitấtcảcácmẫu.Tuynhiên,kếtquảDLS Hình 3.4(B)) đã chứng minh rằng kích thước hạt trung bình được chuyển sang nhỏhơnkhithờigianphảnứngtănglên. MốitươngquangiữathờigianphảnứngvàkíchthướctrungbìnhcủaAgNP/CQDsovớithời g ia n phảnứngđược t óm tắttrong Hình

Hình 3.4(A) trình bày phổ UV của vùng xoắn α (α-Helica) và vùng tấm β (β-sheet) của enzym vis trong dung dịch AgNP/CQD được tổng hợp ở 90°C với các thời gian phản ứng khác nhau: 60 phút, 80 phút, 100 phút, 120 phút và 180 phút Phần (B) thực hiện phân tích DLS cho các mẫu tương ứng từ phần (A) Cuối cùng, phần (C) chỉ ra ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến kích thước hạt trung bình của AgNP/CQD, kèm theo ảnh kỹ thuật số của các mẫu tương ứng.

Trong các phản ứng hóa học, ion Ag+ từ AgNO3 đóng vai trò là chất oxy hóa, trong khi CQD là chất khử Để đạt được sản phẩm tối ưu, nồng độ của hai chất này cần phải tương đương Tuy nhiên, việc ước lượng nồng độ CQD trong dung dịch và số lượng trung tâm phản ứng trên một hạt CQD là rất khó khăn Do đó, việc xác định tỷ lệ thể tích dung dịch AgNO3 0,1 M và dung dịch CQD là cần thiết để tìm ra tỷ lệ tối ưu AgNO3/CQD, điều này có thể được phân tích qua phổ UV.

Các đỉnh hấp thụ của AgNP nằm trong khoảng 418 nm đến 425 nm, tuy nhiên, với mẫu (f) và mẫu (g), đỉnh plasmon đã chuyển sang vùng màu đỏ khoảng 700 nm đến 800 nm Sự thay đổi này có thể do sự kết tụ và/hoặc sự thay đổi hình dạng của AgNP Mối tương quan giữa tỷ lệ Ag + /CQDs và vị trí đỉnh plasmon của AgNP (λ max) cùng với mật độ quang học ở mức hấp thụ tối đa (ODλ max) được thể hiện trong Hình 3.5 (B).

Particlesize(nm) ) s) rticl epa of r m)b e (nu

Điều kiện từ mẫu (e) với λmax= 417 nm và OD417nm là 1,185 được xác định là tối ưu cho phản ứng tổng hợp AgNP/CQD Phân bố kích thước cho thấy các mẫu (a), (b), (c) và (d) tạo ra AgNP/CQD với kích thước lớn nhưng phân bố rất hẹp Trong khi đó, mẫu (g) và mẫu (f) có phân bố kích thước rộng, từ 10 nm đến 1000 nm Mặc dù mẫu (e) cũng có phân bố kích thước lớn, nhưng kích thước trung bình của nó khoảng 20 nm Vì vậy, mẫu điều kiện (e) được chọn làm tỷ lệ Ag+/QGDs tối ưu để tổng hợp AgNP/CQD.

Hình 3.5(A) trình bày phổ UV của vùng xoắn α (α-Helica) và vùng tấm β (β-sheet) của enzym vis từ các dung dịch AgNP/CQD được tổng hợp ở 90°C trong 120 phút với các tỷ lệ dung dịch AgNO3/CQD khác nhau Điều kiện phản ứng đã được mô tả chi tiết trong tài liệu (B) Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích dung dịch AgNO3 và CQD đến vị trí đỉnh plasmon của AgNP (λ max) và cường độ cực đại (OD), kèm theo hình ảnh kỹ thuật số của các mẫu tương ứng.

(A)); (C) Phântích DLScủa cácmẫu tươngứng từ (A), tươngứng.

Khi thêm dung dịch AgNO3và tiến hành phản ứng khử ion Ag+với các hạt CQDsđóngvaitròlàchấtkhửđồngthờilàchấtổnđịnhthìphổUV- Độhấpthụquang(A.U)

Vis(hình3.2A,đườngb)cómặtcủapichấpthụđặctrưngởbướcsóng425mcủahạtnanobạc(AgNPs).Vìt rongdung

Trong nghiên cứu này, khi không bổ sung chất khử và sử dụng dung dịch NaOH với pH 9, không thấy kết tủa Ag2O xuất hiện khi thêm AgNO3, cho thấy các nhóm chức -NH, -COOH, -CHO và -NH2 trên các hạt CQDs đã hấp phụ và khử ion Ag+ thành AgNPs bám quanh các hạt CQDs Điều này cho thấy CQDs đóng vai trò là tác nhân khử và đồng thời là chất ổn định cho các hạt nano bạc (AgNPs) Phổ UV-Vis của dung dịch AgNPs/CQDs cho thấy đỉnh pic ở 420 nm đặc trưng cho nano bạc, chứng tỏ sự hình thành các hạt AgNPs với nồng độ cao.

Hình3.6(A)PhổUV-Vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β –sheet) của enzymViscủa(a)CQDs,và (b)AgNPs/CQDs;(B)PhổXRDcủa(a)CQDsvà

Phổ XRD của CQDs cho thấy dạng gần như vô định hình, với pic nhiễu xạ yếu tại 2θ = 27° đặc trưng cho pic (002) của graphene Vị trí và cường độ pic này phụ thuộc vào sự hiện diện của các nhóm hydroxyl, epoxy/ether, carbonyl và carboxylic Đối với mẫu AgNPs/CQDs, phổ XRD cho thấy các pic đặc trưng tại 2θ 7.50, 43.10 và 64.80, trùng với pic nhiễu xạ của nano bạc (AgNPs) theo PDF card số 40783.

Các pic ở các bước sóng (111), (200) và (220) cho thấy AgNPs được tạo thành trên nền CQDs là các tinh thể bạc đơn pha với các pic đặc trưng của Ag Pic (002) của CQDs không quan sát thấy do cường độ quá yếu so với các pic của AgNPs Phổ UV-Vis chứng tỏ rằng phương pháp đề xuất đã thành công trong việc tổng hợp vật liệu lai tạo AgNPs/CQDs.

