ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
Một nghiên cứu đã được thực hiện với sự tham gia của 100 bệnh nhân từ Bệnh viện Phổi Trung Ương, Bệnh viện 74 Trung Ương và Bệnh viện Phổi Hà Nội Các bệnh nhân này đều có kết quả AFB dương tính, bao gồm cả trường hợp mới và tái trị lao phổi Họ được điều trị bằng các thuốc chống lao hàng 1 theo phác đồ của Chương trình Chống lao Quốc gia Việt Nam năm 2017 và đã tự nguyện tham gia nghiên cứu.
Tiêu chuẩn loại trừ bao gồm phụ nữ đang mang thai và cho con bú, cũng như những bệnh nhân không có sự phát triển của khuẩn lạc trong quá trình nuôi cấy để xác định các thông số dược động học.
Hóa chất dùng cho tách DNA tổng số: E.Z.N.A blood DNA Mini kit (hãng Omega-Biotek)
Oˈ GeneRuler 1kb DNA Ladder (hãng ThermoScientific), Lambda DNA/HindIII Marker (hãng ThermoScientific), Tris base (hãng Bio basic), axit acetic (hãng Merck)
Hóa chất sử dụng cho kỹ thuật PCR bao gồm cặp mồi được tổng hợp từ hãng Phusa-biochem (Việt Nam) với trình tự mồi đã được sử dụng trong một số nghiên cứu khác, nước khử ion từ hãng Omega Biotek và Kapa2G T M Robust HotStart ReadyMix (2X) từ hãng Kapabiosystems.
Hóa chất dùng cho tinh sạch sản phẩm PCR: E.Z.N.A.® CyclePure Kit (hãng
Hóa chất dùng cho PCR-RFLP: nước khử ion (hãng Omega Biotek), enzym cắt
FastDigest KpnI, FastDigest BamHI, FastDigest TaqI (hãng ThermoScientific)
Máy soi, chụp ảnh gel (Gel Doc It - Mỹ), hệ thống điện di (Cleaver Scientific Ltd
- Mỹ), máy PCR (Prime Thermal Cycler - Anh), tủ an toàn sinh học (ESCO - Đức),
- Anh), tủ ấm (Panasonic - Nhật bản), tủ lạnh sâu -30 o C (Panasonic - Nhật Bản), tủ mát
Phương pháp nghiên cứu
Hình 2 1 Các bước tiến hành nghiên cứu
Tách chiết DNA tổng số
PCR nhân dòng đoạn gen NAT2
Xác định kiểu gen thông qua RFLP và giải trình tự tự
Thu thập100 mẫu máu BN lao
Tinh sạch sản phẩm PCR
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Mỗi người bệnh cung cấp 2mL mẫu máu toàn phần lưu trong ống có chứa EDTA, bảo quản ở - 20 o C cho đến khi sử dụng
2.2.2 Tách chiết DNA tổng số
Tách DNA tổng số sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit theo quy trình khuyến cáo của hãng
Hình 2 2 Nguyên lý tách DNA tổng số bằng kit [33]
(1) Ly giải (2) Gắn DNA vào màng
(4) Giải phóng và thu DNA
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
DNA tổng số thu được được điện di trên gel agarose 1,2%, đệm TAE 1X Trộn
Trước khi tra mẫu, 4 μL DNA được trộn với 1 μL 5X DNA loading Dye chứa Ethidium bromide (50 μg/mL) để nhuộm Sau đó, điện di được thực hiện trong hiệu điện thế 84 volt trong 40 phút, sử dụng thang chuẩn DNA λ/HindIII ladder, và các băng DNA được quan sát dưới ánh sáng UV Để đánh giá chất lượng DNA, nồng độ và độ tinh sạch của DNA tách chiết được xác định bằng cách đo mật độ hấp thụ quang tại bước sóng 260 nm (OD260) và 280 nm (OD280) Một giá trị OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,8 - 2,0 cho thấy DNA có độ tinh sạch cao.
