nghiên cứu chiết tách xác định cấu trúc các hoạt chất từ cây bách bộ stemona pierrei gagn ở lào

Trang 1

Sưu tầm bởi GV Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DayKémQuyNhon

LỜI CẢM ƠN

Luận văn thạc sĩ này được hoàn thành tại Bộ môn Hóa học Hữu cơ, Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội

Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn Thầy giáo PGS.TS Đặng Ngọc Quang đã giao đề tài, hướng dã vận tình, đông thời tạo điêu kiện thuận lợi nhât đê tơi hồn thành luận vã k,

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô trong ôn Hóa Hữu

cơ cũng như các thầy cô trong khoa Hóa hoc — Trườnð>Đại học sư phạm Hà Nội đã giúp đỡ và cho tôi những ý kiến đóng góp

xe Khoa học và Công nghệ

ành tốt luận văn này

và bè bạn đã động viên, tạo điều

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đi

Việt Nam đã rất nhiệt tình giúp đỡ để tôi HỆ

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gi:

Trang 2

s* Kí hiệu các phương pháp sắc kí e TLC: Thin Layer Chromatography (sac ki lép méng) e cc: Column Chromatography (sắc kí cột) e Prep HPLC: Preparative High Performance Liquid @ Chromatography (sắc kí lỏng điề s* Kí hiệu các phương pháp phổ s NMR: Nuclear Magnetic Resonance Shyrom (cộng hưởng từ hạt nh; * 'HNMR: Phổcộng hưởng từ atom * ?CNMR: Phổ cộng mee BG e« HSỌC: Phổ hai an ong tác trực tiếp C— H * HMBC: Phổ s* Các kí hiệu khác \ Ö€ e N-E: chè dung mdi n-hexan: etyl axetat e S c9 Stemona

° all Angiosperm Phylogeny Group IT (một hệ thong

Shin loại sinh học thực vật hiện đại dựa trên việc phân tích phân

â đ APGII Angiosperm Phylogeny Group III (duge céng bố tháng 10 năm 2009)

Trang 3

Sưu tầm bởi GV Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DayKémQuyNhon MỤC LỤC MO DAU :66100661G01GG2GGGRGSGESEGBSMVGGBSGRBOOSGGSSG00G0868086 882 1 CHƯNG << 5° << se T071 94403.00T410orendroieesseeoi 3 TONG QUAN ssissscsosssiessasossssnnsssnessusosccsonscsostansstcstnsssussemassnsssnssshtesostessctussstoree 3

1.1 Giới thiệu cây Bách bộ

1.1.1 Khái quát về họ Bách Bộ (Stemonaceae) và chỉ Set V133 8k 3

1.1.1.1 Giới thiệu chung TỶ

1.1.1.2 Giới thiệu về Bách bộ Lào và cây Bich nhỏ 4

1.1.2.Tác dụng dược lý của cây Bách Bộ

1.2 Tình hình nghiên cứu về thành phả áệ học của cây Bách Bộ

1.2.1 Nghiên cứu về Bách bộ nói €hÍgđ§` s-.-s2 6 1.2.1.1 Hợp chất Anealoit [ 19]J`` : 2-©-cz©c2seccsesccsesccsee 6 1.2.2.2 Hợp chất sithen Os 1.2.2.3 Hop chat teyedhVfirene ceeeiiiiiiiiiriee 11 1.2.2.4 Hợp chất

1.2.2 Nghiên Cy é Bach Bộ Lào 12

1.2.3 Nehi¢h-ciru về Bách bộ lá nhỏ Stemona pierrei 14 1.3 Ho:

CHU‘

cưng VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU 18 <1 Đối tượng, nội dung và các phương pháp nghiên cứu 18

2.1.1 Đối tượng nghiên €ữ1 e°-se©2cee+v+eeecveeecreeecrveecre 18

21,2 Nội dunb:H0 Hô CÚ cecasiskilAl404611400880660463344686163431048536613386 586 18 2.1.3 Phương pháp 'gÌlÏÊI1 C HT 5 < << 5< << Eseteeseeseree 19

Trang 4

2.3 Thực nghiệm 2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu v chit tỏch -côeâcsec-+ 20 é;3/2) S Hỗ ti HESRIGliESisoticitioltoitliltioiiliitijgaiqigiitssxtsss 21 2.3.3 Phân lập các chất từ cặn chiết Etylaxetat 2.4 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 2.4.1 Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy 2.4.2 Phương pháp phỗ NMR đ 2.5 Đặc trưng vật lý - phổ của các chất ph: 2.5.1 Hợp chất YE3 2.5.2 Hop chat YE 2.5.3 Hợp chất YE8 2.5.4 Hợp chất YE10.3 ï 2.6 Phương pháp thử bại nh i CHƯƠNG 3 gợi “ KET QUA VA 3.1 Xác định ếấu trúc các hợp chất tỉnh sạch 3.LI lất:VHỗ Guigat8 giữ gh3qãGUAGdGGHãtGuággtgtggHucgge 28 3 75/251 m 30

GS Hep GIẤP VI Thingiotintnigtidtghilttitigtibitbttjio8giqgitgtptga8g 34

3.1.3 Hop Chit YEIO.3 ccsssccsssssssssssssssssssssssessssecsssecsssnesssnecssscssssecssseees 37

3.2 Kết quả thứ hoạt tính sinh học - s<ccesecveesseeer 40

KẾT HUẬNN Gxsseoseesg 2 ihg niỂn G20 tin 0060101600.0600106010100100001121000 01800.001.600 41