C ả m b i ế n x á c đ ị n h n ồ n g đ ộ H 2 O 2

Hình 3.15 (A)Phổ UV-Vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β –sheet) của enzymVis của dung dịch cảm biến khi có mặt: (a)mẫu trắng, (b) 0,5 mMglucose,(c)0,5 mMaxitascorbic,(d)0,5 mMH 2 O 2 , (e)0,5mMaxitSaccarose; (B)A/

Dựa trên cảm biến H2O2 có độ nhạy cao và độ chọn lọc tốt, chúng tôi thiết kế cảm biến phát hiện glucose Trong bước đầu tiên, GOx được thêm vào mẫu chứa glucose, và phản ứng sẽ diễn ra ở pH 7 với nhiệt độ tối ưu là 37°C.

Khi AgNPs gặp H2O2 ở pH = 7, phản ứng xảy ra một cách hiệu quả Sự hấp thụ pic ở bước sóng 425 nm tỷ lệ thuận với nồng độ glucose trong mẫu Cơ chế này được minh họa trong hình 3.12.

Hình 3.16Cơchếhoạtđộng của cảmbiến glucosetrên cơsởAgNPs/CQDs

Cơ chế phản ứng của cảm biến được kiểm nghiệm thông qua độ chọn lọc của nó Độ chọn lọc của cảm biến glucose được xác định bằng cách thực hiện các thí nghiệm với sự có mặt của glucose, galactose, lactose, saccharose và fructose ở nồng độ 4 mM Kết quả cho thấy sự giảm không đáng kể của mật độ quang A ở bước sóng 425nm (OD 425) khi mẫu chứa galactose, lactose, sucrose và fructose Ngược lại, mẫu không chứa glucose cho thấy độ giảm rất mạnh ở OD 425nm.

Các giá trị A/A0 của cảm biến khi sử dụng các saccharide khác nhau ở nồng độ 4 mM được thể hiện trong hình 3.17B Kết quả cho thấy A/A0 (%) đạt 14,59% với galactose, 11,27% với lactose, 17,34% với saccharose và 16,29% với fructose Đặc biệt, giá trị này thấp hơn nhiều so với glucose (A/A0 = 54,76%), với tỷ lệ thấp hơn 3,16 lần ở cùng nồng độ 4 mM Những kết quả này chứng minh rằng cảm biến có độ chọn lọc rất tốt đối với glucose Theo công thức 1.2, độ đặc hiệu của cảm biến glucose cũng đạt 100%.

Hình 3.17(A) trình bày phổ UV của vùng xoắn α (α-Helix) và vùng tấm β (β-sheet) của enzym Vis trong sự hiện diện của các saccharide khác nhau với nồng độ 4 mM Hình (B) thể hiện sự thay đổi tín hiệu cường độ pic ΔA/A0 tương ứng với các saccharide như đã mô tả ở hình (A).

Hình 3.17A minh họa phổ UV-Vis của các mẫu với nồng độ glucose khác nhau, cho thấy khi nồng độ glucose tăng từ 0,5 mM đến 8 mM, mật độ quang học tại 425 nm (OD425) của dung dịch AgNP/CQDs giảm từ 0,61 xuống 0,31 Đường chuẩn phát hiện glucose được trình bày trong Hình 3.17B thể hiện mối quan hệ giữa A/A0(%) và nồng độ glucose, được mô tả bằng phương trình tuyến tính: A/A0(%) = (7,06087 ± 0,40925) × CGluucose(mM).

(3,05473±1,49321)vớiR2=0,97695.Giớihạnpháthiện(LOD)đượcướctínhlà30Mdựatrênbalầnđ ộlệchchuẩncủacácphépthửcủamẫutrắng,kếtquả này cho thấy độ nhạy của cảm biến có thể so sánh được với các báo cáo đã công bố(Bảng3.1).

Hình 3.18(A) trình bày phổ UV của vùng xoắn α (α-Helix) và vùng tấm β (β-sheet) của enzym vis trong cảm biến glucose với các nồng độ glucose khác nhau, đi kèm với hình ảnh minh họa màu sắc của các dung dịch cảm biến tương ứng (B) Đường chuẩn được sử dụng để xác định nồng độ glucose trong dung dịch thông qua độ hấp thụ quang (A.U).

Bảng3.1So sánhcáccảm biếnglucosetrên cơsởphương pháp somàu Đầudò

AuNPs ghép vớiAgNPs No 50x10 -3 ÷70x10 -3 3 Huyết thanhngư ời

AgNPs GOx 2x10 -4 ÷0,1 0,2 Huyết thanhngư ời

HạtnanoCexOy GOx 0,5 ÷100 500,0 Huyết thanhngư ời

HạtnanoMnO2 GOx 0,5x10 -3 ÷ 50x10 -3 0,17 Huyết thanhngư ời

AgNPs/CQDs GOx 0.5 ÷8 30,0 Nướctiểungười Luậnán này

Au@Ag(lõi/vỏ) GOx 0,01x10 -3 ÷0,2x10 -3 ;

HạtnanoAu@Ag(l õi/vỏ) GOx 0,5x10 -3 ÷ 0,4 0,24

Cu-CD GOx 1,9 x10 -3 –0,125 0,69àM Huyết thanhngư ời

CeO2/C GOx 1,0 x10 -3 –0,1 0.69 μMM Huyết thanhngư ời

Nồng độ glucose trong mẫu nước tiểu dương tính với bệnh tiểu đường dao động từ 2,8 đến 5,6 mM, trong khi dải tuyết tính của cảm biến từ 0,5 mM đến 8 mM với giá trị LOD chỉ 30 µM cho thấy tiềm năng lớn trong việc kiểm tra glucose hàng ngày Vật liệu nano AgNPs/CQD không chỉ có hiệu quả xúc tác tương tự như peroxidase mà còn có chi phí chế tạo thấp và ổn định hơn Khi nồng độ glucose tăng từ 0,5 mM đến 8 mM, đỉnh plasmon của CQD tự do xuất hiện rõ ràng hơn ở 357 nm, khẳng định cơ chế đã đề xuất và tạo sự khác biệt so với các cảm biến nano Ag trước đây.