2.2.3 Nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR
1 GGAACAAATT GGACTTGGAA ACATTAACTG ACATTCTTGA GCACCAGATC CGGGCTGTTC CCTTTGAGAA CCTTAACATG
81 CATTGTGGGC AAGCCATGGA GTTGGGCTTA GAGGCTATTT TTGATCACAT TGTAAGAAGA AACCGGGGTG GGTGGTGTCT
161 CCAGGTCAAT CAACTTCTGT ACTGGGCTCT GACCACAATC GGTTTTCAGA CCACAATGTT AGGAGGGTAT TTTTACATCC
241 CTCCAGTTAA CAAATACAGC ACTGGCATGG TTCACCTTCT CCTGCAGGTG ACCATTGACG GCAGGAATTA CATTG TCGAT
321 GCTGGGTCTG GAAGCTCCTC CCAGATGTGG CAGCCTCTAG AATTAATTTC TGGGAAGGAT CAGCCTCAGG TGCCTTGCAT
401 TTTCTGCTTG ACAGAAGAGA GAGGAATCTG GTACCTGGAC CAAATCAGGA GAGAGCAGTA TATTACAAAC AAAGAATTTC
481 TTAATTCTCA TCTCCTGCCA AAGAAGAAAC ACCAAAAAAT ATACTTATTT ACGCTTGAAC CTCGAACAAT TGAAGATTTT
561 GAGTCTATGA ATACATACCT GCAGACGTCT CCAACATCTT CATTTATAAC CACATCATTT TGTTCCTTGC AGACCCCAGA
641 AGGGGTTTAC TGTTTGGTGG GCTTCATCCT CACCTATAGA AAATTCAATT ATAAAGACAA TACAGATCTG GTCGAGTTTA
721 AAACTCTCAC TGAGGAAGAG GTTGAAGAAG TGCTGAGAAA TATATTTAAG ATTTCCTTGG GGAGAAATCT CGTGCCCAAA
801 CCTGGTGATG GATCCCTTAC TATTTAGAAT AAGGAACAAA ATAAACCCTT GTGTATGTAT CACCCAACTC ACTAATTATC
881 AACTTATGTG CTATCAGATA TCCTCTCTAC CCTCACGTTA TTTTGAAGAA AATCCTAAAC ATCAAATACT TTCATCCATA
961 AAAATGTCAG CATTTATTAA AAAACAATAA CTTTTTAAAG AAACATAAGG ACACATTTTC AAATTAATAA AAATAAAGGC
1041 ATTTTAAGGA TGGCCTGTGA TTATCTTGGG AAGCAGAGTG ATTCATGCTA GA
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
2.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR
2.2.5 Xác định kiểu gen NAT2 bằng PCR-RFLP
FastDigest TaqI và FastDigest BamI được sử dụng để cắt 3 alen NAT2*5, *6, *7 Vị trí cắt của enzym trên gen NAT2 quyết định kích thước của các băng điện di tương ứng với từng kiểu gen, cung cấp thông tin dự kiến về kết quả.
2.4 mô tả Alen NAT2*5 (c.341T > C) không có vị trí nhận biết của enzym cắt, tuy nhiên lại liên kết chặt chẽ với c.481C > T có vị trí nhận biết của KpnI Chính vì vậy, kiểu gen NAT2*5 được xác định thông qua kiểu gen của c.481C > T Thành phần và điều kiện của phản ứng cắt được trình bày trong Bảng 2.1
Bảng 2 1 Thành phần và điều kiện của phản ứng cắt Thành phần
Thể tích 1 phản ứng (10 àL) Điều kiện cắt Đệm 10X 1 àL Ủ 5 phút ở 37 ˚C, bất hoạt
DNA khuụn 100 ng/àL 3,5 àL
Kết quả dự kiến cắt alen NAT2*5, NAT2*6 và NAT2*7 được phân loại như sau: TT biểu thị đồng hợp tử kiểu dại, CT là dị hợp tử, CC là đồng hợp tử đột biến, GG là đồng hợp tử kiểu dại, AG là dị hợp tử, và AA là đồng hợp tử đột biến.
Chiều dài đoạn gen ước tính sau khi cắt alen NAT2*5 và NAT2*7 lớn hơn
200bp và các đoạn gen có chiều dài khác biệt trên 200 bp, vì vậy tiến sản phẩm cắt 2
2.2.6 Xác định kiểu gen NAT2 bằng phương pháp giải trình tự
20 µL sản phẩm PCR sau đó được kiểm tra trên gel agarose và tinh sạch bằng kit, sau đó sẽ được gửi đến hãng First Base (Malaysia) để giải trình tự bằng cách sử dụng cùng một mồi cho cả đoạn gen NAT2 Dữ liệu giải trình tự được đọc bằng phần mềm BioEdit phiên bản 7.1.9 để xác định kiểu gen của mỗi người bệnh.