Trang 5

Sưu tâm bởi GV Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DayKèmQuyNhơn

DANH MUC SO DO, BANG SO LIEU VA HINH ANH TRONG LUAN VAN

> Danh sách các sơ đô:

Sơ đồ 2.3.1 Sơ đồ chiết lấy cặn etyl axetat từ củ Bách bộ lá nhó Sơ đồ 2.3.2 Sơ đồ phân lập các chất từ cặn chiết etyl axetat

> Danh sách các bang: `

Bảng 2.1 Hàm lượng % các cặn chiết so với mẫu Khoa Äwoz6ssskgestsssl

Bang 2.2 Khối lượng các phân đoạn E1-E/18 .„:2>%, 5-5<s<s<<e<ssses Bang 3.1 Một số gia tri pho ‘H NMR (CDCI;, 500

hợp chất YE3 so sánh với phố của stigmas

Bảng 3.2 Các giá trị phố của hợp cht YE6.5

so sánh với tài liệu tham khảo HN — 36

Bảng 3.4 Các giá trị phố ! NMR của VY vissssisscsivsssiecesies 40

và so sánh với tài liệu th v I8 PA) 40 > Danh sách xế

Trang 6

1 Phố "H NMR của hợp chất YE3 iT 2 Phố ‘H NMR cia hop chat YE6.5 49

3 Pho °C NMR ciia hợp chất YE6.5 50

4 Phố HSQC của hợp chất Y E6.5 - << < << <s=ses=sese X “TS 51

7 Pho °C NMR cia hợp chat YE8.3 GC — 54

8 Pho 'H NMR cia hop chất YE10.3 =- "“.- 55

Trang 7

Sưu tầm bởi GV Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DayKèmQuyNhơn

MỞ ĐẦU

Lào là một trong số ít những quốc gia còn nhiều rừng nguyên sinh với các thảm thực vật đa dạng, phong phú Dựa vào kinh nghiệm thực tiễn, nguồn tài nguyên quý giá này đã được người dân sử dụng để phòng và chữa bệnh trong nhiều năm qua Tuy nhiên đó mới chỉ là những kinh nghỉ gian,

chưa có cơ sở khoa học Ngày nay, với việc áp dụng các tiế

thuật để nghiên cứu thành phân hóa học, tác dụng sinh Hoe hee dụng duoc ly của các cây thuốc dân gian — không những We san a nang chita bénh của cây thuốc, mà còn nâng cao giá trị, hiệu qua s ung va kha nang khai thác các loài cây thuốc một cách hiệu qua how

Hiện nay, các hợp chất có hoạt tí San học được phân lập từ thực vật ngày càng được chú ý, nghiên cứu ae có những hoạt tính sinh học rất giá trị như chống viêm eon ì thư và làm chất dẫn đường cho các quá trình tông hợp oN các dẫn xuất mới với những hoạt tính sinh học mới, phong phú và Tống hơn

Cây Bách bộ c loại cây bụi, mọc hoang ở các vùng đồng bằng Nam Bộ Việt ào, Đông Bắc Thái Lan, Campuchia, Trung Quốc là một loài cây thề, i - Theo kinh nghiệm dân gian ở Nam bộ Lào, người ta đã sử của cây Bách bộ đề làm thuốc chữa nhiều loại bệnh có hiệu quả bệnh về da, ung thư gan Ngoài ra củ Bách bộ còn có khả năng làm

thiếc diệt sâu bọ, mối mọt So với các loài Bách bộ ở Việt Nam, Trung

Trang 9

CHƯƠNG 1

TONG QUAN

1.1 Giới thiệu cây Bách bộ

1.L1 Khái quát về họ Bách Bộ (Stemonaceae) và chỉ Stenona

1.1.1.1 Gidi thigu chung é

Họ Bách bộ (tên khoa học là S/emonaceae) là một thực vật có

hoa, bao gồm 3-4 chi và khoang 25-35 loai day leo hay cay than thao Hé thong APG II nam 2003 va hé thong APG III n ạt nó trong bộ Dura

dại (Pandanales) của nhánh một lá mầm nhờ oS Họ Bách Bộ được chia thành 4 Ay + Croomia Torr cots) nganh hat kin (Angiosperms) + Stemona Lour + Stichoneuron Ho x + PentastemonatSieehis (đôi khi được tách ra thành họ riêng của chính no la Pentastemo »

TU Ộ Stemona là lớn nhất: có khoảng 30 loài, thường mọc hoang P¬) Ne vùng trung du, miền núi, tập trung ở các các nước Châu Á nơi

ot nóng ẩm như Việt Nam, Trung Quéc, Lao, Thai Lan, [21, 34] ác loài thuộc chi S/emona thường có đặc diém chung nhu sau: [1,7,9]

® Thân thảo, mọc đứng, bò hoặc leo, lá mọc đối, so le hay mọc

vong, thường hình tim

Trang 10

đới có phần

phụ dài hình đùi Bầu trên một ô, đôi khi tiêu giảm Vòi nhụy phân biệt rõ ràng với bầu Đầu nhụy tận cùng gần như phân đôi Noãn 2-11, mọc đứng,

dính ở phía dưới của ô C<

e Quả nang hình trứng hoặc hình mác dẹt, mở bằn GS van Hat

hình trứng, phôi thẳng, có nội nhũ `

e© Rễ củ dài, thịt rễ nạc ~) 1.1.L2 Giới thiệu về Bách bộ Lào và cây Bách O

Theo cac tai liéu [5,28] tai Lao hién cé oai thudc chi Stemona là :

