luận văn thạc sĩ nghiên cứu đặc điểm sinh học khả năng sử dụng nitơ của một số chủng vi khuẩn tạo biofilm phân lập tại việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _ _ Nguyễn Thị Giang NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, KHẢ NĂNG SỬ DỤNG NITƠ CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TẠO BIOFILM PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 i z ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _ _ Nguyễn Thị Giang NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, KHẢ NĂNG SỬ DỤNG NITƠ CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TẠO BIOFILM PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành : Mãsố 60 42 30 : Sinh học thực nghiệm LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Quang Huy Hà Nội - 2012 ii z MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ BIOFILM 1.1 Giới thiệu chung Biofilm 1.2 Các dạng tồn biofilm 1.2.1 Trong tự nhiên 1.2.2 Trong hệ thống thiết bị nhân tạo 1.2.3 Trong thể sinh vật 1.3 1.3.1 Thành phần cấu trúc biofilm Thành phần biofilm 1.3.1.1 Các hợp chất ngoại bào Bảng Vai trò thành phần EPS 1.3.1.2 Lông, roi, tiêm mao phân tử bám dính 1.3.2 1.4 Cấu trúc biofilm Quá trình hình thành màng sinh vật 1.4.1 Các yếu tố ảnh hƣởng tới hình thành màng sinh vật 1.4.2 Các giai đoạn trình hình thành màng sinh vật 11 Vai trò màng sinh vật 16 1.5.1 Vai trò việc hình thành biofilm với vi sinh vật 16 1.5.1 Bảo vệ tế bào khỏi điều kiện bất lợi môi trƣờng 16 1.5.1.2 Tận dụng nguồn dinh dƣỡng môi trƣờng 17 1.5.1.3 Mối quan hệ hợp tác loài 17 1.5.1.4 Trao đổi vật chất di truyền 17 1.5.2 Ảnh hƣởng biofilm đến đời sống ngƣời 18 1.6 Vấn đề xử lý nước thải 19 1.6.1 Thực trạng ô nhiễm nguồn nƣớc 19 1.6.2 Ô nhiễm nguồn nƣớc nƣớc thải chăn nuôi 20 iv z 1.6.3 Xử lý nƣớc thải chăn nuôi 21 1.6.3.1 Phƣơng pháp học 21 1.6.3.2 Phƣơng pháp hóa lý 21 1.6.3.3 Phƣơng pháp sinh học 22 1.7 Chu trình nitơ tự nhiên 23 1.7.1 Khái quát chu tr nh nitơ 23 1.7.2 Quá trình nitrat hóa 24 1.7.3 Q trình phản nitrat hóa 25 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Nguyên liệu 26 2.2 a chất, thiết bị 27 2.2.1 Môi trƣờng nuôi cấy 27 2.2.2 Hóa chất 27 2.2.3 Máy móc thiết bị 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu 28 2.3.1 Phƣơng pháp ph n lập vi khu n 28 2.3.2 Phƣơng pháp đánh giá khả h nh thành biofilm 29 2.3.3 Phƣơng pháp chụp ảnh tr n k nh hiển vi điện tử qu t 29 2.3.4 Phƣơng pháp đánh giá yếu tố ảnh hƣởng tới hình thành biofilm 30 2.3.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ 30 2.3.4.2 Ảnh hƣởng pH 30 2.3.4.3 Phƣơng pháp nhuộm Gram 30 2.3.5 Phƣơng pháp đánh giá khả chuyển hóa hợp chất nitơ 30 2.3.5.1 Phƣơng pháp thử khả chuyển hóa amoni 31 2.3.5.2 Phƣơng pháp thử khả chuyển hóa nitrit 31 2.3.6 Phƣơng pháp ph n loại dựa phân tích gen 16S rRNA 33 2.3.7 Phƣơng pháp thống kê sinh học 34 v z CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 35 3.1 Kết phân lập chủng vi sinh vật có khả tạo biofilm 35 3.2 Đánh giá khả hình thành biofilm 37 3.2.1 Khả tạo biofilm tr n môi trƣờng Winogradski 37 3.2.2 Khả tạo biofilm tr n môi trƣờng Winogradski 39 3.3 Đặc điểm hình dạng chủng vi khuẩn phân lập 41 3.4 Khả phát triển tạo màng sinh vật chủng nghiên cứu 42 3.4.1 Khả phát triển tạo màng 42 3.4.2 Ảnh hiển vi màng chủng nghiên cứu 43 3.4.3 Khả tạo biofilm bề mặt 44 3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả tạo biofilm chủng phân lập 45 3.5.