Bài phúc trình học phần thực tập vi sinh môi trường bài 1 an toàn phòng thí nghiệm vi sinh và nguyên tắc vận hành các thiết bị

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN  BÀI PHÚC TRÌNH HỌC PHẦN THỰC TẬP VI SINH MÔI TRƯỜNG MÃ HP: MT422 Họ tên: Phan Hữu Quốc Sĩ B2202194 Lê Hồng Thái B2202197 Nguyễn Văn Thích B2202199 Nguyễn Thái Tú Thanh B2202196 La Thương B2202205 Lớp: MT2257A1 Nhóm: Lớp/Nghành: KTMT GVHD: Kim Lavane Học kì năm 2023-2024 Bài 1: An tồn phịng thí nghiệm vi sinh ngun tắc vận hành thiết bị Bài 2: Chuẩn bị môi trường phân lập nuôi cấy VSV 12 Bài 3: Phân lập VSV 16 Bài 4: Định lượng tổng E.coli Coliform phương pháp MPN 18 Bài 5+6+7: Định lượng vi khuẩn hiếu khí, Enterococi E.coli coliform nước phương pháp màng lọc .23 Bài 8: Sử dụng kính hiển vi quan sát vi sinh vật bùn hoạt tính 28 Tài liệu tham khảo 30 BÀI 1: AN TỒN PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ NGUN TẮC VẬN HÀNH CÁC THIẾT BỊ • Các nguyên tắc an tồn: Một số hướng dẫn an tồn phịng thí nghiệm sinh kỹ thuật môi trường Chuẩn bị đọc trước thí nghiệm để giảm tối đa rủi ro q trình thí nghiệm Khơng ăn uống phịng thí nghiệm, khơng để lên miệng vật dụng viết chì trình nuôi cấy nhằm hạn chế nguy nhiễm vi sinh vật từ phịng thí nghiệm Bắt buộc mặc áo blouse đeo tra suốt trình làm thí nghiệm Chỉ mang theo vật dụng cần thiết dùng cho thí nghiệm, ghi chép bút ghi Các vật dụng khác tập trung chỗ riêng biệt Trước bắt đầu hay sau kết thúc thí nghiệm cần phải khử trùng cồn 700C Phải có nhãn ghi chai, lọ chứa đựng hóa chất, mơi trường có ghi đầy đủ ngày tháng pha Việc có nhãn mác giúp tránh nhầm lẫn hóa chất, mơi trường với biết thời gian sử dụng Cần tuân thủ dẫn ghi chai lọ hóa chất để đảm bảo an tồn sử dụng biết cách xử lý có cố Khi làm việc mẫu vi sinh cần phải cẩn thận tránh tiếp xúc với vết thương (nếu có) Cần thận trọng việc sử dụng đèn cồn Tránh làm đổ cồn lên mặt bàn Khử trùng cồn phải tuyệt đối tuân thủ qui tắc để tránh phựt lửa 10 Không sử dụng miệng để thực hút hóa chất, mơi trường pipette Ln cầm nắm pipette nhẹ nhàng chắn để tránh rơi vỡ hay làm gãy pipette Thực tương tự dụng cụ thủy tinh 11 Cần phải khử trùng dụng cụ sử dụng để thực thí nghiệm với vi sinh vật trước cất thải bỏ Khơng đổ mơi trường có chứa vi sinh vật vào bồn rửa Trường hợp này, môi trường phải khử trùng trước đổ bỏ Đối với môi trường thạch (agar), khử trùng môi trường trước thải bỏ phải thực Cần lưu ý khử trùng thạch cần có túi nylong chuyên dụng để tránh thạch lỏng đổ thiết bị khử trùng Riêng mẫu môi trường thu thập từ đất, nước tự nhiên khơng cần phải khử trước trước thải bỏ trường hợp không sử dụng hết 12 Sau kết thúc buổi thực hành cần phải dọn dẹp ngăn nắp lau bề mặt cồn 70oC Ngoài cần phải vệ sinh tay cẩn thận trước rời khỏi phịng thí nghiệm 13 Nếu q trình thao tác thí nghiệm có bị vết cắt hay có cố khác cần báo cho người hướng dẫn phịng thí nghiệm để xử