Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng
Sắc ký lỏng là quá trình tách chất diễn ra trên cột tách, với pha tĩnh là chất rắn hoặc chất lỏng và pha động là chất lỏng Mẫu phân tích được đưa lên cột dưới dạng dung dịch, trong khi các chất phân tích phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Do sự khác biệt về cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa, các chất trong hỗn hợp tương tác với pha tĩnh và pha động khác nhau, dẫn đến việc chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách biệt ra khỏi nhau.
Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
Pha động trong sắc ký lỏng
Pha động hoặc chất rửa giải là dung môi có độ tinh khiết cao hoặc hỗn hợp các dung môi
Các chất phụ gia như muối, axit, bazơ, thuốc thử, cũng có thể được hòa tan trong pha động và phải tan hoàn toàn
Chất rửa giải cần được lọc qua màng 0,45μm để giữ lại các hạt mịn lớn hơn 0,5μm Việc này không được can thiệp vào phương pháp phát hiện; ví dụ, nếu sử dụng máy dò UV, pha động phải trong suốt về mặt quang học ở bước sóng đã chọn.
Nên chọn dung môi chuyên dụng cho máy HPLC để đảm bảo hiệu suất tối ưu Ngay cả nước, thành phần thường dùng trong chất rửa giải, cũng cần đạt tiêu chuẩn HPLC nếu không có hệ thống lọc nước siêu tinh khiết Đồng thời, các chất phụ gia cũng phải tương thích với máy dò để đảm bảo kết quả phân tích chính xác.
Pha động có thể chia làm 2 loại:
Pha động có độ phân cực cao chủ yếu chứa nước, nhưng để phân tích các chất hữu cơ, cần bổ sung dung môi nhằm giảm độ phân cực Loại pha động này thường được sử dụng trong sắc ký pha ngược.
Pha động có độ phân cực thấp bao gồm các dung môi như cyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), CCl4 và toluene Để tách một nhóm chất, việc sử dụng pha động đơn thành phần có thể không đủ hiệu quả, do đó thường kết hợp 2 hoặc 3 dung môi để tạo ra pha động có độ phân cực từ thấp đến cao, phù hợp với yêu cầu phân tích Sự thay đổi trong thành phần pha động theo thời gian được gọi là gradient pha động.
Bộ phận khử khí (degasser)
Bộ khử khí là một phần của thiết bị HPLC Khử khí cho phép máy bơm và máy dò hoạt động bình thường
Khử khí là bước cần thiết trong phân tích vết sắc ký, giúp giảm nhiễu của đường cơ sở Quá trình này có thể thực hiện bằng cách sử dụng hệ thống chân không có màng thấm khí hoặc làm sạch bình chứa dung môi bằng heli.
Bơm (pump)
Quá trình phân tách HPLC diễn ra ở áp suất từ 50 đến 300 bar (0,5–3 × 10 Pa), với tốc độ dòng chảy thường dao động từ 0,5 đến 2 ml/phút, và có thể giảm xuống 0,1 ml/phút khi sử dụng cột có lỗ hẹp.
Máy bơm cần đảm bảo cung cấp dòng pha động chính xác tại mọi tốc độ dòng, không bị xung nhịp, bất kể độ nhớt của dung môi và áp suất ngược của cột.
Injector, Autosampler
Thể tích mẫu thường được sử dụng trong phân tích bằng HPLC dao động từ 10 đến 100 µl Mẫu có thể được bơm vào hệ thống thông qua van tiêm một cách thủ công hoặc bằng cách sử dụng bộ lấy mẫu tự động.
Bộ lấy mẫu tự động là thiết bị phổ biến trong hầu hết các hệ thống HPLC, cho phép phân tích mẫu hiệu quả Các mẫu được cho vào lọ nhỏ (ví dụ 2 ml), đậy nắp và đặt vào giá đựng mẫu Để khảo sát các mẫu không bền nhiệt, giá đỡ làm mát có sẵn trên thị trường Lượng mẫu tối thiểu cần thiết cho bộ lấy mẫu tự động dao động từ 10 àl đến 50 àl, tùy thuộc vào cấu tạo và chi tiết của lọ Lưu ý rằng không có thiết bị nào có thể bơm toàn bộ lượng chất lỏng trong lọ, một phần sẽ luôn được để lại.
Tiêm mẫu thủ công là một giải pháp hữu ích khi không đủ mẫu Thay vì sử dụng các lọ, người dùng có thể tiêm trực tiếp từ các đĩa giếng, miễn là có giá đỡ phù hợp.
Cột sắc ký
Cột là thành phần thiết yếu của máy sắc ký, nơi diễn ra quá trình phân tách Nó được thiết kế dưới dạng ống thép không gỉ với đường kính trong khoảng 2 – 4,6 mm và chiều dài từ 5 đến 30 cm.
Cột HPLC được nhồi với các hạt có đường kính từ 3 đến 10 mm, thường sử dụng silicagen hoặc silicagen được bọc một lớp hữu cơ Ngoài silicagen, các chất khác như Al2O3, hạt polime xốp và hạt trao đổi ion cũng được áp dụng Các cột vi mô có đường kính trong nhỏ hơn 1 mm có sẵn và chỉ nên sử dụng với thiết bị HPLC vi mô đặc biệt Cột được lắp đặt giữa van kim phun và đầu báo để đảm bảo hiệu suất tối ưu trong quá trình phân tích.
Hình 1.1 Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao
Hầu hết các cột đều không có hướng dòng chảy định trước nhưng một khi cột đã được sử dụng, dòng chảy không được đảo ngược
Tiền cột là bộ phận quan trọng trong hệ thống HPLC, có chức năng bảo vệ cột khỏi bụi bẩn và tắc nghẽn, đồng thời dễ dàng thay thế khi cần Để đảm bảo hiệu suất tách hiệu quả, việc kiểm soát nhiệt độ cột là cần thiết, đặc biệt khi làm việc ở nhiệt độ cao Do đó, lò cột trở thành một phần tiêu chuẩn trong nhiều thiết bị HPLC và có thể được lắp đặt sau này.
Đầu dò (detector)
Trong HPLC, mẫu được đưa vào cột từ một đầu và các peak tách biệt được rửa giải ở đầu kia Vì nồng độ của các thành phần rất thấp và dải rửa giải hẹp, nên cần sử dụng thiết bị có độ tinh vi cao để phát hiện chúng.
Máy dò được sử dụng để đo các đặc tính quan trọng của chất rửa giải, như chiết suất và độ dẫn điện Hầu hết các máy dò được thiết kế để phát hiện các hợp chất dựa trên các đặc tính cụ thể Một số loại đầu dò phổ biến bao gồm UV/VIS, huỳnh quang, chỉ số khúc xạ, độ dẫn điện, điện hóa, tán xạ ánh sáng bay hơi cho các hợp chất không bay hơi, và máy dò phân cực.
HPLC có thể được kết hợp trực tuyến với phổ khối MS hoặc phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Máy dò chuyển đổi các hiện tượng quan sát được thành tín hiệu điện, chủ yếu là điện áp.
Bộ xử lý dữ liệu
Các tín hiệu từ máy dò được hiển thị trên màn hình hoặc giấy dưới dạng đồ thị cường độ theo thời gian, cung cấp thông tin định tính và định lượng Những sắc ký đồ này cho biết liệu có các peak rửa giải hay không và thời điểm xuất hiện của chúng, đồng thời cho phép xác định kích thước của các pic.
Việc xác định và tính toán kích thước pic cần thiết thường được thực hiện qua máy tính, đồng thời cũng đóng vai trò quan trọng trong việc điều khiển toàn bộ thiết bị HPLC.
Dung môi thải
Một nhược điểm của HPLC là chi phí cao và sự cần thiết phải sử dụng các dung môi độc hại hoặc có hại cho môi trường Để giảm thiểu khối lượng dung dịch rửa giải và lượng dung môi thải, việc sử dụng các cột có đường kính bên trong nhỏ, chẳng hạn như 3, 2 hoặc 1 mm, thay vì các cột 4,6 mm thông thường là giải pháp hiệu quả.
Dây nối
Các bộ phận của máy sắc ký được kết nối qua ống mao dẫn có đường kính 0,25 hoặc 0,18 mm, làm từ thép không gỉ hoặc nhựa chịu hóa chất Tuy nhiên, không phải tất cả các vật liệu đều tương thích với mọi pha động, và nhựa có giới hạn áp suất tùy thuộc vào thành phần hóa học, độ dày thành và pha động sử dụng.
