Nghiên cứu khoa học " NGHIÊN CỨU TẠO PHÔI SOMA THÔNG NHỰA (PINUS MERKUSII) TRONG ĐIỀU KIỆN INVITRO " ppt

38 NGHIÊN CỨU TẠO PHÔI SOMA THÔNG NHỰA 1 (PINUS MERKUSII) TRONG ĐIỀU KIỆN INVITRO 2 3 Vương Đình Tuấn, Nguyễn Xuân Cường, Phan Thị Mỵ Lan 4 Phân viện Nghiên cứu Khoa học Lâm nghiệp Nam Bộ 5 6 TÓM TẮT 7 Tạo phát sinh phôi và phôi soma đã đạt được kết quả tốt trên môi trường LVM có bổ sung 2,0mg/l 2,4-D 8 và 3,0 mg/l BA. Trọng lượng tươi của tế bào tiền phôi tăng hơn 3 lần ở tuần đầu trên môi trường có bổng 9 sung 500mg/l glutamine. Đường maltose ở 90g/l kết hợp 80mg/l ABA và 10g/l phytagel tạo phôi soma tốt 10 hơn sucrose ở cùng nồng độ. Các yếu tố ảnh hưởng đến tái sinh cây xanh từ phôi soma và giai đoạn cây 11 con trong vườn ươm đang được tiến hành. 12 Từ khóa: Đường maltose và sucrose, Phát sinh phôi, Phôi soma, Thông nhựa. 13 14 I. MỞ ĐẦU 15 Thông nhựa (Pinus merkusii Jungh. & de Vriese) là một loài thông có nguồn gốc nhiệt đới, được trồng để 16 cung cấp nhựa và gỗ. Do đặc điểm chịu được những điều kiện khó khăn nghèo dinh dưỡng của đất, nên 17 thông nhựa còn được dùng làm cây để phủ xanh đất trống, đồi trọc và cằn cỗi để cải thiện môi trường và cải 18 thiện thu nhập cho nông dân vùng khó khăn. 19 Kỹ thuật tạo phôi soma được nghiên cứu và áp dụng nhiều để cải thiện giống cây lâm nghiệp ở các nước 20 ôn đới trong vài thập niên gần đây. Lợi ích quan trọng nhất của kỹ thuật này là khả năng giữ các tế bào tiền 21 phôi soma (embryogenic tissue) của các dòng ưu việt trong điều kiện đông khô hàng vài chục năm, thậm chí 22 hàng trăm năm vẫn không ảnh hưởng đến tính di truyền của vật liệu khi được tái sinh. Việc tạo thể tiền phôi 23 soma còn được dùng để tạo cây xanh của những dòng mong muốn với khối lượng lớn trong điều kiện invitro 24 để cung cấp cho sản xuất. Thể tiền phôi, mặt khác, cũng là một loại vật liệu được sử dụng trong ứng dụng 25 kỹ thuật chuyển gene để cải thiện giống. 26 Kỹ thuật tạo phôi soma đã thành công trên một số loài quả nón và loài cây lâm nghiệp khác. Tuy nhiên, 27 hiện chưa tìm thấy kết quả nào được công bố về tạo phôi soma trên Thông nhựa (Pinus merkusii) ở Việt 28 Nam. Vì thế, nghiên cứu này góp phần xây dựng kỹ thuật tạo thể phát sinh và phôi soma từ phôi non Thông 29 nhựa nhằm góp phần tạo vật liệu cho ứng dụng công nghệ gene cải thiện năng suất chất lượng Thông 30 nhựa. 31 32 II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 33 2.1. Vật liệu: Phôi non của gia đình thông nhựa số 31 được cung cấp bởi Trung tâm nghiên cứu giống 34 cây rừng, Viện khoa học Lâm nghiệp Việt nam. Các hóa chất của một số môi trường dinh dưỡng Litvay 35 (Litvay và cộng sự. 1985), DCR (Gupta & Durzan.1986); được mua từ các hãng Merck (Đức); Sigma (Mỹ); 36 Duchefa (Hà Lan). Các máy móc, phương tiện phục vụ nuôi cấy