BO GIAO DUC VA DAO TAO DAI HOC HUE
TRUONG DAI HOC KHOA HOC
NGUYEN CUU NHAT THAO
XAC DINH DONG THOI ACETAMINOPHEN, CHLORPHENIRAMINE MALEATE VA PHENYLEPHRINE HYDROCHLORIDE TRONG DUOC PHAM BANG PHUONG PHAP TRAC QUANG -CHEMOMETRICS
CHUYEN NGANH: HOA PHAN TICH MA SO: 8440118
LUAN VAN THAC SI KHOA HOC
DINH HUONG NGHIEN CUU
NGƯỜI HƯỚNG DÂN KHOA HOC: PGS TS TRAN THUC BINH
Thira Thién Hué, 2019
Trang 2LOI CAM DOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, được các đồng tác giả cho phép sử đụng và chưa từng được công bồ trong bất kỳ một công trình nào khác
Huế, tháng 7 năm 2019
Tác giả
Trang 3LOI CAM ON
Tôi xin gởi lời sâu sắc và chân thành nhất đến PGS.TS Trần Thúc Bình đã tận tình quan tâm, hướng dân, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này
Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy, cô Khoa Hóa Học, Phòng Đào tạo Sau
Đại Học, và các phòng ban của Trường Đại học Khoa Học - Đại Học Huế đã tạo điểu kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường
Tôi cũng xin gởi lời cảm ơn đến quý thầy, cô phòng thí nghiệm Trung tâm
Hóa học Ứng dụng — Khoa Hóa học — Trường Đại học Khoa Học Huế đã giúp đỡ,
góp ÿ, tạo điều kiện đề tơi hồn thành luận văn
Và tôi cũng chân thành cảm on thay cô, gia đình, bạn bè và tập thê lớp Cao
học Hóa (khóa 2017-2019) đã động viên, giúp đồ tôi vượt qua khó khăn, trở ngại
trong thời gian học tập
Huế, tháng 7 năm 2019
Tac giả
Nguyên Cứu Nhật Thảo
Trang 4MUC LUC
Trang
LoL cam:d0ant sancesenccme ncaa cee 1 LOH CAM OD 2c cee L1 21T HH HH HH HH HH Hết 1 ) 0b 0 ai ul Danh mục các bang oo cece St nh HH Hà HH HH net vi Danh mục các HÌNH:::zzscziisesixsotsicEttbIGSGHELRGRGREERGREHSNESRHI(ASEAAS3thgt83tHAm vn Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt - 22 2 2222122122112 xe vill l6 100057 1
Chương 1 TÔNG QUAN LÝ THUYT - 552 22222212212212222222222 e6 3
1.1.CƠ SỞ LÝ THUYÉT CỬA PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỎ HÁP THỤ
THÂN Ti nangntuingtrnruinngnnoitgntN0IESNUG10002HG70NGGINDURPGHDDR.SOHEUH9008001801000000001g0010000đ 3
1.1.1 Định luật Bouguer — Lambert — Be€er - St nh hp 3
1.1.2 Tinh chất cộng tính độ hấp thụ quang ©22+22222E222522251223221222222222-e 3 1.1.3 Những nguyên nhân gây sai lệch định luật Beer ccccsccsc s52 4
1.2 CAC PHUONG PHAP TRAC QUANG-CHEMOMETRICS XÁC ĐỊNH ĐÔNG THỜI CÁC CHẤT CÓ PHÔ HẤP THỤ XEN PHỦ NHAU 5
1.2.1 Cơ sở lý thuyết một số phương pháp trắc quang (UV-VIS)-chemometrics .5 1.2.2 Phương pháp VIerOrd[ c1 t1 t2 1211211112111 111 8H HH HH tt 6 1.2.3 Phương pháp quang phổ đạo hàm 22: 22 222222222512251211122112111111221 2e 7 12.4.Phuong phap loc! Kalman ws ecever cron eemneeeennnemnn 9
1.2.5 Phương pháp hồi quy cấu tử chính (PCR) 2- 22 222225222112111211221 xe 9
1.2.6 Phương pháp phổ toàn phần 22222 22222122112211221211211212222222 e6 10
1.3 TONG QUAN VE PA, PE VÀ CM 5c 5s n2 221212 21tr rra 12
1.3.1 Giới thiệu VỀ PA 5:2:c:22222ttt2222tt2 12th rhuưe 12
1.3.2 Giới thiệu phenylephrine hydrochloride -:- cc: c:‡ccssxstsvxsrrrrsrxses 14 1.3.3 Giới thiệu Clopheniramine Maleafe 2c t2 vs nh rreek 16
14 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PA PE VÀ CM 19
IE y0 v0 -80)./1)9 00:00): 0)0\0.0201- 3 ầtuMà&MãÃỄŨủỒẳỒỪùỒặằùŨẦẲÄẲẦÄẦ 19 1.4.2 Phương pháp định lượng PE - S211 12 12 1E ErrythH Hye ty tret 20
Trang 50.8 aon 60 phút (2) 0.5 2N ; 50 pst 3) 120 phi) 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 240 260 280 300 320
Hinh 3.3 Phé hap thu ctia dung dich chuan hén hop PA 5,0 pg/mL, PE 5,0ug/mL, CM 5,0 pg/mL (PA:PE:CM= 5,0:5,0:5,0) (ug/mL )
trong dung môi NaOH 0.1M Nhận xét:
Từ hình 3.3 ta nhận thấy phổ hấp thụ của dung dịch hỗn hợp PA 5,0 ug/mL, PE 5,0 ug/mL và CM 5,0 ug/mL theo thời gian chồng lên nhau Điều đó chứng tỏ phô hấp thụ của dung dịch hỗn hợp trên không thay đôi đáng ké theo thời gian, hay có thể nói dung dịch hỗn hợp ổn định trong khoảng thời gian 120 phút
3.2 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MẪU CHUAN
3.2.1 Cách tiến hành:
-_ Pha các dung dịch chuẩn PA 10 pg/mL, PE 10 pg/mL va CM 10 pg/mL va
Trang 63.2.2 Danh gia d6 tin cay ctia phuong phap on cece eee eeeeneeneeeneeneeteneenee 33
3.3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MẪU THỰC TÉ -: 34
3.3.1 Đề xuất quy trình xác định đồng thời PA, PE và CM trong dược phẩm bằng phương pháp trắc quang - chemometrics dùng phổ toàn phần - 34
3.3.2 Công thức tính hàm lượng các chất . - 22222 22122212221221211222 e6 35
3.3.3 Áp dụng quy trình xác định PA, PE và CM trong được phẩm trên thị trường .36 3.3.4 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp đối với mẫu thật - 38
Trang 7DANH MUC CAC BANG
Trang
Bảng 3.1 Kết quả xác định nồng độ của mẫu chuẩn PA, PE, CM=2,5:5,0:7,5 33 Bảng 3.2 Kết quả xác định nồng độ của mẫu chuẩn PA, PE, CM=7,5:2,5:5,0 33 Bảng 3.3 Kết quả xác định nồng độ của mẫu chuẩn PA, PE, CM=7,5:5,0:2,5 34
Bảng 3.4 Hàm lượng (ug/mL) của PA, PE và CM trong trong đung dịch mẫu thuốc
viên nếm ;LLEE tpny 80260 20000ĐAIEEHEGDGERGNHEEEDVSGEDYEAEMIVUEGENEEEIEAHGEUENGNAEIDSRGEARYRABB 37
Bảng 3.5 Hàm lượng (mg/viên) của PA, PE và CM trong trong dung dịch mẫu
thuốc viên nén TIFEY pgy 52-52 1 1212212212112 1t 0121 tru 37
Bảng 3.6 Khối lượng mẫu thuốc và nồng độ chất chuẩn thêm vào mẫu thuốc 39
Bảng 3.7 Nồng độ và độ thu hồi xác định được của PA, PE và CM có trong mẫu
thuốc đã thêm chất chuẩn 22-©22¿222222221222511221112211121111211112111211211211 e6 40 Bảng 3.8 Hàm lượng PA xác định theo hai phương pháp trắc quang-chemometrics x50 21589.10si10 922125 alil 41 Bảng 3.9 Hàm lượng PE xác định theo hai phương pháp trắc quang-chemometrics va phuong phap HPLC 00 42 Bang 3.10 Hàm lượng CM xác định theo hai phương pháp trắc quang- chemometrics và phương pháp HPLC S32: 322 E222 EEEtrrxsrrerrrrrsrer 43
Trang 8DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang Hình 3.1 Phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn PA 10ug/mL, PE 10ug/mL, CM 10ug/mL trong dung môi NaOH 0,1M - c2: 21121 2H Hye 29
Hình 3.2 Phổ hấp thụ phân tử của cac dung dich PA 5 pg/mL, PE 5 pg/mL, CM 5
ug/mL va dung dich hén hop PA 5 pg/mL, PE 5 pg/mL va CM 5 pg/mL 31
Hình 3.3 Phé hấp thụ ctia dung dich chuan hén hop PA 5,0 pg/mL, PE 5,0ug/mL, CM
5,0 ng/mL (PA:PE:CM= 5,0:5,0:5,0) (ug/mL ) trong dung m6i NaOH 0.1M