Bước sóng (nm) Nồng độ glucose thêm vào/ mM

3.1.3.2 Ứng dụng vật liệu AgNPs/CQDstrong chế tạo cảm biến xác định nồngđộglucosetrongmẫunướctiểu

Hình 3.19Phươngpháp thêmchuẩnđểxácđịnhnồng độglucosetrong mẫunướctiểungười:

Phổ UV-Vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β-sheet) của enzym Vis được phân tích với các mẫu khác nhau: mẫu trắng (không có nước tiểu), mẫu nước tiểu pha loãng (1:4), và mẫu nước tiểu pha loãng bổ sung 1mM, 2mM và 3mM glucose Phương pháp thêm chuẩn của cảm biến được áp dụng để xác định nồng độ glucose trong mẫu nước tiểu, giúp đánh giá hiệu quả của enzym trong việc phát hiện glucose.

Mẫu nước tiểu trước khi chết chứa nhiều muối hòa tan và cặn thải Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi về mẫu nước tiểu ở người, chúng tôi nhận thấy tỷ lệ pha loãng cao hơn mang lại tín hiệu tốt hơn so với tỷ lệ pha loãng thấp Tuy nhiên, do giới hạn về độ nhạy của cảm biến, tỷ lệ pha loãng tối ưu được xác định là 1:4 Phương pháp thêm chuẩn được áp dụng để phân tích nồng độ glucose trong mẫu nước tiểu, trong đó ngoài mẫu nước tiểu pha loãng, dung dịch bổ sung glucose với các nồng độ khác nhau được sử dụng làm mẫu cho cảm biến đã đề cập.

Phổ UV-Vis của cảm biến glucose cho thấy sự giảm đáng kể cường độ pic hấp thụ tại bước sóng 425 nm khi có mẫu nước tiểu pha loãng Cường độ pic hấp thụ tiếp tục giảm theo chiều tăng nồng độ glucose bổ sung vào mẫu nước tiểu Nồng độ glucose trong mẫu nước tiểu của người được xác định là 3,68 mM, cho thấy đây là mẫu của một bệnh nhân tiểu đường Kết quả phân tích glucose trong máu và tiểu sử sức khỏe của tình nguyện viên xác nhận tình trạng bệnh tiểu đường, với kết quả từ cảm biến tương ứng Thí nghiệm này chứng minh tiềm năng lớn của cảm biến glucose trong việc xác định glucose trong nước tiểu mà không cần mẫu máu, giúp loại bỏ sự bất tiện của việc sử dụng kim chích máu.

3.1.4 Chếtạocảmbiếnpháthiệnhydrogenperoxide(H 2 O 2 )trêncơsởvậtli ệuAgNPs/CQDs sửdụngphần mềnImageJ Đểgiảmthiểusaisốdoảnhsángkhôngđềuchúngtôithựchiệnthínghiệmvớicáchàngtừhàng BđếnhàngG(khôngchomẫuvàohàngAvàhàngH),trongphântíchcũngkhônglấykếtquảcủacột1,2v àcột11,12.Hàngvàcáccộtngoàicùngnàyảnhbịnghiêngdo đó khi xử lý bằng phần mền ImageJ các tâm của các giếng không trùng khớp với tâmcủacác giếngdẫnđếnsaisố.

Hình 3.20Ảnh chụp từ hệ phân tích, (A) ảnh chụp mẫu trắng không có mặt H 2 O 2 , (B) mẫu cómặt

Hình ảnh từ hệ phân tích được đưa vào phần mềm ImageJ, đảm bảo tâm các giếng khớp với tâm đọc kết quả của phần mềm Các phép đo được thực hiện và cường độ màu tự động chuyển đổi thành giá trị độ hấp thụ theo công thức A = -log B / 255, trong đó B là giá trị tọa độ màu xanh lam Hình ảnh được chụp từ điện thoại thông minh ở khoảng cách cố định 25cm, với nguồn sáng từ iPad cũng được đặt cố định để giảm sai số Hộp đựng khay Elisa được bịt kín nhằm đảm bảo điều kiện chụp ảnh nhất quán.

3.1.4.1 Tínhtoán độ tincậycủabộcảm biến Để xác định độ tin cậy của bộ cảm biến phát hiện H2O2thông qua phần mền xử lýhình ảnh ImageJ, chúng tôi tiến hành phân tích kết quả giữa các lần đo của các mẫu trắngvà các mẫu H2O2có nồng độ (10 mM, 20 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500mM) Mẫu trắng được cho vào toàn bộ khay Elisa, mẫu H2O2với mỗi nồng độ được chocác giếng trong cùng một hàng trong khay Elisa Kết quả (cùng nồng độ phân tích) đượcso sánh với nhau của cùng một hàng trong khay Elisa của một lần chụp ảnh và các khaykhác nhau trong các lần chụp khách nhau (trong cùng vị trí giếng) Độ tin cậy được đánhgiáquagiátrịtrung bình,độlệchchuẩnvàsaisốcủacác thí nghiệmtrên. Độlệchchuẩn:tínhtheocôngthức(CT2.9)vàsaisốtươngđốiđượctínhtheocông thức:

Saisố(%)=(𝜎/ A TB)*100 (CT3.1) a) Tínhtoán độtin cậykhiphântíchmẫu trắng

Để xác định độ tin cậy của phương pháp đo, chúng tôi thực hiện tám lần đo khác nhau trên cùng một khay mẫu trắng, trong đó chỉ chứa dung dịch AgNPs/CQDs và nước Kết quả trung bình của các hàng trong khay Elisa và toàn bộ khay được tính toán để đánh giá độ lặp lại và sai số giữa các lần đo Giá trị trung bình cuối cùng được trình bày trong Bảng 3.2.

