Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường

Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trần Thị Lệ Quyên NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC KỸ THUẬT MỚI ỨNG DỤNG ĐỂ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Burkholderia pseudomallei TRONG CÁC MẪU BỆNH PHẨM LÂM SÀNG VÀ NGỒI MƠI TRƯỜNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2023 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trần Thị Lệ Quyên NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC KỸ THUẬT MỚI ỨNG DỤNG ĐỂ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Burkholderia pseudomallei TRONG CÁC MẪU BỆNH PHẨM LÂM SÀNG VÀ NGỒI MƠI TRƯỜNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9420101.07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Trịnh Thành Trung PGS TS Bùi Thị Việt Hà LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác cộng khác Các số liệu trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý đồng tác giả Phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận án Trần Thị Lệ Quyên LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận án tiến sĩ dấu mốc đánh dấu trưởng thành nghiên cứu sinh giai đoạn đầu nghiệp nghiên cứu khoa học Luận án nỗ lực học tập nghiên cứu nghiên cứu sinh, định hướng khoa học thầy hướng dẫn, hỗ trợ đồng nghiệp phòng thí nghiệm nhiều nguồn lực khác Tơi xin bày tỏ biết ơn chân thành tới tất hỗ trợ trực tiếp hay gián tiếp giúp hồn thành luận án Lời đầu tiên, tơi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới TS Trịnh Thành Trung, thầy hướng dẫn thứ nhất, người đưa đến giới “melioidosis” kiến thức chuyên môn sâu rộng với tinh thần đầy nhiệt huyết nghiên cứu khoa học Thầy không người thầy hướng dẫn khoa học giúp định hướng nghiên cứu đáp ứng chất lượng cơng bố quốc tế, mà cịn người lãnh đạo quan tâm hỗ trợ nhiệm vụ khoa học khác đơn vị Tôi gửi lời cảm ơn tới PGS TS Bùi Thị Việt Hà, cô hướng dẫn thứ hai, người đồng hành nhiều năm với từ bậc học đại học tới bậc sau đại học Cô dành cho quan tâm hỗ trợ chuyên môn, tiếp thêm động lực cho tơi hồn thành luận án Để hồn thành luận án này, chân thành cảm ơn ThS Bùi Nguyễn Hải Linh, người đồng nghiệp tâm huyết giúp tơi hồn thành nhiều thí nghiệm luận án Tôi gửi lời cảm ơn anh chị em đồng nghiệp Viện Vi Sinh vật Công nghệ sinh học động viên tạo điều kiện cho tơi q trình thực luận án công việc nghiên cứu Tôi xin cảm ơn hỗ trợ quý thầy cô Bộ mơn Vi sinh vật họcKhoa Sinh học, phịng Đào tạo (bộ phận Quản lý sau đại học), trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội góp ý chun mơn hướng dẫn thủ tục hành để hồn thành luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Quỹ VINIF, Vingroup hỗ trợ phần kinh phí cho q trình thực luận án Cuối cùng, xin biết ơn quan tâm, động viên tạo điều kiện gia đình người thân giúp tơi có thời gian động lực hồn thành luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Trần Thị Lệ Quyên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC HÌNH iii DANH MỤC BẢNG v MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 VI KHUẨN Burkholderia pseudomallei VÀ BỆNH NHIỄM TRÙNG MELIOIDOSIS 1.1.1 Giới thiệu chi vi khuẩn Burkholderia loài B pseudomallei 1.1.2 Đặc điểm sinh học vi khuẩn B pseudomallei 1.1.3 Bệnh nhiễm trùng melioidosis 10 1.1.4 Phân bố vi khuẩn B pseudomallei ca nhiễm melioidosis 15 1.2 NGHIÊN CỨU VỀ B pseudomallei VÀ MELIOIDOSIS TẠI VIỆT NAM 22 1.2.1 Nghiên cứu B pseudomallei 22 1.2.2 Nghiên cứu điều tra ca nhiễm melioidosis .24 1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM VI KHUẨN B pseudomallei TỪ MẪU BỆNH PHẨM LÂM SÀNG 29 1.3.1 Các phương pháp xét nghiệm phụ thuộc nuôi cấy 29 1.3.2 Các phương pháp xét nghiệm melioidosis không phụ thuộc nuôi cấy 35 1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN B pseudomallei NGỒI MƠI TRƯỜNG 38 1.4.1 Phương pháp nuôi cấy 38 1.4.2 Phương pháp sinh học phân tử 41 CHƯƠNG NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .43 2.1 CÁCH TIẾP CẬN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .43 2.1.1 Nghiên cứu phát triển kỹ thuật xét nghiệm nhanh melioidosis 43 2.1.2 Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát vi khuẩn B pseudomallei 46 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU 48 2.2.1 Hóa chất thiết bị 48 2.2.2 Chủng vi khuẩn 51 2.2.3 Mẫu huyết 52 2.2.4 Mẫu môi trường .53 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .57 2.3.1 Kỹ thuật ELISA xét nghiệm nhanh melioidosis .57 2.3.2 Kỹ thuật nuôi cấy làm giàu phát B pseudomallei ngồi mơi trường .60 2.3.3 Định lượng vi khuẩn B pseudomallei từ mẫu môi trường 65 2.3.4 Phương pháp phân tích đa hình trình tự kiểu gen MLST 65 2.3.5 Thống kê xử lý số liệu 66 2.3.6 Sơ đồ nghiên cứu .68 