Hình 3.4 Quy trình xử lý mẫu phan tich PA, PE va CM trong thuốc viên nén TIFFY 34 Hình 3.5 Phổ hấp thụ của dung dich chudén PA 10ug/mL, PE 10ug/mL, CM 10ug/mL và các dung địch mẫu thuốc TIFEY pgy 22©2222222222222E222222x-<e 36 Hình 3.6 Phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn PA I0ug/mL, PE 10ug/mL, CM 10ug/mL và các dung địch mẫu thuốc sau khi thêm chuẩn 2- 22225222 39
Trang 9DANH MUC CAC Ki HIEU, CAC CHU VIET TAT A CLS CM HPLC LS PCR PLS RE RSD RD-HPLC UV-VIS Độ hấp thụ Phương pháp bình phương tối thiểu cổ điển Chlorpheniramine Maleate
Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao
Phương pháp bình phương tối thiểu
Phương pháp hồi quy cấu tử chính Phương pháp bình phương tối thiểu từng Sai số tương đối
Độ lệch chuẩn tương đối
Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao pha đảo Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử
Trang 10MO DAU
Để đáp ứng nhu cầu sức khỏe ngày càng cao của con người, cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật và công nghệ, ngành dược phẩm phát triển không ngừng Các nhà sản xuất dược phẩm đã áp dụng nhiều phương thức sản xuất, chế biến tiên
tiến để tổng hợp ra nhiều loại được phẩm có tác dụng tốt hơn, cụ thể là sản xuất thuốc đa thành phần dé nâng cao hiệu quả chữa bệnh Chính vì vậy, việc xác định
đồng thời các chất trong thuốc đa thành phần nhằm kiểm soát chất lượng trong ngành kiểm định dược phẩm đang là vấn đề cấp thiết
Hiện nay, trên thế giới và trong nước, các phương pháp phân tích đồng thời các chất trong hỗn hợp đang được thực hiện là HPLC, quang phổ UV-VIS, quang phô đạo hàm, trắc quang - chemometrics Một trong số phương pháp trắc quang- chemomectrics sử dụng phương pháp bình phương tối thiểu cổ dién (CLS) ding phổ toàn phần có quy trình đơn giản, thiết bị rẻ tiền, phân tích được đồng thời các cấu tử trong hỗn hợp có phổ xen phủ nhau và cho kết quả phân tích nhanh chóng, có
độ lặp lại, độ chính xác cao rất phù hợp với nhu cầu phân tích chất trong hỗn hợp
hiện nay [13], [14] [16] [20] [22] Tuy nhiên việc áp dụng phương pháp phân tích này ở Việt Nam trong vẫn còn hạn chế và chưa phổ biến rộng rãi trong ngành Hóa phân tích
Acetaminophen (hay còn gọi là Paracetamol (PA)), Phenylephrine Hydrochloride (PE) va Chlorpheniramine Maleate (CM) 1a ba thanh phân chính trong một số thuốc đa thành phần được lưu hành phổ biến hiện nay đạng viên nén
chữa ho, số mũi, cảm PA dùng dé giam dau, ha nhiét, PE ding dé giam huyét ap,
nhỏ mắt để giảm sung huyết kết mạc, nhỏ mũi giảm sung huyết mũi, xoang do bị
cảm lạnh, CM dùng để điều trị viêm mũi dị ứng mùa và quanh năm, mày đay, sốc
phản vệ [4] Thuốc đa thành phần cho hiệu quả chữa bệnh tốt và giảm tối đa tác dụng phụ không mong muốn
Qua các tài liệu tham khảo, cho thấy đa số các tác giả đều sử dụng phương
pháp HPLC để phân tích xác định PA, PE và CM trong thuốc chứa ba thành phan
Trang 11pháp trắc quang khác nhau đề xác định đồng thời các chất này trong thuốc dạng bán thành phẩm và thành phẩm
Phổ hấp thụ phân tử UV-VIS của 3 chất này xen phủ nhau ở vùng tử ngoại và chúng thường kết hợp với nhau trong các thuốc đa thành phần Ở Việt Nam vẫn chưa có tác giả nào công bố bài báo liên quan đến phân tích đồng thời các chất nay trong được phẩm đa thành phần bằng phương pháp CLS dùng phổ toàn phần
Với mong muốn góp phần vào việc mở rộng phương pháp trắc quang —
chemometries trong phân tích ở Việt Nam, trong khuôn khổ luận văn thạc sĩ, chúng
tôi đặt ra mục tiêu nghiên cứu xây dựng quy trinh phân tích xác định hàm lượng PA, PE va CM trong dược phẩm bằng phương pháp trắc quang-chemometrics sử dụng phương pháp CLS dùng phổ toàn phân
Trang 12Chuong 1 TONG QUAN LY THUYET
1.1.CƠ SO LY THUYET CUA PHUONG PHAP QUANG PHO HAP THU PHAN TU
1.1.1 Dinh luat Bouguer — Lambert — Beer
Dinh luat Bouguer — Lambert — Beer (gọi tắt là định luật Beer) mô tả mối
quan hệ tuyến tính giữa độ hấp thụ quang của đung dịch với nồng độ của các cầu tử hấp thụ anh sang trong dung dich [9]
Phuong trinh toan hoc biểu diễn định luật Beer:
Ay = &.b.C (1.1) Trong do:
A¿: độ hấp thu quang cia dung dich 6 bude séng i;
&: hé số hấp thụ mol phân tử của cấu tử tại bước sóng À;
b: bề dày lớp dung dịch (em);
C: nồng độ của cấu tử trong dung dich (mol/L)
* Điều kiện áp dụng định luật Beer:
- Chùm tia sáng phải đơn sắc - Dung địch phải trong suốt
- Nồng độ dung dịch phải nằm trong khoảng thích hợp
- Chất thử phải bền trong dung địch và bền đưới tác dụng của tia sáng đi qua 1.1.2 Tính chất cộng tính độ hấp thụ quang
Để xác định đồng thời các cấu tử trong hỗn hợp mà phổ hấp thụ của chúng xen phủ nhau sử dụng phương pháp phân tích trắc quang thì độ hấp thụ của các cấu tử trong hỗn hợp đó phải tuân theo định luật Beer và có tính cộng tính
Tính chất cộng tính độ hấp thụ: độ hấp thụ của dung dịch hỗn hợp tại một
bước sóng bất kỳ bằng tông độ hấp thụ của mỗi cấu tử trong hỗn hợp tại bước sóng
Trang 13Biểu thức của định luật cộng tính:
n
Ay = Aya t Aga Foe Aig tot Aga = »
a (1.2)
Trong do:
A¿: độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp n cấu tử ở bước sóng À; A¡¿: độ hấp thụ quang của cấu tử thứ I tại bước sóng À;
n: là số cầu tử hấp thụ ánh sáng có trong hỗn hợp, với ¡ = 1 ~n
Kết hợp phương trình (1.1) và (1.2) ta có:
Ay = 14 b C, + E24: b C, + Ein b C + Ena: b Cn = Miền Ein: b C; (1.3)
Khi phân tích đồng thời nhiều cấu tử trong cùng một dung dịch thì tính chất cộng tính của độ hấp thụ quang thường không đảm bảo (vì ảnh hưởng vật lí, hóa
học, ) làm ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả phân tích Vì vậy, việc kiểm tra
tính cộng tính của độ hấp thụ quang của hệ trước khi phân tích là hết sức quan trọng Để kiểm tra tính cộng tính của độ hấp thụ quang ở các nồng độ khá nhau của các cầu tử trong hệ, người ta so sánh tổng độ hấp thụ quang của các dung địch chứa các câu tử riêng rẽ với độ hấp thụ quang của dung dịch chứa đồng thời các cấu tử đo được trong cùng một điều kiện Sự kiểm tra như vậy cho biết nhiều thông tin quan trọng như sự tương tác giữa các cấu tử hấp thụ ánh sáng có xảy ra hay không, giới
hạn nảo thì sự sai lệch vượt quá phạm vi sai số ngẫu nhiên hay nói cách khác, hệ vẫn tuân theo định luật Beer vả tính cộng tính của độ hấp thụ quang Từ đó, có thể