invitro như máy cất nước Direct Q3, nồi hấp 37 (Nhật Bản), máy đo pH (Thụy Sỹ); cân phân tích (Đức) v.v 38 2.2. Phương pháp: Quả Thông non sau khi thu hái, được rửa sạch dưới vòi nước bằng xà phòng. Sau 39 đó quả được vô trùng bề mặt bằng cồn 96 0 trong 10 phút trong tủ cấy vô trùng. Quả sau đó được tráng bằng 40 nước cất vô trùng 2 lần trước khi phôi non được tách và cấy trên đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng. 41 Việc tạo phát sinh phôi và phôi soma được thực hiện qua một số thí nghiệm sau: Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của 42 một số môi trường dinh dưỡng cơ bản đến tạo phát sinh phôi. Một số môi trường như LVM (Litvay và 43 cộng sự. 1985) có cải tiến theo Lelu và cộng sự (2006); DCR (Gupta & Durzan.1986) và TE (Tang và cộng 44 sự. 1998) được sử dụng. Trong đó môi trường LVM, DCR có chứa các aminoacid (500g/l); cả 3 môi trường 45 39 đều được bổ sung glutamine; 2,4-D (2,4 dichlorophenoxy aceticacid - 2,0 mg/l); BA ( Benzyladenine - 3,0 46 mg/l), sucrose, Phytagel (tùy điều kiện thí nghiệm), pH.5,6±1 0 C. 47 Thí nghiệm được bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Mỗi lần 3 đĩa, mỗi đĩa chứa 10 48 phôi non. Đĩa chứa phôi non được để trong tối trong phòng nuôi có nhiệt độ 24 ±2 0 C. 49 Thí nghiệm nhân sinh khối: 50 *Ảnh hưởng của nồng độ glutamine đến nhân nhanh khối phát sinh: Sau khi tạo được thể phát sinh, khối 51 phát sinh (extrusion) được tách khỏi phôi non và cấy trên môi trường tăng sinh khối chứa glutamine với các 52 nồng độ: 0; 100; 300; 500 và 700mg/l để tạo khối tiền phôi soma. Môi trường có kết quả tốt ở hình ảnh (a) 53 được sử dụng. 54 Thí nghiệm 2: tạo phôi soma: 55 *Ảnh hưởng của nồng độ phytagel đến tạo phôi soma: Sau khi thu được lượng sinh khối đủ lớn (sau 2 56 lần cấy chuyền), khối tiền phôi soma (150mg) sẽ được cấy sang môi trường LVM cho thành thục hóa và tạo 57 phôi soma. Môi trường LVM được bổ sung phytagel (4,6 và 10g/l); ABA (80g/l); maltose (60g/l) 58 *Ảnh hưởng của nồng độ Sucrose và Maltose đến tạo phôi soma: Sucrose và maltose ở các nồng độ 59 khác nhau (30,60 và 90g/l) được bổ sung vào môi trường LVM cho tạo phôi soma. Các đĩa cấy tế bào tiền 60 phôi soma sẽ được nuôi cấy trong tối ở điều kiện như trên. Số liệu thành thục hóa và phôi soma được ghi 61 nhận sau 12 tuần nuôi cấy. 62 *Ảnh hưởng của một số nồng độ ABA đến tạo phôi soma: Môi trường cơ bản LVM được bổ sung ABA 63 (Abscisis acid) với một số nồng độ khác nhau (0;20;40;60;80;100 và 120mg/l). Tỷ lệ tạo phôi soma được ghi 64 nhận sau 12 tuần nuôi cấy. 65 *Các số liệu thu được được phân tích bằng phần mềm SPSS ver. 16.1. 