lý kịp thời phù hợp • Nguyên tắc vận hành thiết bị: 1/ Tủ ủ vi sinh MODEL BE600 Tủ ấm vi sinh thiết bị sinh học bên có điện trở gia nhiệt, có tác dụng truyền nhiệt cho khơng khí bên buồng tủ Điện trở gia nhiệt giúp chuyển hóa điện thành nhiệt năng, hệ thống quạt giúp điều chỉnh độ ẩm tạo nên luồng khơng khí có nhiệt độ độ ẩm thích hợp Tủ ấm thường có lớp cách nhiệt nhằm trì nhiệt độ ổn định bên tủ Tủ ấm vi sinh sử dụng với mục đích tạo trì mức nhiệt độ độ ẩm thích hợp cho mơi trường theo yêu cầu người nghiên cứu Tủ ấm sử dụng với mục đích chính: Tạo mơi trường nuôi cấy vi sinh vật: Mỗi loại vi sinh vật cần điều kiện khác để tồn sinh sản, cần sử dụng tủ ấm vi sinh để tạo nhiệt độ, độ ẩm, độ pH, thích hợp Tạo mơi trường ủ ấm vi sinh vật, hỗ trợ vi sinh vật sinh trưởng phát triển: Mỗi loại vi sinh vật lại đòi hỏi nhiệt độ để sinh trưởng phát triển khác Để ni cấy vi sinh vật thành công đạt hiệu cao cần phải cung cấp nhiệt độ thích hợp Nhờ khả điều chỉnh nhiệt độ, tủ ấm vi sinh sử dụng nhiều bệnh viện, phịng thí nghiệm, hoạt động nghiên cứu sản xuất với nhiều ứng dụng khác nhau: • Được ứng dụng trình sản xuất loại thực phẩm cần lên men nhờ hoạt động vi sinh vật sữa chua, pho-mai, nước tương, giấm, rượu, • Ứng dụng việc xử lý rác thải cách nuôi cấy phát triển loại vi sinh vật có khả phân hủy chất hữu • Ứng dụng nuôi trồng thủy sản thông qua việc nuôi cấy phát triển ví inh vật có khả lọc nước thải, tái sử dụng nước thải • Ứng dụng công nghệ sản xuất phân vi sinh, chế phẩm hóa học, thuốc kích thích tăng trưởng, • Sử dụng nhiệt độ để khử trùng: dùng tủ ấm vi sinh tạo nhiệt độ cao nhiệt độ tối đa vi sinh vật làm biến tính cấu trúc, chức chúng • Kiểm tra khả chịu nhiệt vi sinh vật • Nghiên cứu kết tinh • Lưu trữ hóa chất nhiệt độ thích hợp • Kiểm tra độ ổn định dược phẩm trước thay đổi nhiệt độ Tủ ấm nuôi cấy vi sinh ngày sử dụng rộng rãi nhằm phục vụ hoạt động nghiên cứu, sản xuất Chúng ta cần bỏ khoản chi phí đầu tư ban đầu thực nhiều hoạt động liên quan đến nghiên cứu, ứng dụng vi sinh vật Trên thị trường có nhiều dịng sản phẩm tủ ni cấy vi sinh có xuất xứ từ nhiều nước khác nên chất lượng khác Vì lựa chọn mua tủ ấm vi sinh bạn nên tìm địa uy tín - Hướng dẫn sử dụng: B1: Cắm dây nguồn vào ổ điện B2: Bật công tắc nguồn (vặn nút POWER vị trí I), đèn nguồn sáng xanh, nhiệt dộ tủ lên bảng B3: Nhấn nút SET xoay nút điều chỉnh nhiệt dộ đến mức thích hợp Nhiệt độ tủ tăng lên từ từ Khi nhiệt độ đạt đến mức thiết lập tự động khơng tăng trì ổn định suốt thời gian vận hành B4: Nếu xoay nút nhanh nhiệt độ thay đổi lớn Khi xoay nút chậm nhiệt độ thay đổi chậm theo mức nhỏ B5: Khi kết thúc vận hành, trị số nhiệt độ giữ nguyên lúc SET ban đầu Lưu ý điều chỉnh nhiệt độ lần có thay đổi nhiệt độ B6: Sau sử dụng, vặn nút POWER vị trí đèn power tắt Rút dây nguồn khỏi ổ điện 2/ Tủ sấy MODEL UNE 600 - Hướng dẫn sử dụng: B1: Cắm phích điện vào nguồn