vận dụng đề xác định hàm lượng các chất trong khoảng nồng độ cho phép 1.1.3 /Nh ng nguyên nh ng y sail ch Ä nh Ìu f cer
Theo định luật Beer, ta co: A = f(A, b, C), nghia la dé hap thu quang la ham số của ba biến số À„ b, C Do đó, sự sai lệch của ba tham số này đều có thể dẫn đến
Trang 14- Tính đơn sắc của ánh sáng: Do tính chất đặc trưng của các chất là chỉ hấp
thụ những bức xạ có độ dài sóng thích hợp nên định luật Beer chỉ luôn đúng khi
dùng ánh sáng đơn sắc đề nghiên cứu Mức độ đơn sắc càng lớn, khả năng tuân theo định luật Beer càng lớn Các máy đo quang chính xác phải có nguồn sáng cung cấp được dải sóng tập trung quanh một bước sóng nhất định Tốt hơn cả là chọn bước sóng thích hợp tại peak hấp thụ của chất nghiên cứu
- Nồng độ lớn của dung dịch khảo sát: Nồng độ của dung địch lớn sẽ xảy ra tương tác điện, đại lượng e thay đổi, thông thường khi tăng nồng độ dung dich, giá
trị e giảm Sự sai lệch khỏi định luật Beer thường là sai số âm
- Các điều kiện đo độ hấp thụ quang, như: bề dày b của cuvet, độ trong suốt
của bề mặt cuvet không thật đồng nhất, bề mặt cuvet gây các hiện tượng quang học
(tán xạ, hấp thụ): sự trùng hợp hoặc khử trùng hợp phân tử, sự solvat hóa hay hydrat
hóa xảy ra khi thay đổi nồng độ chất hấp thụ: sự tạo thành các hợp chất trung gian,
phức phụ, tạo keo hay sự có mặt các chất điện li mạnh, pH đều có thể làm thay
đổi độ hấp thụ của dung dịch, làm sai lệch khỏi định luật Beer.[11], [15] [16] [17]
1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP TRẮC QUANG-CHEMOMETRICS XÁC ĐỊNH
DONG THOI CAC CHAT CO PHO HAP THU XEN PHỦ NHAU
1.2.1 Cơ sở lý thuyết một số phương pháp trắc quang (UV-VIS)-chemometrics Phương pháp đường chuẩn, phương pháp thêm chuẩn, phương pháp vi sai có thê được áp dụng dé xác định nồng độ của các cấu tử trong dung dich ma phé hap thụ của các cấu tử này không xen phủ nhau và tuân theo định luật Beer Song đối với đung dịch hỗn hợp mà các cấu tử trong dung dịch có phổ hấp thụ xen phủ nhau
thì việc tính toán rất phức tạp Vì vậy, dựa trên định luật Beer, nhiều phương pháp
phân tích đã ra đời cho phép xác định đồng thời các cấu tử trong dung dịch hỗn hợp nhiều cấu tử có phổ hấp thụ xen phủ nhau mà không cần che, tách Sau đây chúng tôi điểm qua một số phương pháp xác định trắc quang đồng thời các chất có phổ
Trang 151.2.2 Phuong phap Vierordt
Để xác định nồng độ của các cấu tử trong hỗn hợp, lần đầu tiên Vierordt đã
đo độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp ở các bước sóng khác nhau, sau đó thiết lập hệ phương trình bậc nhất mà số phương trình bằng số ân số (số cấu tử trong hỗn hợp), giải hệ phương trình này tính được nồng độ của các cấu tử Điều kiện để áp dụng phương pháp này là sự hấp thụ ánh sáng của các cấu tử trong hỗn hợp phải
tuân theo định luật Beer và thỏa mãn tính cộng tính của độ hấp thụ quang Với hỗn
hợp chứa 2 cấu tử ta cần phải lập hệ 2 phương trình 2 ân, thiết lập bằng cách đo độ hấp thụ quang của hỗn hợp ở 2 bước sóng khác nhau (À và 2):
Ag, = £ii.b.Úi + £ại.D C2
(1.3) Aj, = €12.D Cy + €22.b Cy
Trong do:
Ay,- Aa,: 46 hấp thụ quang của hỗn hợp & buc séng Ay và do
£11) £12: hé sé hấp thụ mol phân tử của cấu tử 1 tại bude song dy va Ay; £z¡,£„„: hệ số hấp thụ mol phân tử của cấu tử 2 tại bước sóng Ay Va do
Với hỗn hợp chứa n cấu tử, ta cần phải lập hệ n phương trình n ấn Hệ phương trình này được thiết lập bằng cách đo độ hấp thụ quang của hỗn hợp ở n bước sóng khác nhau Đồng thời phải xác định hệ số hấp thụ mol phân tử của riêng từng cấu tử ứng với từng bước sóng trên
Ag, = £ii.b.C¡ + €24.b 1 Cg +0 + &jy D.C; Ho + &qy D.C, Ag, = €42-D 2 Cy + €g2.b Cy +0 + &j2 D.C, + + Ez bd C,
(1.4)
Ag, = Ein: D.C, + Eqn B Cg + mm, D, Ôi + th + Egy D Cy
Trong do:
Aa,» Aage > Aa, 46 hap thụ quang của hỗn hợp ở bước sóng Àu, As, Ans Ein: hé số hấp thụ mol phân tử của cấu tử ¡ tại bước sóng À„ (xác định bằng
Trang 16b: bé day lớp dung dich (cm);
Cy: nông độ cấu tử thứ ¡ trong hỗn hop (mol/L); voii = 1~+n
Giải hệ n phương trình với n ân số là C¡, C¿, , Cạ sẽ tìm được nồng độ của
các cấu tử Phương pháp Vierordt chủ yếu được vận dụng để tìm cách giải hệ phương trình như: giải bằng đồ thị, giải bằng phép ma trận vuông, phương pháp khử
Gauss, để xác định nông độ của môi câu tử
Ưu điểm và nhược điểm: Phương pháp Vierordt đơn giản, đễ thực hiện nhưng chỉ áp dụng được khi số cấu tử trong dung dịch hỗn hợp ít, phổ hấp thụ quang phân tử xen phủ nhau không nhiều, tính chất cộng tính độ hấp thụ quang
được thỏa mãn nghiêm ngặt Đối với hệ nhiều cấu tử, đặc biệt là khi phổ của các
cấu tử xen phủ nhau nhiều, tính chất cộng tính độ hấp thụ quang không được thỏa mãn nghiêm ngặt, thiết bị đo có độ chính xác không cao thì phương pháp không chính xác và có sai số lớn
Bởi vậy, mặc dù phương pháp Vierordt tuy ra đời đã lâu nhưng ứng dụng trong thực tế còn rất ít, chủ yếu đươc dùng nhiễu trong việc phân tích hỗn hợp các
chất hữu cơ, các loại được phẩm, các hỗn hợp chất mau [19], [20] Tuy nhiên, đây
là cơ sở lý thuyết cơ bản nhất, đặt nền móng cho các nhà khoa học sau này phát triển, cải tiến để xây dựng nên các phương pháp mới
1.2.3 Phương pháp quang phố đạo hàm
Trang 17Ao()=A=e.b.C Ai0)=dA/dA=(de/dA¿).b.C Az(J)Ed°A/dA*=(dˆz/dA^).b.C Aa@)Ed°A/d2*=<(d'e/dA).b.C Vì độ hấp thụ của dung dịch có tính cộng tính nên: An(AoatrFAa(VI+Aa@9s+ +Aa(V)m Với: - m là câu tử có mặt trong hệ - An(M)i, Au(Ma, , An(A)n: giá trị đạo hàm bậc n độ hấp thụ của hệ chứa cầu tử thứ 1,2, , m tại bước sóng A
- AnQeotai: gia tri dao ham bac n dé hap thụ của hệ tại bước sóng À Như vậy
phô đạo hàm bậc n của một hỗn hợp sẽ bằng tổng phố đạo hàm bậc n của từng cấu tử trong hỗn hợp
Để định lượng một cấu tử theo phương pháp phổ đạo hàm, ta tiến hành:
- Ghi phô đạo hàm, tìm bước sóng đo thích hợp mà tại đó giá trị đạo hàm phô của cấu tử cần phân tích là khác 0 hoặc cực đại, còn giá trị đạo hàm phô của
cấu tử khác là bằng 0
- Sau khi xác định được bước sóng đo ở một bậc đạo hàm nhất định rồi, các
bước còn lại có thể thực hiện theo nguyên tắc định lượng của phương pháp đường chuẩn hay phương pháp thêm tùy theo yêu cầu của công việc phân tích [9] [13], [17]
Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp:
