Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 56 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Nội dung
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN * NGUYỄN VĂN DŨNG NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA PROTEASE HIV MANG ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN * NGUYỄN VĂN DŨNG NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA PROTEASE HIV MANG ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Phan Tuấn Nghĩa Hà Nội-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung HIV 1.1.1 HIV/AIDS 1.1.2 Tình hình nhiễm HIV/AIDS 1.1.3 Phương pháp điều trị HIV/AIDS 1.2 Protease HIV-1 (gọi tắt protease HIV-1) 1.2.1 Gen mã hóa protease HIV- 1.2.2 Cấu trúc protease HIV-1 1.2.3 Chức protease HIV-1 10 1.2.4 Tạo protease HIV-1 tái tổ hợp 12 Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên liệu 15 2.1.1 Mẫu huyết 15 2.1.2.Các hệ vector chủng vi sinh vật 15 2.1.3 Hóa chất 15 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Tách chiết RNA hệ gen HIV-1 tổng hợp cDNA 15 2.2.2 Tổng hợp cDNA từ RNA virus 16 2.2.2 Tách chiết định lượng DNA 16 2.2.3 Điện di DNA gel agarose 17 2.2.4 Nhân đoạn gen kỹ thuật PCR 18 2.2.5 Nhân dòng đoạn gen mã hóa protease HIV-1 19 2.2.6 Giải trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 phương pháp Sanger 20 2.2.7 Biểu gen mã hóa protease HIV-1 E coli 21 2.2.8 Tinh protease HIV-1 cột sắc ký lực His-bind (Novagen) 22 Lớp Cao học K18 50 Khóa 2009-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng 2.2.9 Điện di gel polyacrylamide có chứa SDS (SDS-PAGE) theo phương pháp Laemmli [20] 23 2.2.10 Nhận dạng protease HIV-1 thẩm tách miễn dịch (Western blotting) 24 2.2.11 Phân tính hoạt độ protease HIV-1 theo phương pháp Richard tập thể [31] 25 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Phát đột biến kháng thuốc PI gen mã hóa protease HIV-1 26 3.1.1 Xác định trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 26 3.1.2 Phát đột biến kháng thuốc PI gen mã hóa protease HIV-1 (Đột biến N83T) 27 3.2 Thiết kế hệ thống biểu gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến N83T vector pET32a 29 3.2.2 Gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy biến nạp vào tế bào E coli chủng DH5 31 3.2.4 Cảm ứng biểu protease HIV-1 mang đột biến N83T vi khuẩn E coli BL21 (DE3) RIL 38 3.2.5 Tinh protein tái tổ hợp cột sắc ký lực His-bind 40 KẾT LUẬN 44 KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 Lớp Cao học K18 51 Khóa 2009-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng BẢNG CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium Persulphate bp Cặp bazo (base pair) BSA Albumin huyết bò (Bovine Serum Albumin) CBB Coomassie Blue Brillant dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate ddNTP Dideoxyribonucleoside triphosphate dd H2O Nước cất loại ion, khử trùng (deionnized distilled H2O) E coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EtBr Ethidium Bromide IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside kb Kilobase kDa Kilodalton LB Luria Bertani MCS Multiple Cloning Sequence OD Mật độ quang học (Optical Density) PAGE Điện di gel polyacrylamide (Polyarylamide Gel Electrophoresis) PBS Muối chứa đệm phosphate (Phosphate Buffered Saline) PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polmerase Chain Reaction) PMSF Phenyl Methylsulphonyl Fluoride PVDF Polyvinylidene fluoride SDS Sodium Dodecyl Sulphate TAE Tris base-Acetic-EDTA TEMED N, N, N’, N’-Tetramethyl-Ethylenediamine (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Lớp Cao học