TRUONG DAI HOC SU PHAM HA NOI 2 KHOA HOA HOC
= 5s9LU pe===
NGUYEN THI VAN ANH
XAY DUNG PHUONG PHAP
DINH LUONG HOAT CHAT NITIDINE TRONG CAY XUYEN TIEU
(ZANTHOXYLUM NITIDUM)
BANG HE SAC KY LONG HPLC KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC
Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ
Trang 2LOI CAM ON
Khóa luận với đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất
Nitidine trong cây Xuyên Tiêu ( Zanthoxylưm niidum) bằng hệ sắc ký lỏng
HPLC” được thực hiện tại Phòng Hóa sinh Nông nghiệp và Tinh dầu - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Hồng Vân, người đã
giao đề tài, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em thực hiện và hoàn thành khóa luận
`
này
Em xin trân trọng cảm ơn GS TS Phạm Quốc Long - Viện Trưởng Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, đã cho phép và tạo điều kiện đề em được thực tập tại Phòng Hóa sinh Nông nghiệp và Tinh dầu - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, ban Chủ nhiệm khoa cùng toàn thê các Thầy Cô trong Khoa Hóa học đã hết lòng quan tâm, dìu dắt và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập tại trường và hoàn thiện khóa luận này
Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã luôn
luôn bên cạnh động viên, ủng hộ và là chỗ dựa vững chắc cho em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận này
Em xin chân thành cảm ơn
Hà Nội, tháng Š năm 2016
Sinh viên thực hiện
Trang 3MUC LUC
DAT VAN DE oooeececcccescscsesesessesesessvsvscssssvscstsevsesevssscsevevacsevavscsevavsessvavscsascssavscateecscetes |
CHUONG 1: TONG QUAN W occecccceccesceccscescescescsccsescsevsevacessescsevsceacsasseeseessacesvaaeatens 3
1.1 Một vài nét về thực vật cây Xuyên tiêu Zanthoxylium nitđUI 3
1.2 Tình hình nghiên cứu về cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) và hoạt chất
000000 210 na 3
1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thỂ giới cv SE rsresreeo 3
1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở VIỆt NH1 Sa 8
CHUONG 2: DO] TUONG VA PHUONG PHAP NGHIEN CỨU 9
2.1 DGi twong nghién COU ccecccccccccscscescscsesscscsesscsesssvscsevscseseecseseeevscecsevseaeesvseen 9
2.2 Hóa chất, dụng cu va cdc thiét bi diing trong nghién CU ccceceeeeeseeeeseeees 9
2.2.1 Hóa chất và (ÍỤN CHỊ Q0 net 9
2.2.2 Thiét bi ditng trong nghién Cit ccccccccccccsccccscseseesesseseseesesvsessesevscseseesesseees 10
2.3 Phương pháp xử lý mẫu: . ¿+ ¿E E2 E21 E E8 1E 11 E1 911v vn ri 10
2.4 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất: I Ï
2.4.1 Sac k¥ lop mong (TLC) cecccccccccssesceseseesessescsseseecessesescesescesvscesesceavsceavsceevess 11 2.4.2 SAC KY COL (CO) ceccccccccscccseseescssesceseescesescescescsevseescesssccaceaceacsevaevaseeseresseaeeaes II
2.5 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được - 12
2.5.1 Phổ hồng ngoại ÏÍ is k St kStEv SE TEE TT TH HT He 12 2.5.2 Phổ khối lượng (MÔ) St kStE SE SE Sky: 12 2.5.3 Phd céng hwong tie hat nhdn (NMR) ccccccscsecscseseseseeseseseeseseseesesesesesesesees 12 2.6 Điêm nóng chảy (M;) - ¿+ St St 12x 32351223 2151211 11111111111 13
2.7 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ¿6c cv Sexy: 14
2.7.1 Phương pháp nudi Cay té D&O in VỈHFO Set rcrkrkrecee 14
2.7.2 Phép thứ sinh học xác định tính đóc tế bào (CyfofoXie 4S$đY) 14 2.8 Phương pháp HPLC xác định hàm lượng hoạt chất nitidine trong các bộ phận
của cây Xuyên tiêu [Ñ ] - - - c3 101930110 ni nh 16
Trang 43.1 Xử lý mẫu thực vật và điều chế các cặn chiết từ mẫu thực vật 17
3.2 Phân lập hợp chất nitidine từ cặn chiẾT cscscvE 3218151151181 111 sx2 18
3.3 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất ZN l - -¿ xcsscsc: 19 3.4 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất ZN l - + 5c: 20
3.5 Xác định hàm lượng hoạt chất nitidine trong các bộ phận của cây Xuyên tiêu
băng phương pháp HPLC [Š ] - - c1 3110110101101 3 3111 vn ve 20
CHƯƠNG 4: KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN c1 St v S1 S SE nếu 24
4.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất ZN l ¿+ kSxEx SE v SE EE TS rnrre 24 4.2 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất nitidine - 29
4.3 Hàm lượng của hoạt chất nitidine trong các bộ phận lá, quả, cành, thân và rễ
cây XuyÊn tIÊU - - Ă cọ nọ TT nọ ni cv cự 29
CHUONG 5: KET LUAN (St Sv E1 về TS TT TT TT TT ng 32 CONG TRINH CONG BO KHOA HOC CO LIEN QUAN DEN KHÓA LUẬN 33
Trang 5DANH MUC CAC CHU VIET TAT
IR: Infrared Spectroscopy
EI — MS: Electron Impact Mass Spectroscopy 'H NMR: 'H -Nuclear Magnetic Resonance ‘SC NMR: '°C - Nuclear Magnetic Resonance
HSQC: Heteronuclear Singlet - Quantum Coherence
HMBC: Heteronuclear Multiple - Bond Correlation
DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer TLC: Thin layer chromatography
EtOAc: Ethyl acetate
UV-Vis: Ultraviolet-Visible: phố tử ngoại và khả kiến
ò(ppm): Độ dịch chuyên hóa học (parts per million) J(Hz): Hang số tương tác (Hertz) br: broad singlet s: singlet d: doublet dd: double doublet t: triplet
Trang 6DANH MUC HINH VA SO DO
Hinh 1: Anh mau cay Xuyén tiéu (Zanthoxylum nitidum) .c.ccccccccccccscsecsesesseseseeseeeees 9
Hình 2: Sơ đồ điều chế các cặn chiết từ cây Xuyên tiêu ¿ ¿5 +s+s<z£zczszs2 17
Hình 3: Sơ đồ phân lập chat ZN1 ti phan cặn chiết nước của thân và cành cây
XUYÊN IÊU SG G391 nọ ni nọ ni và 19
Hình 4 a) Phố UV-Vis của nitidine; b) Sắc ký đồ HPLC của nitidine 21
Hình 5 Đường chuân định lượng nitidine ¿ ¿5-2522 s22 S2 SE + zEze££zxzxeeeeed 21 Hình 6: Phố 'H-NMR của hợp chat ZN1 o.c.ccccecccscssescsesessesesesesscecscscsesscsesesesscseseeesvees 24 Hình 7: Phô 'ÌC-NMR của hợp chất ZN ¿2 St tSE2EEEEEEEEEEEEeErrkrkrkerrerred 25