66 67 III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 68 3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường dinh dưỡng đến tạo phát sinh phôi 69 Sau 4 tuần nuôi cấy trên 3 loại môi trường dinh dưỡng khác nhau, một số phôi non được quan sát là đã 70 xuất hiện những tế bào màu trắng nhạt từ đầu phôi (hình A). Thực tế, sau khi cấy 2-3 tuần, trên một số phôi 71 đã xuất hiện một số tế bào giống như dạng dây treo ở đầu phôi. Các tế bào này lớn dần hàng ngày. Tuy 72 nhiên, phải đến tuần thứ 5, khi nhuộm những tế bào này bằng 1% IKI và quan sát dưới kính hiển vi thấy các 73 tế bào có hai phần rõ rệt: phần dây treo dài gồm một số tế bào dài, trong suốt và phần đầu gổm rất nhiều tế 74 bào đã phân chia và chứa đầy tế bào chất (hình C,D). Những cụm tế bào này mới được cho là tạo phát sinh 75 ổn định. Tỷ lệ phát sinh phôi được tính dựa trên số liệu này. 76 Bảng 1. Phản ứng tạo phát sinh phôi với các môi trường nuôi cấy 77 TT Môi trường Tổng số phôi cấy Tỷ lệ tạo phát sinh phôi (%) 1 LVM 619 18.74 ±.016 a 2 TE 484 8.68 ±.013 b 3 DCR 399 9.52 ±.015 b Tổng 1502 Ghi chú: Các chữ a và b là mức độ sai khác có ý nghia thống kê ở 95%. 78 Số liệu trên bảng 1 cho thấy trong ba môi trường dinh dưỡng cơ bản được sử dụng trong tạo phôi soma 79 loài quả nón thì phản ứng của phôi non thông nhựa với môi trường Litvay cải tiến (LVM) tốt hơn hai môi 80 trường TE và DCR. Tỷ lệ tạo phát sinh phôi trên môi trường LVM là 18,74%, cao hơn một cách có ý nghĩa 81 so với hai môi trường TE và DCR (lần lượt là 8,68 và 9,52%, Bảng 1). Quan sát màu sắc của các thể phát 82 sinh trên môi trường LVM thấy có màu trắng xốp, ráo nước; trong khi màu sắc của thể phát sinh trên hai môi 83 trường kia ướt hơn. Một số dạng phát sinh như hình (a,b) trong (A) đã được ghi nhận. Những dạng này đều 84 không phát triển hoàn chỉnh thành đầu và dây treo mà chỉ là những tế bào gần tròn. Sau 8-10 tuần, những tế 85 40 bào này chuyển sang màu vàng, vàng nâu, nâu đậm rồi chết. Như vậy, môi trường LVM tỏ ra hiệu quả hơn 86 trong tạo phát sinh phôi Thông nhựa và được sử dụng trong suốt thí nghiệm. 87 Để tạo phát sinh phôi trên Pinus taeda (Loblloly pine), Tang và cộng sự (2001) đã sử dụng 6 loại môi 88 trường dinh dưỡng khác nhau và đã ghi nhận môi trường LOB có thành phần đa lượng vi lượng giống với 89 môi trường của Murashige & Skoog cho tỷ lệ tạo phát sinh phôi cao nhất trên gia đình E-440 (16,9%). Phản 90 ứng của các gia đình Loblolly pine với các môi trường TE và DCR đều ở mức tương đối thấp (lần lượt là 91 6,1-6,5%). Trong một nghiên cứu khác, Lelu và cộng sự (2006) đã sử dụng môi trường LVM để nuôi cấy 92 phôi non của Pinus pinaster và thu được phát sinh phôi trên 100% mẫu cấy. Như vậy, có thể thấy rằng bên 93 cạnh các yếu tố môi trường nuôi cấy, việc tạo phát sinh phôi còn bị chi phối bởi yếu tố di truyền. Các kiểu di 94 truyền khác nhau sẽ có phản ứng tạo phát sinh khác nhau với môi trường dinh dưỡng sử dụng. Thí nghiệm 95 này còn ghi nhận thời gian thu hái phôi khác nhau, thể hiện giai đoạn phát triển khác nhau của phôi, cũng 96 cho phản ứng tạo phát sinh phôi khác nhau (số liệu chưa nêu ở đây). 