Trang 18- Nhược điểm: Khi bậc đạo ham càng cao thi độ nhạy phép xác định càng
giảm Đối với những chất có phổ tương tự nhau hay hỗn hợp phức tạp có nhiều cấu tử có phổ hấp thụ xen phủ nhau thì khó áp dụng phổ đạo hàm
- Ứng dụng: phân tích các hỗn hợp chất vô cơ, hữu cơ [26] 1.2.4 Phương pháp lọc Kalman
Thuật toán học Kalman hoạt động trên cơ sở cá file dữ liệu phổ đã ghi được
của từng cấu tử riêng rẽ và của hỗn hợp các cấu tử, xác định sự đóng góp về phổ của từng câu tử trong hỗn hợp tại các bước sóng Khi chương trình chạy những kết quả tính toán liên tiếp sẽ càng tiến gần đến giá trị thực Trong thực tế, người ta sử dụng phương pháp bình phương tối thiểu để giảm sai số giữa phổ của hỗn hợp với phổ nhân tạo được tiên đoán bởi các xấp xỉ Kalman
Kết quả tính toán là lý tưởng khi phô của hỗn hợp trừ đi phổ nhân tạo được
tính bởi lọc Kalman sẽ tạo ra một đường thẳng có độ lệch không đáng kể Độ đúng của phép xác định phụ thuộc vào độ nhiễu của nên, vào việc tách các đỉnh phổ hấp
thụ của các cấu tử và sự tương tác giữa các cấu tử Hỗn hợp có càng ít cấu tử, các đỉnh hấp thụ càng cách xa nhau thì sai số của phép tính toán sẽ càng nhỏ
Việc tính toán sẽ được thực hiện trên toàn bộ khoảng bước sóng được chọn Nếu kết thúc quá trình tính toán, độ lệch chuẩn tương đối của giá trị nồng độ các
cấu tử trong hỗn hợp vẫn lớn hơn giá trị sai số cho phép thì nồng độ của cấu tử đó
sẽ phải xác định lại Trong trường hợp đó, cần phải tăng giá trị sai số mặc định hoặc
giảm số giá trị nồng độ mặc định để tính giá trị nồng độ trung bình [7]
1.2.5 Phương pháp hồi quy cấu tử chính (PCR)
Trang 191.2.6 Phuong pháp phổ toàn phần
Phương pháp phổ toàn phần (phương pháp bình phương tối thiểu hệ đa biến) sử dụng toàn bộ dữ liệu phổ đo được để tính toán Do bản chất của phương pháp nên gọi đây là phương pháp bình phương tối thiểu hệ đa biến
Áp dụng định luật Beer cho hệ gồm n cấu tử tại m bước sóng (m > n) và độ hấp thụ của hệ có tính chất cộng tính tại một bước sóng
Đặt e¡ = g¡.b và xị = C¡
Với g¡: độ hấp thụ phân tử của cấu tử thứ i;
C¡: nồng độ của cấu tử thứ ¡ trong hỗn hợp
Ta được hệ phương trình tuyến tính gồm m phương trình, n ấn số:
Yy = €y4.%y + Ø1¿.X;¿ + **: + @ịị.Xị + *: Ð Ø1ạ.Xn Ÿ¿ = 6¿1.Xị + 622.X¿ Ä+ **+ + đại Xị + **' + Can Xp
(1.10) Yj = i.Xị Â 2X + hh + Gj Kj Hv + Cin Xy
Yin = mi XI T ma X;¿ + th: + đại Xi + + Cmn- Xn
Khi đo phổ hấp thụ quang của dung dịch ở bước sóng thứ j, ta được giá trị Yj:
Gia tri nay thuong mắc phải sai số đo nên sẽ khác với giá trị thực Y¡ một đại lượng
s¡ Trong đó, s; 1a sai số đo và sị = y¡ — Y/
Hàm biểu diễn sai số bình phương toàn phân:
m m
2 2
S=) 0,-Y)* = Ly; = (G1 %1 +672.X¿ + +: + đu Xi + + ein Xn)| (1.11)
J=1 J=1
Dé § đạt cực tiểu thì đạo hàm của S theo các biến xị phải bằng 0 Nếu ta lay dao ham S theo bién X, va cho dao ham bằng 0 thi sẽ nhận được phương trình sau:
Trang 20m ds ——_—= 2 ly — (ej1.%4 +6/2.X¿ + Cy Xp bot Cjn-Xn) | (-e)1) =0 j=1 m m 2 => » đĩ.X+ + » Cj1- Cj2-X_ + J=1 J=1 m m m + » jr ji Xi + ¬» j1 Ởjm Xpy — » ej1-¥j =O (1.12) j=l J=1 j=l
Tương tự, ta cũng lay dao ham S theo cac bién x; còn lại và cho các gia tri
Trang 21C44 Xy + yg Xz He Fay Xt + Ayn Xp = by đ21.Xị + Azz Xq Her + Az Xi +o + Ann Xp = de
(1.14) Ay Xy + Agg.Xq Herr + Aggy Xj Ae + Ann Xn = dy
Any X14 + Ang Xg Fie + đại, Xị TT th + Ann Xn = Dy
Cac gia tri ay, b, trong hé (1.14) duoc tính từ các giá trị đo ban dau e¡ thông
qua phương pháp bình phương tối thiêu Hệ phương trình (1.14) là một hệ phương trình tuyến tính gồm n phương trình, n ẩn số, giải hệ này để xác định nồng độ của các cấu tử xị trong hệ bằng phương pháp Gauss Phần mềm để giải theo phương
pháp toàn phổ là phần mềm SIMULAN.EXE
Ưu điểm: Phương pháp này có thể sử dụng toàn bộ số liệu phô đề lập ra hệ phương trình tuyến tính có số phương trình nhiều hơn số ân Quá trình biến đổi dựa trên nguyên tắc của phép bình phương tối thiêu sẽ mắc sai số nhỏ nhất, do đó nâng cao độ chính xác của phép phân tích Nồng độ được tính toán tương đối nhanh và có thê dùng cho các hỗn hợp phức tạp
Nhược điểm: phương pháp này có nhược điểm là phải biết thành phần định tính
của mẫu Khi các cầu tử có tương tác với nhau tạo ra hiệu ứng quang học làm thay đôi
hệ số hấp thụ của từng cấu tử thì kết quả phân tích sẽ không chính xác [ I1] [15] [17]
Nhận thấy phương pháp này có nhiều ưu điểm phù hợp với các chất cần xác định đồng thời trong mẫu dược phẩm nên chúng tôi chọn phương pháp phô toàn phần
để xác định đồng thoi 3 chat PA, PE va CM trong mau thuéc vién nén TIFFY pry
1.3 TONG QUAN VE PA, PE VA CM 1.3.1 Giới thiệu về PA
- Công thức hóa hoc: CsHyNO3
Trang 22HN O
OH
- Tén: N-(4-hidroxyphenyl) axetamid (hay Acetaminophen)
- Tinh chat vật lí: là chất bột kết tỉnh màu trắng, không mùi Hơi tan trong
nước, rất khó tan trong chloroform, dễ tan trong dung dịch kiểm, etanol 96%, metilen clorua
Dược lí và cơ chế tác dung
Paracetamol (hay acetaminophen) la thuédc giam dau — ha sét hitu hiéu, là chất chuyên hóa có hoạt tinh ctia phenacetin, có thé thay thế aspirin; tuy vậy, khác với aspirin, paracetamol không có tác dụng chống viêm và thải trừ axit uric, không kích ứng tiêu hóa, không ảnh hưởng đến tiểu cầu và đông máu Với liều ngang nhau tính theo gam, paracetamol có tác dụng giảm đau và hạ sốt tương tự aspirin Paracetamol làm giảm thân nhiệt ở người bệnh sốt, nhưng hiếm khi làm giảm thân nhiệt ở người bình thường Thuốc tác dụng lên vùng dưới đôi gây hạ nhiệt, tỏa nhiệt tăng do giãn mạch và tăng lưu lượng máu ngoại biên Paracetamol với liều điều trị, ít tác động đến hệ tim mạch và hô hấp, không làm thay đổi cân bằng axit — bazo, không gây kích ứng, xước hoặc chảy máu dạ dày như khi dùng salixylat, vì paracetamol không tác dụng trên xyclooxygenat (COX) toàn thân, chỉ tác động đến xyclooxygenat prostaglandin của hệ thần kinh trung ương Paracetamol không có tác dụng trên tiêu cầu hoặc thời gian chảy máu
Khi dùng quá liều paracetamol, một chất chuyển hóa là N- axetylbenzoquinonimin gây độc nặng cho gan Liễu bình thường, paracetamol dung nạp tốt, không có nhiều tác dụng phụ như aspirin Tuy vậy, quá liều cấp tính (trên 10g) làm tổn thương gan gây chết người, những vụ ngộ độc và tự tử bằng paracetamol đã tăng lên một cách đáng lo ngại trong những năm gần đây [4]
Trang 23Dược động học