Stemona_ tuberosa, Stemona_ phylla xo Stemona squamigera Gagnep, Stemona_ cochinchinensis nep, Stemona pierrei Gagnep, Stemona saxorum Gagnep, St hae linsae Craib, Stemona aphylla Craib, Stemona burkillii Prain, Stee griffithiana Kruz va Stemona kerrii Craib Các lồi này phân bơ rải ở các vùng núi miên bắc, đông băng miên trung và miền nam nước

Cây Bách ẾQ]ã nhỏ có tên khoa hoc IA Stemona pierrei Gagnep thuộc

họ Bách Nhớ )

ô tả: Dây leo có thân mảnh, dài từ 10-15m, ở gốc có nhiều rễ

Giờn chùm Lá mọc đối hay so le

e Bộ phận dùng nghiên cứu:Cây Bách bộ lá nhỏ được thu hái tại

tỉnh Savannakhet, CHDCND Lào, tháng 5/2012 Sau khi thu hái, củ rễ được

phơi sây khơ, thái nhỏ

® Nơi sống và fhu hái: Cây Bách bộ nói chung - ưa khí hậu ôn hòa,

Trang 11

nhiều mùn Có thể trồng bằng cách gieo hạt hoặc bằng chôi gốc Bách bộ

được tìm thay ở: Việt Nam, Trung Quốc, Thái Lan, Nhật Bản Lào

1.1.2 Tác dụng dược lý của cây Bách Bộ

Theo lý luận y học cô truyền, Bách bộ vị cam kh, tính vi ôn, quy kinh phế, công năng nhuận phê hạ khí chỉ khái, sát trùng, được sử TU 5 bién & dạng sống hoặc qua chế biến trong điều trị chứng ho hoặc So tri bénh giun sán Bách bộ sống tác dụng thiên về chỉ khái hoá t trùng, dùng trong các trường hợp ngoại cảm dẫn đến ho, nhưng ` ụng phụ gây kích ứng dạ dày Chích mật có thể hồ hỗn tính kíc dày, đồng thời tăng cường tác dụng nhuận phế chỉ khái, dùng rường hợp ho lao (ho lâu ngày), bách nhật khái, phế âm hư khái t = ee c6 mau {11]

Ngoài ra, theo phương pháp cô truyền, Bách bộ còn có thê được chê biến với các phụ liệu dich chié mật ong, rượu như sau [I0]:

® Bách bộ no sau khi thu hái rửa sạch đất cát, cắt bỏ đầu đuôi, thái phiên dài 3-5 cm, dày 5-6 mm, sây ở 50-60°C cho đến

» @

e_ BáclÍbđ chưng rượu: Lấy rượu 40% tắm đều vào bách bộ phiến

theo tỉ lệ kể tchanói lượng) Cho vào một cốc có dung tích phù hợp,

đậy kín£đặt ÿào nôi cách thuỷ sôi, tiếp tục đun sôi 1 giờ, lấy ra phơi, sấy ở cá cho đên khơ

® Bách bộ chích mật ong: Cân mật ong và bách bộ phiến theo tỉ lệ

1/10, thêm nước pha loãng mật ong theo tỉ lệ 1:1 rồi trộn đều vào bách bộ phiến, ủ cho ngắm đều Sấy khô qua, sao lửa nhỏ đến khi miếng bách bộ chuyên màu vàng đậm, sờ không dính tay, mùi thơm, vị đắng ngọt

® Bách bộ chích cam thảo: Cân cam thảo và bách bộ theo tỉ lệ 1/8

Trang 12

Năm 2010, Nguyễn Mạnh Tuyền, trường đại học Dược Hà Nội đã tiến

hành thử tác dụng giảm ho của bách bộ trước và sau chế biến Kết quả cho thay, ở liều thử 20g/kgTT trên chuột nhắt trắng, bách bộ phiến có tác dụng giảm ho tốt, có xu hướng long đờm; bách bộ chưng rượu có tác Ove long đờm tốt, có xu hướng giảm ho; bách bộ chích cam thảo có tác giảm ho, long đờm đều tốt; bách bộ chích mật ong chỉ có xu iam ho, long dom [12]

Bên cạnh đó dịch chiết từ củ bách bộ a xà định là có tác dụng trong việc điều trị côn trùng cũng như ngoạ inh trùng hiệu quả cho gia súc Cụ thể: dùng nông độ 5% đã diệt oe bọ gậy — một pha biến thái trong vòng đời phát triển của muỗi; d sex, độ 3% diệt ve chó, phun lần I diệt 52,4%, phun lần 2 sạch v ếuỒu g nong độ 5% chỉ phun | lần đã diệt được 91,04% ve chó [II] eS

1.2 Tinh hinh nghié AS thành phần hóa học của cây Bách Bộ 1.2.1 Nghién cứá về Bách b6 noi chung

Bach BOR mo loại dược liệu quí nên được nhiều nhà khoa học quan tâm nghi Cho đến nay đã có khá nhiều công trình nghiên cứu về Bách 9 dude céng bé Nhin chung, trong ré c4y Bach b6 (Stemona) thường có

(2 ancaloit khác nhau Ngoài ra còn có gluxit (2,3%), lipit (0,84%), protit

(9,25%) và axit hữu cơ (axIt xItric, malic, oxalic ) 1.2.1.1 Hop chat Ancaloit [19]