K18 53 Khóa 2009-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng DANH MỤC BẢNG Bảng Thành phần phản ứng PCR 18 Bảng Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T 19 Bảng Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn 21 Bảng 4: Thành phần gel cô gel tách acrylamide 23 Bảng Thành phần phản ứng hoạt tính protease HIV-1 25 (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Lớp Cao học K18 54 Khóa 2009-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cấu tạo HIV [40] .4 Hình 2: Cấu trúc khơng gian protease HIV-1 [39] .10 Hình 3: Sơ đồ phân cắt polyprotein gag gag-pol HIV-1 để hình thành protein chức [39] 11 Hình 4: Kết so sánh trình tự đoạn gen mã hóa cho protease HIV-1 so với trình tự đoạn gen tương ứng EU518273 Trung Quốc 27 Hình 5: So sánh trình tự axit amin protease HIV-1 thu nhận Việt Nam (HQ890881) so với trình tự EU518273 Ngân hàng Gen quốc tế 28 Hình 6: Kiểm tra đột biến protease HIV-1 thu nhận Việt Nam (HQ890881) so với sở liệu HIV Đại học Stanford 28 Hình 7: Sơ đồ cấu trúc protein dung hợp với protease HIV-1 để biểu vector pET32a 29 Hình 8: Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen protease HIV .31 Hình 9: Kết biến nạp hỗn hợp gắn sản phẩm PCR (đoạn gen mã hóa protease HIV-1) vector pGEM-T Easy vào E coli chủng DH5α 32 Hình 10: Điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt mang gen mã hóa protease HIV-1 plasmid tái tổ hợp 33 Hình 11: Sơ đồ vector pET32a 34 Hình 12: Điện di sản phẩm phân cắt vector pGEM-ProtHA BamHI XhoI 35 Hình 13: Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa protease HIV-1 36 có thể biến nạp 36 Hình 14: Trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vector pET32-ProtHA 37 Hình 15: Kết so sánh trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến N83T vector pET32-ProtHA vector pGEM-ProtHA 38 Hình 16: Kết điện di protein tổng số có chứa protease HIV-1 tái tổ hợp mang đột biến N83T phân đoạn dịch chiết tủa tế bào E coli BL21 (DE3) RIL .40 Hình 17: Điện di protein kiểm tra độ tinh phân đoạn qua cột His-bind .42 Hình 18: Kết thẩm tách miễn dịch kiểm tra độ tinh phân đoạn qua cột His-bind .43 (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Lớp Cao học K18 55 Khóa 2009-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng MỞ ĐẦU Virus suy giảm miễn dịch người (Human immunodeficiency virus - HIV) nguyên nhân gây hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired Immunodeficiency Syndrome - AIDS) virus gây bệnh nguy hiểm Theo tài liệu cơng bố, có hai type HIV gây nên AIDS HIV type (HIV-1) HIV type (HIV-2), HIV-1 nguyên nhân gây AIDS toàn giới Theo số liệu Tổ chức Y tế Thế giới, tính đến cuối năm 2009 có khoảng 33,3 triệu người sống chung với HIV/AIDS, khoảng 1,8 triệu người chết AIDS có thêm 2,6 triệu trường hợp bị nhiễm virus Ở Việt Nam, theo báo cáo Cục phòng chống HIV/AIDS - Bộ Y tế tính đến 31/3/2011, tồn quốc phát người nhiễm HIV 75,2% xã/phường, gần 97,9% quận/huyện 63/63 tỉnh/thành phố Tổng số trường hợp nhiễm HIV 235.535 người, số bệnh nhân AIDS 94.613 người, số trường hợp tử vong đến cuối kỳ báo cáo 49.912 người Trong chu trình sống HIV-1, protease enzyme thiếu Enzyme cắt chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) vị trí định để tạo thành protein cấu trúc chức cần thiết cho virus hồn chỉnh Vì protease xem đích tác động quan trọng cho liệu pháp tìm thuốc điều trị HIV/AIDS Tuy nhiên, HIV chép nhanh, enzyme phiên mã ngược có tỷ lệ sai sót cao tạo biến đổi liên tục cấu trúc hệ gen nhóm HIV dẫn đến tình trạng kháng thuốc Mặc dù ngày nhiều chất ức chế protease chống