Hình 8: Phố DEPT của hợp chất Z⁄N l ¿5 ++2+2+zS£E£EzE+E+EE£EeEeErEeEeevzsrrrsrsrees 25 Hình 9: Phô HSQC của hợp chất Z⁄N l - ¿5 52s S£E£E£E‡E£E£E£E£EzE+E+EzEczcEcxrsree, 26 Hình 10: Phố HMBC của hợp chất Z⁄N- - 252 Sz se SE+E+ESEE£E£EeErEeEErvzErrrrrsrees 26 Hình 11: Phố khối lượng ESI-MS của hợp chất ZN l -¿ +52 5s=zszszszszse: 27
Hình 12: Cấu trúc hóa học của hợp chất nitiđine - - +5 +sccsexzxzxszczezezersrees 28
Hình 13 Sắc kí đồ HPLC của các cặn chiết metanol tông từ lá - 5s: 30
DANH MỤC BẢNG BIÊU
Bảng 1 Độ lệch CHUAN CUA NILIGIMNE ằ a 22
Bảng 2: Độ chính xác của phương pháp phân tích nitidine -.-. - <- 23
Bảng 3 Số liệu phổ 'H, 'ÌC-NMR của hợp chất ZNI và số liệu tham khảo của hợp
đi 8017111122 ằ ồ 27
Bảng 4 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất nitidine 29
Trang 7DAT VAN DE
Nước ta có diện tích khoảng 330.000 km” nằm trong vùng nhiệt đới gió
mùa cận xích đạo nên nhiệt độ hàng năm khá cao (khoảng từ 22 - 34”C) Lượng mưa hàng năm lớn tạo cho nước ta một hệ thực vật đa dạng và phong phú Theo số
liệu thống kê gần đây hệ thực vật Việt Nam có khoảng 12.000 loài, trong đó cây làm thuốc chiếm khoảng 26-30 % [6,7] Đây là nguồn tài nguyên thiên nhiên rất quý
báu của đất nước
Trong những thập kỷ gần đây, xu hướng quay lại sử dụng các sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên đề phòng và điều trị bệnh trở nên phô biến Trước sự phát
triên vượt bậc của sinh học phân tử, ngày nay việc nghiên cứu và tìm kiếm, khai thác các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học, ứng dụng trong y học, nông nghiệp và các mục đích khác trong đời sống con người là một trong những hướng nghiên cứu đã và đang được các nhà khoa học trong và ngoải nước quan tâm
Cây Xuyên tiêu (hay còn được gọi là Hoàng lực, Sưng, Trưng) có tên khoa
học Zanthoxylum nifidum (Roxb.) DC., thuộc họ Cam (Rutaceae) Các nghiên cứu
trên thế giới cho thấy cây này có thành phần chủ yếu là các hợp chất alkaloid và
lignan; ngoài ra còn có một sỐ hợp chất khác có khung coumarin, terpenoid va steroid Nhiéu hop chất thu được từ cây này đã cho thấy có những hoạt tính sinh học
đáng chú ý như kháng nắm, kháng khuẩn, kháng virut, kháng viêm giảm đau, chống co thắt, chống sốt rét , trong đó nôi bật nhất là khả năng gây độc tế bào, chống ung
thư của hoạt chất chính nitidine Hợp chất này đã được chứng minh có khả năng ức
chế nhiều dòng tế bào ung thư rất tốt và có khả năng trở thành chất chống ung thư
có nguồn gốc thiên nhiên
Tuy nhiên, ở Việt Nam, các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như
hoạt tính sinh học của cây Xuyên tiêu mới chỉ có rất ít Việc nghiên cứu chiết tách,
phân lập và xây dựng phương pháp xác định nhanh hàm lượng hoạt chất nitidine
trong cây Xuyên tiêu ở Việt Nam để từ đó định hướng cho việc khai thác nguồn
Trang 8chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất
nitidine trong cây Xuyên tiêu (Zanfhoxylum niidum) bằng hệ sắc ký lỏng
HPLC”
Noi dung nghién cuu:
1 Xu ly mau, tao các cặn chiét
2 Phân lập, tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học của hoạt chất nitidine 3 Xây dựng phương pháp định lượng xác định hàm lượng của hoạt chất
nitidine trong các cặn chiết bằng HPLC Đối tượng nghiên cứu:
Cây Xuyên tiêu (Z4nthoxylum niidum) thuộc họ Cam (Rutaceae) ở Việt
Trang 9CHUONG 1: TONG QUAN
1.1 Một vài nét về thực vật cây Xuyên tiêu Zanthoxylum nitidum
Cây Xuyên tiêu (hay còn gọi là cây hạt sẻn, sưng, hoàng lực) có tên khoa
học là Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC thuộc họ Cam (Rutaceae) Đây là loại cây
nhỏ leo, ưa sáng và chịu hạn tốt, thường mọc trong các quần hệ cây bụi ở đồi, nương rẫy bỏ hoang hoặc ven rừng thứ sinh, có nhiều cành, dài 1-2 m, có thể dài tới 15m Duong kính thân có thê tới I5cm, có gai quặp Cành hình trụ, nhan, mau nau
đen, có gai ngắn rải rác, dẹt, quay về phía dưới Lá kép lông chim lẻ, mọc so le, dài 18-20 cm, gdm 5-7 14 chét mọc đối, hình trái xoan, dài 6-11 em, rộng 3,5-5,5 cm,
gốc tròn, đầu có mũi nhọn, 2 mặt đều có gai ở gân, mặt trên màu lục sam, mat dưới nhạt, gân lá hắn rõ, cuống lá dài có gai Cụm hoa mọc ở kẽ lá thành chùm, hay chùm xim đơn riêng lẻ, hoa đơn tính, màu trắng, thơm; hoa đực có nhị dài hơn cánh hoa, chỉ nhị mảnh; hoa cái có bầu hình cầu gồm 4-5 lá noãn, hơi ngắn hơn cánh hoa Qua c6 1-5 manh vỏ,thường là 3 tụ lại ở quanh trục, mặt ngoài nhăn nheo, mặt trong nhẫn Khi chín mâu đỏ nhạt, mỗi mảnh vỏ đựng | hat ran, mau den bong [1, 2, 7]
Ở nước ta, cây mọc hoang ở khắp các nơi, nhiều nhất tại các tỉnh miền núi như Phú Thọ, Lào Cai, Yên Bái, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Cao Bằng, Hà
Tĩnh, Nghệ An, Hòa Bình, Hà Tây [2,7]
1.2 Tình hình nghiên cứu về cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) va hoat
chat nitidine
1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
1.2.1.1 Cay Xuyén tiéu (Zanthoxylum nitidum)
Các nghiên cứu về thành phần hóa học cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum
nitidum) trén thé giới cho thấy cây này có thành phần chủ yếu là các hợp chất alkaloid và lignan; ngoài ra còn có một số hợp chất khác có khung coumarin,
terpenoid và steroid Nhiều hợp chất thu được từ cây này đã cho thấy có những hoạt
Trang 10Lớp hoạt chất chính có trong cây Zanthoxylum nitidum là các alkaloid, bao
gồm 5 loại khung là benzophenanthridine alkaloid, quinolon, furoquinoline,
aporphine va pyrimidine; trong đó cac benzophenanthridine alkaloid chiém ham
lượng chính Bằng các phương pháp tách chiết hoặc str dung HPLC, 21 hop chat benzophenanthridine alkaloid đã được tìm thấy có trong cây Zanthoxylum nitidum,