Trang 13

trưng cho thực vật họ bách bộ (Stemonaceae) và hầu như không thể tìm thay trong bất kì loài thực vật nào khác Vì vậy, trước năm 1980 việc xác định cầu

trúc của phân lớn các hợp chất này đều dựa vào phương pháp đo X-ray Xét

về cấu trúc, các ancaloit từ Bách bộ đặc trưng bởi một nhan pyrrolo[1,2-

a]azepine thường liên kết với 2 cầu cacbon tạo thành các vòng lacton đâu- dudi (terminal lactone rings)

Các ancaloit từ Bách bộ được phân loại theo nhiều cádf khác nhau: thành 8 nhóm theo Ye et al hoặc thành 5 nhóm mnt Ferreira de Oliveira Tuy nhién nam 2006, Harald Greger, dai h 1

xét sự sinh tông hợp và sự phân bồ trong các l

ancaloit khác nhau đã đưa ra một cách phân 162 của các mạch cacbon liên kết với C-9 toà,

Trang 14

sensi ` ini _ Hinh Loe khung cơ bản của ancaloit từ cây Bách Bộ @*

tric Stichonerine (tuberostemonine)

ñ yếu là các ancaloit có nhánh etyl (C-16-C-17) lién két voi C-10 (3 ngoai nhu: tuberostemonine, tuberostemoenone, tuberostemoniol,

oxotuberostemonine, stenine, parvineostemonine, parvistemonine,

Trang 15

Sưu tầm bởi GV Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DayKèmQuyNhơn Tuberostemonine b Kiéu cau triic Protostemonine

Bao gồm các ancaloit có một nhóm metyl ở C-10 và thường tạo thành một vòng lacton không no liên kết với ởi một liên kết đôi như:

a=

maistemonine, stemonamine, protos e, stemonine, stemoamide,

parvistemoamide, stemokerrine, stem ine, neostemonine

Stemonamine

4

a cầu trúc Croomine

ính đến năm 2006, đã xác định được khoảng § ancaloit kiểu croomine

Các ancaloit này khác biệt với các ancaloit kiểu stichoneurine và protostemonine ở chỗ chúng chỉ có 4 nguyên tử cacbon liên kết với C-9 tạo thành một vòng lacton liên kết trực tiếp với nhân pyrroloazepine trong một hệ

Trang 16

Croomine Stemospironine

1.2.2.2 Hợp chất Stilbenoit é`

Trang 17

Sưu tâm bởi GV Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DayKèmQuyNhơn MeO Me MeO HO (> Me OMe H OH 3—hidr oxy—2— metyl_s.2'.4'_trimetoxy bibenzyl 3-s_dihydroxy_2_ metoxy _ OMe @

3,3—dihydrox y_2,5— <a

1.2.2.3 Hop chat Stemanthrene

Trang 18

†ˆ CÝ mì se CÁ 2} Me HO Me MeO Stemanthren F Stemanthren G Z © “t2 ộ x Me O ~) semaneeinteE)`

1.2.2.4 Hop chat Stemofuran

Cac hop chat Stemofuran da phanlap-titoc [18, 25, 27]: \ m3 OMe Š Stemofuran G HO MeO » ODD OMe OH C2 Stemofuran K 3 Stemofuran J

1.2.2 Nghiên cứu về Bách Bộ Lào

Năm 2013, lần đầu tiên TS Vonganantha Khamko đã nghiên cứu thành phan hoá hoc va hoạt tính sinh học của ba loài Bách bộ Lào: Š

cochinchinenis, S pierrei, S tuberosa và đã phân lập được 24 hợp chất bao gôm các ancaloit (maistemonine và Isomaistemonine), stilbenoit,

Trang 19

Trang 20

HO OMe OH OMe Stemophenanthren C Stemobenzofuran B On © vs Stemophenanthren D X ophenanthren E

1.2.3 Nghiên cứu về Bách bộ lá Sfemona pierrei

Năm 2003, các nhà khoa c Australia va Thái Lan [33] đã nghiên cứu về Stemona pierrei Kết đã phân lập và xác định được cấu trúc của 7 chất:

1 Stemanthrene A 2 Stemanthrene B 3 Stemanthrene C

Trang 21

Sưu tâm bởi GV Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DayKèmQuyNhơn OH OH OH CH CH COO Oe oe oe HO oe ee dự ~x» 4 Stilbostemin G 5 Stilbostemin B 6 Stilbostemin D OH OH eg 7 Stilbostemin E o> 4'-methylpinosylvin 9 dihydropinosylvin x @ Ancaloit © Stemonin protostemonin

Nam 2012, Nguyén Thi Thu Ha, Nguyén Thi Nhan (DH Su pham Ha Nội) đã nghiên cứu về Stemona pierrei GAGN mọc ở Lào và đã phân lập được các hợp chất: maistemonine, isomaistemonine, stemanthrene A,B,C, axit

benzoic, axit p- anisic [4,8]

Trang 22

Stemanthren B, Syrigaresinol, axit benzoic, axit benzoic, axit p- anisic, metyl 1’-hydroxy-1’-(4-hydroxy-3-metoxyphenyl)propylat Trong d6 có 2 hợp chất mới là Stemobenzofuran A và metyl Iˆ-hydroxy-lI'-(4-hydroxy-3- nà COOCH; metoxyphenyl)propylat [5] HCO CH; eer OH M OMe Stemobenzofuran A ydroxy-1'-(4-hydroxy-3-metoxyphenyl)propylat