97 3.2. Nghiên cứu nhân sinh khối 98 +Nghiên cứu ảnh hưởng của một số nồng độ glutamine đến tăng sinh khối tế bào tiền phôi soma 99 (embryogenesis). 100 Glutamine là một nguồn nitơ hữu cơ thường được sử dụng trong nuôi cấy invitro. Trong các nghiên cứu 101 tạo phôi soma loài quả nón, glutamine cũng được ghi nhận là một trong những yếu tố cần thiết trong tạo 102 phát sinh, duy trì, thành thục hóa và tái sinh cây xanh. Trong nghiên cứu này, một số nồng độ của glutamine 103 đã được bổ sung vào môi trường LVM. Kết quả tăng sinh khối các tế bào tiền phôi soma được thể hiện trên 104 bảng 2. 105 Bảng 2. Hiệu quả của một số nồng độ glutamine đến tăng sinh khối embryogenesis. 106 TT Nồng độ glutamine (mg/l) Trọng lượng ở tuần 1 (mg) Số lần tăng Trọng lượng ở tuần 2 (mg) Số lần tăng 1 0 179,00 ± 7,41 e 1,19 175,20± 6,12e 1,17 2 100 263,83± 8,52 d 1,76 312,70± 13,30d 2,09 3 300 308,63± 4,27 c 2,06 406,40± 5,08 c 2.71 4 500 480,33± 6,56 a 3,20 693,20± 9,97a 4,62 5 700 362,77± 9,03 b 2,42 488,07± 4,57 b 3,25 Môi trường : LVM; Phytagel 8g/l; sucrose (20g/l); trọng lượng ban đầu: 150mg. 2,4-D (2,0mg/l); 107 BA (3,0mg/l). Các chữ a, b, c, d và e là mức độ sai khác có ý nghia thống kê ở 95%. 108 Số liệu trên bảng 2 cho thấy khi tăng nồng độ glutamine bổ sung vào môi trường từ 100 đến 500mg/l, 109 trọng lượng khối tế bào tiền phôi soma tăng rất nhanh, từ 1,76 đến 3,2 lần so với đối chứng. Tuy nhiên, khi 110 glutamine được bổ sung ở 700mg/l thì trọng lượng khối tiền phôi giảm xuống còn 2,42 lần. Sang tuần thứ 2, 111 tốc độ tăng trưởng ở 500mg/l cao gần gấp 2 lần so với ở 300mg/l. Tuy nhiên tăng trưởng ở nồng độ này chỉ 112 cao hơn mức tăng trưởng ở tuần đầu là 1,42 lần. Như vậy, so sánh trong cùng nồng độ glutamine, số liệu 113 trên bảng 2 cho thấy tỷ lệ tăng trưởng ở tuần thứ nhất cao hơn tuần thứ hai. Các tế bào tiền phôi được 114 quan sát là có màu trắng bạc, ráo nước và xốp (hình B). 115 Thông thường, cấy chuyển được thực hiện 2 tuần/lần. Các tế bào tiền phôi hình thành sau tuần thứ nhất 116 có thể được sử dụng cho những loại thí nhiệm khác. Vào cuối tuần thứ 2 màu sắc các tế bào tiền phôi đã 117 chuyển sang màu trắng đục hay vàng nhạt và sự tăng sinh giảm dần. Trong thí nghiệm tăng sinh khối của 118 Pinus strobus, Klimaszewska và cộng sự (2000) ghi nhận là có thể thu được 5-6 g tế bào tiền phôi sau 4 119 tuần nuôi cấy trên môi trường MLV từ 300mg vật liệu ban đầu. Sở dĩ các tế bào tiền phôi có phản ứng tích 120 cực với glutamine trong tăng sinh khối có thể là do nguồn nitơ hữu cơ mà glutamine cung cấp dễ được đồng 121 hóa hơn các nguồn nitơ vô cơ khác. Ngoài glutamine, nồng