gồm có niidine (1), chelerythrine (2), 8-methoxynorchelerythrine (3),
norchelerythrine (4), decarine (5), oxynitidine (6), oxychelerythrine (7), oxyavicine (8), sanguinarine (9), dihydrochelerythrine (10), 6-acetonyldihydrochelerythrine
(11), 5,6-dihydro-6-methox ynitidine (12), (R)-8-[(R)-1-
hydroxyethyl]dihydrochelerythine (13), 8-methoxychelerythrin (14), 8-
hydroxydihydrochelerythrine (15), epizanthocadinanine A (16), zanthocadinanines A (17), zanthocadinanines B (18), epi-zanthocadinanine B (19), zanthomuurolanine (20) va epi-zanthomuurolanine (21) [21, 22, 31, 58, 50]
1: R'=OMe; R?=OMe; R3=H; R*=H
2: R'=H; R?=OMe; R?=OMe; R*=H 6: R'=OMe; R*=OMe; R?=H
3: R'=OMe; R?=OMe; R*=H; R*=OMe 7: R'=H; R?=OMe; R*=OMe
4: R'=H; R?=OMe; R?=OMe; R*=H
Trang 12Hầu hết các hợp chất benzophenanthridine alkaloid này đều có hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư rất tốt, điển hình như các hợp chất nitidine,
chelerythrine, sanguinarine
1.2.1.2 Hop chat nitidine
Ngay từ năm 1976, hợp chất nitidine (1) (hay nitidine chloride) đã được công bồ trên tạp chí Caneer Research về khả năng ức chế sự sao chép ngược của RNÑA
virut gây ung thư và hoạt tính chống bạch cầu, gợi ý về khả năng chống ung thư của hợp chất này [43] Sau đó, nhiều nghiên cứu khác đã cho thấy nitidine có khả năng
chống bệnh bach câu [54], gây độc đối với tế bào ung thư cô tử cung HeLa S3, tế bào bạch cầu chuột LI210, tế bào ung thư phổi người A549, tế bào u xương ác tính ở người MG-63 [36, 39, 56], ngăn chặn quá trình di căn và x4m 14n in vivo cia ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư gan, ung thư thận [II, 17, 18, 32, 38] Nghiên cứu
gần đây nhất (2014) đã cho thấy nitidine có khả năng chống đi căn ung thư hầu,
thực quản [26, 37] Điều đáng quý ở đây là nitidine đã được chứng minh không gây
đột biến gen và có tác dụng gây độc chọn lọc đối với các tế bào ung thư so với tế bào lành tính Năm 1977, ngay sau công bố về khả năng ức chế hoạt tính sao chép
ngược của RNA virut gây ung thư và hoạt tính chống bệnh bạch cầu, gợi ý về khả
năng chống ung thư của nitidine (vào năm 1976), nhà nghiên cứu Sethi V.S đã ngay lập tức tiến hành đánh giá về khả năng gây đột biến gen của hợp chất benzophenanthridine alkaloid này do có sự khá tương đồng về cấu trúc hóa học với chất gây ung thư 5-methylchrysene Thật may mắn, két qua cho thay nitidine khong gây đột biến gen Nghiên cứu sâu hơn về mối liên quan hoạt tính - cấu trúc của các hợp chất này, tác giả đã đưa ra nhận định: chính sự có mặt của nguyên tử nitơ bậc 4
và của các nhóm methoxy trong cấu trúc của nitidine đã khiến cho hợp chất này có hoạt tính gây độc tế bào mà không gây đột biến gen như chất gây ung thư 5-
Trang 13CH;
5-methylchrysene
Mặt khác, trong một chương trình nghiên cứu nhằm tìm kiếm các chất chống ung thư ít gây tác dụng phụ, các nhà nghiên cứu Nhật Bản nhận thấy nitidine có tác dung gay doc in vitro chon loc đối với các tế bao ung thư so với các tế bào lành
tính, đối với cả các dòng tế bào ở người và ở chuột Khi nghiên cứu ¿ vivø trên mô
hình khối u ghép ngoại lai dưới da, nitidine có khả năng ức chế rất tốt sự sinh
trưởng của khối u phổi ác tính ở chuột và ở người mà không gây tác dụng phụ
(không ảnh hưởng đối với các chỉ số huyết thanh và không gây độc đối với gan) Khi nghiên cứu về mối liên hệ hoạt tính - cấu trúc, các tác giả nhận thấy rằng hợp
chất đihydronitidine cũng có tác dụng gây độc chọn lọc đối với các tế bào ung thư
giống như hợp chất nitidine trong khi demethylnitidine thì không Từ đó, các tác giả đưa ra nhận định: chính sự có mặt của nhóm thế methoxy ở vị trí C-& của khung
benzophenanthridine quyết định đặc tính này Nghiên cứu này đã đưa ra bằng chứng in vivo đầu tiên về khả năng chống ung thư ít gây tác dụng phụ của hợp chất alkaloid tự nhiên nitidine [23]
Dihydronitidine Demethylnitidine
Ngoài ra, hợp chất nitidine còn được chứng minh có hoạt tính chống sốt rét
rất tốt Theo nghiên cứu của Jerome Bouquet và D M.N Gakunju nitidine có kha
Trang 14chloroquine Do do hoat tinh chống sốt rét của nitiđine do đó có thê được cải thiện
bằng cách biến đổi cấu trúc của phân tử này dé tăng sự thâm nhập của không bao
tiêu hóa trong ký sinh trùng, nơi hemoglobin chuyên hoá diễn ra [60.6 1] 1.2.2 Tinh hình nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam, mặc dù cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitdum) được sử dụng từ lâu trong dân gian dé chữa bệnh và ở một số nơi được sử dụng làm gia vị (quả) hoặc rau ăn (lá non) nhưng các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tinh sinh hoc của cây thuốc này còn rất ít Cho đến nay mới chỉ thấy có công bó về thành phần hóa học tinh dầu quả xuyên tiêu của nhóm tác giả Nguyễn Xuân Dũng [3] và việc phân lập một số hợp chất stigmasterol, dihydrokeampferit, nitidine và epI-sesamin từ vỏ xuyên tiêu Thanh Hóa của nhóm tac gia Ng6 Xuan Luong [4, 5]
Nhìn chung, đây mới chỉ là các nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa học mà chưa có
các nghiên cứu về hoạt tính sinh học cũng như việc định lượng hàm lượng hoạt chất
nitiđine trong được liệu Xuyên tiêu ở Việt Nam đề định hướng khai thác hoạt chất
Trang 15CHƯƠNG 2: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là thân và cành cây Xuyên tiêu được thu hái tại Na Hang, Tuyên Quang vào tháng 2 năm 2015 Tên cây được xác định bởi nhà thực vật học TS Nguyễn Thế Cường - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên CAR và te ‘a La " = (41
Hình 1: Ảnh mẫu cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitdum)