Cách đọc kết quả giải trình tự trong phần mềm BioEdit rất đơn giản: mỗi nucleotit được biểu thị bằng một đỉnh có màu sắc đặc trưng (A: xanh lá cây, C: xanh da trời, G: đen, T: đỏ) Nếu tại vị trí của một nucleotit chỉ có một đỉnh màu, bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp tử; ngược lại, nếu xuất hiện hai đỉnh màu, đó là kiểu gen dị hợp tử Ngoài 6 SNP đã xác định, chúng ta còn có thể phát hiện nhiều SNP khác trên đoạn gen đã giải trình tự, từ đó giúp tìm ra nhiều mối liên hệ giữa các bệnh khác nhau hoặc giữa các bệnh trên cùng một gen của một cá thể.
2.2.7 Xác định tần số của các SNP và dự đoán kiểu hình acetyl hóa
Tần số kiểu gen và alen được xác định theo công thức sau (giả sử với kiểu gen
X gồm 2 dạng alen là C và T, cho 3 kiểu gen là CC, CT, TT):
- Tần số của mỗi kiểu gen: Tần số kiểu gen X = 𝑠ố 𝑚ẫ𝑢 𝑚𝑎𝑛𝑔 𝑔𝑒𝑛 𝑋
- Tần số của mỗi alen: Tần số alen C: f (C) = f (CC) + 1
2 f (CT) Trong đó, f (CC), f (TT), f (CT) là tần số các kiểu gen tương ứng CC, TT, CT
Đạo đức nghiên cứu
Nghiên cứu này đã được thông qua bởi Hội đồng đạo đức Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội trước khi bắt đầu thực hiện Để đảm bảo tính minh bạch và tuân thủ các nguyên tắc đạo đức, mẫu bệnh án và phiếu xác nhận tự nguyện tham gia nghiên cứu của người bệnh đã được thu thập đầy đủ.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Tách chiết DNA tổng số
Mẫu máu thu được từ 100 bệnh nhân được tách DNA bằng kit của Omega, sử dụng phương pháp điện di trên gel agarose 1,2% Kết quả điện di cho thấy các sản phẩm DNA tổng số đều có băng DNA rõ nét, cho thấy chất lượng DNA từ các mẫu khá đồng đều và ổn định, với độ sáng cao tương ứng với băng 23,1 kb của thang chuẩn.
Hình 3 1 Kết quả DNA tổng điện di trên gel agarose 1,2% Làn M1: thang chuẩn
DNA λ/HindIII; Làn 1 – 12: sản phẩm DNA tổng số của 12 mẫu nghiên cứu.
Nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR
3.2.1 Tối ưu quy trình PCR
Nhiệt độ gắn mồi là yếu tố quan trọng cần được tối ưu hóa để đảm bảo phản ứng PCR đạt hiệu suất cao nhất Để xác định nhiệt độ tối ưu, chúng tôi đã thực hiện PCR trên 10 nhiệt độ khác nhau trong dải nhiệt từ 51,1 độ C đến 59,9 độ C Đồng thời, nồng độ DNA nhân dòng tối ưu cũng được xác định từ dải nồng độ 25, 50, 84, 150, 200 và 250 ng/μL để đảm bảo kết quả PCR chính xác và đáng tin cậy.
Kết quả điện di trên Hình 3.2A cho thấy nhiệt độ gắn mồi tối ưu nằm trong khoảng từ 57,8 đến 58,9 độ C, tại đó sản phẩm PCR thu được có băng đặc hiệu, sáng rõ và kích thước phù hợp với lý thuyết.