Thiết kế gradients
Hệ thống HPLC được mô tả trong Hình 1.2 với chỉ một bình chứa dung môi, cho thấy chế độ phân tách đẳng dòng Trong chế độ này, thành phần pha động giữ nguyên trong suốt quá trình phân tích sắc ký Đỉnh sắc ký xuất hiện muộn sẽ có hình dạng rộng hơn và độ cao thấp hơn.
Hình 1.3 Sắc ký đồ của mẫu chạy đẳng dòng
Việc tách hợp chất trong hình 1.3 sử dụng chế độ chạy đẳng dòng có giới hạn về số lượng hợp chất có thể tách Đối với hỗn hợp phức tạp, cần áp dụng chế độ gradient, trong đó thành phần dung dịch rửa giải thay đổi trong quá trình phân tách Điều này có thể thực hiện bằng cách sử dụng hai hoặc nhiều máy bơm cho từng dung môi và một bộ phận trộn, tạo thành thiết kế gradient áp suất cao Một giải pháp tiết kiệm hơn là sử dụng một máy bơm duy nhất và điều chỉnh tỷ lệ dung môi bằng van chuyển mạch điều khiển bằng máy tính, tương ứng với thiết kế gradient áp suất thấp.
Sử dụng gradient trong phân tích, thời gian tách có thể kéo dài tới một giờ, cho phép phân tích các hỗn hợp phức tạp Các hợp chất trong hỗn hợp có thể có tính chất tương tự hoặc khác biệt rõ rệt Đặc biệt, không có sự mở rộng đỉnh cao đáng kể theo thời gian.
Hình 1.4 So sánh hai giản đồ của sự phân tách bằng chế độ đẳng dòng (trái) và gradient (phải)
Hạn chế của việc phân tách theo gradient là cần thời gian để hệ thống trở lại trạng thái ban đầu, điều này ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình.
Phân tích bằng HPLC
Phân tích định tính
Một peak sắc ký cho thấy sự hiện diện của hợp chất rửa giải chưa xác định Để nhận diện các chất phân tích hoàn toàn mới, việc sử dụng các kỹ thuật quang phổ, đặc biệt là khối phổ, là cần thiết Sự kết hợp giữa máy HPLC và đầu dò quang phổ đóng vai trò quan trọng trong quá trình này.
UV, MS và NMR cho phép làm sáng tỏ cấu trúc ngay lập tức
Trong nhiều trường hợp, bản chất của các chất phân tích đã được xác định và có thể kiểm tra bằng cách tiêm chất chuẩn Để chứng minh sự đồng nhất, chất chuẩn và hợp chất chưa biết cần có thời gian lưu giống nhau trong nhiều hệ thống phân tách khác nhau, bao gồm cả pha bình thường và pha đảo ngược hoặc pha đảo ngược và trao đổi ion.
Phân tích định lượng
Có thể sử dụng diện tích peak hoặc chiều cao peak để định lượng
Mối quan hệ giữa lượng chất phân tích và kích thước peak được mô tả qua hệ số đáp ứng thực nghiệm, do đó cần thực hiện phân tách hiệu chuẩn với nồng độ đã biết để định lượng chính xác Nếu peak của chất phân tích được phân giải tốt, có thể sử dụng hợp chất chuẩn tinh khiết; ngược lại, nên dùng chất đối chiếu hỗn hợp hoặc hòa tan hợp chất đối chiếu trong hỗn hợp nhân tạo Cách tiếp cận này giúp hiệu chuẩn trong điều kiện thực tế Đường chuẩn theo thể tích thường có 5–8 điểm tham chiếu với nồng độ khác nhau, trong đó nồng độ chất phân tích dự kiến của mẫu cần nằm giữa dải hiệu chuẩn.
Phương pháp nội chuẩn
Trong nhiều phương pháp phân tích định lượng, việc sử dụng chất nội chuẩn là rất quan trọng Chất nội chuẩn có độ tương đồng hóa học cao với các chất phân tích, chẳng hạn như đồng phân, giúp đảm bảo tính chính xác trong quá trình chuẩn bị mẫu và sắc ký.
Chất nội chuẩn được bổ sung vào cả mẫu thử và mẫu tham chiếu với lượng giống nhau Dựa vào tỷ lệ khối lượng hoặc nồng độ đã biết của chất nội chuẩn và chất phân tích trong mẫu chuẩn, có thể xác định lượng "thực" của chất phân tích trong mẫu thông qua việc so sánh tỷ lệ kích thước peak.
Phương pháp này có khả năng bù đắp đáng kể cho sự mất mát của chất phân tích trong quá trình chuẩn bị mẫu hoặc các vấn đề liên quan đến tiêm mẫu.
Chuẩn bị mẫu
Chiết lỏng - lỏng
Chiết lỏng – lỏng là phương pháp tách hai chất lỏng không hòa tan vào nhau có khả năng tách pha.
- Cho hỗn hợp mẫu vào phễu chiết (hoặc ống ly tâm, tùy theo lượng mẫu có được)
- Lắc đều và để yên để hỗn hợp tách pha.
Để chiết xuất chất phân tích, đầu tiên cần bay hơi dung môi hữu cơ Sau đó, sử dụng nước để chiết lại thành pha nước, hòa tan chất vào dung môi hữu cơ Tiến hành lắc dung dịch với đệm bazo, và cuối cùng áp dụng sắc ký pha đảo hoặc trao đổi ion để tách biệt các thành phần.
- Hòa tan chất cần phân tích vào dung môi pha động.
Chiết pha rắn
Hình 1.5 Quy trình chiết pha rắn
Bước 1: Chuẩn bị cột chiết (pha tĩnh là chất rắn, thường là silicagel, pha động là hỗn hợp dung môi A)
Bước 2: Cho mẫu vào cột chiết.
Bước 3: Các chất trong mẫu được hấp phụ vào cột.
Bước 4: Rửa giải các tạp chất hoặc chất ảnh hưởng bằng dung môi B.
Bước 5: Rửa giải chất phân tích bằng dung môi C.
Ưu và nhược điểm của phương pháp
Ưu điểm
- Khả năng định lượng tốt, độ chính xác cao
- Có khả năng định lượng đồng thời các chất có độ phân cực gần nhau
- Lượng mẫu phân tích nhỏ.
Nhược điểm
- Thời gian làm sạch và ổn định cột sau các lần chạy lâu
- Cột dễ bị nghẹt nếu không xử lý mẫu kỹ.
Sự cố và xử lý
Đường nền bị nhiễu
Bộ phận của máy HPLC hoạt động kém
- Thay thế khóa của bơm Làm sạch van một chiều của bơm hoặc thay thế chúng.
- Kiểm tra tất cả các bộ phận xem có rò rỉ không
- Thay đèn UV hoặc đèn huỳnh quang sau khoảng thời gian được ghi trong sách hướng dẫn
- Di chuyển thiết bị đến nơi không làm ảnh hưởng đến điện trường, gió lùa, dao động nhiệt độ hoặc ánh nắng trực tiếp.
Pha động không được hòa trộn đều
- Đối với phân tách đẳng dòng, nên chuẩn bị dung dịch rửa giải trong một chai duy nhất thay vì trộn các thành phần trong thiết bị
Ngay cả khi sử dụng phân tách gradient, có thể quan sát thấy đường nền bị nhiễu thấp hơn nếu pha động ban đầu, chẳng hạn như 80% nước với phụ gia và 20% dung môi hữu cơ, được trộn sẵn trong bình chứa A.
Bộ khử khí kém có thể gây ảnh hưởng đáng kể đến kết quả Đặc biệt, trong một số tình huống như phát hiện điện hóa, việc áp dụng quy trình khử khí hai bước, bao gồm helium và chất khử khí màng, là rất cần thiết để đảm bảo độ chính xác.
Dung môi và thuốc thử phải tương thích với đầu dò
Để đạt được chất lượng tốt khi sử dụng, cần tránh việc sử dụng thuốc thử có khả năng tương thích hoàn hảo với tia UV để phát hiện điện hóa và ngược lại.
Trong nhiều tình huống, việc không sử dụng hệ pha cho detector có thể dẫn đến các hiện tượng không mong muốn, như sự xuất hiện của các cực đại phụ hoặc cực đại âm Điều này đặc biệt quan trọng khi cần phát hiện tia cực tím ở bước sóng 210 nm hoặc thấp hơn.
