Đa dạng di truyền bộ sưu tập giống ca cao (theobroma cacao l ) việt nam và khảo sát chất lượng hạt ca cao tại đak lak và bến tre

Đa dạng di truyền bộ sưu tập giống ca cao (theobroma cacao l ) việt nam và khảo sát chất lượng hạt ca cao tại đak lak và bến tre Đa dạng di truyền bộ sưu tập giống ca cao (theobroma cacao l ) việt nam và khảo sát chất lượng hạt ca cao tại đak lak và bến tre Đa dạng di truyền bộ sưu tập giống ca cao (theobroma cacao l ) việt nam và khảo sát chất lượng hạt ca cao tại đak lak và bến tre

GIỚI THIỆU

Đặt vấn đề

Ca cao (Theobroma cacao L.) là cây công nghiệp có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao, với chất lượng hạt thơm ngon, đặc biệt từ các nước như Ghana, Indonesia, và Brazil Hạt ca cao Việt Nam ngày càng được chú ý về sản lượng và chất lượng xuất khẩu Các tập đoàn như Marou, Cargill, Trọng Đức, và Vinacacao đang đầu tư mạnh mẽ vào sản xuất ca cao tại Việt Nam, trong đó Vinacacao đã đầu tư hơn 40 triệu USD cho nhà máy tại Bến Tre và chiếm thị phần lớn nhất trong nước, đồng thời xuất khẩu sang Hàn Quốc, Trung Quốc và các Tiểu vương Quốc Ả Rập Tỉnh Đắk Lắk hiện có trên 2.000ha trồng ca cao, với năng suất bình quân đạt 10 tạ/ha, sản lượng hàng năm khoảng 2.000 tấn Mặc dù diện tích trồng ca cao không tăng, nhưng số lượng doanh nghiệp nhỏ sản xuất sản phẩm ca cao chất lượng tại Việt Nam đang gia tăng.

Chất lượng hạt ca cao khô phụ thuộc vào nguồn gốc di truyền của cây ca cao, bao gồm các nhóm Criollo, Forastero và lai Trinitario Tại miền Nam Việt Nam, có 63 dòng ca cao được trồng và nghiên cứu nhằm tạo ra giống phù hợp với điều kiện thổ nhưỡng và khí hậu của Bến Tre và Đắk Lắk Tuy nhiên, việc phân loại và xác định tính trạng di truyền của các giống ca cao Việt Nam, đặc biệt là sự đa dạng di truyền qua hình thái thực vật và chỉ thị phân tử, vẫn chưa được công bố Do đó, việc xác định giống nào thuộc nhóm Criollo hay Forastero là vấn đề quan trọng trong công tác chọn giống ca cao hiện nay.

Công tác di truyền chọn giống và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình lên men và sấy hạt ca cao là rất quan trọng để tạo ra sản phẩm hạt khô chất lượng cao, đáp ứng yêu cầu chế biến và xuất khẩu Nghiên cứu được thực hiện trên ba giống ca cao năng suất cao TD3, TD5 và TD8, đã được Bộ NN&PTNT công nhận Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu trước đây không phân loại riêng lẽ từng giống ca cao, dẫn đến việc không xác định được điều kiện tối ưu cho quá trình lên men và sấy Đề tài này sẽ khảo sát các điều kiện lên men và sấy nhằm tạo ra sản phẩm hạt ca cao khô chất lượng, được trồng tại hai tỉnh Bến Tre và Đắk Lak, đồng thời theo dõi sự thay đổi của các chỉ tiêu quan trọng trong quá trình này.

Các nghiên cứu về quá trình lên men và sấy hạt ca cao đã được thực hiện trong điều kiện tự nhiên, sử dụng phương pháp ủ tự nhiên và sấy bằng ánh sáng mặt trời Tuy nhiên, việc kiểm soát chất lượng trong điều kiện này gặp khó khăn do phụ thuộc vào thời tiết, trong khi hạt ca cao có thể được thu hoạch quanh năm Để khắc phục vấn đề này, các thí nghiệm đã được tiến hành trong môi trường có kiểm soát với thiết bị lên men và sấy, cho phép điều chỉnh nhiệt độ và thời gian Kết quả mong muốn sẽ giúp quy trình lên men và sấy hạt ca cao diễn ra hiệu quả hơn, giảm lãng phí nguyên liệu và thuận lợi cho chế biến hạt khô ca cao quanh năm Việc trồng giống ca cao chất lượng cao và sử dụng nhiệt độ tối ưu trong quá trình lên men và sấy sẽ góp phần nâng cao sản lượng và chất lượng hạt ca cao khô tại Việt Nam trong tương lai.