HIV sản xuất thương mại hóa việc tìm chất ức chế protease ln quan tâm Bên cạnh đó, đột biến kháng PI tương đối đặc hiệu cho loại thuốc riêng biệt, thay loại thuốc khác trước có tích lũy đột biến phác đồ sau thành công (Hoffmann tập thể, 2007) Vì vậy, xét nghiệm kháng thuốc thường theo hướng phát đột biến gen mã hóa protease HIV có vai trị quan trọng việc xây dựng phác đồ điều trị HIV/AIDS (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng Ở Việt Nam, gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc vấn đề cịn nghiên cứu Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào xác định nhóm virus gây bệnh chủ yếu người Việt Nam tìm số đột biến liên quan kháng thuốc Đặc biệt, chưa có nghiên cứu biểu gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc phân lập từ bệnh nhân người Việt Nam Đề tài nghiên cứu đặt nhằm phát số đột biến kháng thuốc gen mã hóa protease HIV, đồng thời bước đầu biểu gen vi khuẩn E coli để làm sở cho nghiên cứu Các nghiên cứu luận văn thực Phịng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung HIV 1.1.1 HIV/AIDS Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải gọi tắt AIDS, virus HIV gây suy giảm miễn dịch người phát Mỹ năm 1981, đến trở thành “căn bệnh kỷ” toàn giới Về phân loại, HIV Retrovirus có máy di truyền thuộc họ Retroviridae với hai type HIV type (HIV-1) HIV type (HIV-2), HIV-1 gây 98% lan truyền HIV-2 chiếm ưu vùng tây châu Phi, lan truyền giới [1, 15] Vì vậy, HIV-1 xem nguyên nhân gây nên AIDS HIV-1 chia thành nhóm M (main), O (outlier), nhóm N (new) 90% lây nhiễm HIV thuộc nhóm M Trong nhóm M gồm phân nhóm A, B, C, D, F, G, H, J, K nhiều dạng tái tổ hợp khác (circulating recombinant form-CRF) Các phân nhóm khác chủ yếu cấu trúc protein vỏ đặc trưng cho truyền nhiễm theo khu vực địa lý Đây đặc điểm đáng lưu ý nghiên cứu để tìm thuốc điều trị cho bệnh nhân HIV/AIDS theo khu vực [14] Về cấu trúc, HIV có dạng hình cầu với kích thước khoảng 120 nm, mơ tả hình Lớp vỏ ngồi virus HIV bao gồm lớp màng lipid kép có nguồn gốc từ tế bào chủ, lớp vỏ có chứa khoảng 72 protein env virus, protein env lại chứa mũ tạo thành từ phân tử gp120 thân tạo thành từ phân tử gp41 có chức neo giữ lõi virus với vỏ bao ngồi Lõi virus có dạng hạt đậu tạo thành từ 2.000 protein p24 Trong lõi bao gồm hệ gen HIV hai sợi RNA (+) đơn, sợi có kích thước khoảng 10 kb gồm gen mã hóa cho 15 protein khác Cuối chuỗi RNA trình tự gọi trình tự lặp lại tận dài (LTRs) đóng vai trị việc kiểm sốt nhân lên điều hịa q trình tổng hợp protein virus Giống retrovirus khác, HIV có gen gag, pol env mã hóa cho protein tham (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng Sau nhân dòng thành cơng đoạn gen mã hóa cho protease HIV-1 mang đột biến N83T gắn thêm trình tự HA vào vector pGEM-T, tiến hành xử lý vector pGEM-ProtHA vector pET32a cặp enzyme giới hạn BamHI XhoI nhằm tạo đầu dính tương thích cho phản ứng gắn sau Sản phẩm cắt enzyme giới hạn sau tinh Kết điện di gel agarose 1% sản phẩm phân cắt vector pGEM-ProtHA sau tinh (hình 12) cho thấy chúng tơi thu băng DNA rõ nét, băng có kích thước khoảng 5,9 kb tương ứng với kích thước vector pET32a (hình 12, đường chạy 3) băng có kích thước khoảng 0,34 kb tương ứng với kích thước gen mã hóa protease HIV-1 (hình 12, đường chạy 1) Hình 12: Điện di sản phẩm phân cắt vector pGEM-ProtHA BamHI XhoI Đường chạy 1: Gen mã hóa protease HIV-1 sau xử lý BamHI XhoI Đường chạy 2: Thang chuẩn DNA kb Đường chạy 3: Vector pET32a sau xử lý BamHI XhoI Tiếp theo, tiến hành phản ứng gắn đoạn gen mã hóa protease HIV1 vào vector pET32a enzym T4 DNA ligase