2.2 Hóa chất, dụng cụ và các thiết bị dùng trong nghiên cứu 2.2.1 Hóa chất và dụng cụ a) Dụng cụ thí nghiệm: - Binh tam giac (500 ml, 1000 ml, 2000 ml) - Binh cau (250 ml, 500 ml, 1000ml1, 2000ml) - Ong nghiém - Binh thuy tinh 25 ml, 50 ml, 100 ml - Ong dong (50 ml,100 ml, 500 ml, 1000ml) -_ Các loại pipet, ống hút chia độ v.v b)_ Hóa chất:
- Dung mi, metanol, con, n-hexan, etylacetat, cloroform, aceton - Silicagel cd hat 40-60um va 23-40 um (Merk)
- Silicagel pha dao (YMC Cj)
Trang 162.2.2 Thiết bị dùng trong nghiên cứu -_ Hệ thống chiết nóng
- May cé quay chân không: Bũchi Rotavapor R- 114
-_ Cột sắc ký
- May siéu 4m: Elma, S60H
- Ban mong: TLC Silicagel 60 F254, Merck - Bom hút chân không
- Phéu chiét 2000ml
- Can ky thuat Precisa XT 620M
- Can phan tích Precisa XT 220A
- Đèn tử ngoại
- May do pho cộng hưởng tt hat nhan: Bruker Avance AMSOOFT-NRM (Viện Hóa học-Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam)
- May do phổ khối: ESI-MS: AGILENT 1100LC-MSD (Viện Hóa học- Viện
Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam)
-_ Máy đo phô hồng ngoại: 670-FTIR NICOLET-NEXUS (Viện Hóa học- Viện
Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam) - May do diém néng chay: Stuart SMP3
2.3 Phương pháp xử lý mẫu:
Mẫu thân và cành cây sau khi thu hái về được chặt nhỏ, sây đến khô ở nhiệt độ 60°C rồi được xay thành bột Bột dược liệu (Š kg) được ngâm chiết với dung môi
metanol trong bình chiết siêu âm ở nhiệt độ 50°C, lặp lại 3 lần (2 ngày/lần) Gộp
dịch chiết lại và cô quay đưới áp suất giảm đề thu hồi dung môi, thu được cao tông
metanol (màu nâu vàng, 180g) Hda tan cao tông metanol này trong 1000 ml nước cất rồi chiết phân bố lại lần lượt trong các dung môi n-hexan va etyl axetat, sau khi
cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết n-hexan (cặn A) và etyl axetat (cặn B) tương ứng Phần dịch nước còn lại được lọc và sau đó sắc ký trên cột dianion với hệ dung môi metanol:nước thu được các cặn C và D tương ứng
Trang 172.4 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp va phan lập các hop chat: Đề phân tích và phân tách các phần chiết của cây cũng như phân lập các hợp chất, các phương pháp sắc ký đã được sử dụng như: sắc ký lớp mỏng (TLC,
dùng để khảo sáU, sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột pha đảo
2.4.1 Sắc ký lớp móng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sắc ký lớp mỏng là phương pháp phân tích trong
đó chất phân tích di chuyền trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ theo một chiều nhất định Trong quá trình di chuyên mỗi thành phần chuyền dịch với tốc độ khác nhau tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại ở những vị trí khác nhau Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60 F554 (Merck 1,05715), RP\s Fassz4¿ (Merck) Dung môi triên khai sắc ký
là hỗn hợp của một số trong số các dung môi thường dùng như ø¡-hexan, cloroform,
etyl axetat, axeton, metanol và nước Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước
sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H;SO¿ 10 % trong cồn
hoặc thuốc thử dragendorft; thuốc thử được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ
nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu 2.4.2 Sắc ký cột (CC)
Trong sắc ký cột, chất hấp phụ hoặc chất làm nền cho pha cố định được
nhi trong các ống hình trụ được gọi là cột Nhờ vậy mà có thê triển khai dung môi
liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến phân cực mạnh Tùy theo tính chất của chất được sử dụng làm cột mà sự tách trong cột sẽ xảy ra theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ) hoặc theo cơ chế phân bố (cột phân bó) Kích thước cột và cỡ hạt silicagel phụ thuộc vào bản chất của hỗn hợp cần tách
Sắc ký cột được tiễn hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường, silicagel pha đảo Silicagel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh) và
0,015-0,040 mm Silicagel pha dao YMC (30-50 um, Fujisilisa Chemical Ltd.)
Nhựa trao đổi ion Dianion HP-20 (Misubishi Chem Ind Co., Ltd.)
Trang 182.5 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
Phương pháp chung dé xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết hợp giữa việc xác định các thông số vật lý với các phương pháp phô hiện đại
2.5.1 Phố hông ngoại IR
Các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong vùng
10.000 + 100.000 em” và biến thành năng lượng của dao động phân tử Phố hồng
ngoại được xây dựng dựa trên sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân
tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại Như vậy phô hồng ngoại là phổ
hấp thụ của 2 dạng năng lượng là năng lượng dao động và năng lượng quay
Tần số hay độ dài sóng hấp thụ của mỗi chất phụ thuộc vào khối lượng
tương đối của nguyên tử, liên kết và cấu trúc hình học của chúng Mỗi kiểu liên kết
được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau Do đó dựa vào phô hồng ngoại,
có thê xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất, ví dụ, đao động hóa trị của nhóm OH tự do trong nhóm hydroxyl là 3300, 3450 cm”, của nhóm cacbonyl trong khoảng 1700, 1750 cm”
2.5.2 Phố khối lượng (MS)
Máy khối phô sử dụng một chùm electron bắn vào một lượng rất bé chất
thử, phá chúng thành nhiều mảnh ion mang điện dương Các mảnh ion này nhờ bộ phận phát hiện và ghi thành pic với cường độ khác nhau tương ứng với lượng khối của mỗi ion
Phố khối lượng được ghi trên máy Agilent 1200 HPLC-MSD (Electrospray
ionization source-ESI hoac Atmospheric pressure chemical ionization-APCI) cua