Tại nhiệt độ gắn mồi từ 52,6 o C đến 55,8 o C, có sự xuất hiện của băng phụ, trong khi ở các nhiệt độ 52,6 o C, 53,6 o C, 59,5 o C và 59,9 o C, các băng xuất hiện mờ và không rõ nét Do đó, nhiệt độ gắn mồi 58 o C được chọn là điều kiện tối ưu vì cho băng sáng nhất, rõ nét và không có băng phụ, phục vụ cho các phản ứng tiếp theo.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Kết quả PCR trên hình 3.2B cho thấy phản ứng đạt thành công với nồng độ mẫu từ 150-250 ng/μL Tuy nhiên, tại nồng độ 150 ng/μL và 250 ng/μL, băng PCR xuất hiện mờ, trong khi đó nồng độ 200 ng/μL cho băng sáng rõ nét và không có băng phụ, do đó được chọn là nồng độ tối ưu.
Kết quả tối ưu phản ứng PCR nhân dòng NAT2 trên gel agarose 1,5% cho thấy sự quan trọng của việc xác định các điều kiện phản ứng tối ưu Cụ thể, kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi (A) và nồng độ DNA (B) đã được xác định, với thang chuẩn kích thước DNA 1kb (Làn M) và đối chứng âm (Làn (-)) được sử dụng để đánh giá kết quả.
3.3.2 Nhân dòng gen NAT2 của 100 mẫu nghiên cứu
Sau khi tối ưu hóa thành phần và chu trình nhiệt, nhóm nghiên cứu đã thành công trong việc nhân dòng 100 sản phẩm Kết quả điện di nhân dòng gen NAT2 của 10 mẫu đầu tiên cho thấy phản ứng PCR đạt hiệu suất và độ đặc hiệu cao, đảm bảo tham gia các phản ứng tiếp theo Quá trình thao tác không bị nhiễm DNA ngoại lai, được chứng minh qua kết quả âm tính của đối chứng âm Kích thước băng sau khi so sánh với thang chuẩn cho kết quả phù hợp với kích thước lý thuyết, xấp xỉ 1093 bp.
Bảng 3 1 Thành phần và điều kiện phản ứng nhân dòng gen NAT2
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
DNA khuụn 200 ng/àL 1 -Kộo dài cuối:
Hình 3 3 Kết quả nhân dòng 10 mẫu nghiên cứu gen NAT2 theo điều kiện tối ưu Làn M: thang chuẩn kích thước DNA 1kb; Làn (-): đối chứng âm.
Xác định kiểu gen NAT2 bằng PCR-RFLP
Xác định kiểu gen NAT2*5 bằng phương pháp FastDigest KpnI cho phép phân tích kiểu gen một cách chính xác Đối với kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại CC, kết quả sẽ hiển thị hai băng với kích thước 659 bp và 434 bp Trong khi đó, kiểu gen dị hợp tử CT sẽ cho ba băng có kích thước lần lượt là 1093, 659 và 434 bp, và kiểu gen đồng hợp tử đột biến cũng có thể được xác định thông qua phương pháp này.
TT không bị cắt cho một băng với kích thước 1093 bp (Hình 3.4A)
Phân tích kiểu gen NAT2 thông qua phương pháp PCR-RFLP cho thấy các kiểu gen NAT2*5 và *7 được điện di trên gel agarose 2%, với M1 là thang chuẩn kích thước DNA 1kb Bên cạnh đó, kiểu gen NAT2*6 được điện di trên gel acrylamide 10%, với M2 là thang chuẩn kích thước.
DNA 50bp; Làn (-): đối chứng âm
Xác định kiểu gen NAT2*6 bằng phương pháp FastDigest TaqI giúp phân tích biến thể di truyền Trong đó, kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại GG sẽ cho 4 băng điện di với kích thước 316 sau khi cắt bằng enzym giới hạn.
226, 170 và 381 bp Kiểu gen dị hợp tử GA cho 5 băng điện di với kích thước 396,
381, 316, 226 và 170 bp Kiểu gen đồng hợp tử đột biến AA sẽ cho 3 băng điện di với kích thước 396, 381 và 316 bp (Hình 3.4B)
Xác định kiểu gen NAT2*7 bằng FastDigest BamHI là một phương pháp hiệu quả Đối với kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại GG, kết quả sẽ cho 2 băng với kích thước 810 bp và 283 bp Trong khi đó, kiểu gen dị hợp GA sẽ cho 3 băng, giúp phân biệt rõ ràng giữa hai kiểu gen này.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
29 băng với kích thước 1093, 810 và 283 bp Kiểu gen đồng hợp tử đột biến AA không bị cắt cho 1 băng duy nhất với kích thước 1093 bp (Hình 3.4A).