Hỗn hợp phản ứng ủ 4oC qua đêm (12-16 giờ), sau biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5α cấy trải đĩa LB có bổ sung 50 g/ml ampicillin 34 g/ml cholramphenicol, nuôi qua đêm 37oC Kết thu khuẩn lạc riêng rẽ Một số khuẩn lạc trắng (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Lớp Cao học K18 35 Khóa 2009-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng chọn ngẫu nhiên để xác định có mặt gen vector phương pháp PCR trực tiếp với hai cặp mồi T7 promoter/teminator (gọi tắt cặp mồi T7Fw/Rv) có trình tự dựa trình tự vector pET32a Một phản ứng với với khuôn pET32a nguyên khơng chứa đoạn gen mã hóa protease HIV-1 tiến hành để làm đối chứng Theo tính tốn lý thuyết, khuẩn lạc có chứa vector pET32a-ProtHA tái tổ hợp, PCR sử dụng cặp mồi T7 cho băng DNA kích thước khoảng 1,1 kb bao gồm 0,34 kb đoạn gen mã hóa protease HIV-1 đoạn 0,74 kb vector Cịn phản ứng với khn pET32a nguyên bản, PCR sử dụng cặp mồi cho băng DNA kích thước khoảng 0,74 kb Hình 13: Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa protease HIV-1 có thể biến nạp Đường chạy 1: Thang chuẩn DNA 1kb Đường chạy 2: Đối chứng âm Đường chạy 4: Sản phẩm PCR pET32a nguyên Đường chạy 3;5: Sản phẩm PCR với khuôn khuẩn lạc Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 1% (hình 13) cho thấy sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi T7Fw/Rv với plasmid tách từ khuẩn lạc trắng cho băng DNA kích thước khoảng 1,1 kb (hình 13, đường chạy 5) vector pET32a nguyên cho băng khoảng 0,74 kb (hình 13, đường chạy 3) (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Lớp Cao học K18 36 Khóa 2009-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng Để khẳng định chắn vector pET32a tái tổ hợp thu mang đoạn gen mã hoá protease HIV-1, chúng tơi tiến hành đọc trình tự gen mã hóa protease HIV-1 vector pET32a Hình 14: Trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vector pET32-ProtHA : Axit amin mở đầu trình tự Trx.Tag : Vị trí cắt giới hạn enzyme BamHI Spe I : Trình tự tự cắt : Trình tự protease HIV-1 mang đột biến N83T : Trình tự axit amin HA : Trình tự enzyme XhoI : Trình tự His.Tag (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Lớp Cao học K18 37 Khóa 2009-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng Kết đọc trình tự cho thấy đoạn gen mã hóa proteasae HIV-1 đưa vào vector pET32a vị trí khung đọc, vector tái tổ hợp gọi pET32ProtHA (hình 14); trình tự gen mã hóa protease HIV-1 pET32-ProtHA giống 100% với trình tự gen mã hóa protease HIV-1 vector pGEM-ProtHA (hình 15) Như vậy, khẳng định chắn gắn thành công đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu pET32a Hình 15: Kết so sánh trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến N83T vector pET32-ProtHA vector pGEM-ProtHA 3.2.4 Cảm ứng biểu protease HIV-1 mang đột biến N83T vi khuẩn E coli BL21 (DE3) RIL Để biểu gen mã hóa protease HIV-1, plasmid tái tổ hợp pET32-ProtHA sau đưa vào tế bào khả biến E coli chủng DH5α tinh biến nạp vào tế bào E coli BL21 (DE3) RIL Một khuẩn lạc tế bào E coli chủng BL21 (DE3) RIL mang pET32-ProtHA nuôi cấy qua đêm môi trường LB lỏng Tế bào trẻ hóa 150 ml LB lỏng ni cấy mật độ tế bào A600 đạt đến khoảng 0,7, tiến hành cảm ứng IPTG 0,1 mM Sau (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Lớp Cao học K18 38 Khóa 2009-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng 3h nuôi cấy, tế bào ly tâm để loại bỏ dịch nuôi cấy siêu âm để thu dịch chiết đệm Tris-HCl 20 mM pH 7,9 có chứa NaCl 100 mM, PMSF 1mM Tương tự, protein tổng số phân đoạn kết tủa thu nhận cách hòa tủa tế bào đệm