Hằng số thời gian của máy dò quá thấp
Khi lựa chọn hằng số thời gian trong lần tiếp theo, hãy chọn giá trị cao hơn, nhưng cần thận trọng với hằng số thời gian quá cao vì nó có thể gây ra hiện tượng cắt đỉnh.
Trôi đường nền cơ sở
Trôi đường cơ sở là kỹ thuật phổ biến trong phân tách gradient, với độ dốc phụ thuộc vào thành phần pha động và máy dò sử dụng Việc sử dụng thuốc thử và dung môi chất lượng cao là điều kiện tiên quyết Ngoài ra, cần lưu ý rằng một số nguyên tắc phát hiện, như chỉ số khúc xạ, có thể không tương thích với gradient.
Hiện tượng trôi có thể quan sát được khi nhiệt độ dao động, do sự thay đổi thành phần của các pha động đã trộn sẵn, như bay hơi và khử khí heli quá mạnh Điều này cũng xảy ra khi quá trình bơm không hoàn toàn hoặc thời gian cân bằng cột quá ngắn khi dung dịch rửa giải bị thay đổi.
Hình dạng đỉnh kém
Hình dạng đỉnh kém, đuôi mạnh hoặc sự xuất hiện của các đỉnh kép là dấu hiệu cho thấy cột đã không còn phù hợp với mục đích sử dụng và cần được thay thế.
Hiện tượng nối đuôi trong hệ thống HPLC có thể xảy ra do thể tích cột phụ quá lớn, như ống mao dẫn có đường kính lớn, phụ kiện và kết nối kém giữa các bộ phận thiết bị, hoặc do khóa roto bị mòn Đầu dò với thể tích bên trong cao cũng góp phần vào hiện tượng này Hình dạng đỉnh không đối xứng hoặc có đuôi thường là kết quả của thể tích hoặc nồng độ mẫu quá cao, và giải pháp đơn giản là bơm thể tích nhỏ hơn hoặc pha loãng mẫu Ngoài ra, hình dạng pic kém có thể xuất phát từ nồng độ đệm quá thấp, việc làm việc với hệ thống không có bộ đệm cần thiết, hoặc việc sử dụng hệ thống pha không thuận lợi.
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
Nguyên tắc của phương pháp PCR
PCR là phương pháp tạo ra số lượng lớn chuỗi DNA từ một mẫu DNA ban đầu Mẫu DNA này có thể là bộ gen, DNA phiên mã ngược từ RNA, hoặc DNA ty thể.
Kỹ thuật này bao gồm ba giai đoạn: biến tính, lai ghép với mồi và kéo dài Mỗi sản phẩm của từng bước tổng hợp đóng vai trò là khuôn mẫu cho các bước tiếp theo, dẫn đến sự khuếch đại theo hàm mũ.
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) diễn ra trong một hỗn hợp bao gồm DNA khuôn mẫu, Taq polymerase, các đoạn mồi và bốn loại deoxyribonucleoside triphosphat (dNTPs) với nồng độ dư thừa trong dung dịch đệm.
Các ống chứa hỗn hợp mẫu trải qua nhiều chu kỳ nhiệt độ liên tục trong khối gia nhiệt của bộ tuần hoàn nhiệt Thiết bị này có vỏ bọc bảo vệ, cho phép các ống mẫu được lắng đọng và điều chỉnh nhiệt độ một cách nhanh chóng và chính xác trong khoảng từ 0 đến 100°C nhờ vào hiệu ứng Peltier.
Thiết bị này cho phép lập trình thời gian và sự liên tiếp của các chu kỳ nhiệt độ trong quy trình PCR, bao gồm ba giai đoạn với mỗi chu kỳ kéo dài vài chục giây.
2.1.1 Giai đoạn biến tính Đây là giai đoạn phân tách của hai sợi DNA, thu được bằng cách tăng nhiệt độ.Thời kỳ đầu tiên thực hiện ở nhiệt độ 94°C, gọi là nhiệt độ biến tính Ở nhiệt độ này,DNA mẫu, đóng vai trò là chất nền trong quá trình sao chép bị biến tính.
Hình 2.1 Giai đoạn biến tính DNA mẫu
Các liên kết hydro không thể duy trì ở nhiệt độ cao hơn 80°C do đó DNA sợi kép bị tách thành 2 DNA sợi đơn (single-stranded DNA).
Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ từ 40 đến 70°C, đây được gọi là nhiệt độ lai mồi
Giảm nhiệt độ cho phép các liên kết hydro mới được hình thành và do đó các sợi đơn được bổ sung để lai hóa
Các đoạn mồi ngắn và trình tự sợi đơn bổ sung cho các vùng bên hông DNA được khuếch đại giúp quá trình lai ghép trở nên dễ dàng hơn so với DNA mẫu sợi dài Nhiệt độ lai hoá cao hơn sẽ tạo ra sự chọn lọc và đặc hiệu cao hơn trong quá trình này.
Giai đoạn thứ ba của quá trình PCR diễn ra ở nhiệt độ 72°C, được gọi là nhiệt độ kéo dài Tại nhiệt độ này, enzyme Taq polymerase gắn kết với DNA sợi đơn đã được mồi và xúc tác quá trình sao chép bằng cách sử dụng deoxyribonucleoside triphosphat có trong hỗn hợp phản ứng.
Do đó, các vùng của DNA khuôn mẫu ở cuối của mồi được tổng hợp một cách chọn lọc.
Hình 2.3 Giai đoạn kéo dài
Trong chu kỳ tiếp theo, các đoạn được tổng hợp từ chu kỳ trước sẽ trở thành khuôn mẫu Sau một vài chu kỳ, đoạn gen ưu thế sẽ tương ứng với trình tự DNA giữa các vùng mà mồi lai với nhau.
Để tổng hợp một lượng DNA có thể phân tích được, cần thực hiện từ 20 đến 40 chu kỳ, tương đương khoảng 0,1 μg DNA Theo lý thuyết, mỗi chu kỳ sẽ làm tăng gấp đôi số lượng DNA so với chu kỳ trước đó.
PCR là phương pháp hiệu quả để khuếch đại các trình tự DNA có kích thước dưới 6 kilobase Phản ứng PCR diễn ra nhanh chóng, thường chỉ mất từ 2 đến 3 giờ cho 30 chu kỳ.
Hình 2.4 Sơ đồ tổng hợp các bước của phương pháp PCR
Thành phần chủ yếu của phương pháp PCR
Các đoạn mồi là những đoạn nhỏ của chuỗi DNA nhân tạo, đây là những đoạn bổ sung ở đầu 3′ của mỗi sợi DNA đích
Các đoạn mồi thường bao gồm 20–30 nucleotide.
Mồi là các DNA sợi đơn, và việc lai ghép trên các trình tự lân cận trình tự mục tiêu cho phép sao chép có chọn lọc.
Taq polymerase là enzyme DNA polymerase quan trọng, chịu trách nhiệm tổng hợp sợi DNA mới Enzyme này gắn kết ở đầu cuối của đoạn mồi và tiếp tục thêm các nucleotide mới vào sợi DNA ở đầu 3′, bổ sung cho DNA đích.
Nhiệt độ cao lên đến 94°C là cần thiết để tách DNA sợi kép, nhưng DNA polymerase thông thường sẽ bị phá vỡ ở mức nhiệt này Đặc biệt, Taq polymerase có khả năng hoạt động hiệu quả trong điều kiện nhiệt độ cao, điều này giúp quá trình sao chép DNA diễn ra thuận lợi.
Taq DNA polymerase này được chiết xuất từ vi khuẩn Thermus aquaticus Những vi khuẩn này sống trong suối nước nóng và có thể tồn tại ở đó.
Deoxynucleotide triphosphat (dNTP), bao gồm dATP, dCTP, dGTP và dTTP, là nguyên liệu thiết yếu cho việc tổng hợp các sợi DNA mới Taq polymerase sử dụng các dNTP từ dung dịch làm việc và gắn chúng vào đầu mồi, giúp kéo dài chuỗi DNA hiệu quả.
DNA cần khuếch đại được chiết xuất từ mẫu.
Dung dịch đệm tạo môi trường hóa học tối ưu cho phản ứng xảy ra.
Magie clorua hoạt động như một đồng yếu tố của enzym Taq polymerase.
Phát hiện và phân tích sản phẩm PCR
Sản phẩm của PCR bao gồm một hoặc nhiều đoạn DNA có trình tự quan tâm Việc phát hiện và phân tích các sản phẩm này có thể được thực hiện nhanh chóng thông qua phương pháp điện di trên gel agarose hoặc acrylamide.