Xác định kiểu gen NAT2 bằng giải trình tự
SNP Đồng hợp tử kiểu dại Dị hợp Đồng hợp tử đột biến
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Hình 3 5 Kết quả xác định các kiểu gen NAT2 trên BioEdit version 7.1.9
Hình 3.5 thể hiện kết quả phân tích kiểu gen của 6 alen NAT2*5 khi sử dụng phần mềm BioEdit 7.1.9 để giải trình tự Kết quả cho thấy tất cả các kiểu gen của 6 alen này đều được xác định rõ ràng thông qua phân tích trên phần mềm này.
*6, *7, *11, *12, *13 đều xuất hiện trong mẫu nghiên cứu của chúng tôi.
Kết quả phân bố tần số alen và tỷ lệ kiểu gen, kiểu hình NAT2
Kết quả phân tích trên 100 mẫu nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ 6 alen NAT2*5, *6,
Kết quả phân tích cho thấy tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa ở các nhóm nghiên cứu lần lượt là 6%, 32%, 12%, 6%, 7% và 49% (Bảng 3.2) Đặc biệt, kết quả tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa dựa trên 3 SNP và 6 SNP cho thấy sự tương đồng hoàn toàn, với tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa nhanh, trung bình và chậm lần lượt là 25%, 38% và 37% (Bảng 3.3).
Bảng 3 2 Kết quả phân tích kiểu gen và tần số của đa hình NAT2
Tần số alen p - value χ 2 Đồng hợp tử kiểu dại
Dị hợp tử Đồng hợp tử đột biến
Bảng 3 3 Tỷ lệ kiểu hình NAT2 trên 100 người bệnh mắc lao người Việt Nam
Kiểu hình Nhanh Trung bình Chậm Tổng
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
BÀN LUẬN
Tối ưu hóa quy trình phân tích đa hình di truyền NAT2
Nhóm nghiên cứu đã chọn hai phương pháp PCR-RFLP và giải trình tự để tiến hành nghiên cứu, do những ưu điểm bổ sung của từng phương pháp Kết quả nghiên cứu cho thấy hiệu quả của mỗi phương pháp trong việc phân tích các kiểu gen NAT2.
Quá trình nhân dòng gen NAT2 gặp khó khăn do độ dài đoạn gen cần khuếch đại lớn hơn 1 kb và sự tồn lưu của các thuốc trong mẫu DNA gây ức chế phản ứng PCR Để giải quyết vấn đề này, chúng tôi lựa chọn sử dụng Kapa2G Robust Hotstart Ready Mix, một hỗn hợp enzym có sẵn tất cả các chất cần thiết cho PCR, trừ mồi và DNA, giúp đơn giản hóa quy trình thao tác và giảm thời gian thực hiện Ưu điểm chính của enzym Kapa2G là khả năng thực hiện PCR hiệu quả ngay cả khi có sự hiện diện của các chất ức chế hoặc các mẫu DNA có độ tinh sạch chưa cao Ngoài ra, Kapa2G còn có hoạt tính 5’-3’ exonuclease, giúp tăng độ chính xác trong quá trình khuếch đại gen.
Ngoài enzym Kapa2G, HotStartTaq DNA polymerase của QIAGEN mang lại hiệu suất và độ đặc hiệu cao trong quá trình nhân dòng Ưu điểm nổi bật của enzyme này là khả năng nhân dòng hiệu quả ngay cả với các mẫu DNA có nồng độ thấp hoặc phức tạp Buffer PCR của QIAGEN được thiết kế với điều kiện ủ mồi nghiêm ngặt và nồng độ Mg2+ cao hơn so với các buffer thông thường, từ đó nâng cao hiệu suất và độ đặc hiệu của phản ứng Đặc biệt, enzyme này sử dụng dung dịch Q, một chất không độc hại, giúp thay đổi độ tan chảy của DNA, hỗ trợ khuếch đại các mẫu khó mà các enzyme thông thường không thể thực hiện.