Tris-HCl 20 mM pH 7,9 có ure M Protein tổng số phân đoạn dịch chiết phân đoạn tủa tế bào sau điện di gel SDSPAGE 15% thẩm tách miễn dịch với kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 Kết điện di protein tổng số hình 16 cho thấy phân đoạn tủa (đường chạy 1) dịch chiết (đường chạy 2) tế bào E coli BL21 (DE3) mang pET32a-ProtHA cảm ứng IPTG xuất băng kích thước khoảng 19 kDa, mẫu khơng cảm ứng khơng có băng protein (đường chạy 4) Kết điện di cho thấy protein tái tổ hợp có mặt phân đoạn kết tủa nhiều dịch chiết Tuy vậy, băng protein tái tổ hợp 19 kDa không tương đương với KLPT protease HIV-1 tái tổ hợp dạng dung hợp gắn với thioredoxin (KLPT tổng cộng 31 kDa) hay dạng tự cắt khỏi thioredoxin (12 kDa) (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Lớp Cao học K18 39 Khóa 2009-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng Hình 16: Kết điện di protein tổng số có chứa protease HIV-1 tái tổ hợp mang đột biến N83T phân đoạn dịch chiết tủa tế bào E coli BL21 (DE3) RIL Đường chạy 1: Phân đoạn tủa tế bào E coli BL21 (DE3) RIL mang pET32-ProtHA cảm ứng IPTG 0,1 mM Đường chạy 2: Dịch chiết tế bào E coli BL21 (DE3) RIL mang pET32-ProtHA cảm ứng IPTG 0,1 mM Đường chạy 3, 4: Phân đoạn tủa dịch chiết tế bào E coli BL21 (DE3) RIL mang pET32-ProtHA không cảm ứng IPTG Đường chạy 5; 6: Phân đoạn tủa dịch chiết tế bào E coli BL21 (DE3) RIL mang pET32-Prot cảm ứng IPTG 0,1 mM (đối chứng dương) Đường chạy 7: Thang chuẩn protein nhuộm sẵn Đường chạy 8: Phân đoạn tủa tế bào E coli BL21 (DE3) RIL mang pET32a nguyên cảm ứng IPTG 0,1 mM (đối chứng âm) 3.2.5 Tinh protein tái tổ hợp cột sắc ký lực His-bind Để có thêm sở thể lý giải băng protein tái tổ hợp thu có KLPT khơng phù hợp với tính tốn lý thuyết, tiến hành tinh protein (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Lớp Cao học K18 40 Khóa 2009-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng sắc ký qua cột lực hisbind Cụ thể, siêu âm phá vỡ màng tế bào, sau loại bỏ dịch thu tủa tế bào Kết tủa rửa đệm Tris-HCl 20 mM pH 7,9 có chứa Triton X-100 1%, ure M kết hợp lắc nhẹ 30 phút nhiệt độ phịng, sau ly tâm để loại bỏ dịch Bước thực lặp lại lần nhằm loại bỏ phần lớn protein không mong muốn khác Protein tái tổ hợp kết tủa hòa tan đệm Tris-HCl 20 mM, pH 7,9, NaCl 100 mM, ure M, imidazol mM (đệm A), sau cho lên cột hisbind cân với đệm A Protein gắn cột rửa chiết đệm A có chứa imidazol 250 mM Các phân đoạn không hấp thụ cột phân đoạn protein rửa chiết imidazol 250 mM kiểm tra độ tinh điện di protein gel SDS-PAGE 15% thẩm tách miễn dịch với kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 Kết điện di protein thể hình 17 cho thấy phân đoạn khơng hấp thụ cột có chứa số băng protein khác (hình 17, đường chạy 2), phân đoạn rửa chiết imidazol gần có băng protein khoảng 19 kDa (hình 17, đường chạy 1), chứng tỏ protein tinh Kết phân tích thẩm tách miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dịng kháng protease HIV-1 (hình 18) cho thấy kháng thể đơn dịng kháng protease HIV-1 khơng nhận biết băng protein 19 kDa dịch hòa tan kết tủa tế bào băng protein tái tổ hợp tinh Chúng thử khả phân cắt chất đặc hiệu chế phẩm protein tái tổ hợp thu được, nhiên kết qủa cho thấy protein thu khơng có hoạt tính Kết khẳng định protein mà chúng tơi thu protease HIV-1 chứa phần nhỏ protein nên khơng thể tính kháng nguyên hoạt tính xúc tác protease HIV-1 Tóm lại, chúng tơi phát đột biến kháng nhẹ thuốc PI gen mã hóa protease HIV-1 phân lập từ bệnh nhân Việt Nam điều trị thuốc kháng virus bước đầu đưa gen vào hệ thống vector biểu pET32a dạng dung