DNA được phát hiện bằng cách sử dụng ethidium bromide, cho phép quan sát ngay lập tức các sản phẩm khi chiếu tia cực tím (280–320 nm) Các sản phẩm nhỏ thường hiển thị gần mặt trước dưới dạng nhiều hoặc ít dải khuếch tán, tương ứng với các chất dimer của mồi và đôi khi là chính các mồi.
Tùy thuộc vào điều kiện phản ứng, DNA không đặc hiệu có thể được khuếch đại với mức độ khác nhau, dẫn đến việc hình thành các dải lưới hoặc "vết bẩn" Trong các hệ thống tự động, máy phân tích mảnh sử dụng nguyên tắc điện di mao quản để thực hiện phân tích Việc phát hiện phân mảnh được thực hiện thông qua một diode laser, điều này chỉ khả thi khi PCR được thực hiện với các mồi kết hợp với fluorochromes.
Ưu và nhược điểm của phương pháp
- Cho kết quả xét nghiệm nhanh, thường không quá 5 giờ kể từ khi bắt đầu làm xét nghiệm.
Phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh mà các xét nghiệm vi sinh hay miễn dịch truyền thống trong phòng thí nghiệm lâm sàng không thể xác định.
PCR có khả năng định lượng chính xác số lượng bản sao virus trong 1 ml máu, giúp bác sĩ đánh giá hiệu quả điều trị và dự đoán giai đoạn bệnh một cách hiệu quả.
- Phát hiện các đột biến gen gây ung thư, gây các bệnh di truyền khác nhằm có biện pháp phòng ngừa bệnh.
- Xác định mối quan hệ huyết thống giữa những cá thể khác nhau.
- Ngoại nhiễm cao do khả năng nhân bản DNA mạnh.
- Sai sót của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp.
- Kết quả phụ thuộc rất lớn vào toàn bộ thao tác.
Sự cố và xử lý sự cố
Các nguyên nhân có thể là:
Khi lượng khuôn mẫu DNA quá ít, việc khuếch đại có thể không đạt hiệu quả tối ưu Để đảm bảo kết quả chính xác, cần tăng cường số lượng mẫu DNA trong các điều kiện này.
Nếu điều kiện phản ứng được duy trì quá nghiêm ngặt, có thể dẫn đến việc không có sự khuếch đại nào của sản phẩm PCR.
Trong quá trình thực hiện phản ứng hóa học, việc không thêm một hoặc nhiều thuốc thử vào hỗn hợp có thể xảy ra Để đảm bảo kết quả chính xác, cần thực hiện lại toàn bộ phản ứng bằng cách thêm cẩn thận các thuốc thử cần thiết.
Để đảm bảo độ chính xác trong quá trình thí nghiệm, cần kiểm tra nồng độ của thuốc thử, tránh sử dụng thuốc thử không ở nồng độ tối ưu hoặc đã hết hạn sử dụng Việc làm mới và thay thế thuốc thử định kỳ là cần thiết nhằm xác định rõ vấn đề liên quan đến hiệu quả của từng loại thuốc thử.
- Nhiệt độ biến tính quá cao hoặc quá thấp: Trong điều kiện đó, thay đổi nhiệt độ thấp hoặc cao 1°C tại một thời điểm.
- Nhiệt độ ủ mồi quá cao: Trong trường hợp này, hãy hạ nhiệt độ xuống 2°C cùng một lúc.
Hình thành mồi mới có thể thực hiện bằng cách tự ủ hoặc ủ kết hợp hai mồi Kết quả điện di trên gel cho thấy sự xuất hiện của một sản phẩm nhỏ, với kích thước dưới 100 cặp bazơ Việc bổ sung này đóng vai trò quan trọng trong quá trình nghiên cứu.
DMSO có thể giải quyết vấn đề này Ngoài ra, chu kỳ nhiệt có thể giải quyết vấn đề này.
Số chu kỳ nhiệt dưới mức tối ưu có thể dẫn đến việc sản xuất ít sản phẩm PCR hơn Để cải thiện hiệu suất, nên tăng thêm 5–10 chu kỳ nhiệt.
- Mồi bị lỗi: mồi có thể bị lỗi và do đó PCR có thể không hoạt động Trong trường hợp đó, hãy thiết kế lại mồi.
2.5.2 Sản phẩm không đặc hiệu
Trong quá trình PCR, sản phẩm không đặc hiệu có thể xuất hiện, dẫn đến sự hình thành nhiều dải có độ dài khác nhau khi điện di trên gel Nguyên nhân của hiện tượng này có thể bao gồm nhiều yếu tố khác nhau.
- Quá ít nghiêm ngặt trong PCR: Điều kiện quá ít nghiêm ngặt tạo ra các sản phẩm DNA không mong muốn trong PCR.
- Quá nhiều mẫu DNA: Quá nhiều mẫu DNA có thể tạo ra sản phẩm không mong muốn trong PCR.
- Quá nhiều chu trình nhiệt: Trong trường hợp này, hãy giảm số chu trình nhiệt xuống 5–10.
- Nồng độ magie quá cao: Điều chỉnh nồng độ và giảm nồng độ xuống thấp.
- Mồi bị lỗi: Thiết kế lại mồi.
- Bị ô nhiễm: Thay đổi nơi thực hiện PCR.
ENZYMEE-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)
Nguyên tắc chung của ELISA
ELISA là phương pháp dựa trên phản ứng kháng nguyên - kháng thể, thể hiện sự tương tác hóa học giữa kháng thể do tế bào B của bạch cầu sản xuất và kháng nguyên Phản ứng miễn dịch này đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể trước các tác nhân xâm nhập như mầm bệnh và độc tố.
ELISA cho phép phân tích định lượng và định tính có độ nhạy cao và chọn lọc đối với các kháng nguyên, bao gồm protein, peptit, axit nucleic, hormone, thuốc diệt cỏ và các chất chuyển hóa thứ cấp của thực vật thông qua việc khai thác phản ứng đặc hiệu Để phát hiện các phân tử này, một kháng nguyên hoặc kháng thể được đánh dấu bằng cách sử dụng các enzym như alkaline phosphatase (ALP), horseradish peroxidase (HRP), và β-galactosidase trong xét nghiệm miễn dịch enzym.
Kháng nguyên trong pha lỏng được cố định trên bề mặt rắn như tấm microtiter làm từ polystyrene, polyvinyl clorua hoặc polypropylene Sau đó, kháng nguyên này tương tác với kháng thể đặc hiệu, và kháng thể này được phát hiện thông qua một kháng thể thứ cấp có đánh dấu enzym.
Hình 3.1 Nguyên lý hoạt động của phương pháp ELISA
Màu sắc được tạo bằng cách sử dụng chất nền sinh màu tương ứng với sự hiện diện của kháng nguyên.
Các phản ứng enzym - cơ chất thường diễn ra trong khoảng thời gian từ 30 đến 60 phút và sẽ dừng lại khi thêm dung dịch thích hợp như natri hydroxit, axit clohydric, axit sulfuric, natri cacbonat hoặc natri azit Cuối cùng, các sản phẩm có màu hoặc huỳnh quang được phát hiện thông qua đầu đọc tấm microtiter.
Các loại ELISA
Năm 1971, Engvall và Perlmann và Van Weemen và Schuurs là những người đầu tiên phát triển ELISA trực tiếp, là kiểu cơ sở cho các loại ELISA khác
Hình 3.2 ELISA trực tiếp để phát hiện kháng nguyên (a) và kháng thể (b)
Để thực hiện quy trình, trước tiên gắn kháng nguyên hoặc kháng thể vào pha rắn Tiếp theo, ủ hỗn hợp với kháng thể hoặc kháng nguyên được đánh dấu enzym Sau đó, rửa sạch để loại bỏ kháng thể hoặc kháng nguyên đánh dấu enzym chưa liên kết Cuối cùng, tạo màu bằng cách sử dụng chất nền.
Kháng nguyên hoặc kháng thể được cố định trên bề mặt tấm microtiter Sau khi bề mặt được chặn bằng các protein như albumin, gelatin, casein và sữa gầy để ngăn chặn sự hấp phụ không đặc hiệu, kháng thể hoặc kháng nguyên được đánh dấu enzym sẽ phản ứng với mục tiêu cố định Quá trình này dẫn đến việc tạo màu với chất nền thích hợp, và khi số lượng mục tiêu tăng lên, tín hiệu cũng sẽ gia tăng.
ELISA trực tiếp thích hợp cho việc phân tích định tính các đại phân tử.