Hấp thu nhanh qua ống tiêu hóa, sinh khả dụng là 80 — 90%, hầu như không gắn với protein huyết tương Chuyên hóa lớn ở gan và một phần nhỏ ở thận, đo các dẫn xuất glucoro và sulfo-hợp, thải trừ qua thận [4]
Chỉ định
Giảm đau: dùng chữa các chứng đau nông mức độ nhẹ hoặc vừa do bất cứ nguyên nhân gì, như: đau dau, đau răng, đau nhức mình mây, đau cơ xương khớp,
đau bụng kinh
Hạ nhiệt: điều trị các chứng sốt do bất cử nguyên nhân gì, như: viêm khớp, nhiễm khuẩn tai mũi họng, miệng, phế quản-phổi, say nắng, phát ban và truyền nhiễm ở trẻ em, sốt do tiêm chủng
Chống chỉ định
Người bệnh nhiều lần thiếu máu hoặc có bệnh tim, phôi, thận hoặc gan
Người bệnh quá mẫn với paracetamol
Người bệnh thiếu hut glucose-6-phosphat dehydrogenase 1.3.2 Giới thiệu phenylephrine hydrochloride
Trang 24Dược lí và cơ chế tác dung
Phenylephrine hydrochloride là một thuốc tác dụng giống thần kinh giao cảm
œ¡(œ¡-adrenergic) có tác dụng trực tiếp lên các thụ thể a-adrenergic lam co mach
máu và làm tăng huyết áp Tác đụng làm tăng huyết áp yếu hơn norepinephrine, nhưng thời gian tác dụng dài hơn Phenylephrine hydrocloride gây nhip tim cham do phản xạ, làm giảm thể tích máu trong tuần hoàn, giảm lưu lượng máu qua thận, cũng như giảm máu vào nhiêu mô và cơ quan của co thé
Ở liều điều trị, phenyephrin thực tế không có tác dụng kích thích trên thụ thể -adrenergic của tim (thụ thể B¡-adrenergic); nhưng ở liều lớn, có kích thích thụ thé -adrenergic Phenylephrin không kích thích thụ thể -adrenergic của phế quản
hoặc mạch ngoại vi (thụ thể b2-adrenergic) O liéu điều trị, thuốc không có tác dụng
trên hệ thần kinh trung ương
Phenylephrin HCI hấp thụ rất bất thường qua đường tiêu hóa, vì bị chuyển hoá ngay trên đường tiêu hóa thông qua enzyme MAO, nên sinh khả dụng của
thuốc chỉ đạt < 38% Vì thế, có thể tác dụng trên hệ tim mạch thường phải dùng
đường tiêm Sau khi tiêm fĩnh mạch, huyết áp tăng hầu như ngay lập tức và kéo đài 15-20 phút Sauk hi tiêm bắp, huyết áp tăng trong vòng 10-15 phút và kéo dài từ 30
phút đến 1-2 giờ
Khi hít qua miệng, phenylephrine có thể hấp thu đủ để gây ra tác dụng toàn than Sau khi uống, tác dụng chống xung huyết mũi xuất hiện trong vòng 15-20 phút, và kéo dài 2-4 giờ
Sau khi nhỏ dung dịch 2,5% phenylephrine vào kết mạc, đồng tử giãn tối đa vào khoảng 15-60 phút và trở lại như cũ trong vòng 3 giờ Nếu nhỏ dung dịch 10% phenylephrine, đồng tử giãn tối đa trong vòng 10-90 phút và phục hồi trong vòng 3- 7 giờ Đôi khi phenylephrine bị hấp thu đủ để gây tác dụng toàn thân
Để làm giảm sung huyết ở kết mạc hoặc ở mũi, thường dùng các dung
dịch loãng hơn (0,125 — 0,5%) Sau khi nhỏ thuốc vào kết mạc hoặc vào niêm mạc mũi, mạch máu tại chồ hâu như co lại ngay
Trang 25Thời gian tác dụng làm giảm sung huyết sau khi nhỏ thuốc đối với kết mạc hoặc niêm mạc mũi dao động nhiều, từ 30 phút đến 4 giờ Phenylephrin trong tuaàn hoàn có thể phân bố vào các mô với Vd giai đoạn đầu: 26-61 lít và Vd ở trang thái
ổn định: 340 lít Còn chưa biết thuốc có phân bố được vào sữa mẹ không
Phenylephrine bị chuyên hóa ở gan và ruột nhờ enzym monoaminoxidase (MAOQ) nhờ phản ứng oxy hóa khử amin và phản ứng liên hợp với axit gluconIc Nửa đời thải trừ t2 ơ khoảng 5Š phút và 1/2 khoảng 2-3 giờ [4]
Chỉ định e Toàn thân:
Hiện nay thuốc này ít được chỉ định Trước đây, thuốc đã được chỉ định điều trị
giảm huyết áp trong sốc sau khi đã bù đủ dịch, hoặc giảm huyết áp đo gây tê tủy sống hoặc gây tê vùng Phenylephrin có thê dùng đường uống đề điều trị sung huyết mũi
e Tại chỗ:
Nhỏ mắt để làm giãn đồng tử (trong điều trị viêm màng bồ đảo có khả năng gây dính: chuẩn bị trước khi phẫu thuật trong nhãn cầu; để chuẩn đoán)
Nhỏ mũi để làm giảm sung huyết mũi, xoang do bị cảm lạnh
Chồng chỉ định
e Người suy thận nặng
e Người đang lái xe hay điều khiển máy không dùng e Có thê gây tôn thương gan khi dùng liều quá cao 1.3.3 Giới thiệu Clopheniramine Maleate
- Công thức hóa học:C¡¿H¡;CIN;.CuH¿O¿
COOH
`
Trang 26
- Tén: (RS) -3-(4 clorophenyl) - 3 - (2-pyridyl) propyldimethylamin hydrogen maleat
- Tinh chat vat ly:
Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng, không mùi Dễ tan trong nước, tan trong ethanol 96%
Dược lý và cơ chế tác dụng
Clopheniramine là một hỗn hợp đồng phân đối quang có tác dụng kháng histamine, an thần trung bình nhưng cũng có thể kích thích nghịch thường, đặc biệt ở trẻ nhỏ và kháng muscarin Clopheniramin maleat dẫn xuất từ alkylamin là kháng histamine an thần thuộc thế hệ thứ nhất Một đồng phân dextro của thuốc là dexclopheniramin có tác dụng mạnh gấp hai lần Như hầu hết các kháng histamin khác, clopheniramin làm giảm hoặc làm mất các tác dụng chính của histamine trong cơ thể bằng cách cạnh tranh phong bế đảo ngược histamine ở các thụ thê Hạ ở các mô trên đường tiêu hóa, thành mạch và đường hô hấp; thuốc không làm mất hoạt tính của histamine hoặc ngăn cản tổng hợp hoặc giải phóng histamine
Clopheniramin maleat và dexclopheniramin maleat được dùng để điều trị
triệu chứng các bệnh dị ứng như mé day, phù mạch, viêm mũi dỊ ứng, viêm màng
tiếp hợp dị ứng Thuốc là thành phần phổ biến trong nhiều chế phẩm đề điều trị ho, cảm lạnh Tuy vậy, các chế phẩm này phải đùng thận trọng cho trẻ em và thường phải dùng cho trẻ nhỏ dưới 2 tuổi, vì có nguy cơ gây tử vong [4]
Dược động học
Clopheniramin maleat hấp thụ tốt nhưng tương đối chậm vì thuốc chuyền hóa nhiều ở niêm mạc đường tiêu hóa và chuyển hóa bước đầu ở gan khi uống và xuất hiện trong huyết tương trong vòng 30-60 phút Nồng độ đỉnh huyết tương đạt được trong khoảng 2,5 đến 6 giờ sau khi uống Khoảng 25-40% liều đơn vào được tuần hoàn toàn thân dưới dạng thuốc không chuyền hóa Sinh khả dụng thấp, đạt 25- 50% Khoảng 70% thuôc trong tuần hoàn liên kết với protein Thể tích phân bố khoảng 2,5 -3,2 lít/kg (người lớn) và 3,8 lít/kg (trẻ em)
Trang 27Clopheniramin maleat chuyển hóa nhanh và nhiều Các chất chuyển hóa gồm
có desmethyl-didesmethyl-clopheniramin và một số chất chưa được xác định, một
hoặc nhiều chất trong số đó có hoạt tính Nồng độ clopheniramin trong huyết thanh không tương quan đúng với tác dụng kháng histamine vì còn một chất chuyển hóa chưa xác định cũng có tác dụng Thời gian tác dụng của thuốc kéo đài từ 4-6 giờ, ngắn hơn dự đốn so với các thơng số được động Thuốc được bài tiết chủ yếu qua