Viện Hóa hoc các Hop chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2.5.3 Phố cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Pho cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phô hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay Với việc sử dụng kết hợp các kĩ thuật phô NMR một chiều và hai
chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc các hợp chat ké ca cau
trúc lập thể của phân tử Nguyên lý chung của các phương pháp phố NMR (phố
Trang 19proton va pho cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ ('H và ÝC)
dưới tác dụng của từ trường ngoài Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn
bằng độ dịch chuyền hóa học
Phổ 'H-NMR: Trong phô 'H-NMR do dich chuyén hoa hoc cua cac proton
được xác định trong thang TMS từ 0 ppm dén 14 ppm tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá
học của phân tử Mỗi loại proton cộng hưởng ở một trường khác nhau và vì vậy chúng được biêu diễn bằng một độ dịch chuyên hoá học khác nhau Dựa vào độ dịch chuyền hoá học, diện tích pic cũng như tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau mà người ta có thê xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất
Phố !ÍC-NMR: Phổ này cho tín hiệu phố vạch cacbon Mỗi nguyên tử cacbon ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu pho khac nhau Thang do cho
a 13
pho “°C-NMR cing dugc tinh bang ppm véi dai thang do rộng hơn so với phố
proton (ttr 0 ppm dén 240 ppm)
Pho DEPT: Phé nay cho các tín hiệu phô phân loại các bậc cacbon khác
nhau Trên phố DEPT 135 không cho tín hiệu của cacbon bậc 4, tín hiệu của CH và
CH; nam về một phía, còn tín hiệu của CH; nằm về phía đối diện Trên phổ DEPT 90 chỉ có duy nhất tín hiệu phổ của CH Kết hợp phổ 'ÌC-NMR và phổ DEPT sẽ
cho ta biết chính xác số cacbon bậc I, 2, 3, 4
Phô cộng hưởng từ hạt nhân được ghi trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Chất nội chuan 1a TMS (Tetrametyl Silan)
2.6 Điểm nóng chảy (M,)
Đối với chất rắn kết tinh thì điểm chảy là một tiêu chuẩn vật lý rất quan
trọng, nó là tiêu chuân dé đo mức độ tỉnh khiết của hợp chất Nếu điểm chảy của hai
loại tỉnh thê thu được qua hai lần kết tỉnh chênh lệch không quá 0,5°C thì sản phâm
kết tỉnh có thể đã tinh khiết Nếu một hợp chất kết tinh có điểm chảy còn thấp rất xa
so với điểm chảy lý thuyết thì chứng tỏ sản phẩm thu được chưa tỉnh khiết và phải tinh chế, kết tỉnh lại
Trang 20Điểm nóng chảy được đo trên may Kofler micro-hotstage của Viện Hoá học
các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2.7 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào
2.7.1 Phương pháp nudi cay té bao in vitro
- Các dòng tế bào ung thư: bao gồm 5 dòng tế bào ung thư (té bao ung thu
biểu mô thực quản (KB), tế bào ung thư va (MCF-7), té bao ung thư phổi LU-I, tế
bào ung thư gan Hep-G2, tế bào ung thư tuyến tiền liệt LNCaP)) do GS TS J.M Pezzuto, Truong Dai hoc Hawaii va GS Jeanette Maier, truong Dai hoc Milan, Italia cung cap
- Cac dong té bao ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường
nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM
HEPES, va 1,0 mM sodium pyruvate, ngoai ra b6 sung 10% fetal bovine serum —
FBS (GIBCO)
- Tế bào được cấy chuyên sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO;
ở điều kiện 37C, 5% CO¿
2.7.2 Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytfotoxie assay)
Phương pháp thử độ độc tế bào viro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa
Kỳ (National Cancer Institute - NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuân nham sang loc, phat hién cac chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diét TBUT ở điều kiện ¿n viro Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks (1991) Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tông số dựa
vao mat d6 quang hoc (OD — Optical Density) đo được khi thành phần protein của
tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD máy đo được tỉ lệ
thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng
protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thê như sau:
- Chat thir (10 pl) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96
giếng để có nồng độ nồng độ 100ug/ml1, 20 ug/ml; 4 pg/ml; 0.8 pg/ml; 0.16 pg/ml
Trang 21- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm đề làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm đề điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm
- Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190 pl méi trường) và để chúng phát triên trong vòng từ 2 ngày
- Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có TBUT (1801) sẽ được
sử dụng làm đối chứng ngày 0 Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cô định tế bào bằng Trichloracetic acid — TCA
- Sau giai đoạn phát triên trong tủ ấm CO, tế bào được có định vào đáy giếng
bang TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 °C Đồ bỏ SRB
và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng
- Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base dé hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của
chất nhuộm SRB qua pho hap phu ở bước sóng 515 nm Kha năng sống sót của tế
bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:
[OD(chắt thir) - OD(ngay 0)] x 100
% sống sót =
OD(đối chứng âm) - OD(ngày 0) % ức chế = 100% - % sống sót
- Các phép thử được lặp lại 3 lần đề đảm bảo tính chính xác Ellipticine
(Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các
nong d6 10 ug/ml; 2 pg/ml; 0,4 ng/ml; 0,08 ug/ml
DMSO10% luôn được sử dụng như đối chứng âm Giá trị ICso (nồng độ ức
chế 50% sự phát triển của tế bào) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính
TableCurve Chất thử nào có I[Czo < 20 ug/ml (voi chat chiét tho, hoặc với phân
đoạn hóa học) hoặc ICso < 4 Lig/ml (với hoạt chất tỉnh khiết) sẽ được xem là có hoạt
tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt TBUT
Trang 222.8 Phương pháp HPLC xác định hàm lượng hoạt chất nitidine trong các bộ
phận cua cây Xuyên tiêu [8]
Máy sắc ký lỏng LC Agilent 1200 Series (USA) Sử dụng hoá chất dùng cho phân tích HPLC (Merck, Đức) Cột sắc ký Zorbax Eclipse X-C18 (4,6
x150mm, 5um) va cét bảo vệ C18 cua hang Agilent Lugng mau bom 5 ul, st dụng
hệ thống bơm mẫu tự động có điều nhiệt, bơm và rửa kim sau khi nạp mẫu vào cột
Detector DAD hap thụ cực đại ở bước sóng 273 nm Nhiệt độ cột 35 °C Tốc độ
dong 0,3 ml/phút Hệ dung môi gradient acetonitrile (kênh A)/H;O (kênh B): chạy gradient kênh A từ 50%-80%, kênh B từ 50%-20%
Trang 23CHUONG 3: THUC NGHIEM
3.1 Xử lý mẫu thực vật và điều chế các cặn chiết từ mẫu thực vật
Thân và cành cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) sau khi thu hái về được rửa sạch và chặt nhỏ, sau đó sây đến khô ở nhiệt độ 60°C rồi nghiền thành bột
Bột mâu khô sau đó được ngâm chiêt đê điêu chê các cặn chiêt theo sơ đô trong Hình 2 Thân và cành cây Xuyên tiêu (Bột khô, 5kg)
-Ngâm chiết trong bình siêu âm ở nhiệt độ 50°C với dung môi metanol, 3 lân, 2 ngày/lân
-Cô quay dưới áp suât giảm đê thu hôi dung môi
Can chiết metanol tổng (180 g)
-Hòa trong nước cât -Chiét lại bang n-hexan
| -Cât loại dung môi dưới áp suat giam Ỷ Can chiết n-hexan (cặn A, 80 g) M Dịch nước
-Chiết tiếp bằng etylaxetat
Trang 243.2 Phân lập hop chat nitidine từ cặn chiết
Cặn D (7 g) được sau khi tiến hành rửa giải qua cột Dianion HP-20 với hệ dung môi MeOH-nước (0, 25, 50, 75, 100% MeOH), thu được 5 phân đoạn kí hiệu
từ ZN/D/I đến ZN/D/5 Phân đoạn ZN/D/5 được sắc ký trên cột silica gel pha
thường với hệ dung môi CHC]::MeOH (7:1, v/v) thu được 5 phân đoạn nhỏ, ký hiệu
từ ZN/D/5-1 đến ZN/D/5-5 Phân đoạn ZN/D/5-3 được sắc ký trên cột silica gel pha
đảo YMC C-18§ với hệ dung môi rửa giải MeOH:H¿;O (3:1, v/v) thu được chất ZN1 (chất rắn màu ngà vàng, 100 mg)
Sơ đồ chiết tách và phân lập các chất từ thân và cành cây Xuyên tiêu được
trình bày trong Hình 3
Trang 26C-NMR (125 MHz, DMSO) & (ppm): 105,74 (C-1), 148,40 (C-2), 148,85 (C-3), 104,56 (C-4), 119,92 (C-4a), 132,50 (C-4b), 151,29 (C-6), 132,48 (C-6a), 108,73 (C-7), 151,53 (C-8), 158,29 (C-9), 103,27 (C-10), 119,42 (C-10a), 132,56 (C-10b), 119,23 (C-11), 130,01 (C-12), 124,11 (C-12a), 102,70 (O-CH,-O), 51,41 (N-CH3;), 55,27 (8-OCH3;), 56,28 (9-OCH3)
3.4 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất ZN1
Hợp chất phân lập được ZN1 được thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên
5 dòng tế bào ung thư thử nghiệm là tế bào ung thư biểu mô người KB (human
nasopharyngeal epidermoid carcinoma cell line), tế bào ung thư phổi người LU-I (human lung adeno-carcinoma cell), tế bào ung thư vú người MCE7 (human breast adenocarcinoma cell line), tế bào ung thư gan người HepG2 (human liver
cancercell line) và tế bào ung thư tuyến tiền liệt người LNCaP
(human prostateadenocarcinoma cell line) Phuong phap thu nghiệm được mô tả
trong muc 2.7
3.5 Xác định hàm lượng hoạt chất nitidine trong các bộ phận của cây Xuyên
tiêu bằng phương pháp HPLC [8]
* Xây dựng đường chuẩn của nữtidine:
Cân | mg mau nitidine pha trong I ml dung môi (ACN/H;©) tỷ lệ (50/50), siêu âm trong vòng 10 phút ở nhiệt d6 30 °C Dung dich cac mẫu chuân được pha ở
các nông độ giam dan (100, 80, 50, 20, 10, 5, 1 ug/ml) Tiến hành chạy gradien trên
HPLC voi hé dung môi ACN/H;O
Hệ máy sắc ký được chạy ồn định trong vòng 15 phút với hệ dung môi ban
đầu dùng dé phân tích ACN/H;O (50:50) Mau nitidine được phát hiện bởi detector UV-Vis/DAD ở bước sóng 273 nm (bước sóng này được chọn thông qua khảo sát
quét đải bước sóng của nitidine, đồng thời kết hợp với tài liệu tham khảo [10]) Các tín hiệu píc cho thấy nitidine xuất hiện tại 6,258 phút
Trang 27¬ m / A | / 24 / tt rJ\/ 1 ° g4 t4 Vu ÁN : $:4 * z rv iz z ai i 1 3: xa tod i 2
Hình 4 a) Pho UV-Vis cia nitidine; b) Sac ky d6 HPLC cia nitidine
Duong chuan dinh lượng nitidine được xây dựng dựa trên các thang nồng do tt 1-100mg/g Duong chuẩn được tính toán dựa trên diện tích píc tại thời gian
lưu của nitdine Kết quả thu được đường thăng qua gốc tọa độ với hệ số tương quan R=0,99991 Điều này chứng tỏ rằng các giá trị thông số của phương pháp mà chúng
tôi đã lựa chọn cho hệ thong HPLC là phù hợp cho việc phân tích định lượng
Area + Nitidine at exp RT: 6.270
5000 ~ # DAD1 B, Sig=273,16 Ref=360,100 1 ra Correlation: 0.99991 4000 As Residual Std Dev.: 28.75981 1 Formula: y = mx + Ðb 1 m: 51.57162 ME 5 b: -17.77519 3 x: Amount[mg/g 2000 - y: Area 4 TÊN > 3 ñ 0 T T T T T T T T T T 0 50 100 Amount[mg/a]
Hình 5 Đường chuẩn định lượng nitidine
Độ lặp lại của phương pháp được xác định trên mẫu chuẩn bằng cách đo diện tích pic của 5 lần phân tích liên tiếp cho kết quả như Bảng 1
Trang 28Bang 1 Độ lệch chuẩn của nitidine STT ¡ Nông độ | Speak | STB | SD | RSD l 20ug/ml | 1027.5 20ug/ml | 1012.2 20ug/ml | 1021.8 | 1019.1 | 5.49 | 0.538% 2 3 4 20ug/ml | 1014.1 5 20ug/ml | 1019.9 Ghi chi: S peak - dién tích pic; STB - dién tich trung binh;
SD (Standard Deviation)-d6 léch chuadn; RSD (Relative Standard Deviation)-d6 lệch chuẩn tương doi
Kết quả cho thấy phương pháp có độ lặp lại tốt với độ lệch chuân 5,49 và
độ lệch chuẩn tương đối 0,538 %
Độ chính xác của phương pháp được xác định bằng sự thu hồi chất chuẩn trong phương pháp thêm Một lượng chính xác nitidine được thêm vào mẫu có nồng