1.3 Hoat tinh sinh hoc VY

Theo cac tai liéu

], dich chiét etanol cia cli bach b6 S tuberosa c6

tác dụng ức chế sử lên của một số loài nắm và vi khuẩn kiểm định Một số dẫn xuất của bibenzyl (3,5-dihydroxy-4-methylbibenzyl), c6 kha nang tc chế sử phá tuẩến của tế bào ung thư máu P338 và gan của chuột

am, TS Vũ Ngọc Kim đã tiến hành thử nghiệm tác dụng sinh

€¡ ích chiết S./¿berosa, ancaloit toàn phần và tuberostemonine L-G và Cà nhận thấy chúng không độc, có tác dụng làm liệt cơ giun đũa, giảm ho và long đờm trên chuột Ngoài ra tuberostemonine L~-G còn có tác dụng ức

chê một sô vi khuẩn thử nghiệm nhu: Bacillus subtillis, Bacillus pumilius,

Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Klebsiella {27| Nghién cttu kha nang gây độc tế bào của các dịch chiết thô từ ba loai nhu: S tuberosa, S saxorum, Š cochinchinensis, cho thây: dịch chiết thô từ S cochinchinensis có hoạt tính

Trang 23

kháng cả bốn dòng tế bào ung thư gan, ung thư màng tử cung, ung thư màng

tim và ung thư thận người Chỉ sau khi được làm giàu theo định hướng các dẫn chất bibenzyl, các mẫu §Š /„berosa và S saxorum mới xuất hiện hoạt tính

gây độc tế bào đối với ba dòng tế bào ung thư trên [27]

Năm 2003, các nhà khoa học Australia và Thái Lan [30] đã nghiên cứu

vé Stemona pierrei Hop chat Stemanthren C phân lập được từ lồ§femona pierrei có hoạt tính kháng tế bào ung thư dong KB mite dé tru nh với giá

trị ICso là 82.03 pg mL” CN

Về Bách bộ Lào, năm 2013 TS Vonganantha o đã tiền hành thử

hoạt tinh sinh hoc cua 13 hop chat tinh sach phan & ợc từ ba loài Bách bộ: S.cochinchinenis, S pierrei, S tuberosa Ket.qua cho thay có 3 chât (stemophenanthren C, D, E) có hoạt tí đá ø sinh, gây độc 4 dòng tế bào

ung thư ở mức độ khá (ICso từ 4,49 đ ân 63,65 ug/ml); c6 5 chat (stemanthren

C, A; stemophenanthren A, B; (Rhy rox y-2-metox yphenyl)-2-(3’hydroxy- 5’-metoxy-2’,4’ dinerynteggoee

bình (ICso từ 20,67 đên ug/ml) [5]

) gây độc tế bao ung thu KB ở mức trung

Trang 24

2.1 Đối tượng, nội dung và các phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Đối trợng nghiên cứu

Cây Bách bộ lá nhỏ được thu hái tại tỉnh Savannakhet, C tháng 5/2012 ThS.Nguyén Thé Anh, Vién Héa hoc, Vién

giúp xác định tên khoa học của mẫu cây Bách bộ lá nhôylà-S/emona pierrei

Sau khi thu hái, củ rễ được phơi sấy khô, thái nhỏ

Hình 2.1 Cây Bách bộ lá nhỏ 2.1.2 Nội dung nghiên cứu

1 Xác định tên khoa học của cây Bách bộ lá nhỏ

2 Khảo sát định tính các lớp chất có trong củ Bách bộ lá nhỏ

3 Chiết tách, xác định cầu trúc một số hợp phân trong củ Bách bộ lá nhỏ 4 Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của chất sạch

Trang 25

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu

1 Phương pháp thu hái và xử lí mẫu

2 Phương pháp ngâm chiết dé thu lay dịch chiết 3 Phương pháp hóa học định tính các lớp chất từ hạt xà sàng 4 Phương pháp sắc kí cột và sắc kí bản mỏng để chiết tách các lớp chat ` 5 Phương pháp HPLC điều chế

6 Xác định cấu trúc của các cấu tử phân lập được

pháp vật lý hiện đại như đo nhiệt độ nón chs , phô 'H NMR,

'°3CNMR, HSQC, HMBC `

2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất @

2.2.1 Thiết bị ©

1 Thiết bị chiết siêu âm Ultrasðnic cleaner (Hàn Quốc ), tại Bộ môn

Hóa hữu cơ, khoa hó đGŠIr ờng ĐHSP Hà nội

2 Đèn soi bản mỏng.v bước sóng (254nm, 302nm và 365nm))

3 Thiết bị đo eget GallenKamp tại Bộ môn Hóa học hữu cơ, khoa hóa ường ĐHSP Hà Nội

4 Thiét bimay HPLC diéu chế của Bộ môn Hóa học hữu cơ, khoa hóa hồcÄrờng ĐHSP Hà nội

t bị đo cộng hưởng từ hạt nhân Brucker Avance 500MHz của

oe Viện hóa học, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam

2.2.2 Hóa chất

- Dung môi: Metanol, n- hexan, clorofom, etylaxetat, etanol

- Thuốc thử : Dragendoff, Mayer, Wagner, Liebermann — Burchard, và các hóa chất: dung dịch H;SO,đặc, dung dịch H;SO; 5%, dung

