A Tách chiết lipid Đồ cần chuẩn bị Dichloromethane methanol (2 1) Bình tam giác 100 Giấy lọc Whatman KCl 0,88% Quy trình 1 Cân 0,2g sinh khối khô vào bình thủy tinh 2 Bổ sung 8ml hỗn hợp d[.]
A Tách chiết lipid Đồ cần chuẩn bị: Dichloromethane : methanol (2:1) Bình tam giác 100 Giấy lọc Whatman KCl 0,88% Quy trình: Cân 0,2g sinh khối khơ vào bình thủy tinh Bổ sung 8ml hỗn hợp dung môi (dichloromethane : methanol = 2:1 ) vào bình, đậy kín để 2h (thỉnh thoảng lắc nhẹ) Lọc dung dịch giấy Whatman vào ống falcon 15mL Thêm 1,25ml dung dịch KCl 0,88% vào dịch lắc mạnh + ly tâm phút Hút lớp (lipid), loại bỏ lớp (dung môi) sấy khô 60oC → cân lại tính hàm lượng theo cơng thức: X = m2/m1 x 100% m1: khối lượng sinh khối khô đem tách m2: khối lượng lipid cân sau tách X: hàm lượng lipid (%) B Xác định hàm lương Carbohydrate Hóa chất cần chuẩn bị H2SO4 1M: Đổ 30mL nước vào ống falcon, sau rót từ từ 2,18mL H2SO4 98% vào cuối them nước vào ống cho đủ 40mL (nước = 38,72mL) * Chú ý: Không đổ nước trực tiếp vào H2SO4 đặc (98%) Glucose (0,1mg/mL) Phenol 5% (Hòa 2g tinh thể phenol 40mL nước) H2SO4 đặc (98%) Ống nghiệm, ống eff Tách chiết Carbohydrate Hịa 200mg sinh khối khơ 10mL H2SO4 1M siêu âm phút Ủ mẫu 100 C 1h Ly tâm mẫu thu dịch (đường đơn bị thủy phân) Đo carbohydrate Xây dựng đường chuẩn carbohydrate theo bảng: H2O (uL) Glucos e (uL) 200 180 160 140 120 100 20 40 60 80 80 60 40 10 20 11 100 120 140 16 18 20 0 Pha loãng mẫu 100 lần Mỗi ống eff cho 200uL mẫu + 600uL H2SO4 đặc + 120uL phenol 5% Ống blank cho 200uL nước + 600uL H2SO4 đặc + 120uL phenol 5% Vortex ống eff ủ 90ºC phút Để yên nhiệt độ phòng phút Hút từ ống 260uL cho vào giếng đĩa 96 (mỗi mẫu lặp lại lần) Đo OD bước sóng 490nm Note: x2 thể tích ( b1-4) C Xác định hàm lượng protein phương pháp Bradford Hóa chất cần chuẩn bị: Lysis buffer: 5ml/L Triton X100; 0,3722g/L Na2EDTA; 0,0348g/L PMSF Thành phần Triton X100 (5mL/ Stock solution Solution Pha 50mL 250uL L) Na2EDTA 3,722g/40mL 200uL (0,3722g/L) PMSF (0,0348g/L) 3,48mg/100uL 50uL Ống nghiệm, ống eff Nước deion BSA - kit (2mg/mL) Dung dịch thuốc thử Bradford (kit – có sẵn) Tách chiết protein Hịa 10mg sinh khối khơ 10mL Lysis buffer Giữ nhiệt độ phòng 10 phút → siêu âm phá vỡ tế bào 10 phút → ly tâm mẫu 10000 vòng / 4oC / 20 phút → thu dịch chứa protein Xác định hàm lượng protein theo pp Bradford Dựng đường chuẩn protein Chuẩn bị ống nghiệm chứa 40uL BSA (2mg/mL) theo bảng nồng độ Ống ug BSA uL BSA uL Nước Nồng độ (mg/mL) 0 40 2,5 37,5 0.12 10 35 0.2 15 7,5 32,5 0.37 5 20 10 30 0.5 25 12,5 27,5 0.62 30 35 15 17,5 25 22,5 0.75 0.87 40 20 Thêm 2mL dung dịch Bradford vào ống nghiệm chứa BSA Trộn để 10 phút (< 60p) nhiệt độ phòng Đo OD bước sóng 595nm (Blank = ống 0) Xác định hàm lượng protein mẫu Hút 2ml dung dịch Bradford vào ống nghiệm chứa 40uL mẫu Trộn để nhiệt độ phòng 10 phút Đo OD bước song 595nm Tính hàm lượng protein theo phương trình đường chuẩn (Y = Ax + B) OD mẫu nằm đường chuẩn Nếu phải pha loãng mẫu tính theo cơng thức sau: P (%) = CVD / m x 100% C: Hàm lượng protein theo phương trình đường chuẩn (mg/mL) V: Thể tích Lysis buffer sử dụng (mL) D: Độ pha loãng mẫu m: Sinh khối khơ dùng để chiết (mg) T470 Tốn vũ miện tây hồ 300/1b-2b/1t gs nữ trường