Vào năm 1973, Belanger đã phát triển phương pháp ELISA cạnh tranh để phát hiện α-fetoprotein ở chuột, góp phần vào sự ra đời của ELISA gián tiếp và ELISA sandwich Phương pháp ELISA cạnh tranh nổi bật với phản ứng cạnh tranh giữa mục tiêu trong mẫu (kháng nguyên hoặc kháng thể) và mục tiêu được đánh dấu enzym (kháng nguyên hoặc kháng thể) tương ứng với kháng thể hoặc kháng nguyên cố định.
Hình 3.3 ELISA cạnh tranh để phát hiện kháng nguyên (a) và kháng thể (b)
Quy trình ELISA bao gồm các bước: gắn kháng nguyên/kháng thể vào pha rắn, ủ với kháng thể/kháng nguyên đánh dấu enzym, rửa sạch kháng thể/kháng nguyên đánh dấu enzym chưa liên kết, và tạo màu với chất nền Trong phương pháp ELISA cạnh tranh, kháng nguyên đánh dấu enzym cạnh tranh với kháng nguyên đích để liên kết với kháng thể cố định Khi lượng kháng nguyên trong mẫu tăng, lượng kháng nguyên đánh dấu enzym liên kết với kháng thể giảm, dẫn đến tín hiệu giảm Phương pháp này chỉ thích hợp để đo các đại phân tử do cần có enzym đánh dấu để xác định kháng nguyên.
Khi kháng nguyên là hợp chất có trọng lượng phân tử thấp như hapten, các liên hợp hapten-enzym không được nhận diện bởi kháng thể cố định, dẫn đến phân tích không thành công Để phát hiện kháng thể, kháng nguyên cần được cố định, và sự cạnh tranh giữa kháng thể trong mẫu và kháng thể đánh dấu enzym sẽ được quan sát Trong trường hợp này, cả đại phân tử và hapten đều có thể được phát hiện khi hapten tiếp xúc với bề mặt của tấm microtiter.
Các mục tiêu phát hiện như kháng nguyên hoặc kháng thể có thể thay đổi tùy thuộc vào đối thủ cạnh tranh Khi sử dụng kháng nguyên tự do làm đối thủ cạnh tranh thay vì kháng thể không có nhãn, phản ứng cạnh tranh giữa kháng nguyên tự do và kháng nguyên cố định sẽ được quan sát, cho phép phát hiện kháng nguyên tự do trong mẫu Ngược lại, khi sử dụng kháng thể tự do thay vì kháng nguyên không được gắn nhãn, cũng sẽ có sự cạnh tranh tương tự.
Hệ thống ELISA gián tiếp đã được phát triển trên cơ sở ELISA trực tiếp để đánh giá sự hiện diện của kháng thể trong kháng huyết thanh.
Hình 3.4 ELISA gián tiếp để phân tích kháng thể
Quy trình xét nghiệm bao gồm các bước sau: đầu tiên, gắn kháng nguyên vào pha rắn; sau đó, ủ bằng kháng thể chính để tạo phản ứng; tiếp theo, rửa sạch kháng thể sơ cấp không liên kết; tiếp tục ủ với kháng thể thứ cấp được đánh dấu enzym; cuối cùng, tạo màu với chất nền để hoàn thiện quá trình.
Quá trình liên kết giữa hai kháng thể chính và kháng thể thứ cấp đánh dấu enzym là bước quan trọng trong hệ thống này Điều này cho phép kháng nguyên đích được phát hiện một cách gián tiếp thông qua kháng thể thứ cấp, được đánh dấu bằng enzym, thường được gọi là ELISA gián tiếp.
Kháng nguyên được cố định trên bề mặt tấm microtiter, nơi mà các protein ngăn chặn đã được sử dụng để chặn bề mặt Sau đó, kháng thể chính trong kháng huyết thanh sẽ liên kết với kháng nguyên cố định, cho phép phản ứng với kháng thể thứ cấp được đánh dấu enzym Quá trình này dẫn đến sự phát triển màu sắc, và tín hiệu sẽ tăng lên khi lượng kháng nguyên đích cố định tăng.
ELISA gián tiếp là phương pháp lý tưởng để đo lường các đại phân tử Bằng cách sử dụng kháng huyết thanh làm kháng thể chính, phương pháp này cho phép đánh giá sự hiện diện của các kháng thể liên quan đến bệnh trong mẫu huyết thanh.
3.2.4 ELISA cạnh tranh gián tiếp
ELISA cạnh tranh gián tiếp (icELISA) liên quan đến sự kết hợp của ELISA gián tiếp và ELISA cạnh tranh.
Hình 3.5 ELISA cạnh tranh gián tiếp để phát hiện kháng nguyên
Quy trình này bao gồm các bước sau: đầu tiên, gắn kháng nguyên vào pha rắn; sau đó, ủ kháng nguyên đích tự do với kháng thể chính; tiếp theo, rửa sạch để loại bỏ kháng nguyên đích tự do không liên kết và kháng thể chính; tiếp tục ủ với kháng thể thứ cấp đánh dấu enzym; cuối cùng, tạo màu với chất nền.
Kháng nguyên đích được cố định trên tấm microtiter và bị chặn lại, sau đó kháng nguyên và kháng thể tự do được ủ bệnh, tạo ra sự cạnh tranh giữa kháng nguyên cố định và kháng nguyên tự do Kháng thể sơ cấp liên kết với kháng nguyên cố định được phát hiện nhờ kháng thể thứ cấp đánh dấu enzym Trong icELISA, tương tự như ELISA cạnh tranh, tín hiệu giảm khi lượng kháng nguyên tự do tăng Phương pháp icELISA có thể đo cả đại phân tử và hapten khi hapten tiếp xúc trên bề mặt tấm microtiter.
Hệ thống này sử dụng phương pháp bánh sandwich để phát hiện kháng nguyên đích, thông qua việc neo giữ giữa hai kháng thể, mỗi kháng thể nhận diện các biểu mô khác nhau.
Hình 3.6 Sandwich ELISA để phát hiện kháng nguyên đặc hiệu
Quy trình thực hiện bao gồm các bước sau: đầu tiên, gắn kháng thể bắt giữ vào pha rắn; tiếp theo, ủ với kháng nguyên đích để tạo liên kết; sau đó, rửa sạch để loại bỏ các mục tiêu không gắn kết; tiếp tục ủ với kháng thể đánh dấu enzym; cuối cùng, tạo màu bằng chất nền để hoàn tất quá trình.
Sandwich ELISA là phương pháp bắt đầu bằng việc cố định kháng thể bắt giữ trên đĩa microtiter Sau khi bề mặt đĩa được chặn để ngăn chặn sự hấp phụ không đặc hiệu của protein, kháng nguyên trong mẫu sẽ phản ứng với kháng thể bắt giữ Kháng nguyên liên kết với kháng thể bắt giữ sau đó được kẹp với kháng thể đánh dấu enzym, tạo ra phản ứng màu sắc.
Quy trình thực hiện kiểm tra mẫu bằng bộ kit ELISA
3.4.1 Chuẩn bị chất chuẩn Để chuẩn bị chất chuẩn, 5 ống propylen eppendorf 1,5 mL phải được đặt trên giá và đánh số.
Mỗi loại trong số này phải được thêm một chất pha loãng với lượng được xác định.
Dùng pipet tự động lấy nồng độ thích hợp của chất chuẩn gốc, thêm vào ống 5 và trộn bằng máy xoáy trong khoảng 10 giây.
Nồng độ thích hợp của tiêu chuẩn số 5 này phải được lấy bằng pipet tự động có đầu đã được thay đổi và đưa vào ống 4
Quá trình này cần được lặp lại cho đến ống 1, sử dụng đầu pipet mới cho mỗi lần chuyển Các chất chuẩn nên được chuẩn bị bằng phương pháp pha loãng nối tiếp.
3.4.2 Chuẩn bị dung dịch rửa Để pha loãng 50 mL dung dịch rửa đậm đặc gấp 20 lần do công ty sản xuất cung cấp, nên cho 950 mL nước cất vào bình Sau đó, thêm 50 mL dung dịch rửa đậm đặc
20 lần vào nước cất, bạn có thể có dung dịch rửa đậm đặc gấp 1 lần.
- Các khoang giếng trống trong đĩa phải được để trống.
- Cần bổ sung một lượng thích hợp đệm EIA vào các giếng NSB.
