Bài giảng Kỹ thuật di truyền

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦY LỢI Khoa Hóa Mơi trường – Bộ môn Công nghệ Sinh học KỸ THUẬT DI TRUYỀN Giảng viên: TS Lê Thị Ngọc Quỳnh Email: ngocquynhle@tlu.edu.vn Sách: [1] giảng giảng viên [2] Kỹ thuật gen, nguyên lý ứng dụng // Khuất Hữu Thanh Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội 2006 [3] Kỹ thuật di truyền ứng dụng // Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 2004 Bạn nhận thấy khác hai nhóm chuột? Kỹ thuật di truyền gì? Kỹ thuật di truyền thay đổi trực tiếp hệ gen sinh vật, để tạo nên tính trạng mong muốn Thay đổi hệ gen để tạo đặc điểm mong muốn với sinh vật khác Những sinh vật tạo nhờ kỹ thuật di truyền gọi sinh vật biến đổi di truyền enetically modified organisms (GMOs) ADN tái tổ hợp Lược sử phát triển GMO 1973: tạo vi khuẩn biến đổi gen 1974: chuột biến đổi di truyền 1982: GMOs thương mại hóa (vi khuẩn sản xuất insulin) 1994: Thực phẩm biến đổi di truyền bắt đầu bán thị trường 2003: Vật nuôi GMOs bắt đầu bán thị trường (Glofish) Qúa trình tạo GMO?  Tất thay đổi vật chất di truyền ảnh hưởng đến trình tổng hợp protein sinh vật  Bằng cách thay đổi protein tạo ra, kỹ thuật di truyền ảnh hưởng đến tính trạng tổng thể sinh vật sống  Biến đổi vật chất di truyền tạo vài phương pháp sau: • Chèn vật chất di truyền vào vị trí ngẫu nhiên có đích xác định • Trực tiếp thay gene • Loại bỏ gen • Đột biến gen tồn Vi khuẩn GMO • Vi khuẩn GMO phổ biến có cấu trúc đơn giản nên cho phép dễ dàng thao tác DNA • Một ứng dụng thú vị vi khuẩn biến đổi gen sản xuất hydrocacbon (nhựa nhiên liệu) thường có nhiên liệu hóa thạch • Vi khuẩn lam biến đổi để sản xuất nhựa (polyetylen) nhiên liệu (butanol) sản phẩm phụ q trình quang hợp • Vi khuẩn E.Coli biến đổi để sản xuất nhiên liệu diesel Thực vật GMO Kỹ thuật di truyền sửa đổi thực vật để giải vấn đề hàng ngày? (Xem xét nạn đói giới, vấn đề thời tiết, ô nhiễm thuốc trừ sâu…) 10 IV-Mục đích tách dịng Thiết lập ngân hàng gen Thiết lập ngân hàng cDNA Sản xuất protein, enzyme Sản xuất vaccine Sản xuất kháng sinh 10 IV-1- Ngân hàng hệ gen (genomic library) - Có mặt tất trình tự hệ gen tế bào - Các gen có trình tự nucleotide cấu trúc giống hệ gen tế bào tự nhiên, bao gồm trình tự điều hịa, trình tự DNA đệm, trình tự liên gen trình tự khơng mã hóa (intron) - Ở sinh vật nhân chuẩn, phần lớn trình tự DNA trình tự khơng mã hóa cho protein, đoạn trình tự lặp lại, trình tự đệm, trình tự điều khiển, bên cạnh gen cấu trúc - DNA hệ gen cấu trúc DNA đầy đủ phức tạp tế bào - Ý nghĩa : Ngân hàng hệ gen có ý nghĩa quan trọng việc lập đồ di truyền, giải mã trình tự hệ gen 10 IV-2-Ngân hàng cDNA ( cDNA library) • Chỉ tập hợp nhỏ phần hệ gen, gồm gen biểu • Các trình tự cDNA phản ánh trình tự sản phẩm mRNA hồn thiện sau q trình phiên mã, khơng phải trình tự thực đầy đủ gen tương ứng phân tử DNA hệ gen (khơng có trình tự điều khiển, promoter, operator, enhancer,…) • Phần lớn cDNA khơng phải có chiều dài đầy đủ phân tử mRNA • Các protein mã hóa cDNA tổng hợp (dịch mã) tế bào chủ mà