Bảng3.2Giátrị đo cườngđộ hấp thụtrung bìnhgiữa cáclầnđo

Tênhàng Lần1 Lần2 Lần3 Lần4 Lần5 Lần8 Lần7 Lần8 GTTB1

HàngB 0,153 0,158 0,157 0,151 0,153 0,152 0,155 0,158 0,154 HàngC 0,161 0,152 0,155 0,151 0,158 0,152 0,163 0,158 0,156 HàngD 0,150 0,139 0,149 0,147 0,152 0,146 0,156 0,158 0,150 HàngE 0,148 0,138 0,140 0,139 0,144 0,137 0,149 0,146 0,143 HàngF 0,153 0,139 0,130 0,137 0,137 0,129 0,134 0,139 0,137 HàngG 0,163 0,147 0,129 0,137 0,142 0,130 0,131 0,139 0,140 GTTB2 0,155 0,146 0,143 0,144 0,148 0,141 0,148 0,150 0,147 Ghichú:sốliệutrongbảnglàgiátrịtrungbìnhtheocáchànggiữacáclầnđo

Hình 3.22(A)GTTB cáckhaytrong cáclần đo;(B)GTTB hàngtrongcáclầnđo

Từbảng trênta thấy giá trịgiữacáclần đotheo khayhaytheo hàngthì kết quảcótínhlặplạitươngđốicao.Giátrịtrungbìnhcủacáchànggiữacáclầnđotừ0.137đến

0.156.Nếutínhgiátrịtrungbìnhcủacảkhaythìtínhlặplạicòncaohơntừ0.141đến 0.156.Từkết quảtrêncóthểthấy hệcótínhlặplạitươngđốicao,giữacáclầnđo.

Tổnghợp,đặctrưngvàứngdụngvậtliệuFe 3 O 4b ọc carbon(Fe@C)trongchếtạocảmbiếnsinhhọcs omàupháthiệnglucose

Figure 3.26 presents the XRD spectra of Fe@C material samples, highlighting the α-Helix and β-sheet regions of enzymes 0, 3, 5, and 10 Additionally, the FTIR spectra also illustrate the α-Helix and β-sheet regions corresponding to the same enzyme samples, emphasizing the structural characteristics of the Fe@C materials.

Hạt carbon bọc Fe3O4 (Fe@C) được chế tạo thành công thông qua quá trình đồng kết tủa kết hợp với phương pháp thanh hóa glucose bằng thủy nhiệt, tạo ra bột mềm, mịn màu đen Sản phẩm Fe@C có độ mịn và dễ nghiền hơn so với bột nano Fe3O4 không bọc carbon Đặc biệt, khi tăng hàm lượng glucose, bột Fe@C càng có màu nâu uv và càng mềm, mịn, dễ nghiền hơn Các mẫu vật liệu Fe@C được tổng hợp với tỉ lệ khối lượng Fe3O4:C = 1:0, 1:3, 1:5, 1:10 đã được nghiên cứu về cấu trúc và khả năng cảm biến với hydrogen peroxide và glucose Phổ XRD của hạt nano Fe3O4 cho thấy 6 đỉnh nhiễu xạ đặc trưng, khẳng định sự hình thành của pha tinh thể nano spinel của Fe3O4.

C ườ ng độ (A U ) Đ ột Tr an sm) it ta nc e ( % ) ru yề nq ua (% )

Trong nghiên cứu về vật liệu carbon bọc Fe3O4, phổ XRD cho thấy sự xuất hiện của các pic đặc trưng của Fe3O4, tuy nhiên cường độ và độ sắc nét giảm dần khi tỷ lệ Fe3O4:C tăng Điều này chứng tỏ rằng tinh thể Fe3O4 vẫn giữ nguyên cấu trúc trong vật liệu, trong khi carbon hình thành ở dạng vô định hình Các mẫu Fe@C(1-1) và Fe@C(1-3) duy trì đặc tính của Fe3O4, nhưng mẫu Fe@C(1-10) không đạt yêu cầu Phổ FT-IR của mẫu Fe3O4 và Fe3O4/C cho thấy các pic liên kết Fe-O tại các bước sóng 443, 445, 447 cm-1 và 590, 592 cm-1, cùng với các đỉnh đặc trưng ở 3406 cm-1 và 3365 cm-1 cho thấy sự hiện diện của liên kết O-H.

Mẫu Fe3O4 cho thấy một đỉnh hấp phụ CO2 ở 1622 cm-1, trong khi mẫu Fe3O4/C(1:2) xuất hiện phổ với các sóng từ 1697 đến 1620 cm-1, đặc trưng cho liên kết C=O trên lớp vỏ carbon, có thể là nhóm chức axit hoặc nhóm carbonyl của aldehyde, xeton Ngoài ra, các mẫu Fe3O4/C có các đỉnh ở 1118-1000 cm-1, đặc trưng cho liên kết C-OH trên vỏ carbon So sánh hai phổ FTIR của các mẫu, kết hợp với phân tích ảnh TEM và phổ XRD, cho thấy việc chế tạo thành công vật liệu có cấu trúc lõi vỏ Fe3O4/C.

Hình 3.27 trình bày phổ VSM của Fe3O4 và Fe3O4/C, bao gồm các vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β-sheet) của các enzym khác nhau: (a) Fe@C cho enzym0, (b) Fe@C cho enzym2, và (c) Fe@C cho enzym3.

(d)Fe@C(1-Vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β –sheet) của enzym5),(e)Fe@C(1-Vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β –sheet) của enzym7), (f)F e @ C ( 1 -Vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β –sheet) của enzym 1 0 )

Vỏ carbon vô định hình bao bọc bên ngoài vật liệu không có từ tính, do đó tính chất từ của vật liệu Fe@C chủ yếu đến từ Fe3O4 Đường cong từ hóa của mẫu cho thấy sự ảnh hưởng của thành phần này đến tính chất từ của vật liệu.