độ biết trước, sau đó mẫu thêm được phân tích theo đúng quy trình đã phân tích Độ
thu hồi của nitidine được tính toán giữa hàm lượng mẫu thu hồi và lượng mẫu được
thêm vào Kết quả cho thấy phương pháp có độ chính xác cao với độ thu hồi trung bình là 99.84%, độ lệch chuẩn là 0,965%, độ lệch chuẩn tương đối là 0,966% Kết
quả thể hiện trên Bảng 2
Trang 29Bang 2: Độ chính xác của phương pháp phân tích nitidine
TT | Nitidine Nitidine | Nitidine Nitidine Độ thu
trong mẫu | thêm vào | phân tích thu hồi hồi
(ug/ml) (ug/ml) (ug/ml) (ug/ml) (%) 1 7.97 0.48 8.454 0.484 100.8 2 14.92 1.68 16.6 5.26 98.87 Độ thu hồi trung bình 99.84 Độ lệch chuân 0.965 Độ lệch chuẩn tương đối | 0.966
Như vậy, phương pháp định lượng nitidine bằng hệ sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC) đã được thực hiện với sự ồn định và lặp lại cao Đây sẽ là phương pháp tối ưu cho việc đánh giá và kiểm tra chất lượng dược liệu và chế phâm có sử dụng hoạt chất nitidine
* Định lượng nitidine trong các mẫu cặn chiết metanol của các bộ phận lá, quả,
cành, thân và rễ cây Xuyên tiêu:
Với các mẫu cặn chiết, cân 1 mg pha trong I ml dung môi (ACN/H;O) tỷ lệ
(50/50), siêu âm trong vòng 10 phút ở nhiệt độ 30 °C Tiến hành chạy gradien trên
HPLC với hệ dung môi ACN/H;O
Can chiết tông metanol của các bộ phận lá, quả, cành, thân và rễ cây Xuyên
tiêu được chúng tôi xử lý và bơm vào hệ máy HPLC Bước đầu định tính nitidine có
trong mẫu cặn chiết, sau đó chúng tôi dựa vào đường chuẩn và sử dụng phương
pháp hồi quy tuyến tính để đánh giá hàm lượng của nitidine có trong các mẫu
nghiên cứu
Trang 30CHUONG 4: KET QUA VA THAO LUAN
4.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất ZN1
Hợp chất ZN1 thu được dưới dang tinh thé hình kim màu vàng Trên phố
'H-NMR của hợp chất ZN1 cho thấy, trong vùng trường thấp xuất hiện hai tín hiệu
doublet cua hai proton cap ortho tai 5, 8,90 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-11), 8,29 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-12) cùng ba tín hiệu singlet đặc trưng cho 3 proton thơm khác tại ồn
7,77 (1H, s, H-1), 8,30 (1H, s, H-4), 7,89 (1H, s, H-7), 8,35 (1H, s, H-10); 6 vung
trường cao hơn, sự xuất hiện của một tín hiệu singlet tại ð 6,34 (2H, s) đặc trưng cho proton của nhóm metylendioxI (O-CH;-O), một tín hiệu singlet của nhóm N- CH; tai dy 4,89 (3H, s) va hai tín hiéu singlet khac tai dy 4,22 (3H, s) và 4,04 (3H,
s) tương ứng với 2 nhóm metoxy Các dữ liệu phố 'H-NMR trên gợi ý cho thấy hợp
chất ZN1 có cấu trúc khung benzophenanthridin khá đặc trưng ở các lồi Zanthoxylum ZN1-DMSO-1H $© œ œ0 œ œò gò [- f~ 4 0 8 5 Ø 9 7 9 2 4 1.890 26 4 022 453 377 500 497 a4 = ai <<
Hình 6: Phé ‘H-NMR cia hop chat ZN1
Nhan dinh trén duoc khang dinh thong qua phô 'SC-NMR két hop voi pho DEPT cho thay trong cau tric cua ZN1 xuat hién tin hiéu céng huong cua 21
Trang 31nguyên tử cacbon, trong đó gồm có 3 nhóm CH;, | nhém CH;, 7 nhóm CH và 10 cacbon bậc 4 4 ae HOOF TOMO MOM cà | \ ỷ NI Ụ WV $ S en tựwdÙ8i944ME9isi0iggstg T T T T T T T T T T 180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm Hinh 7: Phé “C-NMR cua hop chat ZN1 ZN1-DMSO-C13CPD &DEPT DEPT90 T T T M T T T T T T T T T r T T 170 160 150 140 130 120 120 100 %6 “0 ?9 60 50 40 30 20 ppm C13CPD
Hinh 8: Pho DEPT của hợp chất ZN1
Trên phô HSQC, cac proton cua nhóm dioximetylen tại ồn 6.34 (2H, s) có
tương tác với cacbon tương ứng tại ðc 102.71; các proton của 2 nhóm metoxy tại ði
4.22 (3H, s) và 4.04 (3H, s) có tương tác với cac cacbon tuong tng tai 6¢ 56.31 va
ðc 57.29 ppm
Trang 32° = — oO -_ — | — ~~ = 4 ầ —- t— - " š m¬ † —:.ˆ — Š ~- “—————.- = | —- — ` tư ~| + † m¬ 4 + abe + T T T 3 In - Sa me ¬ „ 3 uw “ w nN ~ ° "1 wo + a ow ee o co} ° co o ° o ° o o ° ° Hình 9: Phố HSỌC của hợp chất ZN1
Trên phô HMBC, proton tại ðn 4.89 (3H, s) của nhóm N-CH; có tương tác
voi cacbon C-4b (132.55 ppm), C-6 (151,29 ppm) va C-4 (104,55 ppm); proton cua
hai nhóm metoxy tai 6, 4.04 (3H, s, 8-OCH3) va 4.22 (3H, s, 9-OCH3) co tuong tac
Trang 33Phổ khối lượng EI-MS của ZN1 cho pic ion tại m⁄2 347 [M]” tương ứng với
công thức phân tử C;;H¡;NÑOi
Display Report - Selected Window Selected Analysis Analysis Name: 14031402.ơ Instrument: Agilent 6310 Jon Trap Print Date: 3/14/2014 11:04:08 Method: DO MSm Operator: Phong PTHC, Vien Hos HCTN Acq Date: 3/14/2014 fi458:14 AM Sample Name: 2N1 Analysis Info: wena, | TNS, Daman #108 x0’ j 1284 | 2⁄48 1 Loot ors 1 sd i 0254 ] ‹ o.oo 200 200 400 = s00 600 — 700 mỹ
MSD Trap Report v 4 (A4-Opt2) Page 1 of 1 Agar Yeckeolagss
Hình 11: Phé khéi lwong ESI-MS cia hop chat ZN1
Các số liệu phổ 'H-NMR, '°C-NMR cua hop chat ZN1 duoc déi chiéu so
sánh với hợp chất nitidine (Bảng 3) và cho thấy có sự trùng khớp
Trang 346a - 119,43 C - 119,76 7 7,89 (1H, s) 108,78 CH 7,86 (1H, s) 109,15 8 - 151,55 - 151,88 9 - 158,31 - 158,64 10 8,35 (1H, s) 103,26 CH 8,25 (1H, s) 103,37 10a - 132,09 C - 132,42 10b - 124,11 - 124,41 8,90 (1H, d, J = 9,0 8,77 (1H, d, J II 119,22 CH 119,41 Hz) = 9,0 Hz) 8,29 (1H, d, J = 9,0 8,22 (1H, d, J 12 130,03 CH 130,5 Hz) = 9,0 Hz) 12a - 132,49 C - 132,79 O-CH;-O 6,34 (2H, s) 102,71 CH, 6,30 (2H, s) 103,06 N-CH; 4,89 (3H, s) 51,42 CH; 4,85 (3H, s) 51,73 8-OCH; 4,04 (3H, s) 56,31 CH; 4,02 (3H, s) 56,67 9-OCH; 4,22 (3H, s) 57,29 CH; 4,19 (3H, s) 57,56
“Do trong DMSO, ’500 MHz, ‘125 MHz
Nhu vay, tong hợp các dữ liệu phô thu được trên đây, kết hợp với tài liệu tham khảo [40] hợp chất ZNÑ1 được xác định là nitidine và có cấu trúc như hình vẽ dưới đây
Hình 12: Cấu trúc hóa học của hợp chất nitidine
Trang 354.2 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất nitidine