Trang 26

- Thuốc hiện hình: vanilin trong H;SO¿ 5% 2.2.3 Dụng cụ

- Sắc ký cột, chất hấp thu silicagel( hang Merck-60), kích th(Óc hạ 40- 60 với hệ dung môi rửa giải là ø- hexan:etylaxetat te? độ phân Cực - Sắc ký bản mỏng: sử dụng bản mỏng dé nhô ø sẵn silicagel F- 254 (hãng Merck) - Các dụng cụ trong phòng thí nghiệm 2.3 Thực nghiệm © 2.3.1 Phương pháp xử lý mâu và chi a Thu hái tò Củ Bách bộ lá nhỏ S$ perrrei được thu hai tai tinh Savannakhet, CHDCND Lào, tháng ae b Xứ lí mẫu © - Say mau:

Củ Báá(bộ lá nhỏ được đem sấy nhanh ở 110°C trong vòng 50 giây để

diệt mà men, sau đó sấy khô ở 60-70°C (có thể phơi dưới ánh nắng mặt

ỜI đó thái nhỏ

©) - Ngâm chiết mẫu:

Lay 8 kg mẫu củ Bách bộ lá nhỏ (đã sây khô) đem ngâm chiết liên tục băng dung môi metanol khoảng 3 tuân Lọc để thu lấy dung dịch có màu vàng cam Phân bã còn lại đem ngâm lại trong metanol Tiên hành tương tự như thế 6 lần Thu lây tất cả các dung dịch lọc được đem cất cô quay chân không dé

Trang 27

Dé phân đoạn các hợp chất tự nhiên từ cao tông thu được ở trên chúng

tôi sử dụng qui trình chiết băng phễu chiết thực hiện ở điều kiện nhiệt độ phòng, với các dung môi có độ phân cực tăng dần: ø-hexan, etyl axetat và metanol Qui trình chiết như sau:

+ Lây cao tông hòa trong n-hexan, dùng phễu chiết đề chiết lây dịch n-

hexan Phân bã còn lại tiếp tục chiết với n-hexan tương tự như thế 2 lân Dịch chiết n-hexan qua 3 lần chiết được gom lại Phần bã còn lạiGồi a ba 1

+ Tiếp tục chiết ba 1 bang etyl axetat Lam 3 lan om dich chiét

etyl axetat vào Phân bã còn lại sau khi chiết etylaxeta bã 2

+ Phan ba 2 đem chiết 3 lần bằng metano lân sau đó gom dịch

chiết metanol &

Các dịch chiết thu được u cú mĐđnu sm Sau khi cất đuổi dung

môi thu được các cặn chiết tương ú metanol đò, Dưới đây là khối omg pn chiết thu được và hàm lượng % các cặn : can n-hexan, can etyl axetat, can chiét:

Bang afin lượng % các cặn chiết so với mẫu khô

Trang 28

Củ Bách bộ lá nhỏ | Sấy khô ở 60-70°C Ngâm trong metanol trong 3 tuần Dung dịch Qe = & =— Cat c6 quay; Cao tông A ki x< wW

I1.n -hexan 1.Etylaxetat 1.Metanol

2.cat đuôi dunế wồi 2.cất đuôi dung môi 2.cất đuôi dung môi

v O { Ỷ

Cặn €) Cặn Cặn

n-hexan ° Etylaxetat Metanol

(Al) (A2) (A3)

củ lập các chất từ cặn chiết Etylaxetat

Việc phân lập các chất từ cặn chiết Etylaxetat được thực hiện bằng các phương pháp sắc kí khác nhau như phương pháp sắc kí bản mỏng (TLC), phương pháp sắc kí cột (CC), sắc kí lỏng diéu ché (prep HPLC)

e Sắc kí bản mỏng: Sắc kí bản mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 Fss¿ (Merk) Phát hiện chất băng đèn tử ngoại ở ba bước sóng 254nm, 302nm và 365nm hoặc dùng thử là dung dịch HSO 5% -

Trang 29

Vanilin bằng cách phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi

hiện lên màu

s® Sắc kí cột (CC): Sắc kí cột được tiễn hành với chất hâp phụ là silicagel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (Merk) Hệ dung môi rửa giải là các hệ dung môi hữu cơ: n-hexan/etylaxetat có độ phân cực tăng dân

e Sắc kí lỏng điều chế: Sắc kí lỏng điều chế được tiễn hành=trên máy sắc kí lỏng điều chế (prep HPLC) của hãng Jasco (Nhật Bản Xw PU-2087, detector UV-2070 va RI-2031, cột sắc kí VN L-I (10.0 x 250mm), tốc độ chạy cột 1,0ml/phút Thiết bị đặt ta f ` úng tôi thu được các cặn Jasco ơn Hố hữu cơ, Ae

Khoa Hoá Học, Trường Đại học Sư phạm Hà N

Sau quá trình ngâm chiết từ mẫu củ Bác

chiết: cặn n-hexan (AI), cặn etylaxeta 2D) a can metanol (A3) Lay mot

lượng nhỏ mỗi cặn chiết và kiểm tra sắc kí bản mỏng với các hệ dung môi rửa giải phù hợp, từ kết quả ợc chúng tôi nhận thấy sự khả quan