Hình 3.27 thể hiện rằng các mẫu Fe3O4 và Fe@C có tính chất siêu thuận từ, với độ từ hóa bão hòa Ms đạt 60,2 emu/g cho mẫu chỉ có Fe3O4 Tuy nhiên, giá trị này vẫn thấp hơn so với độ từ bão hòa của mẫu khối, khoảng 90 emu/g, và giảm xuống còn 54,97 emu/g cho mẫu Đột ừh oá.

(đường b) vớimẫuFe@C(1-2)vàtiếp tụcgiảmxuốngcòn9,34emu/g (đườngf)với mẫuFe@C(1-10);

Sự bao phủ của carbon lên các hạt Fe3O4 làm giảm đáng kể độ từ hóa, điều này có thể được giải thích qua mô hình lõi vỏ của cách hạt nano Các spin sắp xếp hỗn loạn trên bề mặt hạt nano từ gây nên tương tác giữa bề mặt và lõi, làm cho phân bố spin bên trong hạt trở nên phức tạp Mômen từ nguyên tử bề mặt đóng góp không đáng kể vào mômen từ chung của hạt Lớp bề mặt lộn xộn này được gọi là lớp vỏ với độ dày t, ảnh hưởng của lớp vỏ này khiến mômen từ của hạt nano thấp hơn so với mômen từ của vật liệu khối Sự phụ thuộc của mômen từ bão hòa Msv vào giá trị của lớp vỏ được biểu diễn theo công thức.

Từ độ bão hòa của mẫu Fe3O4 là 60,20 emu/g, lớn hơn đáng kể so với mẫu Fe@C Mô hình lõi – vỏ cho thấy lớp vỏ carbon trong mẫu Fe@C dày hơn lớp vỏ trong hạt Fe3O4, dẫn đến từ độ bão hòa Msc của Fe3O4 cao hơn Msc của Fe@C Vật liệu Fe3O4/C có lớp vỏ phi từ carbon vô định hình bao bọc hạt sắt từ, và khi lớp vỏ này dày hơn, giá trị Msc giảm do lượng Fe3O4 giảm Điều này cho thấy kích thước hạt và bề dày lớp vỏ ảnh hưởng lớn đến tính chất từ của các mẫu vật liệu Sự thay đổi Msc giữa các mẫu Fe@C với tỷ lệ khác nhau cũng liên quan đến vật liệu nano Fe3O4 ban đầu Với tính chất từ mạnh, vật liệu Fe@C có khả năng dễ dàng tách ra khỏi dung dịch sau khi hấp phụ, tái sinh và tuần hoàn nhờ từ trường ngoài.

Hình 3.28 trình bày ảnh hiển vi điện tử quét (SEM) của vật liệu carbon bọc Fe3O4 (mẫu 1-0.1-1, 1-10) với độ phóng đại khác nhau: 1:20.000, 1:50.000, 1:100.000, 1:150.000 Kết quả cho thấy các hạt nano Fe3O4 có kích thước khoảng 8.5 nm, hình cầu và có trạng thái kết dính với nhau Khi nồng độ glucose tăng, kích thước hạt cũng tăng do sự hình thành lớp vỏ carbon bên ngoài hạt Fe3O4 Khi chiều dày lớp vỏ carbon tăng, các hạt nano Fe3O4 bọc carbon có xu hướng co cụm lại, làm cho ranh giới giữa các hạt trở nên khó phân biệt (mẫu 1-10) Dựa vào kích thước và trạng thái của hạt, vật liệu Fe3O4 bọc carbon mẫu Fe@C(1-1) được đánh giá là phù hợp hơn so với hai mẫu Fe@C(1-0) và Fe@C(1-10).

The structural analysis of enzymes reveals distinct regions, including the alpha-helix (α-Helix) and beta-sheet (β-sheet) formations These structural motifs, represented in various samples of Fe@C, play a crucial role in the enzymatic function and stability Understanding these regions is essential for insights into enzyme behavior and potential applications in biochemistry.

The image illustrates the TEM analysis of Fe@C materials, highlighting the α-Helix and β-sheet regions of various enzymes, specifically Fe@C samples 0, 0.5, and 3 This study focuses on the structural characteristics of these enzymatic regions, emphasizing their significance in understanding the properties of Fe@C composites.

5),Fe@C (1-Vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β –sheet) của enzym7)

Để khảo sát cấu trúc lõi vỏ của vật liệu, chúng tôi đã tiến hành chụp ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM), cho kết quả như trong Hình 3.29 Ảnh TEM của mẫu Fe3O4 chưa bọc carbon cho thấy các hạt kết tụ mạnh với kích thước khoảng 8.5 nm Hình 3.29 cũng hiển thị ảnh TEM của mẫu Fe@C (1-5) và Fe@C (1-7) với độ phóng đại khác nhau.

Kết quả nghiên cứu cho thấy các hạt có hình dạng cầu với mức độ kết tụ thấp hơn, nhờ vào lớp vỏ carbon bao quanh giúp tách biệt các hạt Kích thước hạt mẫu Fe@C1-0 khoảng 10 nm, trong khi mẫu Fe@C(1-5) và Fe@C(1-7) có kích thước khoảng 20 nm Hình ảnh TEM của mẫu Fe@C(1-5) và Fe@C(1-7) cho thấy các hạt Fe3O4 được bao bọc bên ngoài bởi lớp vỏ carbon dày khoảng 10 nm.