Mục tiêu nghiên cứu

1 Làm rõ sự đa dạng di truyền của bộ sưu tập cây ca cao Việt Nam (63 dòng) dựa vào hai (02) khảo sát: đặc tính hình thái thực vật và chỉ thị phân tử.

2 Xác định nhiệt độ lên men và nhiệt độ sấy tối ưu của 03 giống hạt ca caoTD3, TD5 TD8 phục vụ cho sản xuất hạt ca cao chất lượng tại Đắk Lắk và Bến Tre.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu này tập trung vào sáu mươi ba (63) dòng ca cao, mỗi dòng đại diện cho một giống nông học đã được lai tạo và trồng thuần dưỡng tại địa phương Các mẫu được ký hiệu theo tên nguồn gốc xuất xứ, bao gồm TD, CT, Man, LCTEEN, SCA, NA, và MA.

Nghiên cứu đã tiến hành ly trích DNA từ 63 giống cây nông học và xây dựng cây di truyền phả hệ bằng ITS 1-4 để ghi nhận mối quan hệ di truyền của bộ sưu tập giống ca cao Việt Nam Tiếp theo, thí nghiệm được thực hiện với 8 giống ca cao đầu dòng do Bộ NN và PTNT công bố năm 2009, trong đó chọn ra 3 giống năng suất cao nhất (TD3, TD5, TD8) để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men và sấy hạt ca cao Mục tiêu là tìm ra yếu tố tối ưu cho quá trình lên men và sấy nhằm nâng cao chất lượng hạt ca cao khô phục vụ chế biến và xuất khẩu Ngoài ra, nguồn phế phẩm từ quy trình lên men, cụ thể là dịch rỉ, cũng được sử dụng trong nghiên cứu.

Nghiên cứu này tập trung vào sáu mươi ba giống ca cao nông học được trồng tại các vùng ca cao của Việt Nam, bao gồm Tây Nguyên, Đồng Nai, Bến Tre và Cần Thơ Các mẫu hoa và lá non đã được thu thập vào buổi sáng để xây dựng hệ thống phân loại hình thái và cây di truyền phả hệ cho bộ sưu tập giống ca cao Việt Nam Trái ca cao tươi từ ba dòng giống được thu hái vào mùa cao điểm từ tháng 09 đến tháng 12 tại Đắk Lắk và Bến Tre Nghiên cứu cũng thiết lập các thông số quy trình lên men và sấy nhằm tạo ra hạt ca cao khô chất lượng, phục vụ cho chế biến và nâng cao sản lượng xuất khẩu.

Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện với 02 nội dung sau:

Nội dung 1: Khảo sát làm rõ đa dạng di truyền bộ sưu tập 63 giống cây ca cao Việt

Nam (bằng khảo sát hình thái thực vật và khảo sát cây di truyền phả hệ).

Nội dung 1.1: Khảo sát đa dạng về hình thái thực vật của bộ sưu tập 63 giống ca cao nông học.

Nội dung 1.2: Xây dựng cây di truyền phả hệ bằng đoạn mồi ITS1-4

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men và sấy hạt ca cao của ba giống TD3, TD5, TD8 được thực hiện bằng thiết bị lên men và sấy được kiểm soát hoàn toàn về nhiệt độ và thời gian Nghiên cứu này nhằm tối ưu hóa quy trình sản xuất hạt ca cao, đảm bảo chất lượng và hương vị tốt nhất cho sản phẩm cuối cùng.

Nội dung 2.1: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men hạt

Nội dung 2.2: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sấy hạt

Nội dung 2.3: Xây dựng quy trình lên men dịch rỉ hạt ca cao

Ý nghĩa của luận án

Bài viết cung cấp thông tin chi tiết về bộ sưu tập 63 giống cây ca cao đang được trồng tại Việt Nam, được phân loại theo các nhóm chính như Criollo, Forastero và Trinitario Thông tin này nhằm hỗ trợ công tác nghiên cứu và lai tạo giống ca cao chất lượng, với mục tiêu nâng cao sản lượng và cải thiện hương vị hạt ca cao.

Công bố dữ liệu về bộ gen các giống ca cao Việt Nam và thiết lập cây di truyền phả hệ giúp mô tả mối quan hệ di truyền trong bộ sưu tập ca cao của đất nước.