độ chất điều hòa sinh trưởng (2,4-D) và BA 122 cũng tác động đến gia tăng sinh khối. 123 41 3.3. Nghiên cứu tạo phôi soma 124 *Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ phytagel đến tạo phôi soma. 125 Kết quả những thí nghiệm sơ khởi cho thấy Phytagel có hiệu quả hơn các loại agar khác trong việc tạo 126 thể phát sinh phôi thông nhựa. Vì thế một số nồng độ phytagel đã được thử nghiệm để tìm ra nồng độ thích 127 hợp cho tạo phôi soma. 128 Số liệu trên bảng 3 cho thấy trong việc tạo phôi soma, không có sự bổ sung các chất điều hòa sinh 129 trưởng như BA, 2,4-D, mà thay vào đó là Abscisis (80mg/l). Kết quả trên bảng 3 ghi nhận ở những nồng độ 130 thấp (4 và 6 g/l) của phytagel được bổ sung vào môi trường LVM đều không có hiệu quả tạo phôi soma 131 thông nhựa Bề mặt đĩa cấy luôn ở tình trạng thừa ẩm độ làm cho các tế bào phôi cũng không còn ở trạng 132 thái xốp, ráo. Tuy nhiên, khi lượng phytagel được nâng lên 10g/l, bề mặt đĩa cấy khô ráo. Các tế bào tiền 133 phôi soma giữ được trạng thái khô ráo, xốp và các tế bào soma được ghi nhận hình thành từ tuần thứ 12. 134 Số lượng phôi soma được ghi nhận là 23,5 từ 150mg tiền phôi cấy ban đầu. Lượng 10g/l Phytagel dùng 135 trong giai đoạn thành thục hóa và tạo phôi soma cũng đã được Klimaszewska and Smith (1997) sử dụng và 136 thu được hiệu quả tốt trong tạo phôi soma Pinus strobus. Tương tự, Klimaszewska và cộng sự. (2000) đã 137 thử nghiệm một số loại agar khác nhau và quan sát thấy phytagel ở nồng độ 0.8% và 1.0% là tốt nhất trong 138 tạo phôi soma pinus. Các tác giả này cho rằng phytagel ở nồng độ cao có thể thay thế PEG trong điều chỉnh 139 áp suất thẩm thấu của màng tế bào. 140 141 Bảng 3. Ảnh hưởng của lượng Phytagel đến tạo phôi soma. 142 TT Nồng độ (g/l) Tỷ lệ tạo phôi soma (%) 1 4 0 b 2 6 0 b 3 10 23,5 ±3,5 a Môi trường LVM; ABA (80mg/l) ; 150mg tiền phôi và Maltose 60g/l. Các chữ a và b là mức độ sai khác có 143 ý nghia thống kê ở 95%. 144 Thực tế, ở nồng độ cao, phytagel góp phần làm giảm ẩm độ trong đĩa cấy mẫu và điều kiện này đã kích 145 hoạt việc chuyển chương trình phân chia của tế bào tiền phôi sang giai đoạn tạo phôi (Klimaszewska và 146 cộng sự., 2000). 147 +Nghiên cứu hiệu quả của nồng độ sucrose và maltose đến tạo phôi soma. 148 Thông thường đường (sucrose, maltose và một số loại khác) được biết là chất không những cung cấp 149 nguồn carbon mà còn là chất điều hòa áp suất thẩm thấu rất có hiệu quả trong nuôi cấy invitro nhiều loài cây 150 trồng khác nhau. Sucrose cũng thể hiện hiệu quả tốt trong tạo phát sinh phôi thông nhựa trong nghiên cứu 151 này. Tuy nhiên, trong giai đoạn thành thục hóa và tạo phôi soma, nhiều kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng 152 maltose có hiệu quả hơn sucrose. 