khơng cần có máy hồn thiện phân tử mRNA (bao gồm q trình cắt intron) • cDNA có trật tự cấu trúc đơn giản DNA hệ gen 10 IV-2-Ngân hàng cDNA ( cDNA library) Mục đích: • Nghiên cứu biểu gen xác định vấn đề liên quan điều hịa gen • Nghiên cứu tương tác gen trình sống 10 VI Sàng lọc dòng gen ngân hàng gen 10 VI Sàng lọc dòng gen ngân hàng gen 10 VI Sàng lọc dịng gen ngân hàng gen • Có số phương pháp để tìm dịng gen mong muốn ngân hàng hệ gen: -Thông qua biểu sản phẩm gen tách dịng (ví dụ: enzyme, protein có hoạt tính,…) -Lai axit nucleic để tìm dịng tế bào mang trình tự mong muốn -Nhận biết sản phẩm gen nhờ phản ứng miễn dịch • Phương pháp xác định dịng gen thơng qua biểu gen áp dụng sản phẩm gen trạng thái biểu chức Ví dụ: gen mã hóa enzyme chuyển hóa tổng hợp chất dinh dưỡng xác định nhờ nuôi cấy môi trường chọn lọc 10 TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦY LỢI Khoa Hóa Mơi trường – Bộ môn Công nghệ Sinh học DNA tái tổ hợp biểu gen Giảng viên: TS Lê Thị Ngọc Quỳnh 11 Vector biểu 11 1 Đặc điểm cấu trúc vector biểu • Vector biểu gen vector tách dòng mang promoter mạnh, cho phép biểu đồng thời gen thị gen tách dòng để tạo sản phẩm protein lai • Vector biểu gồm thành phần chủ yếu: (1) Promoter mạnh; (2) trình tự chép (ori); (3) Vị trí khởi đầu phiên mã; (4) Vị trí bám ribosome; (5) Tín hiệu kết thúc dịch mã; (6) Các trình tự đa cắt nối (MCS); (7) Các gen thị… 11 Các loại promoter thường sử dụng vector biểu gen • Vector biểu gen tế bào prokaryote: thường sử dụng promoter mạnh thực khuẩn thể (T7 promoter, T3 promoter,…) số promoter mạnh vi khuẩn (lac promoter, trp promoter, lac UV5 promoter…) promoter thích hợp với nhiều loại RNA polymerase 11 3 Các loại promoter thường sử dụng vector biểu gen • Trong vector biểu gen, vị trí cài gắn đoạn DNA tách dịng sau promoter vị trí trước kết thúc phiên mã gen thị Tùy theo cấu trúc đặc trưng đoạn gen tách dòng loại promoter để lựa chọn vị trí gắn gen tách dịng thích hợp Ví dụ: sử dụng vector tách dịng có gen lacZ, gen cần tách dịng thường gắn cuối gen lacZ 11 4 Các hệ thống biểu gen 4.2 Biểu gen Baculovirus nuôi tế bào trùng Baculovirus nhóm virus kí sinh 600 lồi trùng khác nhau, Baculovirus loại tế bào chủ cho phép biểu gen mã hóa loại protein có kích thước 50 kD Baculovirus cải biến gen thường gắn thêm promoter cực mạnh gen mã hóa protein vỏ virus Baculovirus ni cấy tế bào trùng cho phép biểu nhiều loại protein người α-interferon, β-interferon, adenosine, interleukin 2,… 11 Các hệ thống biểu gen 4.3 Biểu gen tế bào nấm men • Nấm men nhóm tế bào chủ sử dụng rộng rãi biểu gen sinh vật bậc cao • Nấm men S Ceseivisiae Pichia Pastoris tế bào biểu gen ưa chuộng hệ thống biểu gen 11 Các hệ thống biểu gen 4.3 Biểu gen tế bào động vật bậc cao Ưu điểm: • Tế bào động vật bậc cao cho phép biểu protein kích thước lớn 50 kD • Các vector biểu gen thường có promoter mạnh SV40, CMV cho phép thực phản ứng glycosyl hóa cắt chuỗi tín hiệu xác Một số hạn chế: • Chỉ biến nạp xung điện • Thời gian sàng lọc lâu • Ni cấy phức tạp, giá thành cao 11