Xây dựng quy trình lên men và sấy hạt ca cao khô chất lượng là yếu tố quan trọng trong chế biến và xuất khẩu hạt, nhằm nâng cao giá trị sản phẩm và thúc đẩy nền kinh tế nông nghiệp Quy trình này không chỉ đảm bảo hạt ca cao đạt tiêu chuẩn chất lượng cao mà còn góp phần phát triển bền vững cho ngành nông nghiệp địa phương.

- Góp phần cải tiến chất lượng hạt ca cao trong quy trình sơ chế ca cao ở quy mô nông hộ, nâng cao giá trị hạt ca cao thành phẩm.

Việc tận dụng phế phẩm từ quá trình chế biến thực phẩm là một nhiệm vụ quan trọng hiện nay, giúp nâng cao giá trị dinh dưỡng của thực phẩm và đồng thời giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

- Phân loại 63 giống ca cao Việt Nam thành 03 nhóm giống ca cao, xây dựng cây phả hệ di truyền, trình tự gen của 63 giống ca cao Việt Nam

- Xây dựng thông số kỹ thuật kiểm soát đối với quá trình lên men và sấy hạt ca cao đạt yêu cầu (nhiệt độ và thời gian).

Kết quả nghiên cứu sẽ được chuyển giao kỹ thuật trực tiếp cho các nông hộ trồng và sơ chế ca cao thông qua sự hỗ trợ của các cán bộ khoa học kỹ thuật tại địa phương.

Những điểm mới của luận án

Luận án đã hoàn thành việc phân loại 63 giống ca cao thành 03 nhóm chính: Criollo, Forastero và Trinitario Kết quả nghiên cứu không chỉ thúc đẩy công tác lai ghép tạo giống ca cao năng suất mà còn cung cấp dữ liệu di truyền phân tử cho bộ sưu tập giống ca cao Việt Nam Đây là lần đầu tiên có công bố về phân loại thực vật cho 63 giống ca cao tại các vùng trồng năng suất cao nhất Việt Nam, với thông tin chi tiết về hình thái thực vật của từng giống Hơn nữa, cây di truyền phả hệ của bộ sưu tập giống ca cao Việt Nam đã được xây dựng thông qua phương pháp phân tích di truyền phân tử.

Để tạo ra hạt ca cao khô chất lượng phục vụ chế biến sản phẩm từ ca cao và nâng cao sản lượng xuất khẩu, việc thiết lập các thông số về nhiệt độ và thời gian trong quy trình lên men và sấy là rất quan trọng Các thông số này cần được kiểm soát hoàn toàn, không phụ thuộc vào nhiệt độ ngoài tự nhiên Mục tiêu là kiểm soát hiệu quả nhiệt độ và thời gian trong quá trình lên men và sấy, từ đó tạo ra hạt ca cao khô đạt tiêu chuẩn Ngoài ra, quy trình cũng nên tận dụng dịch rỉ ca cao để phát triển sản phẩm thức uống tốt cho sức khỏe.

Tận dụng phế phẩm từ quy trình sản xuất không chỉ đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng thiết yếu mà còn giúp tăng thu nhập và giảm ô nhiễm môi trường.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương tiện nghiên cứu

3.1.1Thời gian và địa điểm

-Đề tài được thực hiện từ 01/2018 đến 12/2021.

Trong thí nghiệm 01 về hình thái và di truyền, mẫu lá, trái và hoa ca cao được thu thập từ các vùng trồng ca cao bằng túi nilong và giấy ghi nhãn, cùng với việc sử dụng máy ảnh kỹ thuật số Canon 2100 (Nhật Bản) để ghi lại hình ảnh Dữ liệu được thu nhận tại LAB thực vật thuộc Khoa sư phạm, Đại học Cần Thơ.

Bảng 3.1 Kí hiệu giống và nơi thu thập

Mã giống Số lượng Nguồn gốc Nơi thu thập

CT1-CT9 7 Colombia Cần Thơ

Các giống TD lai ghép 11 Việt Nam Trảng Bom

ICS/PA/NA/AMAZ/IMC/UIT 16 Peru Đồng Nai

TD du nhập (TD1-TD14) 14 Malaysia Bến Tre

EET/SIAL/MO/APA/POUND/MAN 15 Trinidad/Ecuador ĐắkLắk

Trong thí nghiệm thứ hai, trái ca cao chín từ ba giống TD3, TD5 và TD8 đã được thu mua từ các hộ trồng ca cao tại Châu Thành, Bến Tre và Eauka, Đắk Lắk Quá trình thí nghiệm bao gồm việc lên men và sấy hạt tại bộ môn Công nghệ Thực phẩm của Đại học Cần Thơ.