hợp với gen mã hóa cho thioredoxin với trình tự nhận (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Lớp Cao học K18 41 Khóa 2009-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng biết phân cắt protease HIV-1 Tuy chưa thành công việc biểu gen mã hóa protease HIV-1 để tạo protein có hoạt tính Hình 17: Điện di protein kiểm tra độ tinh phân đoạn qua cột His-bind Đường chạy Phân đoạn rửa chiết cột His-bind imidazil 250 mM Đường chạy Phân đoạn không gắn cột His-bind Đường chạy Protein tổng số tủa tế bào E coli BL21 (DE3) RIL mang pET32-ProtHA Đường chạy Thang chuẩn protein nhuộm sẵn (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Lớp Cao học K18 42 Khóa 2009-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng Hình 18: Kết thẩm tách miễn dịch kiểm tra độ tinh phân đoạn qua cột His-bind Đường chạy Thang chuẩn protein nhuộm sẵn Đường chạy Protein tổng số tủa tế bào E coli BL21 (DE3) RIL mang pET32-ProtHA Đường chạy Protease HIV-1 (Đối chứng dương) Đường chạy Phân đoạn không gắn cột His-bind Đường chạy Phân đoạn rửa chiết cột His-bind imidazil 250 mM (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Lớp Cao học K18 43 Khóa 2009-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng KẾT LUẬN Từ kết thu trình nghiên cứu, rút số kết luận sau: Đã nhân bản, nhân dòng xác định trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 thu nhận Việt Nam phát đột biến thay nucleotide A C vị trí 248 (A248C), dẫn đến thay asparagine (N) trí 83 threonine (T) protein Đột biến xác nhận có tính kháng nhẹ thuốc ức chế protease Đã đưa gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến N83T vào vector biểu pET32a dạng dung hợp với thioredoxin với trình tự nhận biết phân cắt protease HIV-1 biến nạp vào tế bào E coli BL21 (DE3) RIL Protein biểu từ tế bào mang vector tái tổ hợp có khối lượng phân tử khoảng 19 kDa, tinh qua cột sắc ký lực hisbind không nhận biết kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 khơng có hoạt tính phân cắt chất đặc hiệu enzyme KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu cách có hệ thống diện rộng gen mã hóa protease HIV để phát đột biến kháng PI phục vụ công tác điều trị nghiên cứu Nghiên cứu biểu gen mã hóa cho protease HIV-1 mang đột biến N83T đột biến kháng PI khác để tìm hiểu đặc trưng xúc tác ảnh hưởng thuốc ức chế protease lên hoạt độ chúng, góp phần làm sáng tỏ tính chất kháng thuốc điều trị bệnh AIDS (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Lớp Cao học K18 44 Khóa 2009-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Đỗ Ngọc Liên (2008), Miễn dịch học sở, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Thị Hồng Loan, Hồ Xuân Hùng, Ngô Thị Huyền Trang, Nguyễn Thị Vân Anh, Phan Tuấn Nghĩa (2010), “Nhân dịng bước đầu biểu gen mã hóa protease HIV type phân lập Việt Nam”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 8(2), tr 227-233 Nguyễn Thị Hồng Loan, Nguyễn Văn Dũng, Nguyễn Thị Trang Huyền, Nguyễn Thị Vân Anh, Phan Tuấn Nghĩa (2011), “Một số đột biến gen mã hóa protease HIV type phân lập Việt Nam”, Tạp chí Khoa học Công nghệ (ĐHQGHN) (đang in) Tài liệu tiếng Anh Alastair, J J., Wood, M D (1998), “HIV protease inhibitors”, Engl J Med, 338, pp 1281-1292 Chen, H., Xu, Z., Yin, X., Cen, P (2007), “Cloning and expression of the HIV protein in Escherichia coli cell-free system”, Appl Micrbiol Biotechnol, 77, pp 347–354 Cheng, Y S E, McGowan, M H, Kettner C A, Schloss, J V., Erickson, S., Yin F H (1990), “High-level synthesis of recombinant HIV-1 protease and the recovery of active enzyme from inclusion