3.2.2.1 Khảo sát hoạt tính xúc tác tương tự enzym hydrogen peroxidase của vậtliệuFe@C

Hoạt tính tương tự enzym HRP của vật liệu carbon bọc Fe3O4(Fe@C) trong môhìnhperoxidaseđượcchứngminhquathínghiệmxúctáccủachúngchophảnứngoxihóakhửH 2 O2v ớiTMBđểchuyểndạngkhửkhôngmàuthànhTMBdạngoxihóacómàuxanhlácâyđặctrưngvàcóhấpth ụcực đạiở652nm:

TMBkhử(khôngmàu)+H2O2→→TMB𝐹𝑒𝐶 oxihóa(màuxanh)+H2O( P T 3.3) a) Thínghiệm control

Hình3.30PhổUV-Vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β –sheet) của enzymVisthínghiệmcontrol

Quá trình oxi hóa TMB trong môi trường đệm axetat diễn ra khi có mặt của xúc tác Fe@C, nhưng hiệu suất phản ứng không cao do sự hiện diện của O tự do trong dung dịch Khi không có xúc tác Fe@C, TMB gần như không bị oxi hóa Phản ứng oxi hóa TMB chỉ diễn ra mạnh mẽ khi có sự kết hợp của cả H2O2 và xúc tác Fe@C.

C ả m b i ế n x á c đ ị n h n ồ n g đ ộ H 2 O 2

Bảng3.10Giớihạn tìmkiếm H 2 O 2 nhỏ nhất củamột sốbáo cáotrướcđây

Hình 3.38Cơchếcủa cảmbiến glucosesửdụngFe@Ct h a y t h ế enzym HRP

H2O2 là sản phẩm phụ của phản ứng sinh hóa do enzym xúc tác, trong đó glucose được enzym glucose oxidase (GOx) oxi hóa thành gluconic acid và hydrogen peroxide (H2O2).

Vìvậy,H2O2đượcđịnhlượngrồitừđósuyranồngđộglucosehaycholesteroltươngứng,đâycũnglàph ươngphápxétnghiệmsinhhóa hiện nay. a. u.

Hình 3.39(A) trình bày phổ UV của vùng xoắn α (α-Helica) và vùng tấm β (β-sheet) của enzym Vis trong các mẫu: (a) glucose + Fe@C13 + GOx; (b) GOx + Fe@C13; và (c) glucose + GOx Phần (B) thể hiện cường độ A652 của các cảm biến khi mẫu chứa: (a) glucose; (b) acid ascorbic; (c) galactose; (d) sacarose; và (e) saccarose, với nồng độ các mẫu là 0,2 mM.

Hình 3.40Độ hấp thụ A 652 của các mẫu tương ứng trong thí nghiệm control; Phổ UV-Vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β –sheet) của enzymvis đườngchuẩnGlucose;Đường chuẩn glucose

Enzym GOx chỉ hoạt động khi có mặt của glucose, dẫn đến sự hình thành H2O2, điều này được xác nhận qua phổ UV-Vis Phản ứng đạt hiệu suất cao nhất trong môi trường đệm PBS, cho phép chế tạo cảm biến glucose thông qua việc xác định nồng độ H2O2 sinh ra Độ hấp phụ của các ống Eppendorf chứa glucose vượt trội so với các ống không chứa glucose, và mẫu ascorbic cho thấy A652 thấp hơn so với mẫu chỉ có H2O Kết quả thí nghiệm cho thấy cảm biến glucose có độ chọn lọc và độ đặc hiệu cao.

Trong nghiên cứu này, độ hấp thụ quang (A652) chỉ phụ thuộc vào nồng độ glucose khi các điều kiện tối ưu được cố định Kết quả thí nghiệm cho thấy nồng độ glucose và độ hấp thụ quang có mối quan hệ tỷ lệ thuận và tuân theo quy luật tuyến tính Do đó, phương pháp đường chuẩn được lựa chọn để xây dựng phương pháp định lượng glucose.

3.35 cho thấy quan hệ giữa nồng độ glucose trong mẫu và độ hấp thụ quang A652của cảmbiếnlàtuyếntínhkhinồngđộglucosetừ0,01mMđến0,9mMvớiphươngtrìnhtuyếntínhlà: A 652 0,11378 +0.43995Cglucosevới R2=0,96521 LOD là40 àM Với nồng độ glucoselớn hơn nồng độ khoảng tuyến tính, phương pháp định lượng của cảm biến sẽ đạt đến giátrịbãohòanêngâysaisốlớn.

Bảng3.11So sánh hoạttính xúctáccủa Fe@C với cácxúctáckhác Hệxúctác

K m (mM) LOD H2O2 LOD glucose Tài liệuthamk TMB H 2 O 2 hảo

Fe@C13 0,004 0,052 20àM 40àM Luậnỏn này

So sánh hoạt tính xúc tác của Fe@C với các xúc tác khác cho thấy Kmcủa vật liệu này thấp hơn so với các loại vật liệu khác Cụ thể, Kmcủa Fe@C nhỏ hơn nhiều so với hạt nano Fe3O4, với giá trị Kmcủa H2O2 là 0,052 mM so với 154 mM Khi được bọc carbon, khả năng vận chuyển electron của vật liệu tăng lên, từ đó nâng cao khả năng xúc tác Thêm vào đó, lớp vỏ carbon không chỉ cải thiện khả năng phân tán của vật liệu trong dung môi mà còn giảm thiểu sự kết tụ, giúp tăng khả năng lưu trữ của vật liệu trong dung môi lên đến 6 tháng và khi chứa hạt trong dung môi lên đến 12 tháng.

3.2.3.1 Ứng dụng vật liệu Fe@C trong chế tạo cảm biến xác định glucose trongdungdịchvàmẫuthực a) Xácđịnhglucosetrongdungdịch

Bước sóng (nm) Bước sóng (nm)

Hình3.41PhổUV-Vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β –sheet) của enzymVisđomẫuthực Dung dịch glucose truyền tĩnh mạch 5%: tức có nồng độ glucose là khoảng

Dung dịch glucose có nồng độ 277mM được pha loãng với tỷ lệ 1:100, 1:200 và 1:300 để sử dụng làm mẫu cho cảm biến Mẫu so sánh là dung dịch glucose pha sẵn ở nồng độ 0,55mM Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua phổ UV-Vis như trong Hình 3.41, và các kết quả đo được trình bày trong Bảng 3.12.