3.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất:

Thiết bị, dụng cụ, hóa chất của nghiên cứu này được tiến hành theo từng nhóm công việc như sau:

Ghi nhận hình thái thực vật bao gồm việc quan sát các cơ quan sinh dưỡng và sinh sản Để thực hiện điều này, chúng tôi sử dụng các thiết bị hiện đại như kính hiển vi Olympus CX41 (Nhật Bản), kính lúp Binocular microscope, và kính hiển vi stereo zoom Motic SMZ-168 Ngoài ra, camera Olympus CX41-C5050 cũng được sử dụng để ghi lại hình ảnh chi tiết của các mẫu vật.

- Phân tích di truyền (ly trích DNA): micropipette, máy ly tâm, máy PCR Thermo

Cycle, máy chụp hình gel Bio-RAD UV, bộ điện di 1 chiều Embi-Tec, tủ đông -20 0 C, tủ ủ, vortex, các kit.

-Hóa chất: CTAB extraction buffer (pH 8.0) : 20 g / l CTAB, 1.4 M NaCl, 0.1 M TRIS ; 0.02 M Na2EDTA ; CTAB precipitation buffer : 5 g / l CTAB, Proteinasease

K, Chloroform, NaCl solution (1.2 M), Isopropanol, 70% ethanol, MQ water.

Bài viết phân tích các chỉ tiêu hóa lý trong thí nghiệm lên men và sấy hạt ca cao, sử dụng bộ phân tích béo Soxhlet, máy đo pH, và cân phân tích Ohuos (Đức) Ngoài ra, các thiết bị như tủ cấy, tủ ủ vi sinh vật, thiết bị sấy và lên men với điện trở điều khiển nhiệt độ và thời gian, cùng hệ thống quạt thổi, đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì điều kiện nhiệt độ và không khí ổn định (Việt Nam - Lab Công nghệ thực phẩm) Cuối cùng, việc sử dụng GCMS giúp đảm bảo độ chính xác trong phân tích.

-Hóa chất : Dung dịch NaOH chuẩn 0.1N; Dung dịch phenolphthalein 1% ;

Na2CO3 ;CaCO3,NaCl; Folin – Ciocalteu ; Methanol ; Ethanol ; Axit acetic ; Ether dầu hỏa 60 – 90, Nutrient agar, MRS agar, Czapek-Dox Agar, Yeast extract,Pepton.

Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu

Nội dung 01 :Khảo sát hình thái thực vật và di truyền phân tử

1.1 : Khảo sát hình thái thực vật

Bài nghiên cứu sử dụng 63 giống ca cao thu thập từ các địa phương trồng ca cao khác nhau Sau khi thu thập, mẫu thí nghiệm hình thái thực vật được bảo quản trong thùng lạnh và chuyển về Phòng thí nghiệm hình thái thực vật - Khoa Sinh học để phân tích ngay trong ngày hôm sau Mẫu lá được trích DNA từ 63 giống ca cao và được lưu trữ ở nhiệt độ -18°C để phục vụ cho các phân tích di truyền.

 Mẫu thu thập (63 giống) cho thí nghiệm hình thái thực vật bao gồm:

- Cơ quan sinh dưỡng: lá ca cao (quan sát màu sắc lá non) Lá non và hoa được thu vào thời điểm 6-7 giờ sáng.

Cơ quan sinh sản của hoa ca cao bao gồm nhị, nhụy, bao phấn và lá đài, trong khi trái chín của mỗi giống cũng đóng vai trò quan trọng Nụ hoa ca cao, có kích thước dài 5-6 cm và rộng 3-4 cm, thường được thu hái ngẫu nhiên vào sáng sớm.