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ 45 3.5.2 Ảnh hƣởng pH 47 3.6 Phân loại chủng vi khuẩn dựa gen 16S rRNA 48 3.7 Khả chuyển h a nitơ 51 3.7.1 Khả chuyển hóa amoni 52 3.7.2 Khả chuyển hóa nitrit 53 KẾT LUẬN 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 63 vi z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.nam DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt BNNPTNT Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn EPS Extracellular Polymeric Substances Mạng lƣới ngoại bào LB Luria Broth agar Môi trƣờng LB OD Optical Density Mật độ quang học PE Polyethylen Nhựa polyethylen PVC Polyvinyl chloride Nhựa polyvinyl chloride QCVN Quy chu n Việt Nam SEM Scanning Electron Microscope Ảnh hiển vi điện tử quét UV Ultra violet Tia cực tím vii luan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.nam z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.nam DANH MỤC BẢNG Bảng Vai trò thành phần EPS Bảng Số lƣợng vi khu n phân lập đƣợc địa điểm nghiên cứu 36 vi luan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.nam z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.nam DANH MỤC HÌNH Hình Màng sinh vật Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia Flavobacterium spp bề mặt thép không gỉ H nh Các giai đoạn hình thành màng biofilm 12 H nh Các giai đoạn tạo thành biofilm 15 Hình Hoạt động trao đổi chất bên biofilm 15 Hình Chu tr nh nitơ tự nhiên 24 Hình Các vị trí lấy mẫu 26 Hình Khả phát triển tạo màng sinh vật chủng vi khu n phân lập từ trại nuôi lợn xã T n Ƣớc tr n môi trƣờng Winogradski 37 Hình Khả phát triển tạo màng sinh vật chủng vi khu n phân lập từ hệ thống thoát nƣớc xã Dƣơng Nội tr n môi trƣờng Winogradski 38 Hình Khả phát triển tạo màng sinh vật chủng vi khu n phân lập từ trại nuôi vịt xã Trung Tú tr n môi trƣờng Winogradski 39 Hình 10 Khả phát triển tạo màng sinh vật chủng vi khu n phân lập từ trại nuôi lợn xã T n Ƣớc tr n môi trƣờng Winogradski 40 Hình 11 Khả phát triển tạo màng sinh vật chủng vi khu n phân lập từ hệ thống thoát nƣớc xã Dƣơng Nội tr n môi trƣờng Winogradski 40 Hình 12 Khả phát triển tạo màng sinh vật chủng vi khu n phân lập từ trại nuôi vịt xã Trung Tú môi trƣờng Winogradski .41 Hình 13: Hình dạng chủng vi khu n nghiên cứu 42 Hình 14 Khả tạo biofilm chủng nghiên cứu 43 Hình 15 Ảnh hiển vi màng chủng vi khu n 44 Hình 16 Khả tạo biofilm vật liệu nhựa .45 Hình 17 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả tạo biofilm 46 Hình 18 Ảnh hƣởng pH đến khả tạo biofilm 48 Hình 19 Vị trí phân loại chủng T2.2 với lồi có quan hệ họ hàng gần .49 Hình 20 Vị trí phân loại chủng H2.2 với lồi có quan hệ họ hàng gần .50 Hình 21 Vị trí phân loại chủng T4.1 với lồi có quan hệ họ hàng gần 51 Hình 22 Khả chuyển hóa amoni chủng H2.2 T4.1 52 Hình 23 Khả chuyển hóa nitrit chủng LD2.2 T2.2 .53 vii luan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.nam z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.nam Luận văn Thạc sỹ Sinh học Nguyễn Thị Giang MỞ ĐẦU Nƣớc thải có hàm lƣợng nitơ cao mức cho phép đƣợc thải sông, hồ gây tƣợng phú dƣỡng làm nƣớc có màu, mùi khó chịu ảnh hƣởng đến môi trƣờng sinh thái nhƣ sức khoẻ cộng đồng Do vậy, việc phải loại bỏ nitơ đến mức tối thiểu từ nguồn