Bảng3.12Kếtquả tính lượngglucosetrong mẫuthựctheo mẫuchuẩn

Nồng độ pha loãng 1/300 cho sai số thấp nhất khoảng 6,832%, trong khi các tỷ lệ pha loãng 1/100 và 1/200 lại cho sai số lớn Điều này xảy ra vì nồng độ glucose trong các mẫu này vượt quá khoảng tuyến tính, dẫn đến sai số lớn.

MẫumáuthựcđượccungcấpbởiTrungtâmYtếBáchKhoa:mẫuđãđượclytâmtáchhếthồngcầu,bạchcầ u,cácđạiphântửthuđượcdungdịchserum(huyếtthanh).Trongnghiêncứumẫuđược sửdụngtrực tiếpnhưdungdịchchứa glucose. Độhấpthụquang (A.U) Độhấpthụquang (A.U)

Bảng 3.13So sánh kết quả phân tích glucose trong mẫu huyết thanh giữa cảm biến Fe@C13 vàtrung tâm ytế

TT A1 A2 A3 S Đỉnh 0,534 0,416 0,386 0,552θ Đáy 0,103 0,093 0,119 0,137 Độhấp thụquang (A.U) 0,431 0,32θ3 0,2θ67 0,415

Từ kết quả thể hiện ở bảng trên, có thể thấy cảm biến vừa chế tạo có khả năng hoạtđộng tốt vớimẫuthựclàhuyếtthanh người, đưaracáckếtquảphântíchcósai sốtừ3,81

Tổnghợp,đặctrưngvàứngdụngvậtliệuFN- CQDstrongchếtạocảmbiếnsinhhọcsomàupháthiệnglucose

Bước sóng (nm) Số sóng/ cm-1

Bài viết trình bày đặc trưng vật liệu FN với các vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β-sheet) của enzym CQDs thông qua các phương pháp phân tích khác nhau Hình 3.42 minh họa phổ nhiễu xạ tia X (XRD), phổ từ kế mẫu rung (VSM), và ảnh SEM ở độ phóng đại nhỏ kèm theo phổ EDX, cùng với ảnh SEM ở độ phóng đại lớn Ngoài ra, bài viết còn đề cập đến ảnh TEM, phổ phát huỳnh quang, phổ quang hấp thụ, và phổ hồng ngoại của FN, nhấn mạnh các đặc điểm cấu trúc và tính chất quang học của vật liệu.

Giản đồ XRD của FN-CQDs (Hình 3.42A) xuất hiện các pic đặc trưng ở góc 2θ

1.7°, 36.7°, 45.1°, 57.0° và 62.6° tương ứng với các đỉnh (220), (311), (422), (511) và(440),trùngkhớpvớiđặctrưngcủaγ-

Vật liệu FeOOH có tính chất thấp và thường xuất hiện đỉnh (002) ở góc 2θ ≈ 22.7°, thể hiện cấu trúc chồng lên nhau của các lớp carbon/graphen Tuy nhiên, trong Hình 3.7A, đỉnh này không xuất hiện, có thể do tín hiệu quá yếu hoặc bị che bởi nền Đỉnh (002) phụ thuộc vào mức độ oxy hóa của CQDs, liên quan đến các nhóm hydroxyl, epoxy, carbonyl và carboxylic, có thể làm tăng khoảng cách giữa các lớp CQDs Phổ từ kém mẫu rung (VSM) của vật liệu FN-CQDs và γ-FeOOH cho thấy tính chất siêu thuẫn từ của cả hai vật liệu tại nhiệt độ phòng, với giá trị từ tính bão hòa lần lượt là 5 và 20 emu/g ở 25 °C Giá trị thấp của FN-CQDs chứng minh hàm lượng γ-FeOOH trong vật liệu lai tạo này rất nhỏ Ảnh FE-SEM của FN-CQDs cho thấy cấu trúc dạng vảy, xếp chồng lên nhau giống như γ-FeOOH, với các hạt FN-CQDs xuất hiện dưới dạng hình tròn có đường kính từ 22 đến 100 nm Phổ tán xạ năng lượng tia X xác nhận sự có mặt của các nguyên tố trong cấu trúc.

Hình dạng của vật liệu được thể hiện rõ qua ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM), cho thấy các hạt nano FN-CQDs với đường kính trung bình khoảng 50nm Những hạt này kết tụ lại với nhau, tạo thành các tấm/hạt có kích thước lớn hơn Kết quả này phù hợp với hình ảnh từ FESEM, cho thấy các hạt FN-CQDs nhỏ và có hình dạng như vảy.

Phổ phát huỳnh quang của vật liệu FN-CQDs cho thấy cường độ phát xạ huỳnh quang khá thấp khi bước sóng kích thích thay đổi từ 300 nm đến 380 nm Tuy nhiên, với bước sóng kích thích 360 nm, 440 nm và 460 nm, FN-CQDs phát xạ mạnh ở khoảng 510 nm – 525 nm, với bước sóng phát xạ mạnh nhất tại 521 nm khi kích thích ở 400 nm Đỉnh hấp thụ phân tử UV-Vis của FN-CQDs xuất hiện tại 350 nm, đặc trưng cho cấu trúc π → π* của liên kết C=O.

Hình 3.42I trình bày giản đồ FT-IR của vật liệu, cho thấy các đỉnh hấp thụ tại 1022 cm -1 và 1109 cm -1, đặc trưng cho biến dạng uốn của liên kết O – H trong γ-FeOOH Ngoài ra, hai dải hấp thụ ở 608 cm -1 và 427 cm -1 tương ứng biểu thị sự kéo giãn và uốn cong của liên kết Fe–.

Cấu trúc tương tự graphit của vật liệu được thể hiện qua các dải phổ hấp thụ tại 2550 cm -1 và 1400 cm -1, cho thấy sự tác động của nguyên tố nitơ vào các chấm lượng tử carbon Các dải hấp thụ ở 3383 cm -1, 1741 cm -1 và 1263 cm -1 phản ánh sự dao động kéo giãn của các liên kết O – H, C = O và C – O – C, chỉ ra rằng có một lượng lớn oxy trong cấu trúc FN-CQDs Kết quả này cũng phù hợp với dữ liệu thu được từ phương pháp phân tích năng lượng tia X (EDX).