4.1.2 Phương pháp giải trình tự
Giải trình tự gen được coi là tiêu chuẩn vàng để xác định đột biến, đặc biệt trong lĩnh vực di truyền y học Với sự phát triển của công nghệ y sinh, giá thành giải trình tự tại Việt Nam ngày càng giảm, tạo điều kiện cho việc ứng dụng rộng rãi trong các cơ sở y tế nghiên cứu Ưu điểm của giải trình tự là cung cấp đầy đủ thông tin về điểm đột biến, bao gồm loại đột biến, vị trí và giúp xác định chính xác các điểm đột biến trên cả một hệ gen với độ chính xác cao.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Giải trình tự là phương pháp tốt nhất để xác định chính xác tất cả các đa hình trên phân đoạn cần phân tích, đặc biệt phù hợp cho các nghiên cứu chưa xác định được đa hình liên quan đến bệnh lý quan tâm Một gen có thể có rất nhiều đột biến liên quan đến nhiều bệnh khác nhau, vì vậy giải trình tự cung cấp dữ liệu kiểu gen đầy đủ nhất của đối tượng tham gia nghiên cứu Trong nghiên cứu này, việc sử dụng cặp mồi cho phép nhân dòng toàn bộ vùng gen mã hóa cho enzym NAT2, cung cấp rất nhiều thông tin di truyền về gen NAT2, bao gồm cả các alen khác trên gen này Kết quả là lần đầu tiên cung cấp bộ dữ liệu đa hình di truyền gen NAT2 ở người bệnh lao, mở ra khả năng nghiên cứu sâu hơn về mối quan hệ giữa gen NAT2 và bệnh lao.
Hiện nay, phương pháp giải trình tự DNA đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong việc phát hiện các đột biến DNA Những đột biến này đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá nguy cơ ung thư và xác định hiệu quả của các thuốc điều trị đích sinh học Ngoài ra, phương pháp này còn giúp chẩn đoán nguy cơ và tình trạng mắc các bệnh lý thần kinh, bệnh lý di truyền như bệnh Parkinson, Huntington, teo cơ Lateral Sclerosis, cũng như các bệnh mất trí nhớ như Alzheimer.
Kết quả giải trình tự không chỉ giúp chẩn đoán xác định việc nhiễm các tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn và nấm, mà còn đánh giá sự liên quan giữa đột biến và khả năng đáp ứng hoặc kháng một số loại thuốc Điều này cho thấy tầm quan trọng của phương pháp giải trình tự trong ngành y sinh học, dược học và các lĩnh vực liên quan, đồng thời mở ra nhiều ứng dụng mới và tiềm năng phát triển trong tương lai.
Phương pháp PCR-RFLP sở hữu những ưu điểm vượt trội về thời gian thao tác nhanh chóng, chi phí thấp và dễ dàng thực hiện Do đó, phương pháp này đã trở thành lựa chọn của nhiều nhà nghiên cứu để tiến hành phân tích kiểu hình acetyl hóa, đặc biệt là thông qua 3 alen NAT2*5 và *6.
Khi áp dụng vào thực hành lâm sàng, phương pháp RFLP là lựa chọn sáng giá cho những bệnh nhân cần kết quả sớm Phương pháp này phân tích ba alen NAT2*5, *6, *7 và cho kết quả kiểu gen hoàn toàn tương đồng với giải trình tự Các kiểu hình xác định dựa trên ba SNP và sáu SNP trong nghiên cứu không có sự khác biệt, hoàn toàn giống nhau Do đó, chúng tôi khuyến cáo sử dụng kỹ thuật RFLP để dự đoán kiểu hình acetyl hóa thông qua ba alen NAT2*5, *6, *7.
Về đa hình di truyền NAT2
4.2.1 Tần số alen và tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa
Các biến thể di truyền NAT2 đóng vai trò quan trọng trong khả năng acetyl hóa của enzyme này tại gan, từ đó ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa thuốc và tính nhạy cảm với một số bệnh nhất định Tuy nhiên, phần lớn các nghiên cứu chỉ tập trung vào một số đột biến "chỉ thị" như NAT2*5, *6, *7, *11, *12 và *13, mà bỏ qua phân tích các đa hình không làm thay đổi chức năng của enzyme.
Our study, conducted on over 100 Vietnamese patients with tuberculosis, revealed the frequencies of NAT2 alleles *5, *6, *7, *11, *12, and *13 to be 6%, 32%, 12%, 49%, 6%, and 7%, respectively.