bodies”, Gene, 87, pp 243-248 Daar, E S., Little, S., Pitt, J., Santagelo, J., Ho, P., Harawa, N., Kemdt, P., Giogi, J V., Bai, J., Gaut, P., Richman, D A., Mandel, S., Nicholas, S (2001), “Diagnosis of primary HIV-1 infection”, Ann Int Med, 134, pp 25-29 Darke, P L., Leu, C T., Davis, L J., Heimbach, J C., Diehl, R.E., Hill, W S., Dixon, R A , Sigal, I S (1989), “Human immunodeficiency virus protease: bacterial expression and characterization of the purified aspartic protease”, J Biol Chem, 264, pp 2307-2312 Debouck, C., Gorniak, J G., Strickler, J E., Meek, T D., Metcalf B W., Rosenberg, M (1987), “Human immunodeficiency virus protease expressed in Escherichia coli exhibit autoprocessing and specific maturation of the gag precursor”, Proc Natl Acad Sci USA, 84, pp 8903-8906 (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Lớp Cao học K18 45 Khóa 2009-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng 10 Dergousova, N L., Amerik, A Y., Volynskaya, A M., Rumsh, A D (1996), “HIV-1 protease cloning, expression, and purification”, Appl Biochem Biotechnol, 61, pp 97-108 11 Francessca, C., Gago, F., Bertoli, A., Forbici, F (2004), “Identification of the minimal conserved structure of HIV-1 protease in the presence and absence of drug pressure”, AIDS, 12, pp 9-11 12 Geoghegan, K F., Spender, R W., Danley, D E., Contillo, L G., Andrews, G C., (1990), “Fluorescence-based continuous assay for the aspartyl protease of human immunodeficiencyl virus HIV-1”, FEBS Lett, 262(1), pp 119-122 13 Graves, M C., Lim J J., Heimer, E P (1988) “An 11-kDa form of human immunodeficiency virus protease expressed in Escherichia coli is sufficient for enzymatic activity”, Proc Natl Acad Sci USA, 85, pp 2449-2453 14 Hare, B C (2006), “Clinical overview of HIV”, HIV Insite Knowledge Base Chapter Nguồn www.hivinsite.ucsf.edu 15 Hoffman, C., Rockstroh, J., Kamps, B S., HIV Medicine (2006) from www HIVMedicine.com 16 Ishizaki, A., Cuong, N H., Thuc, P V., Trung, N V., Saijoh, K., Kageyama, S., Ishigaki, K., Tanuma, J., Oka, S., Ichimura, H (2009), “Profile of HIV type infection and genotypic resistance mutations to antiretroviral drugs in treatment-naive HIV type 1-infected individuals in Hai Phong, Viet Nam”, AIDS Res Hum Retrovir., 25, pp 175-182 17 Janeway, C (2001), Immunobiology, Garland Science, USA 18 Komai, T., Ishikawa, Y., Yagi, R., Suzuki-Sunagawa, H., Nishigaki ,T., Handa, H (1997), “Development of HIV-1 protease expression methods using the T7 phage promoter system”, Appl Microbiol Biotechnol., 47, pp 241-245 19 Krauslicht, H G., Ingrahams, R H., Skoog, M T.,Wimmert, E., Pallait, P V., Cartert, C A (1989), “Activity of purified biosynthetic proteinase of human immunodeficiency virus on natural substrates and synthetic peptides”, Proc Natl Acad Sci USA, 86, pp 807-811 (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Lớp Cao học K18 46 Khóa 2009-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng 20 Laemmli, U K (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature.227, pp: 680-685 21 Lan, N T., Recordon-Pinson, P., Hung, P V., Uyen, N T., Lien, T T (2003), “HIV type isolates from 200 untreated individuals in Ho Chi Minh City (Vietnam): ANRS 1257 study, Large predominance of CRF01_AE and presence of major resistance mutations to antiretroviral drugs”, AIDS Res Hum Retrovir., 19, pp 925–928 22 Lech, W J., Wang, G., Yang, Y L., Chee, Y., Dorman, K., McCrae, D., Lazzeroni, L C., Erickson, J.W., Sinsheimer, J S., Kaplan, A H (1996), “In vivo sequence diversity of the protease of human immunodeficiency