Phương pháp giải phẫu và mô tả cấu trúc mô sử dụng nhuộm hai màu son phèn lục iod Carmin alune' 0.1N và Vert de Mirande 0.01N (Easu, 1964; Nguyễn Nghĩa Thìn, 2006) Tiêu bản được đặt trên lame và đậy bằng lamen, sau đó được quan sát bằng kính lúp Motic SMZ-168 Stereo zoom Microscope và kính hiển vi Olympus CX41-C5050 tại PTN Thực Vật- Bm Sinh học-Khoa Sư Phạm-Trường ĐH Cần Thơ Lá đài và bao phấn được chụp bằng kính lúp Binocular microscope trên nền đen (Engels, 1983; Lachenaud et al, 1994) Hạt phấn được quan sát bằng máy Tabletop Microscope TM-1000 (Hitachi High Technology) tại PTN Microscope Electro- BM Môi Trường (Efombagn et al, 2009).

Phương pháp Toxopeus được sử dụng để mô tả đặc tính hình thái của trái (pod), trong đó tiến hành mô tả 4 trái khỏe mạnh, không bị sâu bệnh và đã trưởng thành (Hardy, 1960; Bekele, 2006).

1.2: khảo sát di truyền bằng chỉ thị phân tử

Trong nghiên cứu này, 63 mẫu DNA đã được ly trích và tinh sạch, sau đó được giải trình tự bằng primers ITS1-4 để thiết lập giản đồ phả hệ Quá trình giải trình tự DNA được thực hiện bằng máy giải trình tự ABI XL3130.

(63 trình tự) tại công ty Sinh hóa Phù Sa (Việt Nam)

Nội dung 02: khảo sát chất lượng hạt lên men và sấy

Thí nghiệm 01 và 02: khảo sát chất lượng hạt lên men và sấy

Quy trình sản xuất hạt ca cao khô

Hình 2.19 Quy trình sản xuất hạt ca cao khô (Nguyễn Thị Hiền, 2010)

Thuyết minh phương pháp nghiên cứu từng công đoạn

Nông dân thu hoạch trái ca cao chín từ các giống TD3, TD5, TD8 tại các vườn ca cao Quá trình thu hái được thực hiện cẩn thận nhằm tránh làm dập trái, từ đó giảm thiểu tổn thất và hư hỏng trong quá trình bảo quản.

Trái chín từ ba giống ca cao TD3, TD5 và TD8 được thu hái tại các vườn ca cao ở Châu Thành, Bến Tre và Đắk Lắk Sau đó, trái được vận chuyển về Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông Nghiệp, Trường ĐHCT để tiến hành bóc tách hạt tươi và lên men từng mẻ theo kế hoạch thí nghiệm.

Quá trình lên men ca cao bắt đầu bằng việc cho hạt đã bóc vỏ vào túi vải the, để hạt rỉ bớt dịch quả trong 1 giờ (10%-14%) Việc này giúp tăng độ thông thoáng, tạo điều kiện cho vi sinh vật hiếu khí hoạt động, từ đó giảm axit lactic và tăng axit acetic Sau đó, sử dụng lá chuối lót vào rổ có lỗ thưa để dễ dàng thoát dịch, đồng thời khoét lỗ trên lá chuối để dịch lên men thoát ra ngoài Khối ủ được đậy bằng vải the dày và cho vào tủ ủ Mỗi mẻ ủ sử dụng 5 kg nguyên liệu từ 3 giống TD3, TD5 và TD8, trộn đều theo tỷ lệ 1:1:1 kg, tương đương khoảng 1,5 – 2 kg hạt ca cao.

Mỗi 3 giờ, khối ủ sẽ được đảo trộn và nhiệt độ trong tủ ủ cùng với khối hạt sẽ được đo Nếu có sự chênh lệch so với yêu cầu thí nghiệm, cửa tủ ủ sẽ được mở hé để theo dõi các chỉ tiêu thí nghiệm Sau khi lên men, hạt ca cao sẽ được đưa vào tủ sấy thiết kế đặc biệt với thời gian nghỉ nhằm tối ưu hóa quá trình sấy Đồng thời, cứ mỗi 3 giờ, hạt ca cao sẽ được đảo trộn để đảm bảo hạt khô đều và các chỉ tiêu thí nghiệm sẽ được theo dõi liên tục.

Bảo quản: Sau khi sấy hạt ca cao được cho vào bao bì hút chân không, cho vào thùng giấy carton bảo quản bằng tủ mát.