nƣớc ô nhiễm trƣớc đƣa môi trƣờng cần thiết Trong số loại nƣớc thải ô nhiễm, nƣớc thải chăn ni loại nƣớc thải có hàm lƣợng nitơ cao, có khả g y nhiễm môi trƣờng sinh sống phát triển nhiều nhóm sinh vật gây bệnh loại nƣớc thải nhiễm khó xử lý Có nhiều phƣơng pháp xử lý nitơ khác nhƣ áp dụng phƣơng pháp hoá học, vật lý nhƣng phƣơng pháp xử lý mang tính bền vững, thân thiện với mơi trƣờng phƣơng pháp sinh học với tham gia nhóm vi sinh vật tự nhiên Trong tự nhiên, hầu hết tế bào vi sinh vật thƣờng liên kết với tạo thành cộng đồng bám dính bề mặt giá thể thơng qua mạng lƣới hợp chất ngoại bào, hình thành cấu trúc màng sinh vật (biofilm) Biofilm giúp cho vi sinh vật tồn quan hệ hợp tác loài khác hệ thống màng sinh vật, tận dụng đƣợc nhiều nguồn dinh dƣỡng Việc nghiên cứu khả phát triển tạo màng sinh vật chủng vi sinh vật phân giải nitơ nƣớc thải nói chung nƣớc thải chăn ni nói riêng hƣớng nhằm nâng cao hiệu xử lý ô nhiễm môi trƣờng nhƣ góp phần tìm hiểu đa dạng sinh học tự nhiên Xuất phát từ thực tiễn đó, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học, khả sử dụng nitơ số chủng vi khuẩn tạo biofilm phân lập Việt Nam.” luan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.nam z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.nam Luận văn Thạc sỹ Sinh học Nguyễn Thị Giang CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ BIOFILM 1.1 Giới thiệu chung Biofilm Khái niệm màng sinh vật đƣợc hiểu tập hợp quần xã vi sinh vật bám dính phát triển bề mặt mơi trƣờng khác thông qua mạng lƣới chất ngoại bào chúng tạo [32], [57] Màng sinh vật hình thành bề mặt mơi trƣờng vơ sinh hay hữu sinh tƣợng phổ biến xuất tự nhiên, đời sống hay nhiều ngành công nghiệp khác Các tế bào vi sinh vật màng sinh vật khác biệt với tế bào sống trôi tự việc tổng hợp chất ngoại bào giúp tế bào bám dính với bề mặt, giảm tỷ lệ tăng trƣởng, điều hòa tăng giảm gen đặc biệt Khả bám d nh vi sinh vật trình phức tạp đƣợc điều hịa đặc điểm khác môi trƣờng nuôi cấy, chất ngoại bào bề mặt tế bào [56] Vi khu n bắt đầu trình tạo màng sinh vật để đáp ứng với tác động cụ thể từ môi trƣờng sống nhƣ nguồn chất dinh dƣỡng oxy Quá trình tạo thành màng sinh vật trải qua biến đổi động học việc chuyển từ đời sống tự sang dạng sống bám dính cấu trúc màng sinh vật, bao gồm việc sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp gia tăng chất chống lại tác nhân vật lý, hóa học sinh học gây hại [82] Sự hình thành màng sinh vật đƣợc coi số chế tồn vi sinh vật, vi khu n tận dụng đƣợc nguồn dinh dƣỡng nhận đƣợc bảo vệ điều kiện bất lợi nhƣ khơ hạn, xạ cực tím chất độc hại Mặt khác coi hệ thống màng sinh vật mạng lƣới nhiều gen, vật liệu di truyền dễ dàng đƣợc trao đổi qua lại tế bào vi sinh vật [65] Biofilm đƣợc hình thành tập hợp tế bào nhiều loài vi sinh vật khác nhƣ nấm, tảo, xạ khu n, vi khu n Trong biofilm tế bào tập hợp thành đơn vị cấu trúc vi khu n lạc Thành phần đóng vai trị quan trọng q trình hình thành biofilm đặc biệt giai đoạn đầu quy định đặc tính hình thành biofilm cho loài vi sinh vật, đảm nhiệm chức tiết hợp chất ngoại bào nhƣ có chứa yếu tố phụ trợ tế bào nhƣ lông roi, lơng nhung hỗ trợ cho việc bám dính tế bào khác lên bề mặt giá thể luan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.kha.nang.su.dung.nito.cua.mot.so.chung.vi.khuan.tao.biofilm.phan.lap.tai.viet.nam z