Kết hợp thêm dữ liệu tần số alen NAT2 đã được công bố, nghiên cứu tiến hành so sánh kết quả với một số vùng và lãnh thổ khác nhau, cung cấp thêm thông tin về sự đa dạng di truyền giữa các quần thể.
Tần số của các alen NAT2 khác nhau giữa các quần thể và vùng địa lý Cụ thể, alen NAT2*5 xuất hiện với tần số nhỏ hơn 10% ở Đông Á, nhưng cao hơn ở các quần thể khác, từ 29% đến 45% Trong khi đó, alen NAT2*7 có tần số thấp ở Châu Âu và Châu Phi, nhưng cao hơn ở Đông Á, đạt 19% và 12% trong nghiên cứu của chúng tôi Alen NAT2*6 chiếm tỷ lệ khá cao ở các vùng, từ 23% đến 36% Sự phân bố các alen NAT2*12 và *13 cũng có sự khác biệt rõ rệt giữa các vùng địa lý, với tỷ lệ thấp hơn 10% ở người Việt Nam và Đông Á, nhưng cao hơn 35% ở các vùng khác Điều này cho thấy có sự ảnh hưởng của gần gũi địa lý đến cấu trúc di truyền quần thể.
Các tần số phân bố của alen NAT2*5, *6, *7, *11, *12, *13 tại một số vùng và khu vực trên thế giới được thể hiện trong Hình 4.1 Dữ liệu được sắp xếp theo vị trí địa lý, cung cấp cái nhìn tổng quan về sự phân bố của các alen này ở các khu vực khác nhau trên toàn cầu.
Châu Phi (n = 661), Châu Mỹ (n = 347), Châu Âu (n = 503) , Hồ Chí Minh ( Dân tộc Kinh ở thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam, n = 198), nghiên cứu (nhóm người Việt
Nam mắcl lao, n = 100), Đông Á (n = 504), Nam Á (n = 489) [61]
Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện trên toàn thế giới về tần số alen gây ra kiểu hình acetyl hóa chậm, tỷ lệ kiểu hình này, nồng độ INH sau khi uống và liều điều trị phù hợp cho từng cá nhân Theo Geetha Ramachandran và S Swaminathan (2012), tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa chậm ở người Mông Cổ như Eskimos, Nhật Bản và Trung Quốc là 10%, trong khi con số này là 90% ở khu vực Trung Đông, 60% ở người Negroid, da trắng và Nam Ấn.
Châu Phi Châu Mỹ Châu Âu Nghiên cứu Hồ Chí
NAT2*5 NAT2*6 NAT2*7 NAT2*11 NAT2*12 NAT2*13
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa chậm ở Việt Nam là 37%, thấp hơn so với Ấn Độ, Mỹ và Negroid nhưng cao hơn ở người Mông Cổ, Nhật Bản và Trung Quốc Một nghiên cứu lớn trên 99 quần thể khác nhau trên thế giới của Audrey Sabbagh và cộng sự năm 2011 đã chỉ ra sự phân bố khác nhau của kiểu hình này liên quan đến nghề nghiệp chủ yếu ở mỗi quốc gia hoặc vùng lãnh thổ Sự thích ứng với điều kiện môi trường đã ảnh hưởng lên bộ gen của con người, gây ra sự thay đổi về tần số alen để đáp ứng với sự thay đổi về môi trường phù hợp.
Hình 4 2 Sự phân bố kiểu hình acetyl hóa chậm trên 99 quần thể trên thế giới
Mỗi biểu đồ hình tròn thể hiện tỷ lệ phần trăm của kiểu hình acetyl hóa, trong đó màu cam đại diện cho tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa chậm, màu vàng đại diện cho tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa nhanh và trung bình.