Thí nghiệm 03: Thí nghiệm lên men dịch rỉ hạt

Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 10 năm 2020 đến tháng 05 năm 2021 tại

Bộ môn Công nghệ Thực phẩm thuộc Khoa Nông Nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ, nghiên cứu quy trình thu hồi dịch rỉ từ hạt ca cao tươi Quá trình này bắt đầu bằng việc ép tách dịch rỉ từ trái ca cao tươi, với khối hạt được ủ kín trong thùng lên men, cho phép dịch rỉ chảy ra dưới thùng với tỷ lệ 10-12% Dịch rỉ này được thu mua hàng sáng từ các công ty chocolate Kimmy và vườn ca cao Mười Cương Để đảm bảo chất lượng, dịch ca cao phải được ép tách bằng dụng cụ sạch trong vòng 10 giờ và ngay lập tức tiến hành lên men để tránh tình trạng lên men không mong muốn.

Giống nấm men sử dụng nấm men thương phẩm Saccharomyces Cerevisiae RV818 của tập đoàn Angel Hàn Quốc.

3.2.2 Phương pháp ly trích DNA: CTAB-Proteinase K (Lam et al., 2015)

- CTAB buffer (pH 8.0) bao gồm CTAB (20 g/L), NaCl (1.4 M), Tris (0.1 M) và

Na2EDTA (0.02 M) CTAB precipitation buffer chứa CTAB (5 g/L) và NaCl (0.04 M). Thêm 1.5 mL CTAB extraction buffer (làm nóng 65ºC) vào 300 mg mẫu và trộn đều. Hỗn hợp ủ 30 phút 65 o C.

- C Bổ sung Proteinasease K (10 àL, 20 U/mg) và tiếp tục ủ 30 phỳt 65 o C Sau ly tõm 10p 12,000 (Microcentrifuge-Eppendorf 5415D), hút lớp dịch nổi trên vào tube mới, bổ sung một lượng tương đương chloroform.

Huyển phù được ly tâm ở tốc độ 12,000 xg trong 15 phút Sau đó, chuyển lớp dịch nổi vào ống ly tâm mới và thêm gấp đôi thể tích của dung dịch CTAB precipitation buffer Tiếp tục ủ ở nhiệt độ phòng trong 60 phút, rồi ly tâm lần nữa trong 15 phút với tốc độ 12,000 xg.

Dịch nổi được hủy bỏ và DNA tủa được hòa tan bằng 350 µL NaCl (1.2 M) Sau đó, bổ sung 350 µL chloroform, huyền phù ly tâm trong 10 phút ở 12,000 xg và pha nước được chuyển vào ống mới Cuối cùng, thêm 0.6 thể tích isopropanol và trộn đảo ngược ống, giữ huyền phù ổn định trong 20 phút.

- Sau khi ly tâm 15p 12,000 xg,dịch nổi được loại bỏ CTAB được hoàn toàn loại bỏ bằng thờm 500 àL ethanol 70% v/v.

- Chất nổi được hỳt bỏ, vệt DNA được hũa tan trong 100 àL của Milli-Q.

3.2.3 Phương pháp PCR Đoạn trình tự ITS

 Mồi forward ITS1 (CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A), Tmh,4 (Gardes and Bruns 1993)

 Mồi reverse ITS4 (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC), Tm = 61.5 (White et al., 1990)

The reaction mixture consists of 20 µL, containing 2 µL of DNA product and 18 µL of master mix The master mix includes 10.2 µL of double-distilled water, 4 µL of 5x GoTaq PCR buffer (Promega), 0.8 µL of each primer (10 µM), 2 µL of dNTPs (5 mM), and 0.2 µL of GoTaq DNA polymerase (5 U).

Cặp mồi ITS1-4 bắt đầu với giai đoạn biến tính DNA ở 95°C trong 5 phút, tiếp theo là 30 chu kỳ gia nhiệt gồm: biến tính DNA ở 95°C trong 1 phút 30 giây, gắn mồi ở 54°C trong 60 giây, và tổng hợp DNA ở 72°C trong 1 phút 30 giây Cuối cùng, phản ứng PCR được kết thúc bằng giai đoạn ổn định sản phẩm ở 72°C trong 7 phút và lưu trữ ở 4°C.

 Chương trình gia nhiệt cho phản ứng PCR bằng máy Gene Amp PCR System 9700.

Phân tích sản phẩm PCR:

Sản phẩm PCR được điện di bằng bộ điện di Bio-RAD kết hợp với PC, sử dụng gel agarose 1.5% trong 1x TAE buffer Sau khi nhuộm với 1 ng/μL ethidium bromide, gel được chụp hình dưới tia UV bằng máy Bio-RAD Gel Doc Hình ảnh băng được phân tích bằng phần mềm Quantity One, và thang chuẩn Lamda Hind III cùng GeneRulerTM100 bp DNA ladder Plus được sử dụng để ước lượng kích thước đoạn DNA.