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 69 3.1 PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM NHANH MELIOIDOSIS TỪ MẪU BỆNH PHẨM LÂM SÀNG 69 3.1.1 Nghiên cứu phát triển kỹ thuật ELISA xét nghiệm nhanh melioidosis 69 3.1.2 Đánh giá hiệu xét nghiệm melioidosis WC/Hcp1-ELISA 79 3.2 PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT PHÁT HIỆN B pseudomallei NGỒI MƠI TRƯỜNG 90 3.2.1 Nghiên cứu phát triển kỹ thuật nuôi cấy phát vi khuẩn B pseudomallei ngồi mơi trường 90 3.2.2 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy làm giàu hai bước điều tra có mặt B pseudomallei ngồi mơi trường .96 KẾT LUẬN 111 KIẾN NGHỊ 112 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ 113 LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .113 TÀI LIỆU THAM KHẢO .114 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh AhpC Alkyl hydroperoxide reductase subunit C API Analytical profile index AUROCC Area under the receiver operating Tiếng Việt characteristics curve BV TƯ Bệnh viện Trung ương BVĐK Bệnh viện đa khoa BSA Bovine serum albumin CDC Centers for disease control and Trung tâm Kiểm sốt prevention Phịng ngừa Dịch bệnh CDS Coding DNA sequence Trình tự mã hóa CFU Colony forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc CI Confidence interval CPS Capsule polysaccharide DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay EM Erythritol medium EPS Exopolysaccharide GIs Genomic island Hcp1 Hemolysin co-regulated protein ICT Immunochromatography Test Đảo gen Xét nghiệm sắc ký miễn dịch IHA Indirect hemagglutination assay Ngưng kết hồng cầu gián tiếp iiPCR Insulated isothermal PCR PCR đẳng nhiệt IQR Interquartile range IPTG Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside solution i LAMP Loop-mediated isothermal amplification PCR khuếch đại đẳng nhiệt PCR vòng lặp LB Luria-Bertani broth LPS Lipopolysaccharide Maldi-tof MS Matrix assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry MHA Mueller Hinton agar MLST Multilocus sequence typing Đa hình trình tự kiểu gen MNGC Multi-nucleated giant cells Tế bào khổng lồ đa nhân MQ Milli-Q Nước cất Milli-Q NST Nhiễm sắc thể NTDs Neglected tropical diseases Các bệnh nhiệt đới PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PVDF Polyvinylidene difluoride OPD O-phenylenediamine dihydrochloride RENOMAB Research network on melioidosis and Mạng lưới nghiên cứu Burkholderia pseudomallei melioidosis B pseudomallei SDS Sodium dimethyl sulfate SDS-PAGE Sodium dimethyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis ST Sequence type TBSS-C50 Threonine-basal salt solution colistin 50 Kiểu trình tự mg/liter TLTK Tài liệu tham khảo TMB 5’5-Tetramethylbenzidine TTSS1 Type III secretion system VSV Hệ thống tiết nhóm III Vi sinh vật VSV&CNSH Vi sinh vật Công nghệ sinh học VTCC Vietnam type culture collection Trung tâm Nguồn gen Vi sinh vật Quốc gia X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-Dgalactoside WC Whole cell Toàn tế bào WHO World health organization Tổ chức Y tế giới iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây phát sinh chủng loại B pseudomallei loài quan hệ họ hàng Cây xây dựng dựa trình tự gen 16S rRNA lồi nghiên cứu.5 Hình 1.2 Hình thái tế bào vi khuẩn B pseudomallei Hình 1.3 Các dạng hình thái khuẩn lạc vi khuẩn B pseudomallei môi trường thạch Ashdown sau ngày nuôi cấy 37oC Hình 1.4 Dự đốn tính phù hợp mơi trường tồn B pseudomallei 18 Hình 1.5 Số liệu báo Quốc tế công bố B pseudomallei melioidosis Việt Nam từ lúc phát ca bệnh năm 1925 đến thời điểm kết thúc chiến tranh năm 1975, dư âm ca bệnh công bố sau chiến tranh năm hịa bình lập lại 27 Hình 1.6 Khuẩn lạc vi khuẩn B pseudomallei loài vi khuẩn khác phân lập từ mẫu bệnh phẩm tạp nhiễm môi trường thường quy (Columbia, MacConkey UTI) chọn lọc (Ashdown) thời gian 1-2 ngày, 37oC 30 Hình 1.7 Quy trình ni cấy phân lập phát có mặt vi khuẩn B pseudomallei ngồi mơi trường theo hướng dẫn chuẩn 40 Hình 2.1 Cấu trúc vector pPSG-IBA3 50 Hình 2.2 Vị trí thu mẫu nước ruộng lúa Triệu Sơn - Thanh Hóa .54 Hình 2.3 Vị trí thu mẫu đất nước Sóc Sơn 56 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phát triển kỹ thuật nuôi cấy làm giàu để phát vi khuẩn B pseudomallei ngồi mơi trường 63 Hình 2.5 Sơ đồ bước nghiên cứu phát triển kỹ thuật xét nghiệm nhanh melioidosis từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng .68 Hình 3.1 Kết so sánh trình tự gen BPSL2697 mã hóa protein GroEL từ chủng chuẩn B pseudomallei K96243 trình tự gen từ vector nhân dịng sử dụng khn DNA chủng B pseudomallei VTCC 70157 70 Hình 3.2 Nhân dịng gen mã hóa kháng ngun protein .70 Hình 3.3 Biểu protein tái tổ hợp Hcp1 (1), GroEL1 (2) AhpC (3) tế bào E coli BL21(DE3) pLysS; sản phẩm tinh Hcp1 (20,7 kDa) (4);