- Cần thêm lượng thích hợp dung dịch tiêu chuẩn vào các giếng tiêu chuẩn;
- Một lượng thích hợp của các giải pháp kiểm soát chất lượng liên quan phải được đặt trong các giếng đối chứng 1 (QC1) và QC2.
- Các giếng mẫu phải được bổ sung các chất pha loãng mẫu liên quan.
- Tất cả các giếng trừ giếng mù phải được bổ sung một lượng kháng thể sơ cấp.
- Đĩa phải được phủ bằng parafilm và để ủ ở nhiệt độ phòng trong một thời gian.
- Tất cả các giếng phải được rửa trong máy rửa ELISA sử dụng một lượng đệm rửa thích hợp.
- Mẫu được lắc bằng máy lắc quỹ đạo (350 vòng/phút) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
- Rửa trong máy rửa ELISA với đệm rửa như được hướng dẫn trên danh mục.
- Cần thêm một lượng nhất định peptit được đánh dấu biotin vào tất cả các giếng, ngoại trừ mẫu trắng.
- Đĩa phải được phủ bằng parafilm và để ủ ở nhiệt độ phòng trong một khoảng thời gian được nêu trên danh mục.
- Cần gỡ bỏ lớp parafilm trên đĩa và làm sạch chất chứa trong giếng.
- Rửa lại trong máy rửa ELISA sử dụng dung dịch đệm rửa, sau đó sẽ được loại bỏ.
- Dung dịch SA-HRP nên được thêm vào tất cả các giếng.
- Đĩa phải được phủ bằng parafilm một lần nữa và để ủ trong máy lắc quỹ đạo
(350 vòng/phút) ở nhiệt độ phòng trong một thời gian nhất định.
- Sau khi loại bỏ parafilm trên đĩa, tất cả các giếng phải được rửa trong máy rửa ELISA sử dụng một lượng đệm rửa thích hợp.
- Dung dịch TMB nên được thêm vào tất cả các giếng, sau đó sẽ được ủ Ở giai đoạn này, đĩa nên được che để tránh ánh sáng.
- Đĩa sẽ được phủ parafilm một lần nữa và ủ.
Để ngừng phản ứng, cần loại bỏ parafilm và thêm axit HCl 2N vào từng giếng Sau khi thêm dung dịch dừng, màu xanh lam sẽ chuyển sang màu vàng.
3.4.4 Giai đoạn đọc kết quả
Sau khi thêm dung dịch dừng, kết quả cần được đọc trong vòng 10 phút tại bước sóng 450 nm Trước khi thực hiện việc đọc, nồng độ của các chất chuẩn phải được nhập vào máy đọc ELISA, giúp thiết bị vẽ đồ thị đường cong tiêu chuẩn và tự động tính toán nồng độ của các mẫu Kết quả tính toán này có thể được in ra.
Trong phòng thí nghiệm của chúng tôi, thiết bị ELISA ELX800 được sử dụng để đọc kết quả, kèm theo máy in và vòng đệm, phục vụ cho phương pháp ELISA như được minh họa trong hình 3.7.
Hình 3.7 Máy rửa (a), đầu đọc kết quả (b) và máy in (c) được sử dụng trong quy trình
Ưu và nhược điểm của phương pháp ELISA
- Quy trình thực hiện đơn giản
- Độ đặc hiệu và độ nhạy cao
- Có thể phân tích đồng thời mà không cần xử lý trước mẫu phức tạp
- An toàn và thân thiện với môi trường
- Sử dụng nhiều lao động và tốn kém trong việc chuẩn bị kháng thể
- Yêu cầu kỹ thuật phức tạp và môi trường nuôi cấy đắt tiền
- Khả năng dương tính/âm tính giả cao
- Việc ngăn chặn không đủ kháng nguyên cố định dẫn đến kết quả sai
- Kháng thể không ổn định
- Cần phải vận chuyển và bảo quản trong tủ lạnh vì kháng thể là một protein.
PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE)
Nguyên tắc
Điện di trên gel trường xung (PFGE) là một phương pháp hiệu quả để tách các phân tử DNA trong gel agarose Kỹ thuật này sử dụng hai điện trường xen kẽ, với các vectơ hướng về phía nhau ở góc tù, giúp cải thiện độ phân giải của các mảnh DNA PFGE thường được áp dụng trong nghiên cứu di truyền và phân tích gen để xác định cấu trúc và kích thước của DNA.
PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) là kỹ thuật phân đoạn các phân tử DNA lớn, với kích thước từ 10 kb đến 10 Mb Kỹ thuật này có khả năng phân tích DNA nhiễm sắc thể của cả sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân thực bậc thấp, cho phép điều khiển DNA của toàn bộ nhiễm sắc thể hoặc các đoạn lớn của chúng, đặc biệt là đối với sinh vật bậc cao Chính vì vậy, PFGE trở thành một công cụ quan trọng trong nghiên cứu hệ gen hiện đại.
Hình 4.1 Sơ đồ thể hiện cơ chế phân đoạn DNA trong quá trình điện di trên gel trường xung
Khi chuyển đổi điện trường, các phân tử DNA bắt đầu di chuyển ngược lại trong gel, với chuyển động được dẫn dắt bởi các đuôi của chúng Mỗi phân tử di chuyển theo tỷ lệ với kích thước của nó, dẫn đến việc các phân tử dài hơn nằm sau các phân tử ngắn hơn Khi chuyển sang một trường mới, sự chậm lại của các phân tử dài hơn trở nên rõ rệt hơn E1, E2 là vectơ cường độ điện trường, với các mũi tên dài và ngắn biểu thị cho các phân tử DNA dài và ngắn, tương ứng Hướng di chuyển của các phân tử được chỉ ra bởi các đầu mũi tên, trong khi các đường đứt nét hiển thị dấu vết di chuyển của chúng trong gel.
Thiết bị và quy trình thực hiện
Điện trường được chuyển đổi trong những khoảng thời gian nhất định ở một góc 90°
Gel được đặt trong buồng để thực hiện điện di ngang, nơi có một điện trường đồng nhất được tạo ra bởi hai hàng điểm điện cực Ngoài ra, một điện trường không đồng nhất cũng được hình thành nhờ nhiều điểm điện cực âm và một điểm điện cực dương Hệ thống này được gọi là "điện di gradient trường xung" (PFGE).
Hình 4.2 Giản đồ thể hiện hình dạng điện cực trong các dụng cụ thường dùng cho điện di gel trường xung
Các tác giả xem gradient điện thế là yếu tố quan trọng để tách các phân tử DNA trong trường xung Họ đã áp dụng các cấu hình điện cực cuối cùng để tạo ra một trường điện không đồng nhất Trong hệ thống này, góc giữa các vectơ cường độ trường thay đổi từ 110° đến 150° ở các vùng gel khác nhau.
Các phân tử có kích thước tương đương di chuyển với tốc độ khác nhau tùy theo vị trí ban đầu trong gel, điều này gây khó khăn trong việc so sánh sự di động điện di của DNA trên các làn đường viền và làm cho việc ước tính kích thước trở nên không chính xác.
Các yếu tố ảnh hưởng đến độ chính xác của phương pháp
2008) 4.3.1 Thời gian xung (thời gian chuyển đổi, khoảng thời gian chuyển đổi)
Thời gian xung là yếu tố quyết định trong quá trình chuyển hướng của trường điện Các thí nghiệm đầu tiên về phân đoạn ADN trong điện trường xung đã chứng minh rằng thời gian xung đóng vai trò quan trọng nhất trong việc phân tách các phân tử.
Kích thước của các phân tử phân đoạn càng lớn thì việc chuyển đổi điện trường càng ít
Để phân đoạn DNA hiệu quả trong một phạm vi kích thước rộng, cần xác định thời gian xung tối ưu, vì chỉ các phân tử có kích thước cụ thể mới xuất hiện trong điều kiện này Việc tìm ra chế độ tăng tuần tự của thời gian xung là điều cần thiết để đạt được kết quả tốt nhất trong quá trình tách phân đoạn DNA.
Hình 4.3 Ví dụ về phân đoạn và xác định kích thước của DNA nhiễm sắc thể bằng điện di trên gel trường xung với đoạn dốc thời gian xung
Sự thay đổi của thời gian xung trong quá trình điện di được gọi là “tăng dần” Tham số này có thể được điều chỉnh trong suốt quá trình chạy, bao gồm cả liên tục và không liên tục, trên một phạm vi giá trị rời rạc Quá trình gia tăng liên tục của thời gian xung từ giá trị nhỏ nhất đến lớn nhất trong một khoảng thời gian nhất định được gọi là tăng dần.