, «

khi phân tách cặn chiết wicker các hệ dung môi rửa giải n-E từ 10:1 đến 1:1 (trên bản mỏng hẩ hiện các chấm gân tròn tách xa nhau) Vì vậy,

w *

chúng tôi lựa chọn c ét etylaxetat dé tiên hành nghiên cứu, phân lập các

chất tinh sạch GC

Tién aphychay sắc kí cột với 13,05g cặn chiết etylaxetat, rửa giải bang các hệ n-E từ 6:I đên 100% etylaxetat chúng tôi thu được 18 phân đoạn, kí hiệu 18 Các phân đoạn này được làm khô tự nhiên cho bay hết dung (ốfván dé xác định khối lượng, thu được kết quả như sau

Trang 30

trong dung môi Etanol 100%, chúng tôi thu được chất YE3 (20mg)

- _ Lấy 37mg mẫu từ phân đoạn E6 đem chạy sắc kí lỏng với hệ dung môi rửa giải n-E = 3:1, detector UV 254nm, các ống nghiệm hứng mẫu theo thời gian lưu, được đánh số từ I đến 8 Từ ống nghiệm số 5 chúng Aes duoc chất YE6.5 là chất kết tinh màu trắng, hình kim, có khối lượng :

- _ Từ phân đoạn E8 (143mg), chúng tôi tiến hành c Nhu cột với các

hệ dung môi n-E từ 6:1 đến 1:10 để phân cắt thành ` ân đoạn nhỏ hơn

E8.1-E8.4 €

Lây phân đoạn 8.1 đem chạy sắc kí lỏn ệ dung môi rửa giải n-E = 1:1, detector UV 254nm ching tôi Ne hat YE8.3 két tinh hinh kim, màu trăng, có khối lượng 7mg

- _ Tiến hành tương tự với cá tom còn lại, chúng tôi thu được chất

+

YEI0.3 kết tinh hình kim, mà ø, có khối lượng 7mg

Việc phân lập các chật được minh hoạ bằng sơ đồ dưới đây:

Trang 31

Trang 32

Các chất sạch YE3, YE6.5, YE8.3, YE10.3 sau khi rửa sạch và sấy khô, lây một lượng nhỏ đo nhiệt độ nóng chảy băng thiết bị đo điểm chảy Gallen

Kampf tại Bộ môn Hóa học hữu cơ, Khoa hóa học, Trường ĐHSP Hà Nội

2.4.2 Phương pháp phố NMR

Các chất sạch YE3, YE6.5, Y§.3, YE10.3 sau khi rửa sađ Và sây khô, lây một lượng nhỏ đo các phố NMR băng các thiết bi nh ở mục 2.2.1 Phân tích hợp chất phân lập được

2.5 Đặc trưng vật lý - phố của các chất phân Paes

2.5.1 Hop chat YE3 @

- Nhiệt độ nóng chảy: 169 - 1709 :

- Tỉnh thể màu trắng, hình oN ông phát quang dưới đèn tử ngoai ,

hiện màu với vanilin/H;SO,, dễ metanol, etanol, clorofom

+

- Phé 'H NMR: Xem bảằg Ä.1 và Phụ lục 1 2.5.2 Hop chat YE6.5 x

- Tinh thé & hình kim, hiện màu với vanilin/H;SO¿, dễ tan

trong metanol, etdnol, clorofom, etylaxetat

Pho NMR va °C NMR, HSQC, HMBC: Xem bang 3.2 và Phụ lục

9-5:

230i chit YE8.3

- Nhiét d6 néng chay: 183-184 °C

- Tinh thé mau trang, hinh kim, hién màu với vanilin/H;SO¿, tan tốt

trong metanol, etanol, clorofom, etylaxetat

- Phé 'H NMR va ‘°C NMR: xem bang 3.3 va Phu luc 6,7 2.5.4 Hop chat YE10.3

Trang 33

- Tinh thé màu trắng, hình kim, hiện màu với vanilin/H;SO¿, tan tốt trong metanol, etanol, clorofom, etylaxetat

- Phố 'H NMR va ‘°C NMR: xem bang 3.4 va Phu luc 8,9 2.6 Phương pháp thử hoạt tính sinh học

Việc thử hoạt tính kháng nam, khang khuẩn được tiến hành tại Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam theo phương pháp sau:

- Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh: đó là xác yee nang tiêu diệt VSV gây bệnh ở mức nặng hay nhẹ, pho khá ân (Gram âm, dương) hoặc các loại nắm men, nắm sợi Có thể ag ơng pháp đục lỗ

(hay còn gọi là khuếch tán trên đĩa thạch) nore g phap MIC nhu da

trinh bay 6 trén &

`

v

Trang 34

3.1 Xác định cấu trúc các hợp chất tỉnh sạch 3.1.1 Hợp chất YE3 Hop chất YE3 (20mg) kết tinh hình kim, màu trăng, t°„„ r3 ss Á ều ở vùng trường tan tốt trong clorofom, methanol

Trang 35

Sưu tầm bởi GV Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạayKèmQuyNhơn

So sánh các giá trị phố của YE3 với phổ của stigmasta-5,22-dien-3/Ø-ol từ tài liệu tham khảo [15] chúng tôi thấy có sự trùng khớp tốt, vì vậy có thể kết luận rằng hợp chất YE23 chính là stigmasta-5,22-dien-3/-ol (CasH„;O)

Bang 3.1 Một số giá trị phố 'H NMR

YE3 (Stigmasta-5,22-die )