nước tiểu dưới dang không đổi hoặc chuyển hóa, sự bài tiết phụ thuộc vào pH nước
tiêu tăng và lưu lượng nước tiểu giảm Chỉ một lượng nhỏ được thấy trong phân Người lớn có chức năng gan, thận bình thường nửa đời thải trừ của clopheniramin
dao động từ 12-43 giờ và đối với trẻ em từ 5,2-23,I gio Ở người bệnh suy tận mạn
nửa đời thài trừ kéo dài tới 280-330 giờ Một số viên nén clopheniramin được bảo chế dưới đạng tác dụng kéo dài, dưới đạng viên nén 2 lớp Lớp ngoài được hòa tan và hấp thu giống viên nén thông thường Lớp trong chỉ được hấp thu sau 4-6 giờ Tác dụng của những viên nén kéo đài bằng tác dụng của hai viên nén thông thường, uống cách nhau khoảng 6 giờ [4]
Chỉ định
e Điều trị triệu chứng: Viêm mũi dị ứng mùa và quanh năm, mày đay
e Điều trị sốc phản vệ (điều trị bổ sung)
Chống chỉ định
e Trẻ sơ sinh hoặc trẻ em nhỏ
Các cơn hen cấp
Không thích hợp cho việc dùng ngoài tại chỗ Người bệnh có triệu chứng phì đại tuyến tiền liệt Glaucom góc hẹp
Tắc cổ bàng quang
Loét dạ dày, tắc môn vị-tá tràng
Phụ nữ có thai và cho con bú, trẻ sơ sinh và trẻ đẻ thiếu tháng
Trang 281.4 MỌT SÓ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LUONG PA, PE VA CM
1.4.1 Phương pháp định lượng PA * Phương pháp sắc kí lỏng
Chuẩn bị các đung dịch ngay trước khi đùng và tránh ánh sáng
Pha động: Hỗn hợp gồm 250 thê tích methanol (TT) có chứa 4.6 g/l dung dịch tetrabutylamoni hydroxyd 40% với 375 thể tích dung dich dinatri hydrophotphat 0,05M va 375 thé tích dung dich natri dihidrophotphat 0,05M
Dung dịch thử: Cân chính xác một lượng bột viên tương tương với khoảng 0,2g
paracetamol vào bình định mức 10ml, thêm pha động vừa đủ thể tích, lắc đều, lọc
Dung dịch đối chiếu (1): Pha loãng 1,0 mLdung địch thử thành 20.0 mL bằng pha động Pha loãng 1,0 mL đung dịch thu được thành 20,0 mL bằng pha động
Dung dịch đối chiếu (2): Chứa 0,002% 4-aminophenol (TT) va 0,002%
paracetamol chuân trong pha động
Dung dịch đối chiếu (3): Pha loãng dung dịch chứa 0,02% 4°-cloroacetanilid (TT) trong methanol (TT) bằng pha động đề thu được dung dịch chứa 0.00002% 4'- cloroacetanilid Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25cm x 4,6mm) được nhéi pha tinh B (5 um) Cột Zorbax Rx C8 la phù hợp Nhiét d6 cdt: 35°C Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 245nm Tốc độ dong: 1,5 ml/min Thể tích tiêm: 20 pl Cách tiễn hành:
Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký dung dịch đối chiếu (2), độ phân giải giữa 2 pic tương ứng với 4-aminophenol và paracetamol
Trang 29không nhỏ hơn 4,0 Tiến hành sắc ký dung dịch thử với thời gian bằng 12 lần thời
gian luu cua pic paracetamol Yêu cẩu:
Trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch thử: Pic tương ứng với 4-aminophenol không được có diện tích lớn hơn diện tích pic 4-aminophenol thu được trên sắc ký đồ của dung địch đối chiếu (2) (0,1%) Pie tương ứng với 4°-cloroacetanilid không
được có diện tích lớn hơn diện tích pic chính trên sắc ký đỗ của dung dịch đối chiếu
(3) (Oppm) Bat ki pic tạp nào khác không được có diện tích lớn hơn điện tich pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0.259)
Định lượng:
Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên và nghién thành bột mịn Cân
chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 0,150g paracetamol cho vao
bình định mức 200 mL, thêm 50 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 M, thém 100 mL nước và lắc kỹ 15 min Thêm nước đến định mức, lắc đều Lọc, loại bỏ 20 mL dung dịch đầu Pha loãng 10,0 mL dịch lọc thành 100,0 mL với nước Lấy chính xác 10
mL dung dich này cho vào bình định mức dung tích 100 mL, thêm 10 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 M Pha loãng với nước đến định mức Đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch thu được ở bước sóng 257nm, cốc đo dày I em Dùng dung dịch natri hydroxyd 0,01 M làm mẫu trắng
Cách tiến hành: Chẫm riêng biệt lên bản mỏng 10 uL mỗi dung dịch trên Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 12 cm Lấy bản mỏng ra, để khơ ngồi không khí và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254nm Bắt kỳ vết phụ nào trên sắc ký đồ của dung dịch thử không được đậm màu hơn vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (0,2%) Bỏ qua các vết tại điểm xuất phát [3]
1.4.2 Phương pháp định lượng PE Phương pháp chuẩn độ điện thế:
Một phương pháp chuẩn độ bằng phép đo đơn giản, chính xác và nhanh chóng để xác định phenylephrine-HCI trong các công thức được phẩm bằng cách sử
Trang 30dung tetraiodie bismuth (III) làm chất kết tủa Phương pháp được để xuất dựa trên
sự hình thành liên kết cap ion gitta PE và phức hợp vô cơ, bismuth (II) để tạo thành kết tủa màu đỏ cam của PE và độ dẫn điện của dung dịch cặp ion được đo như là
một hàm của thê tích chất chuẩn độ Các yếu tố khác nhau ảnh hưởng đến phản ứng
đã được đánh giá để có được kết quả tốt nhất Thuốc được nghiên cứu được đánh
giá trong nước khử ion trong khoảng 0.4 — 2.5 mg (85050g/ml) PE [27] 1.4.3 Phương pháp định lượng CM
*Phương pháp sắc kí lỏng
Dung dịch đệm: Hòa tan I1,5g amoni dihydrophotphat (TT) trong nước, thêm 1mL axit phosphorie (ET) và pha loãng với nước thành 1000 ml
Pha dong: Acetonitril — dung dịch đệm (20:80) Diéu chinh tỷ lệ nếu cần
Dung địch chuẩn: Hòa tan một lượng clorpheniramin maleat chuẩn trong pha động để thu được dung địch có nồng độ khoảng 0.08mg/ml
Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên và nghiền thành bột mịn Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 4 mg clorpheniramin maleat vào bình định mức 50 mL, thêm 30 mL pha động và lắc siêu âm khoảng 10 min Pha loãng bằng pha động vừa đủ đến vạch và trộn đều Lọc.4 Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25em x 4.6mm) được nhồi pha tĩnh C (10um) Nhiệt độ cột: 30%C Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 262nm Tốc độ dong: 1,0 ml/min Thể tích tiém: 10 pL Cách tiễn hành:
Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống Tiến hành sắc ký đối với dung dịch chuẩn Thứ tự rửa giải lần lượt là acid maleie, clorpheniramin không nhỏ hơn 4000
Tiên hành sắc ký lần lượt đối với dung dịch và dung dịch thử
Trang 31Tinh ham lượng clorpheniramin maleat C¡¿H;¡¿CINa.CuH¿OÒ¿, có trong viên dựa