"nội suy" Một biến thể thay thế, thời gian xung tăng lên từng bước, được gọi là
Sự phân giải phân tử trong gel được xác định bởi khoảng cách và độ sắc nét của dải Khu vực trong gel mà DNA được phân tách hiệu quả được gọi là “vùng phân giải” hay “cửa sổ phân giải” Trong vùng này, mối quan hệ giữa tốc độ di chuyển của DNA và kích thước phân tử là tuyến tính, cho phép ước tính chính xác kích thước của các phân tử DNA.
4.3.2 Cường độ trường Độ phân giải là hàm của cả thời gian xung và cường độ điện trường Nhìn chung,cường độ trường càng cao thì tốc độ di chuyển phân tử càng cao Tuy nhiên, kích thước phân tử càng cao thì sự phụ thuộc này càng lệch khỏi hàm tuyến tính Để tách các phân tử nhỏ hơn 1 Mb, cường độ trường áp dụng là 6 –10 V/cm Cường độ trường càng thấp, độ phân giải càng cao; tuy nhiên, phạm vi kích thước của các phân tử được phân tách hẹp hơn
Cường độ trường điện quá cao (trên 10 V/cm) gây ra sự phân tách phân tử yếu, dẫn đến hiện tượng "vết bẩn" với các vùng nhuộm DNA đồng nhất và các dải đơn không thể nhìn thấy bằng mắt thường Đối với các phân tử lớn hơn 1 Mb, cường độ trường cao tạo ra "hiệu ứng bẫy", khiến phân tử bị cố định vĩnh viễn trong gel do những thay đổi không thể đảo ngược trong cấu trúc của chúng Do đó, các phân tử này nên được phân đoạn ở cường độ trường thấp (1–3 V/cm) để đạt hiệu quả tốt nhất.
Thời gian xung và cường độ trường là các yếu tố có liên quan lẫn nhau Độ phân giải PFGE được xác định bằng “hàm Window” sau:
W = E1,4 × Tp Trong đó E là cường độ điện trường và Tp là thời gian xung
Giá trị của hàm W càng cao, kích thước phân tử DNA càng lớn, giúp phân tách hiệu quả hơn Có thể đạt được sự phân tách các phân tử DNA có cùng kích thước bằng cách điều chỉnh thời gian xung khác nhau, miễn là cường độ trường được thay đổi để giữ giá trị hàm W không đổi.
Trong một số thiết bị PFGE, tham số góc định hướng là cố định, trong khi ở những thiết bị khác, nó có thể thay đổi từ 90 đến 180° Nghiên cứu cho thấy sự thay đổi này không ảnh hưởng đáng kể đến sự di chuyển của các phân tử nhỏ hơn 1 Mb Đối với các phân tử lớn hơn, độ linh động tăng khi góc giảm, nhưng độ phân giải dải trong gel lại giảm Theo kinh nghiệm, phân tách tốt nhất đạt được với góc lớn hơn 110°, và hầu hết các thiết bị thương mại PFGE hiện có sử dụng góc cố định 120°.
4.3.4 Nồng độ agarose trong gel
Nồng độ agarose trong gel có tác động hạn chế đến tính di động của các phân tử DNA khi thực hiện điện di trong trường xung so với trường không đổi.
Nghiên cứu cho thấy gel agarose 1,2% có độ phân giải tốt hơn so với gel 0,9% Tăng nồng độ agarose không cải thiện độ phân giải mà chỉ giảm tính linh động và kéo dài thời gian chạy Để tách các phân tử nhỏ hơn 3 Mb, gel agarose với nồng độ từ 1,0% đến 1,5% thường được sử dụng.
4.3.5 Thành phần và nhiệt độ của đệm điện di
Bộ đệm có độ bền ion cao, Tris-borate (0,5 × TBE) hoặc Tris-acetate (1 × TAE) thường được sử dụng cho PFGE
Tính linh động của các phân tử DNA trong trường điện di chịu ảnh hưởng lớn từ nhiệt độ của đệm Cụ thể, khi nhiệt độ tăng cao, tốc độ di chuyển của các phân tử DNA cũng tăng theo.
PFGE thường được thực hiện ở nhiệt độ 12–16°C Khi nhiệt độ tăng cao hơn, các dải sẽ trở nên rộng và khuếch tán, dẫn đến việc giảm đáng kể độ phân giải và sự xuất hiện của vết bẩn.
Ưu và nhược điểm của phương pháp
PFGE đã chứng minh là phương pháp vượt trội trong phân tích sinh hóa và phân tử, với khả năng phân biệt cao hơn so với các phương pháp khác Nó đặc biệt hiệu quả trong việc phân tích các vi khuẩn như Escherichia coli, enterococci kháng vancomycin, S aureus, loài Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa và M avium Đặc biệt, PFGE nổi bật trong việc phân biệt các chủng S aureus kháng methicillin, cho thấy ưu thế rõ rệt so với các phương pháp phân tích khác.
PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) có khả năng phân biệt các chủng vi khuẩn tốt hơn so với phương pháp PCR dựa trên trình tự yếu tố lặp lại (Rep-PCR) Phương pháp này hiệu quả trong việc phân loại các chủng của Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii phức hợp, cầu khuẩn ruột kháng vancomycin, Neisseria gonorrhoeae và P aeruginosa.
Thời gian hoàn thành phân tích PFGE là một yếu tố hạn chế đáng kể trong việc sử dụng phương pháp này, mặc dù quy trình thực hiện khá đơn giản Thời gian cần thiết để hoàn tất thủ tục thường kéo dài từ 2 đến 3 ngày, điều này ảnh hưởng đến khả năng phân tích số lượng lớn mẫu của phòng thí nghiệm.
SẮC KÝ KHÍ (GC)
Nguyên tắc của sắc ký khí
Sự phân tách xảy ra khi các thành phần riêng lẻ di chuyển chậm lại qua một cột dài nhờ vào khí mang, thường là heli hoặc nitơ.
Cột bao gồm một ống thép hoặc thủy tinh chứa đầy vật liệu đóng gói trơ như thủy tinh hoặc hạt gốm.
Hình 5.1 Sơ đồ của hệ thống sắc ký khí
Trong sắc ký khí-lỏng (GLC), bề mặt chất lỏng dễ bay hơi được phủ lên chất lỏng, tạo ra diện tích tiếp xúc lớn với khí Một số ứng dụng sử dụng bao bì rắn mà không có lớp phủ lỏng, được gọi là sắc ký khí-rắn (GSC), tuy nhiên, phương pháp này ít phổ biến hơn so với GLC.
Mẫu được bơm vào dòng khí mang, nơi các phân tử của từng chất trong mẫu phân bố giữa pha khí và pha lỏng Các phân tử này liên tục di chuyển giữa hai pha trong trạng thái cân bằng động Khi ở pha khí, một phân tử di chuyển dọc theo cột, trong khi ở pha lỏng, nó đứng yên Chất càng dễ bay hơi, thời gian chuyển động của các phân tử trong khí mang càng lớn, dẫn đến việc chúng ra khỏi cột sớm hơn Nhờ vậy, mỗi chất sẽ được tách ra trong cột và phân tách theo thời gian ở đầu ra.
Thời gian lưu (Rt) là khoảng thời gian từ khi tiêm đến khi đạt đỉnh, đặc trưng cho từng chất trong các điều kiện nhất định Thời gian này phụ thuộc vào độ bay hơi của chất, nhiệt độ của cột, cũng như chiều dài và đường kính của cột Nhiều chất có thời gian lưu giữ lâu ở nhiệt độ phòng, gây bất tiện, nhưng có thể được khắc phục bằng cách nung cột trong lò.
Sau khi tách các thành phần trong cột, việc phát hiện và đo lường chúng là cần thiết Hai loại detector phổ biến được sử dụng trong quá trình này là dẫn nhiệt và ion hóa ngọn lửa.