Hợp chất nitidine được thử hoạt tính gây độc tế bào trên 5 dòng tế bào ung thư
thử nghiệm là tế bào ung thư biêu mô người KB, tế bào ung thư phổi người LU-I, tế
bào ung thư vú người MCF 7, tế bào ung thư gan người HepG2 và tế bào ung thư tuyến
tiền liệt người LNCaP Kết quả được đưa ra trong Bảng 4 dưới đây
Bảng 4 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất nitidine
Tên chất Dòng tế bào, ICs» (ug/ml)
thử KB LU-1 MCF-7 Hep-G2 LNCaP ZN1 0.27 +0.01 0.25+0.02 | 0.27+0.02 | 0.29+0.01 | 0.26+0.02 (Nitidine) Ellipticine | 0.41+0.02 | 0.31 40.02 | 0.38+0.05 | 0.35 +0.04 | 0.36+0.04 Kết quả thu được cho thấy, hop chat nitidine có kha năng ức chế rất mạnh
cả 5 dòng tế bào ung thư, mạnh hơn cả chất đối chứng ellipticine, với các giá trị
ICs) nam trong khoảng 0,25-0,29 ug/ml Kết quả này cho thấy hợp chat nitidine rat có tiềm năng trong việc tiếp tục nghiên cứu theo hướng tạo chế phâm chống ung
thư
4.3 Hàm lượng của hoạt chất nitidine trong các bộ phận lá, quả, cành, thân và
rễ cây Xuyên tiêu
Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ở trên cho thấy nitidine có khả năng ức chế rất mạnh cả 5 dòng tế bào ung thư nên rất có tiềm năng phát triên thành chất chống ung thư
Để tiến tới việc chiết xuất hoạt chất nitidine này từ nguồn nguyên liệu đạt hiệu quả nhất, chúng tôi đã tiến hành định lượng nitidine trong các mẫu cặn chiết
tông metanol từ các bộ phận khác nhau của cây Xuyên tiêu (lá, quả, cành, thân và rễ) bằng phương pháp HPLC
Cặn chiết tông metanol của các bộ phận lá, quả, cành, thân và rễ cây Xuyên
tiêu được chúng tôi xử lý và bơm vào hệ máy HPLC Dựa vào đường chuẩn và sử dụng phương pháp hồi quy tuyến tính để đánh giá hàm lượng của nitidine có trong các mâu nghiên cứu
Trang 36Sắc ký đồ thể hiện ham lượng nitiđine có trong các cặn chiết tổng metanol được chúng tôi đưa ra dưới Hình 13 và Bảng 5
Trang 37Bảng 5 Hàm lượng nitidine có trong các bộ phận lá, quả, cành, than và rễ cây Xuyên tiêu
Bộ phân cây Hàm lượng ni(idine Hàm lượng so với
trong cặn chiết (mg/g) nguyên liệu mẫu khô (%) Lá 0 0 Quả 4.37 0.012 Cành 5.65 0.054 Than 17.56 0.17 Ré 18.47 0.21 Kết quả thu được cho thấy nitidine có hàm lượng cao nhất trong rễ (0,21%), tiếp đó là trong thân (0,17 %), trong cành (0,054 %), chỉ có mặt với hàm lượng thấp trong quả (0,054 %) và không có trong lá Do vậy, việc khai thác chiết xuất hoạt chat nitidine từ các bộ phận rê hoặc thân cây Xuyên tiêu sẽ cho hiệu quả cao nhat
Trang 38CHUONG 5: KET LUAN
Trong khuôn khổ đề tài, chúng tôi đã thu được các kết quả sau:
- Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp, từ phần cặn chiết nước của thân cành cây Xuyên tiêu, đã phân lập được hợp chất alkaloid sạch, ký hiệu là ZN1
- Dựa trên các phương pháp phô hiện đại, đã xác định cấu trúc hóa học của
hop chat ZN1 1a nitidine
- Đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất nitidine phân lập được Kết qua cho thấy nitidine có kha năng ức chế rất mạnh cả 5 dong tế bào ung thư
(mạnh hơn cả chất đối chứng ellipticine) với các giá trị ICs nằm trong khoảng từ 0,25 dén 0,29 pg/ml
- Đã xây dựng phương pháp HPLC đề xác định hàm lượng hoạt chất nitidine ở trong các bộ phận lá, quả, cành, thân và rễ của cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum niidum) Kết quả cho thấy nitdine có mặt với hàm lượng cao nhất trong rễ (0,21%), sau đó là trong thân (0,17%) nhưng không có mặt ở lá và trong quả thì rất
ít Phương pháp HPLC nhanh, có thê dùng để định lượng nitidine trong mẫu thực
vật với độ chính xác cao, độ lặp lại tốt, độ lệch chuẩn tương đối và độ thu hồi lớn
(>90%) trong khoảng I—100ug/ml, với giới hạn định lượng là | pg/ml
Trang 39CONG TRÌNH CONG BO KHOA HOC CO LIEN QUAN DEN KHOA LUẬN
1 Nguyén Thi Héng V4n, Tran Thị Tuyên, Đinh Thị Thu Thủy, Nguyễn Đức Duy,
Phạm Viết Cường, Nguyễn Thị Vân Anh, Vũ Đình Hoàng, Nguyễn Ngọc Thành,
Nguyễn Thị Nhài, Cam Thị Ích, Phạm Thị Minh Diệp, Phạm Quốc Long, (2015),
Quantitative analysis of nitidine in Zanthoxylum nitidum by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection, Tap chi Khoa hoc va Cong
nghé, tap 53, số 4B, tr 67-73
Trang 40TAI LIEU THAM KHAO VIET NAM
I Đỗ Huy Bích và các tác giả (2004) Cây thuốc và động vật làm thuốc ở
Việt Nam, tập 2 Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật
2 _ Võ Văn Chi (1999) Từ điển cây thuốc Việt Nam Nhà xuất bản Y học
3 Nguyễn Xuân Dũng, Trịnh Hằng Nga, Pierre A Leclercq (1992) Một số
kết quả nghiên cứu cây Zanthoxylum nitidum, Tạp chí Dược học, 4, tr 21
4 Lê Văn Hạc, Đỗ Thị Ninh, Ngô Xuân Lương (2008), Phân lập và xác định
cấu trúc phân tử của một số hợp chất từ vỏ thân cây Xuyên tiêu
(Zanthoxylum nitidum DC.) 6 Thanh Héa, Tạp chí Hóa học và Ung dung,
6(78), tr 40-43
5 Lé Van Hac, Lé Thanh Ting, Ng6 Xuadn Lương, Nguyễn Xuân Ding
(2005) Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học lá cây xuyên tiêu Zanthoxylum nitidum 6 Thanh Hóa, Tạp chí Dược học, 5, tr 7-9
6 Phạm Hoàng Hộ (1992), Cây co Việt Nam, Nhà xuất bản trẻ
7 Đỗ Tắt Lợi (2001), Những cây thuốc và VỊ thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản
Y học
NƯỚC NGOÀI
8 _ Chang-Ping Jial and Fang Feng (2014), Optimization of the separation and
determination of nitidine and chelerythrine
in Zanthoxylum nitidum by High-Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection, Journal of Chromatographic Science, 52, p.164-168
9 Chan SL., Lee MC., Tan KO., Yang LK., Lee AS., Flotow H., Fu NY.,
Butler MS., Soejarto DD., Buss AD., Yu VC (2003), Identification of chelerythrine as an inhibitor of BclXL Function, J Biol Chem., 278(23),