Bước sóng (nm) Bước sóng (nm)

Bước sóng thụ ở 1544 cm -1 có thể xuất phát từ biến dạng của imin proton (= NH + ) Hai đỉnh ở 2926 cm -1 và 788 cm -1 tương ứng đại diện cho biến dạng rung kéo dài và rung uốn phẳng của nhóm N–H.

3.3.2 Cảmbiếnxác địnhnồngđộH 2 O 2t r ê n cơsở vậtliệuFN-CQDs

Hoạt tính tương tự enzym HRP của FN-CQDs trong mô hình peroxidase đượcchứng minh qua thí nghiệm xúc tác của chúng cho phản ứng oxi hóa khử của

H2O2 với TMB chuyển TMB từ dạng khử không màu thành dạng oxi hóa có màu xanh Để chứng minh vai trò xúc tác của FN-CQDs, chúng tôi thiết kế ba mẫu thử: mẫu (a) gồm TMB và FN-CQDs, mẫu (b) gồm TMB và H2O2, và mẫu (c) gồm TMB, H2O2 và FN-CQDs Các mẫu trên được phản ứng tại nhiệt độ phòng đến trạng thái bão hòa, và khi đo UV-Vis, phổ được trình bày trong Hình 3.43A Tác dụng của FN-CQDs có thể được quan sát rõ ràng.

CQDskhôngcókhảnăngoxihóaTMBnếukhôngcóH 2 O2,bằngchứngởđâylàmẫu(a)giữnguyêntrạngthá ikhôngmàu(làđặctrưngcủaTMBởdạngkhử).

Hình 3.43 trình bày hoạt tính xúc tác của FN trong vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β-sheet) của enzym CQDs trong mô hình peroxidase Kết quả thí nghiệm cho thấy khả năng hoạt động của FN trong vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β-sheet) của enzym CQDs, với phổ UV được khảo sát để đánh giá thời gian phản ứng của TMB + H2O2.

Vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β-sheet) của enzym CQDs được phân tích trong các thí nghiệm với TMB và FN, cùng với sự hiện diện của H2O2 Độ hấp thụ quang (A.U) được ghi nhận cho từng trường hợp, cho thấy sự tương tác của các thành phần này trong quá trình nghiên cứu.

Trong mẫu (b), sự oxy hóa TMB diễn ra chậm và với cường độ thấp do H2O2 có khả năng tự phân hủy mà không cần xúc tác, tạo ra oxy nguyên tử [O] để oxy hóa TMB Ngược lại, mẫu (c) với sự có mặt của FN-CQDs cho thấy cường độ tín hiệu đo được từ máy UV-vis cao hơn và tốc độ phản ứng nhanh hơn, nhờ FN-CQDs tăng tốc độ phân hủy H2O2, tạo ra lượng [O] lớn hơn giúp oxy hóa TMB diễn ra nhanh chóng, được thể hiện qua màu xanh đặc trưng của TMB ở dạng oxy hóa, xác định bằng phương pháp quang hấp thụ tại bước sóng 652 nm Nhóm nghiên cứu đã khảo sát thời gian bão hòa và sự thay đổi độ hấp thụ quang tại 652 nm (A652) theo thời gian, cho thấy FN-CQDs không ảnh hưởng đến quá trình oxy hóa – khử của TMB, với A652 của mẫu (a) hầu như không thay đổi trong suốt 30 phút khảo sát và không xuất hiện đỉnh rõ ràng tại 652 nm trong phổ UV-Vis.

Mẫu (b) và (c) đều có sự xuất hiện đỉnh tại 652 nm và tăng dần theo thời gian từ 5 phút đến 45 phút Tuy nhiên, biên độ tăng của A 652 ở mẫu (b) rất thấp, sau 45 phút giá trị A 652 chưa đạt 0,1 và vẫn tiếp tục tăng Trong khi đó, ở mẫu (c), giá trị A 652 tăng rõ rệt theo thời gian và gần như không thay đổi sau 30 phút Điều này chứng minh rằng, với FN, sự khác biệt trong biên độ tăng giữa hai mẫu là đáng kể.

CQDslàxúctác,phảnứngoxihóaTMBbằngH 2 O2sẽrơivàotrạngtháibãohòasau30phút.Vớisựgópmặt củaxúctácFN-CQDs,phảnứnggiữaH2O2v àTMBxảyranhư sau:

Chúng tôi tiến hành tối ưu hóa các điều kiện phản ứng của H₂O₂ với TMB không màu để đạt được sản phẩm H₂O và TMB oxi hóa màu xanh Các yếu tố được tối ưu bao gồm pH, nhiệt độ, thể tích xúc tác và thể tích TMB sử dụng Mục tiêu là thiết lập các điều kiện phản ứng ở trạng thái tối ưu, nhằm đảm bảo tín hiệu A652 thu được từ phản ứng đạt giá trị tối ưu và ổn định nhất, vì A652 chỉ thay đổi khi nồng độ cơ chất thay đổi.

H2O2 Thông số của các thí nghiệm tối ưu đã được nêu ở phần thực nghiệm vàkếtquảđượcthểhiệnởHình3.39.

Hình 3.44Kết quả các thí nghiệm tối ưu: (a) pH, (b) nhiệt độ, (c) thể tích xúc tác, (d) thể tíchTMBsử dụng

Chúng tôi đã tiến hành khảo sát phản ứng ở các giá trị pH từ 3 đến 10 bằng cách điều chỉnh pH của dung dịch đệm Kết quả cho thấy, ở pH từ 3 đến 6, giá trị hoạt động tương đối của phản ứng đạt từ 90 đến 100% so với giá trị A 652 cao nhất tại pH = 3 Tuy nhiên, khi dung dịch đệm không còn tính axit, hiệu suất của phản ứng giảm đáng kể, với giá trị hoạt động tương đối chỉ còn lại ở pH = 7.