Trang 36

phân đoạn E6 qua hệ thống sắc kí lỏng điều chế với hệ dung môi n-E=3:I, detector UV 254nm Kiểm tra độ tỉnh khiết của chất bằng phương pháp sắc kí bản mỏng, kết quả cho thấy có I vết châm tròn đậm duy nhất hiện lên bản mỏng ở bước sóng À=254 nm, R;= 0.44

Pho ‘H NMR cua hop chat YE6.5 cé tín hiệu của I1 pron) chi ia thanh 7 pic ứng với 7 loại proton không tương đương, bao sàn hệ, vùng trường cao (2,19 ppm) và 6 pIc ở vùng trường trung bình (Š 8 ) trong đó có các tín hiệu đặc trưng của các proton thơm Cụ thê: Hình 3.2 Phố 'H NMR c £f~ f~ ¬ 6< ee eee ee se se ° 4 t Wy \ a 37 » 3H-mety! no One cH, 3' trihidroxy 3 metylbipheny!

Oo - 3 proton voi = 2.19 ppm (vân đơn) được gán cho proton nhóm Mh A q

metyl (-CH; ) liên kết trực tiếp với hệ thơm

- 2 proton với ổ= 5.05 ppm (vân đơn, tù) được gán cho proton các nhóm hydroxy (-OH)

Trang 37

- 2 proton với ổ= 6.94 ppm (vân đôi, J=6,5) được gán cho 2 proton tương đương bị tách bởi I proton bên cạnh trong hệ thơm

- | proton với 5= 7.24 ppm (vanba, J=1, J=7) va l proton với ổ= 7.28 ppm (van ba, J=1, J=8) duoc gan cho 2 proton thom bi tach boi 2 proton bén canh trong hé thom

- Ï proton với ø= 7.50 ppm (vân đôi, J=8) và l proton vớổ= 7.58 ppm (van đôi, J=7) được gán cho 2 proton bi tach boi | proton Cale trong hé thom ` Hình 3.3 Phé °C NMR ciia hợp oe YEN—YE65—~CDC1 3—C13CP 156.379 1$5 096 154,330 1 0$) 2 954 Bói 29% iL 008 4 221 11.213 11.019 76.764 < opt a, <= 3ì —(2£ —È-l¿0 eS cằẰằƒ⁄£ SỈ ‘OH HO O: 2,2'3'-trihidraoxy-3- $a 9@ thom SERA 66Apic ở vùng trường mạnh (8.12ppm) va 12 pic 6 ving trudng trung bình C-mvetyl a \ mm T T T ợ T = T ` 60 40 20 0 pre

C NMR của hợp chất YE6.5 có tín hiệu của 13 cacbon, trong đó (100-160ppm) Kết hợp với phổ HSQC chúng tôi quy kết được 13 cacbon nay bao gồm:

- Ì nguyên tử cacbon bậc I1 (-CH; ) - 6 nguyên tử cacbon bậc 3 (-CH)

Trang 38

tiếp với O; cacbon cộng hưởng ở I11,3ppm (độ chuyên dịch hoá học thấp nhất trong 6C này) được gán cho cacbon thơm liên kết trực tiếp với nhóm metyl Hình 3.4 Phổ HMBC của hợp chất YE6.5 k5 5 s xO 2 ee ° À : —? | | i ls Tmmrrrerrr mm 7.7 ?.6 145 14 13 7.2 7.1 7.0 6.9 6.4 6.7 pạa YEN- YE65- CDC13- HMBC Ằ 6 ¬ "mĩ

Pho C cho thấy các tương tác xa C-H trong phân tử:

- Prot nhóm metyl (-CH;) có tương tác với 2C bậc bón (111.3ppm va ai tuong tac yéu voi 1C metilen (-CH, 104.46ppm) — vị trí nhóm CH; trong phan tử là .C(OH)-C(CH:)-CH

- _ Các proton thơm ở 7.58ppm, 7.50ppm, 7.28ppm và 6.94ppm có tương tác

với C-OH —> các proton này liên kết với C ở vị trí ortho hoặc meta so với C- OH

Trang 39

Sưu tầm bởi GV Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạayKèmQuyNhơn

2 proton thơm ở 6.94ppm và 7.50ppm có tương tác với 2C bậc bốn (129.05ppm và 129.17ppm)

- _ Proton thơm ở 7.23ppm không tương tác với C-OH —> proton này liên kết với C ở vị trí para so với C-OH

Trang 40

5 7.28, t, J=1, J=8 124.26 41.4! 0) 6' 6.94, d, J=6.5 101.22 1',2' 4-Me 2.19, s, 3H 8.13 : 2,2'-OH | 05 & 2H | | GO

Nhận thây các sô liệu phô của hợp chât YE6.5 khá phì VỚI công

thức giả định ở trên, chúng tôi kết luận hợp chất Y inh là 2,2°,3'- trihidroxy-3-metylbiphenyl là hợp chất mới lần đâu tiêf»phân lập được từ cây

Bách bộ lá nhỏ SG

3.1.3 Hop chat YE8.3

Hợp chat YE8.3 (7mg) két ti (` màu trắng, được chiết tách từ phân đoạn E8.I qua hệ thống On điều chế với hệ dung môi n-E=l:1, detector UV 254nm Kié Ke)

bản mỏng, kết quả cho có I vết châm tròn đậm duy nhất hiện lên bản inh khiết của chất bằng phương pháp sắc kí mỏng ở bước sóng nm, Re= 0.43

oN trúc ˆ” 3 được xác định nhờ các phương pháp phổ Cụ