3.2.4 Phân tích di truyền phả hệ:

Phương pháp phân tích và xử lý kết quả

Nghiên cứu đã ghi nhận 63 mẫu trái ca cao chín, phân tích các đặc điểm hình thái như màu sắc, cấu tạo và hình dạng trái Các tác giả đã phân loại hình thái trái ca cao thành 3 nhóm dựa trên kích thước, hình dạng vỏ và màu quả.

Bảng 3.3 Phân loại nhóm cacao theo hình thái trái và màu lá non (Cuatrecasae, 1964; Hamon P.,

2003; Barley, 2005; Phạm Hồng Đức Phước, 2009; Nguyễn Bảo Vệ, 2011)

Nhóm Đặc điểm hình thái của trái (pod)

Forastero -Amelonado: kích thước và trọng lượng trung bình, da trơn láng, màu xanh.

-Agoleta: trái sần sùi, quả xanh.

- Quả xanh khi non, chín màu vàng Lá non màu xanh nhạt

Criollo -Cundeamor: trái dài và nhọn (elongate), quả màu đỏ, nâu sậm Lá non màu nâu đỏ.

- Lá non: màu đỏ nâu

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lên men đến chất lượng hạt ca cao.

Mục đích: xác định nhiệt độ và thời gian lên men thích hợp thu được hạt ca cao sau lên men đạt chất lượng tốt nhất.

Bố trí thí nghiệm:Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 nhân tố và lặp lại 3 lần.

Nhân tố A: nhiệt độ lên men hạt ca cao ( o C)

Nhân tố B: thời gian lên men hạt ca cao (ngày)

Tổng số đơn vị thí nghiệm: 4 x 5 x 3 = 60 đơn vị thí nghiệm (đvtn).

Chuẩn bị mẫu và đặt vào tủ lên men với các nhiệt độ 35 o C, 40 o C, 45 o C và 50 oC; thu mẫu từ 0 đến 8 ngày và ghi nhận kết quả Trong quá trình lên men, đo nhiệt độ khối ủ ở 3 vị trí khác nhau và lấy mẫu để phân tích độ ẩm, pH, axit tổng, hàm lượng lipit, hàm lượng axit béo tự do và vi sinh vật.

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian sấy đến chất lượng hạt ca cao

Nhân tố C: Nhiệt độ sấy hạt ca cao ( o C)

Tổng số đơn vị thí nghiệm: 4 x 3 = 12 đơn vị thí nghiệm

Sau khi ủ tối ưu, tiến hành lấy mẫu sấy ở các mức nhiệt độ 40°C, 45°C, 50°C và 55°C cho đến khi hạt đạt độ ẩm tối ưu dưới 7% theo tiêu chuẩn hạt ca cao khô Trong quá trình sấy, cần lấy mẫu để phân tích các chỉ tiêu hóa lý.

3.3.4 Khảo sát dịch rỉ của hạt ca cao

Sau khi thu nhận dịch cacao, tiến hành kiểm tra độ Brix và pH, điều chỉnh dịch quả đạt độ Brix = 24 o Bx và pH = 4 Dịch quả sau đó được chuẩn bị cho quá trình lên men bằng các phương pháp lên men khác nhau.

Thí nghiệm được thiết kế ngẫu nhiên với một nhân tố và được lặp lại 3 lần, sử dụng thông số tối ưu từ thí nghiệm trước làm nhân tố cố định cho thí nghiệm tiếp theo Tổng số nghiệm thức là 3, dẫn đến tổng số đơn vị thí nghiệm là 9 (3 x 3) Đối với thí nghiệm với 02 nhân tố, tổng số đơn vị thí nghiệm là 18 (2 x 3 x 3).

3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu

-Phương pháp xử lý số liệu sinh học phân tử (mục 3.2.4)

Phương pháp xử lý số liệu hóa lý và vi sinh bao gồm việc tính toán thống kê, phân tích phương sai ANOVA và kiểm định LSD để xác định sự sai khác trung bình giữa các nghiệm thức Các kết quả được xử lý bằng phần mềm Statgraphics Centurion 16.1.18 và Excel 2013 Thí nghiệm được thực hiện với ba lần lặp lại để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của dữ liệu.