vào diện tích pic clopheniramin thu được từ sắc ký đồ của dung dịch thử, đung dich
chuẩn và hàm lượng C¡¿H¡;CIN;.C„H¿O¿ trong clorpheniramin maleat chuẩn [4]
1.4.4 Phương pháp xác định đồng thời PA, PE và CM 1.4.4.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Diéu kiện HIPLC
- May HPLC Hitachi L-2000 với detector UV-VIS L-2420 - Cột phân tích C18 (Inertsil ODS-3250mm x 4.6)
- Bộ lọc dung môi và mẫu với đường kính lỗ màng lọc 0.45um - Máy lắc siêu âm, máy đo pH
- Pha động là đệm diphotphat 0.05M: acetonitrile (tỉ lệ thê tích 93:7)
- Đệm điphotphat được chuẩn bị bằng cách hòa tan 6.4g NaH;PO, trong 1 lít nước cất 2 lần Sau đó lắc siêu âm trong 10 phút Độ pH của dung dịch được điều chỉnh bằng 4.0 với axit photphorie thu được hỗn hợp dém diphotphat 0.05M Pha hỗn hợp đệm diphotphat 0.05M và acetonitrile theo tỉ lệ 93:7 về thể tích rồi lọc qua màng lọc 0.45um sau đó rung siêu âm để khử bọt khí
Thể tích bơm mẫu là 20uL, tốc độ dòng chảy pha động 1.5uL⁄phút ở nhiệt độ
30°C, tín hiệu được đo quang trên detector UV-VIS L-2420 tại bước sóng 2l5nm Chuẩn bị các mâu chuáđn:
Pha các dung dich chudn CM 2ug/mL, PE 7.5ug/mL va PA 500ug/mL trong bình định mức 25mL bằng hỗn hợp nước cất và dung dịch pha loãng là dung dich pha loãng với tỉ lệ thể tích là 24:1 (dung địch pha loãng là đung dịch hỗn hợp đệm diphotphat 0.05M: acetonitrile voi ti 1é thể tích là 1:1) Dung dịch pha xong được rung siêu âm và lọc qua mang loc 0.45um
Chuẩn bị các mẫu thật:
Cân chính xác 20 vien thuốc TIFFY (mỗi viên có 500mg PA, 2mg CM và 7.5mg PE), sau đó tính khối lượng trung bình của viên và nghiền thành bột mịn
Trang 32Cân chính xác một lượng bột thuốc tương đương với 100 mg PA, 0,4 CM và 1.5 mg PE cho vào bình định mức 100 mL sau đó định mức bằng dung địch pha loãng và rung siêu âm trong 15 phút Hút 12.5 mL dung dịch vừa pha vào bình định mức 25 mL và định mức bằng dung dịch có chứa PA 500 ug/mL; CM 2 ug/mL va PE 7.5 ug/mL Loc dung dịch qua màng lọc 0.45 um [8], [12], [29]
1.4.4.2 Phuong phap quang phé (PCR, PLS1 va PLS2)
*Diéu kién
- Bộ máy và phần mềm máy quang phố GBC Cintra 101 chim tia kép, với
các tế bào thạch anh 1 em, tố độ quét 1000nm tối thiểu và độ rộng khe 2nm được sử
dung dé thu thập phô hấp thụ UV-VIS được số hóa Phổ UV của hỗn hợp được ghi lại trong bước sóng 200-400nm với một điểm dữ liệu trên mỗi nanomet Chúng được lưu ở dạng ASCII và được chuyển sang máy vi tính Pentium (IV) đề chạy các chương trình
- Máy đo pH Metrohm 691
*Chuẩn bị mẫu chuẩn
- PA, PE và CM từ công ty dược phẩm Rouz Darou *Chuẩn bị mẫu thực
- Thuốc Cold, số lô D.259, hàm lượng PA=325mg, PE=5mg và CM=2mg
- Cân 20 viên thuốc được nghiền thành bột và trộn Một lượng bột tương đương với một viên được cân chính xác và chuyển vào bình định mức sử đụng methanol: 0,1M HCI (3:1) và hòa tan bằng cách lắc cơ học trong 30 phút Dung
dịch được lọc vào bình định mức 100ml qua giấy lọc Whatman số 42, pha loãng với
cùng dung môi, sau đó điều chỉnh thành thể tích 100ml [21]
1.4.5 Một số thuốc trên thị trường chứa đồng thời 3 chất PA, PE và CM trên
thị trường
Hiện nay, trên thị trường lưu hành 2 loại thuốc chứa cả ba thành phần trên, được sử dụng để diéu tri cảm cúm, sốt, nhức đầu, nghẹt mũi, sung huyết mii Hai loại thuốc đó là:
Trang 33- Decolgen fort co ham lượng : 500mg PA, 10mg PE, 2mg CM - Tiffypey co ham lượng : 500mg PA, 10mg PE, 2mg CM
Ở để tài này chúng tôi chọn đối tượng nghiên cứu là mẫu thuốc Tiffypey dé phân tích thành phần bằng phương pháp CLS dùng phổ toàn phần
Trang 34Chuong 2 NOI DUNG VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU
2.1 DOI TUONG NGHIEN CUU
Thuốc TIFFY Dey sản xuất tại công ty TNHH Thái Nakorn Patana — Viét
Nam, dạng viên nén, SDK: VNB — 4671-05, ngày san xuất: 16/10/2018, hạn dùng: 15/10/2023 số lô sản xuât: 2531018 Thanh phan: Mỗi viên nén chứa: + Paracetamol :500mg + Phenylephrine HCI :l0mg + Clopheniramine Maleate :2mg
+Ta dược vira du: Pregelatinized srarch, Povidone K-90, Natri Starch
Glycolate, Magnesi Stearate, Tartrazine dye 2.2 NOI DUNG NGHIEN CUU
Mục đích của luận văn là nghiên cứu phương pháp trắc quang —
chemometrics để xác định đồng thời hàm lượng của 3 hoạt chất PA và PE và CM
trong thuốc viên nén
Đề tài gồm những nội dung nghiên cứu cụ thê sau:
2.2.1 Khảo sát điều kiện thí nghiệm
2.2.2 Xây dựng quy trình để xác định hàm lượng của 3 hoạt chất PA, PE, CM trong thuốc viên nén bằng phương pháp trắc quang — chemometrics dùng phổ toàn phần
2.2.3 Áp dụng quy trình đã xây dựng để định lượng PA, PE, CM trong thuốc TIFFY Dey ban trên thị trường
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Áp dụng phương pháp trắc quang — chemometrics đùng phổ toàn phần để xác dinh PA, PE, CM
Trang 352.3.1 Quy trình đo và tính toán nồng độ của PA, PE, CM
Quy trình đo và tính nông độ của PA, PE, CM được tiến hành
Bước I: Chuan bị các dung dịch chuân của mỗi câu tử cân xác định và các
dung dịch hỗn hợp của chúng
Bước 2: Quét phô hấp thụ của các dung dịch trong khoảng bước sóng thích
hợp, lưu và truy xuất số liệu đo được ( Export data) voi file dang “ txt”
Bước 3: Dựa vào dữ liệu phố đề tính toán nồng độ các cấu tử trong dung dịch hỗn hợp và sai số của chúng
2.3.2 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp:
Việc đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích là một trong các yêu cầu bắt buộc khi triển khai một phương pháp phân tích Độ tin cậy của phương pháp
được đánh giá thông qua các đại lượng thống kê như : độ lặp lại, độ đúng 2.3.2.1 D6 lap lai Độ lặp lai được đánh giá qua gia tri độ lệch chuẩn ( S) hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD) — Ji-¡œi-3” S Pe (2.1) 5.100 RSD(%)= — (2.2) Trong do:
© x;: giá trị nồng độ tính được tại lần đo thứ ¡ (ug/mL) eX : giá trị trung bình của nồng độ sau n lần đo (ug/mL) en: số lần thí nghiệm
Khi định lượng chất phân tích có một nông độ xác định, có thể ước lượng sai
số giá trị định lượng ( giá trị đó có được chấp nhận hay không ) bằng cách dựa vào phương trình Horwitz ( RSDy) theo công thức (2.3)
Trang 36RSDy (%) = 20-05#196) (2.3)
Trong do:
C: là nồng độ ( được biểu diễn đưới dang phan sé)
RSDg : độ lệch chuẩn tương đối khi xác định chất phân tích có nông độ C đó