Máy dò độ dẫn nhiệt (TCD) hoạt động dựa trên sự thay đổi độ dẫn nhiệt của khí thoát ra từ cột, với khí mang là helium tinh khiết đi qua dây tóc vonfram-helium nóng, làm giảm nhiệt độ do helium có độ dẫn nhiệt cao Khi có chất hóa học xuất hiện, quá trình làm mát giảm, dẫn đến tăng nhiệt độ dây tóc, và điện trở của nó tăng theo nhiệt độ, có thể được đo và ghi lại Trong khi đó, phát hiện ion hóa ngọn lửa (FID) phổ biến hơn trong các ứng dụng thực phẩm vì độ nhạy cao hơn đối với các hợp chất hữu cơ, nhạy hơn khoảng một nghìn lần so với TCD Khí thoát ra được đốt cháy trong hỗn hợp hydro và không khí, tạo ra các ion dẫn đến dòng điện có thể khuếch đại và ghi lại trên máy ghi biểu đồ Mặc dù số lượng ion tạo ra rất nhỏ, nhưng tỷ lệ này luôn ổn định, cho phép tín hiệu ghi lại tỷ lệ thuận với lượng hóa chất có trong mẫu.
Chọn điều kiện chạy sắc ký
Cột là thành phần quan trọng nhất trong máy sắc ký, đóng vai trò khởi đầu và trung tâm của quá trình phân tách Việc lựa chọn cột phù hợp sẽ giúp đạt được sự phân tách sắc ký tối ưu, từ đó đảm bảo phân tích chính xác và đáng tin cậy.
Việc sử dụng cột không đúng cách có thể gây ra sự phân tách khó hiểu và không đầy đủ, dẫn đến kết quả không hợp lệ hoặc khó khăn trong việc diễn giải.
Có hơn 10.000 hợp chất có thể phân tích bằng phương pháp GC, cùng với hơn 400 loại cột mao quản GC Lựa chọn ban đầu về cột và thiết bị hỗ trợ ảnh hưởng lớn đến khả năng và kết quả tối ưu hóa phân tách Việc điều chỉnh các thông số của cột như pha tĩnh, đường kính trong, chiều dài và độ dày màng giúp máy sắc ký kiểm soát hiệu quả cột, nâng cao độ phân giải và tăng tốc độ phân tích.
Trong sắc ký khí, thứ tự rửa giải của chất phân tích bị ảnh hưởng bởi áp suất hơi tiềm ẩn, khả năng hòa tan trong pha tĩnh và xu hướng tương tác phân tử trong pha tĩnh Những yếu tố này thay đổi theo nhiệt độ, và sự phối hợp của chúng quyết định sự phân bố cân bằng của các phân tử chất tan giữa pha động và pha tĩnh.
Việc xác định vận tốc tuyến tính trung bình tốt nhất khá dễ dàng và chỉ liên quan đến một lượng nhỏ thử và sai
Hydro cung cấp độ phân giải tốt nhất trong khoảng thời gian ngắn nhất
Helium cung cấp độ phân giải tương tự nhưng với thời gian phân tích lâu hơn Khi sử dụng heli làm khí mang, nên thử vận tốc tuyến tính trung bình ban đầu là 30 cm/giây.
Nitơ không được khuyến khích sử dụng với cột mao quản do thời gian phân tích quá dài
Khi lựa chọn khí làm pha động trong sắc ký khí, cần xem xét các yếu tố như tính trơ, độ khô, hàm lượng oxy tự do, mức độ an toàn, chi phí và tính sẵn có của khí.
5.2.3 Tối ưu hóa chương trình nhiệt độ lò cột
Nhiệt độ trong tủ sấy có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả tách sắc ký, đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát quá trình GC.
Trong một số tình huống, chế độ đẳng nhiệt không phải là phương pháp tối ưu để tách mẫu, và trong những trường hợp này, việc áp dụng chương trình nhiệt độ là cần thiết Hầu hết các chương trình nhiệt độ trong sắc ký khí (GC) thường bao gồm nhiệt độ khởi đầu, một đoạn đường nối với mức tăng nhiệt độ mỗi phút, và nhiệt độ kết thúc.
Khi không có thông tin phân tích trước đó, hãy bắt đầu với chương trình nhiệt độ tuyến tính đơn giản Để cải thiện độ phân giải của các pic rửa giải, có thể giảm nhiệt độ ban đầu hoặc tăng thời gian giữ ban đầu Giảm nhiệt độ ban đầu thường mang lại sự cải thiện lớn nhất về độ phân giải, nhưng sẽ kéo dài thời gian phân tích Độ phân giải của các peak rửa giải ở giữa sắc ký đồ có thể thay đổi do tốc độ dốc Nếu độ phân giải quá mức, tăng tốc độ đường nối để giảm độ phân giải và thời gian phân tích Ngược lại, nếu độ phân giải không đủ, giảm tốc độ đường nối và tăng thời gian phân tích Độ phân giải tốt hơn cho các đỉnh rửa giải sau thường xảy ra khi giảm tốc độ dốc.
5.2.4 Tối ưu hóa loại đầu tiêm, nhiệt độ và thể tích tiêm Đưa mẫu vào hệ thống GC là một bước quan trọng trong quá trình phân tách Độ tái lập của lượng mẫu được bơm vào là rất quan trọng để đảm bảo độ tái lập của kết quả
Mẫu có thể được đưa vào hệ thống thông qua bơm thủ công hoặc sử dụng hệ thống lấy mẫu tự động Một trong những lỗi phổ biến trong phân tích GC là kỹ thuật tiêm không đạt yêu cầu.
Nhiệt độ kim phun đóng vai trò quan trọng trong quá trình tách, giúp hóa hơi nhanh chóng mẫu lỏng thành pha khí Pha khí này sau đó được đưa vào cột để thực hiện quá trình tách hiệu quả.
Trong sắc ký khí mao quản và vi đóng gói (GC), có bốn kỹ thuật chính để bay hơi mẫu và đưa vào cột phân tích: tiêm tách, không tách, trực tiếp và trên cột Trong số đó, tiêm tách và tiêm không tách lớp là hai phương pháp phổ biến nhất được sử dụng.
Tiêm tách là phương pháp phân tích hiệu quả cho mẫu có nồng độ cao Trong chế độ tiêm phân chia, chỉ một lượng nhỏ mẫu hóa hơi được chuyển lên đầu cột, trong khi phần còn lại được loại bỏ qua đường thông hơi Phương pháp này chỉ nên áp dụng khi nồng độ mẫu đủ cao, giúp loại bỏ một phần mà vẫn duy trì nồng độ chất phân tích cần thiết để tạo ra tín hiệu tại máy dò.
Khi chọn cột, trước tiên hãy xác định đặc tính của mẫu để phù hợp với pha tĩnh của cột
Pha tĩnh nói chung được chia thành 3 loại: thứ nhất không phân cực, thứ hai ở giữa cực và thứ ba có cực
Pha tĩnh được phân loại thêm bằng Siloxan (không phân cực và trung cực) và Polyethylene glycol (PEG hoặc phân cực)
G1, G2 và G38 (100% Methyl Polysiloxan) không tương tác qua liên kết hydro, trong khi sự thay đổi thứ tự rửa giải của Hexanol và Phenol với G14, G15, G16, G20, G39 và G47 (Polyetylen glycol) liên quan đến sự kết hợp của liên kết lưỡng cực và liên kết hydro.
5.2.6 Tối ưu hóa đầu dò và nhiệt độ đầu dò
Kỹ thuật chuẩn bị mẫu
Sắc ký khí là phương pháp chủ yếu để phân tích các hợp chất dễ bay hơi bền nhiệt Đối với các mẫu không bay hơi, có thể thực hiện các phản ứng hóa học nhằm tăng cường độ bay hơi của các hợp chất.
Các hợp chất chứa các nhóm chức như OH, NH, COH và SH thường khó phân tích bằng phương pháp GC do tính chất không đủ bay hơi, có khả năng bị hấp thụ quá mạnh vào pha tĩnh hoặc không ổn định về nhiệt.
Hầu hết các phản ứng tạo dẫn xuất phổ biến được sử dụng cho GC có thể được chia thành ba loại:
Các mẫu được tạo dẫn xuất trước khi được phân tích để:
- Tăng độ bay hơi và giảm độ phân cực của hợp chất
- Tăng độ nhạy bằng cách kết hợp các nhóm chức năng dẫn đến tín hiệu dò cao hơn
- Cải thiện sự phân tách và giảm sự gắn đuôi.
Ưu và nhược điểm của phương pháp
- Độ phân giải tốt, thể hiện bằng các đỉnh sắc nét và đối xứng
- Độ lặp lại cao và độ tái lập của thời gian lưu
Độ chính xác cao trong định lượng được đảm bảo thông qua các phép đo diện tích peak, mà không cần phân biệt các thành phần dựa trên độ bay hơi, độ phân cực hay nồng độ.
- Chỉ phân tích những cấu tử nhẹ
- Môi trường mẫu phải có độ bay hơi kém hơn chất phân tích.