điện B2: Nhấn nút ON/OFF, đèn bật sáng, nhiệt độ tủ, nhiệt độ tối đa tủ sẻ lên bảng theo dõi nhiệt độ B3: nhấn nút SET xoay nút để điều chỉnh đến nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ tủ tăng lên từ từ, đạt đến nhiệt độ cần thiết ngừng tăng trì nhiệt độ bên suốt thời gian vận hành B4: Nếu xoay nút nhanh điểm nhiệt độ thay đổi lớn, xaoy chậm điểm nhiệt độ thay đổi số B5: Khi máy kết thúc vận hành, giá trị nhiệt độ SET giữ máy tắt công tắc máy Lưu ý để điều chỉnh nhiệt độ cho lần sử dụng B6: Sau sử dụng xong, nhấn nút ON/OFF, đèn POWER tắt 3/ Thiết bị khử trùng HIRAYAMA HVE-50 - Hướng dẫn sử dụng: B1: Cắm phích điện vào nguồn điện Nhấn nút POWER ON/OFF để bật thiết bị B2: Mở nắp: Đẩy gạt phía UNCLOCK, nắp tự động bật lên B3: Cho nước cất lần vào buồng khử trùng nhìn thấy mục nước ngập để đỡ dụng cụ (3 lít) B4: Cho mơi trường vi sinh, dụng cụ cần khử trùng vào buồng khử trùng LƯU Ý: ĐỂ CÁC DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG TRONG RỌ INOX VÀ ĐẶT RỌ VÀO BUỒNG KHỬ TRÙNG B5: Đóng nắp: Kéo gạt phía CLOCK B6: Kiểm tra chọn chế độ khử trùng: - Nhấn nút MODE để chọn chế độ khử trùng - Khử trùng Agar: chọn MODE - Khử trùng chất lỏng: chọn MODE - Khử trùng dụng cụ: chọng MODE B7: Cài đặt nhiệt độ thời gian khử trùng: Nhấn nút SET/ENT Để điều chỉnh nhiệt độ nhấn nút () để tăng nhiệt độ nút () để giảm sau nhấn SET Tiếp theo, để thay đổi thời gian nhấn nút NEXT Sau dùng nút lên-xuống để điều chỉnh thời gian cuối nhấn nút SET B8: Nhấn nút START/STOP để bắt đầu khử trùng B9: Sau khử trùng xong, Nhấn nút START/STOP để kết thúc vận hành B10: Kéo gạt phía UNCLOCK lấy dụng cụ khử trùng ngồi sử dụng, tắt cơng tắc nguồn rút điện LƯU Ý: PHẢI SỬ DỤNG BAO TAY VẢI ĐỂ MANG RỌ CHỨA DỤNG CỤ, MƠI TRƯỜNG RA NGỒI B11: Tắt nguồn: Nhấn nút ON/OFF Rút phích cắm khỏi nguồn điện 4/ Máy trộn mẫu ( Vibra Mix R) - Hướng dẫn sử dụng: B1: Cắm điện B2: Điều chỉnh tốc đô mức phù hợp B3: Chọn nút tự động chạm lắc B4: Bật công tắc nguồn số B5: Cắm giữ ống nghiệm thẳng đứng để nhẹ lên đế cao su để trộn mẫu 5/ Máy khuấy từ Bạn xác định máy trộn từ tính Nó sử dụng từ trường để quay khuấy tạo hỗn hợp đồng Bạn sử dụng tàu kín có dấu hồn chỉnh mà khơng cần sử dụng dấu quay phức tạp Máy khuấy từ máy phổ biến hiệu quitter Thiếu di chuyển phần bên ngăn chặn thiệt hại phần khác thiết bị 6/ Tủ ủ vi sinh MODEL BE 500 - Hướng dẫn sử dụng: B1: Cắm phích điện vào nguồn điện B2: Bật nút POWER vị trí 1, đèn xanh bật sáng, nhiệt độ tủ lên bảng theo dõi nhiệt độ B3: nhấn nút SET xoay nút để điều chỉnh đến nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ tủ tăng lên từ từ, đạt đến nhiệt độ cần thiết ngừng tăng trì nhiệt độ bên suốt thời gian vận hành B4: Nếu xoay nút nhanh điểm nhiệt độ thay đổi lớn, xaoy chậm điểm nhiệt độ thay đổi số B5: Khi máy kết thúc vận hành, giá trị nhiệt độ SET giữ máy tắt công tắc máy Lưu ý để điều chỉnh nhiệt độ cho lần sử dụng B6: Sau sử dụng xong, vặn nút POWER vị trí 0, đèn POWER tắt 7/ Tủ cấy vi sinh Tủ cấy vi sinh (tủ an toàn sinh học hay tủ nuôi cấy mô ) tên gọi hệ thống làm việc thiết kế để ngăn ngừa tác nhân ô nhiễm thao tác mẫu sinh học, vật liệu nhạy cảm với hạt bụi Khơng khí hút thông qua lọc HEPA đưa vào buồng thao tác 8/ Tủ ủ vi sinh - Hướng dẫn sử dụng: B1: Cắm phích điện vào nguồn điện B2: Bật công tắc nguồn, đèn nguồn sáng đỏ, nhiệt độ tủ bắt đầu tăng B3: Lẫn tay nắm lên kéo cửa mở Kéo nhẹ cánh chuyển mẫu vào B4: Đẩy nhẹ cánh khép kín Kéo cánh cửa bên ngồi lẫy tay nắm khóa lại B5: Sử dụng dấu mũi tên  để điều chỉnh nhiệt độ tủ ủ B6: Sau sử dụng, tắt công tắc nguồn rút điện 9/ Máy bơm chân khơng • Máy bơm nước chân khơng gì? Máy bơm chân khơng loại máy bơm nước khơng khí Cụ thể, dòng máy bơm dân dụng cỡ nhỏ có khả bơm hút chân khơng mức độ định dùng để bơm nước chất lỏng khác tương tự khơng phải hóa chất ăn mịn • Ngun lý hoạt động Máy bơm chân khơng vịng nước hoạt động ngun tắc Piston có nghĩa quay chất lỏng, trục cánh bơm phận chuyển động Khi cánh bơm quay chất lỏng liên tục, lực văng ly tâm hướng ngồi tạo nên vịng chất lỏng quay đồng tâm với vỏ bơm Chất lỏng tạo lực ly tâm cánh bơm quay cổng hút làm nhiệm vụ hút khơng khí Sau phận cổng hút thông, chất lỏng quay trở lại vào không gian cánh bơm lưỡi, đẩy khơng khí bên ngồi qua cổng xả Cho đến không gian lưỡi cánh chạm với cổng xả vịng chất lỏng đưa khơng khí bị nén vào cổng xả 10 - Khuấy máy khuấy trộn mẫu tan đều, khoảng phút (Ống 10-1 khuấy phút, ống sau khuấy 30s) Dùng pipet rút 1ml mẫu pha loãng (ống 1) chuyển vào ống nghiệm thứ (1ml + 9ml = 10ml, tương đương pha loãng 10 lần), tiếp tục tiến hành bước tương tự đạt mức pha loãng cần thiết (10-5) B3 Dùng pipet hút 1ml dung dịch mẫu có nồng độ pha loãng theo thứ tự tăng dần (10-5 , 10-4 , 10-3 , 10-2 ) khuấy trộn vào đĩa petri chứa môi trường PDA B4 Dùng que Drigalski khử trùng qua đèn cồn, trải 1ml dd đĩa petri chứa PDA B5 Đem cấy tủ ủ vi sinh nhiệt độ 37o C 3-5 ngày Quan sát kết đánh giá: Sau quan sát kết quả, thấy xuất vi nấm ngày từ số phân lập thấp 10-1 đến 10-5 để phân lập vi nấm chủng cần phân lập lại nhiều lần phân lập BÀI 4: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG E.COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN I GIỚI THIỆU CHUNG: Mục đích: Tổng Coliform & fecal Coliform hai nhóm VSV thị cho mức độ nhiễm nguồn phân Qua nầy giúp sinh viên nắm kỹ thuật phân tích hai tiêu Định nghĩa ❖ Tổng coliform Coliform trực khuẩn, gram âm, hiếu khí, kỵ khí tùy tiện, khơng sinh bào tử, lên men lactose với sinh khí vịng 48 37oC 18 Nhóm Coliform diện rộng rãi tự nhiên, ruột người động vật xem nhóm vi sinh vật thị Nhóm Coliform gồm giống là: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella Enterobacter Tính chất sinh hố đặc trưng nhóm thể qua thử nghiệm IMViC: Indol (I), methyl red (M), Voges-Proskaue(V)and Citrate (iC) ❖ Coliform phân/Coliform chịu nhiệt/E coli Từ “Coliform phân” dùng vi sinh vật nước coliform mọc 44 hay 44,5oC lên men đường lactose để sinh acid khí Trong thực tế có số vi sinh vật có đặc tính khơng có nguồn gốc từ phân cụm từ “Coliform chịu nhiệt” xác sử dụng nhiều Tuy nhiên, diện coliform chịu nhiệt gần luôn thị ô nhiễm phân Thông thường 90% coliform chịu nhiệt có nước E coli Do mà khơng cần thiết phải làm thêm xét nghiệm sâu để xác định xác E coli Các mơi trường giàu dinh dưỡng thúc đẩy phát triển hay tồn số loài coliform chịu nhiệt nhiều E coli Nên ý đến khả mà, ví dụ kết phân tích cao bất thường loại nước xem Trong trường hợp này, nên xác định thêm thị chuyên biệt E coli Phương pháp Phương pháp MPN (Most Probable Number): phương pháp có số xác suất cao nhất, số tối giản nhất) cịn gọi phương pháp pha lỗng tới giới hạn hay phương pháp chuẩn độ Đây phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn diện đơn vị thể tích mẫu Đây phương pháp định lượng dựa kết định tính loạt thí nghiệm lặp lại số lần pha lỗng khác Thơng thường, việc định lượng thực lặp lại lần cấp độ pha loãng bậc 10 liên tiếp (10 -1;10-2,…), tổng cộng có ống nghiệm Quy trình thực định lượng theo phương pháp sau: Cho vào ống nghiệm có chứa mơi trường thích hợp cho tăng trưởng đối tượng vi sinh vật cần định lượng thể tích xác dung dịch mẫu nồng độ pha lỗng bậc 10 liên tiếp (ví dụ 1/10, 1/100, 1/1000) Ủ nhiệt độ thời gian thích hợp Dựa vào kết biểu kiến chứng minh tăng trưởng vi sinh vật cần kiểm định ống nghiệm (thường tượng sinh hơi, đổi màu, đục mẫu ,…), ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính độ pha 19 loãng Sử dụng số liệu dựa vào bảng Mac Crady suy mật độ vi sinh vật trình bày dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu Độ xác trị số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại độ pha lỗng; II VẬT LIỆU, DỤNG CỤ, Q TRÌNH THỰC HIỆN VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ: Vật liệu: - Mẫu nước sau tòa phức hợp Đại Học Cần Thơ - Môi trường LSB (Lauryl Sulfate Broth) Dụng cụ, hóa chất: - Cốc thủy tinh - Pipet 1mL, 10mL - Máy trộn mẫu - Tủ tủ ủ vi sinh - Nước cất pha loãng - NaOH (6N) - Khay đựng ống nghiệm - Máy chiếu tia UV - Giấy cân - Que đè lưỡi y học - Cân phân tích - Dụng cụ hút Q trình thực hiện: B1 Chuẩn bị môi trường tổng số Coliform (ống nghiệm có ống Durham lật ngược) tổng số E.coli B2 Pha lỗng mẫu phân tích: - Chuẩn bị mẫu pha lỗng: lấy mẫu sơng dụng cụ lấy mẫu phải tiệt trùng để tránh nhiễm vi sinh vật (lưu ý lấy mẫu lấy mẫu độ sâu cách mặt nước 20cm) - Chuẩn bị ống nghiệm chứa 9ml dd pha loãng (nước cất) Dung dịch pha loãng phải khử trùng trước sử dụng - Lắc kỹ mẫu để trộn Dùng pipet rút 1ml chuyển vào ống nghiệm (1ml +9ml= 10ml, pha loãng 10 lần) - Lắc ống nghiệm vừa pha loãng máy trộn mẫu Dùng pipet rút 1ml chuyển vào ống nghiệm Lặp lại tương 20