Nghiên cứu của Toure A và cộng sự trên 96 người bệnh mắc lao đã áp dụng hai phương pháp chính để xác định chỉ số acetyl hóa và kiểu hình acetyl hóa, bao gồm đo nồng độ INH trong huyết tương sau khi uống INH 3 giờ và 6 giờ Kết quả cho thấy các alen NAT2*4, *5A, *6A, *13A đóng vai trò quan trọng và kiểu hình acetyl hóa giữa hai phương pháp này tương đồng Đặc biệt, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng nồng độ INH huyết tương sau 3 giờ và 6 giờ ở nhóm acetyl chậm cao hơn so với nhóm acetyl nhanh.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Donald và cộng sự đã nghiên cứu tác động của liều isoniazid và kiểu gen
Nghiên cứu về dược động học và dược lực học của INH ở người lớn mắc lao phổi cho thấy sự acetyl hóa nhanh của INH với liều 6 mg/kg/ngày có hiệu quả tương tự như liều 3 mg/kg/ngày của kiểu hình acetyl hóa chậm Nhóm nghiên cứu khuyến cáo rằng giảm liều INH dưới 6 mg/kg có thể gây bất lợi cho người có kiểu hình acetyl hóa nhanh, trong khi liều 3 mg/kg/ngày là đủ cho người có kiểu hình acetyl hóa chậm để đạt được nồng độ điều trị hiệu quả.
Nghiên cứu trên 326 người bệnh ở Ấn Độ cho thấy tỷ lệ acetyl hóa chậm, trung bình và nhanh lần lượt là 58%, 35% và 7% Nồng độ INH trong máu sau 2 giờ sử dụng INH đơn độc (6 mg/kg) của kiểu hình acetyl hóa chậm, trung bình và nhanh là 10,2 μg/mL, 8,1 μg/mL và 4,1 μg/mL Điều này cho thấy người bệnh có kiểu hình acetyl hóa chậm có nồng độ INH trong máu cao hơn, dẫn đến sự tăng tạo thành các chất trung gian gây độc cho cơ thể Một nghiên cứu khác trên 201 người bệnh tại Ấn Độ cũng cho kết quả tương tự, với tỷ lệ acetyl hóa chậm, trung bình và nhanh là 55%, 32% và 13%, và nồng độ INH trong huyết tương của kiểu hình acetyl hóa chậm cao hơn so với các nghiên cứu khác.
Hình 4 3 Nồng độ INH sau 2 giờ của mỗi kiểu hình acetyl hóa[26]
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng những người có kiểu hình acetyl hóa chậm nên sử dụng liều INH thấp hơn liều được khuyến cáo để đạt hiệu quả điều trị tốt nhất Một nghiên cứu đối chứng ngẫu nhiên trên 172 người bệnh của Nhật Bản năm 2013 đã chứng minh rằng việc điều trị liều INH dựa trên kiểu gen có thể mang lại kết quả điều trị tốt hơn Điều này cho thấy tầm quan trọng của việc xác định kiểu hình acetyl hóa để điều chỉnh liều INH phù hợp với từng người bệnh.
Nghiên cứu về NAT2 giúp cải thiện khả năng dung nạp thuốc và tăng hiệu quả của phác đồ điều trị 6 tháng đối với người bệnh lao phổi mới Mục tiêu chính của nghiên cứu này là xác định tỷ lệ tổn thương và tìm hiểu vai trò của gen NAT2 trong việc cải thiện kết quả điều trị bệnh lao phổi.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Một nghiên cứu đã đánh giá hiệu quả của liệu pháp INH trong 8 tuần điều trị và tỷ lệ thất bại điều trị sớm ở tuần thứ 8 Kết quả điều trị được đánh giá thông qua kết quả xét nghiệm vi khuẩn lao dương tính ở tuần thứ 8 hoặc hình ảnh X-Quang phổi không cải thiện Nghiên cứu sử dụng hai phương pháp điều trị: liều điều trị theo kiểu gen (PGx) và liều chuẩn (STD), với liều lượng khác nhau tùy thuộc vào kiểu hình acetyl hóa của bệnh nhân Kết quả cho thấy, những người bệnh có kiểu hình acetyl hóa chậm sử dụng liều chuẩn có tỷ lệ tổn thương gan tăng nhanh hơn so với những người sử dụng liều điều trị theo kiểu gen.
Tỷ lệ tổn thương gan do INH (INH-DILI) theo thời gian được nghiên cứu trên 172 người bệnh, với các kiểu gen khác nhau: RA type (acetyl hóa nhanh), IA type (acetyl hóa trung bình), và RA type (acetyl hóa chậm) Phương pháp điều trị PGx được áp dụng dựa trên kiểu gen, trong khi phương pháp STD sử dụng liều chuẩn thông thường.