ở các phòng thí nghiệm khác nhau ( dùng bất kỳ phương pháp phân tích nào ) Khi
phân tích chất có nồng độ C trong nội bộ phòng thí nghiệm, nếu đạt được độ lặp lại
RSD(%)<RSD pry = 1⁄2 RSD„ là chấp nhận được 2.3.2.2 D6 dung
Độ đúng của phương pháp có thê xác định được qua độ thu hồi (Rev) khi
phân tích mẫu thật đã thêm chuẩn một lượng xác định chất cần phân tích
Công thức tính độ thu hồi Cr~Ca a Rev(%) = 100 (2.5) Trong do:
a: nồng độ của chất chuẩn thêm vào mẫu (ng/mL)
Cr: nồng độ chất xác định được trong mẫu sau khi thêm chuẩn (g/mL) C€„: nồng độ chất xác định được trong mẫu khi chưa thêm chuẩn (ug/mL) So sánh với phương pháp tiêu chuẩn HPLC
So sánh giá trị trung bình với giá trị thực bằng cach so sanh gia tinh Va thang Néu tinn<toang=> két quả hai phương pháp là như nhau
Nếu tưnh> tbáng> kết quả hai phương pháp là không giống nhau 2.3.3 Xử lí và kiểm tra số liệu thực nghiệm:
2.3.3.1 Khoảng tin cậy của kết qua sé liệu nghiên cứu
= =x.tŒ/)s
x+E=X vă (2.6)
Trang 37Trong do:
e X la gid tri trung binh cha két quả nghiên cứu sau n thí nghiệm
e t(P.f): gia tri cua chuẩn Student với độ tin cay P=0,95 va bac tu do f=n-1 e S: độ lệch chuẩn được tính theo công thức (2.1)
2.4 DUNG CU VA HOA CHAT:
2.4.1 Dung cu:
- May quang phd UV-VIS hiéu Jasco V-630+UV/VIS Spectrometer cia
Trung tâm Hóa học và ứng dụng Đại học Khoa học Huế - Đại học Huế có khả năng
quét phổ nhanh trong khoảng bước sóng từ 190-990 nm, kết nối với máy tính và phần mềm Spectra Manager có khả năng Import/Export Data đưới dạng file “.txt” 6
dạng 2 cột (bước song và độ hấp thụ)
- Các thiết bị và dụng cụ khác: Cân phân tích hiệu Precisa XB 2204 độ chính xác 0,0001 g; Máy cất nước hai lần bằng thạch anh, hiệu Fistreem Cyclon
và Aquatron; Micropipet 100 ul, 1000u1 cia hang HTL; Cac dung cu thuy tinh:
pipet, binh định mức, céc, binh tam giác nút nhám, đũa thủy tinh, giấy lọc, phéu
thy tinh,
2.4.2 Hóa chất
NaOH tinh thé
Chat chudn Paracetamol, Phenylephrine HCl, Clopheniramine Maleate : B6
y tế - Viện kiểm nghiệm thành phố Hồ Chí Minh
Pha các dung dịch gốc PA 100ug/mL trong dung dịch NaOH 0,1M bằng
cach cho 10mg 14n luot cdc chat chudn vao binh dinh mitc 100mL, thém NaOH vào, lắc đều, định mức đến vạch bằng dung dịch NaOH 0,1M
Dùng pipet lấy chính xác 25mL dung dịch gốc cho vào bình định mức
100mL, định mức đến vạch bằng dung dịch NaOH 0,1M, lắc đều được dung dịch
Trang 38Chuong 3 KET QUA VA THAO LUAN
3.1.KHAO SAT VA CHON DIEU KIEN THi NGHIEM THÍCH HOP
3.1.1 Khảo sát phố hấp thụ của PA, PE và CM
Theo [4], [25] cả ba hoạt chất PA, PE, CM đều tan được trong dung môi
NaOH 0,1 M và độ hấp thụ của chúng trong dung môi này ổn định Do vậy, chúng
tôi chọn dung môi NaOH 0,IM làm dung môi hòa tan cho quá trình xác định PA,
PE, CM bằng phương pháp trắc quang - chemometrics
Các dung môi chuẩn của PA, PE, CM được pha như sau:
- Dùng pipet lấy chính xác 10uL dung dich trung gian cho vào bình định
mức 100mL, định mức đến vạch bằng NaOH, lắc đều được dung dịch chuẩn PA
10ug/mL, PE 10ug/mL, CM 10ug/mL
- Quét phổ hấp thụ dung dich chuan PA 10ug/mL, PE 10ug/mL, CM 10ug/mL Phố hấp thụ của đung dịch chuân PA, PE, CM trong dung môi NaOH ở khoảng bước sóng từ 225+320 nm được biểu diễn ở hình 3.1 A 0.8, PA 10 mg/mL PE 10 mg/mL, 0.7 CM 10 mg/mL 0.6) 0.5) 0.4 0.3) 0.2 0.1 0.0 240 260 280 300 320 A (am)
Hình 3.1 Phô hấp thụ của dung dịch chuẩn PA 10ug/mL, PE 10ug/mL, CM 10ug/mL trong dung môi NaOH 0,1M
Trang 39Nhan xét:
Hình 3.1 cho thay phé hap thu ctia cdc dung dich chuan PA 10ug/mL, PE 10ug/mL, CM 10ug/mL trong dung m6i NaOH xen phu nhau 6 khoang budc song tir 225+320 nm
3.1.2 Khảo sát tính cộng tính độ hấp thụ của dung dịch hỗn hợp PA, PE và
CM trên phố hấp thụ
Khi áp dụng phương pháp quang phô hấp thụ phân tử đề định lượng các chất, một yêu cầu quan trọng là phải kiểm tra tính chất cộng tính độ hấp thụ của dung dịch chứa tất cả các câu tử cần xác định trên toàn bộ vùng phổ nghiên cứu
Vì vậy, tôi tiến hành khảo sát tính cộng tính độ hấp thụ của PA, PE và CM
trong dung dịch hỗn hợp của chúng Cách tiến hành như sau:
- Pha cdc dung dich chuan PA 5 pg/mL, PE 5 pg/mL, CM 5 pg/mL va dung dịch hỗn hop PA 5 pg/mL, PE 5 ug/mL va CM 5 pg/mL từ các dung dịch làm việc trung gian PA 25 pg/mL, PE 25 ug/mL va CM 25ug/mL
- Quét phổ hấp thụ phân tử các dung địch này trong đung môi NaOH 0,1M ở khoảng bước sóng 225 + 320 nm, khoảng cách bước sóng ghi phổ là 0,5 nm
Tại mỗi bước sóng, cộng giá trị độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn PA 5
ug/mL, PE 5 pg/mL va CM 5 pg/mL ta duoc gia tri tông độ hấp thụ của dung dich hén hop PA 5 pg/mL PE 5 ug/mL va CM 5 g/mL theo lý thuyết (A„) Dựa vào giá
tri tong do hap thu của dung dich hén hop theo thuc té do duoc (A,,), ta tinh duoc
sai số tương déi RE (RE%= "¬ 100)
Từ đó, có thể khảo sát được tính cộng tính độ hấp thụ của dung dịch hỗn hợp PA, PE và CM Kết quả xác định và sai số tương đối được trình bày 6 phu luc 1, co
các gid tri sai sé6 RE(%)<7% Phé hap thu phan tử cla cdc dung dich PA 5 pg/mL, PE 5 pg/mL, CM 5 pg/mL va dung dich hon hop PA 5 pg/mL, PE 5 pg/mL va CM 5
ug/mL được thể hiện ở hình 3.2
Trang 400,7 - 4 — 1 PAS —— 2 PE5 ——3 CM5 — 4, PA5+PE5+CM5 (LT) —5 PA5+PE5+CM5 (TT) 0,63 0,53 0,44 0,3 - 0,23 0,13 0,0 240 260 280 300 320 Wavelength (nm)
Hình 3.2 Phô hấp thụ phân tử của các dung dịch PA 5 ug/mL, PE 5 ng/mL, CM 5 pg/mL va dung dich hén hop PA 5 pg/mL, PE 5 pg/mL va CM 5 pg/mL Nhận xét: Từ hình 3.2 và kết quả ở phụ lục 1, nhận thấy phô hấp thụ của các dung dịch chuẩn PA, PE và CM xen phủ nhau và độ hấp thụ quang của hai chất có tính chất cộng tính ở khoảng bước sóng 225 + 320 nm Vì vậy, chúng tôi chọn vùng bước sóng 225 + 320 nm dé khao sát các thí nghiệm tiếp theo
3.1.3 Khảo sát độ ổn định phố hấp thụ của dung dịch hỗn hợp của PA, PE,
€M (fỉ lệ PA:PE:CM= 5:5:Š (ng/mL)) theo thời gian Cách tiến hành:
- Pha dung dich hén hop PA 5,0 g/mL, PE 5,0 ug/mL và CM 5,0 pg/mL từ các dung dịch làm việc PA 25 ug/mL, PE 25 pg/mL va CM 25 ug/mL
- Quét phổ hấp thụ của dung dich hén hop PA 5,0 pg/mL, PE 5,0 ug/mL va CM 5,0 ug/mL 6 khoang budc song 225+320nm trong thoi gian 120 phut, voi khoảng các lần đo khác nhau
Phổ hấp thụ của dung dịch hỗn hợp PA 5,0 ug/mL, PE 5,0 pg/mL và CM 5,0 ug/mL theo thời gian được biêu diễn ở hình 3.3