virus type 1: presence of protease inhibitor-resistant variants in untreated subjects”, J Virol., 70, pp 2038–2043 23 Leuthardt, A., Roesel, J L (1993), “Cloning, expression and purification of a recombinant poly-histidine-linked HIV-1 protease”, FEBS Lett, 326 (1, 2,3), pp 275-280 24 Louis, J M., Mcdonald, R A., Nashed, N T., Wondraku, E M., Jerina, D M., Oroszilan S., Mora, P T (1991), “Autoprocessing of the HIV-1 protease using purified wild-type and mutated fusion proteins expressed at hing level in Escherichia coli”, Eur J Biochem., 199, pp 361-369 25 Louis, J M., Nashed, N T., Parris, K D., Kimmel, A R., Jerina D M (1994), “Kinetics and mechanism of autoprocessing of human immunodeficiency virus type protease from an analog of the Gag-pol protein”, Proc Natl Acad Sci USA, 91, pp 7970- 7974 26 Nashed, N T., Louis, J M., Sayer, J M., Wondrak, E M., Mora, P T., Oroszlan, S., Jerina, D M (1989), “Continuos spectrophotometric assay for retroviral protease of HIV-1 and AMV”, Biochem Biophys Research Commun., 163(2), pp 1079-1085 27 Navia, M A., Fitzgerald, P M., McKeever, B M., Leu, C.T., Heimback, J C., Herber W K., Sig, I S., Darke P.L., Springer J P (1989), “Three-dimensional structure of aspartyl protease from human immunodefiency virus HIV-1”, Nature Rev., 337 (6208), pp 615-620 (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Lớp Cao học K18 47 Khóa 2009-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng 28 Nijhuis, M., Maarseveen, N M., Lastere, S., Schipper, P., Coakley, E., Glass, B (2007), “A novel substrate-based HIV-1 protease inhibitor drug resistance mechanism”, Plos Med., pp 152-163 29 Nutt, R F., Brady, S F., Darke, P L., Ciccarone, T M., Nutt, E M., Rodkey, J A., Bennett, C.D., Waxman, L H., Sigal, I S., Anderson, P S., Veber D F (1988), “Chemical synthesis and enzymatic activity of a 99-residue peptide with a sequence proposed for the human immunodeficiency virus protease”, Proc Natl Acad Sci USA, 85, pp 7129-7133 30 Rao, M., Tanksale, A., Ghatge, M S., Deshpande, V V (1998), “Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases”, Microbiol Mol Biol Rev., 62, pp 600-601 31 Richards, A D., Phylip, L.H., Farmerie, W G., Scarborough, P E., Alvares, A., Dunn, B M., Hirel, H., Konvalinka, J., Strop, P., Pavlickova, L., Kostla, J., Kay V (1990), “Sensitive, soluble chromogenic substrates for HIV-1 Proteinase”, J Biol Chem USA, 265 (14), pp 7733-7736 32 Rangwala, S H., Finn, R F., Smith, C.E., Berberich, S A., Salsgiver, W J., Stallings, W C., Glover, G I., Olins, P O (1992), “High-level production of active HIV-1 protease in Escherichia coli”, Gene, 122, pp 263-269 33 Sambrook, J., Russell, D W (2000), Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp 15-22 34 Shedlock, D J., Daniel H., Andy, Y C., Christopher, W C., Karuppiah, M., David, B W (2008), Apoptosis, Spingerlink, USA 35 Taylor, A., Brown, P D., Kadam, S., Maus, M., Kohlbrenner, E W., Weigl, D., Turon, C M., and Katz, L (1992), “High-level expression and purification of mature HIV-I protease in Escherichia coli under control of the araBAD promoter”, Appl Microbiol Biotechnol., 37, pp 205-210 36 UNAIDS in Vietnam, from www.unaids.org.vn 37 United nations program on HIV/AIDS, UNAIDS/WHO AIDS, Epidemic update: December 2010 (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc Lớp Cao học K18 48 Khóa 2009-2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc (LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc(LUAN.van.THAC.si).nghien.cuu.gen.ma.hoa.protiease.HIV.mang.dot.bien.khang.thuoc