153 Ba nồng độ (30, 60 và 90g/l) của mỗi loại đường được bổ sung vào môi trường LVM để tìm hiểu phản 154 ứng tạo phôi soma của Thông nhựa. Số liệu trên bảng 4 cho thấy chỉ có 0,8% phôi soma được hình thành 155 nếu bổ sung 30g/l sucrose, trong khi đó tỷ lệ hình thành phôi soma ở nghiệm thức bổ sung maltose là 3,4% 156 ở cùng nồng độ (30g/l). 157 Gia tăng nồng độ sucrose hay maltose từ 30 lên 90g/l đã làm gia tăng tỷ lệ tạo phôi soma từ 0,8 lên 158 21,67% đối với sucrose và 3,4 lên 40,8% cho đường maltose (hình E). Như vậy, rõ ràng là maltose ở nồng 159 độ 90g/l tỏ ra thích hợp cho việc tạo phôi soma ở Thông nhựa. 160 Bảng 4. Hiệu quả của nồng độ sucrose và maltose trong tạo phôi soma. 161 TT Loại đường Tỷ lệ tạo phôi soma (%) Sucrose 1 30 0,8 ± 0,8 a 2 60 18,33 ± 12,25 a 42 3 90 21,67 ± 10,04 a Maltose 5 30 3,4 ± 1,54 b 6 60 19,75 ± 6,61 b 7 90 40,8 ± 6,86 a -Môi trường LVM; 150mg tiền phôi, ABA (80mg/l) , Phytagel 10g/l 162 -Các chữ a và b là mức độ sai khác có ý nghia thống kê ở 95%. 163 Khi quan sát các phôi soma ở nghhiệm thức có bổ sung maltose, hình thái phôi soma thể hiện rõ nét, các 164 lá mầm hình thành nhanh hơn phôi trong nghiệm thức có bổ sung sucrose (hình F). 165 Khi tạo phôi soma ở Pinus sylvestris, Salajova và cộng sự (1999) đã ghi nhận bổ sung 6-9% maltose đã 166 làm gia tăng số phôi soma tạo thành. Tương tự, Salajova và Salaj (2005) cũng đã chỉ ra phản ứng tạo phôi 167 soma khác nhau giữa ba gia đình Pinus nigra (E7, E15 và E16) khi được nuôi cấy trên môi trường có các 168 nồng độ maltose khác nhau (3,6 và 9%), theo đó chỉ có gia đình E 16 là tạo được phôi soma với lá mầm rõ 169 rệt ở 9% maltose. Trong một kết quả công bố trên loài P. densiflora, Shoji và cộng sự (2005) cũng cho biết 170 maltose thể hiện hiệu quả cao hơn hẳn sucrose trong tạo phôi soma ở mọi nồng độ. Các tác giả đã ghi nhận 171 đã thu được 22 phôi soma trên 50mg tế bào tiền phôi trên môi trường DCR. 172 Tuy nhiên, Percy và cộng sự (2000) lại cho rằng sucrose ở nồng độ từ 6-9% đều không phù hợp cho 173 phát triển của phôi Pinus brutia TEN vì nồng độ sucrose cao có thể gây độc cho tế bào. Trong khi nhiều tác 174 giả khác cho rằng nên giữ nồng độ sucrose ở 30g/l như trong giai đoạn tăng sinh khối (Lipavska và cộng sự. 175 2000), nhiều người khác lại cho là sucrose có thể được sử dụng từ 10 đến 60g/l trong môi trường thành 176 thục tế bào (Iraqi and Tremblay. 2001) để đạt hiệu quả cao. 177 +Nghiên cứu hiệu quả của nồng độ Abscisis (ABA) đến tạo phôi soma. 178 Vai trò của Abscisic acid đã được chứng minh là rất quan trọng trong tạo phôi soma. Abscisis đóng vai 179 trò như một cái ngắt, chuyển giai đoạn phát triển của tiền phôi sang tạo phôi. 180 Trong nghiên cứu này 7 nồng độ của ABA được thử nghiệm. Số liệu trên bảng 5 cho thấy tỷ lệ tạo phôi 181 soma tăng từ 7% đến 12% khi môi trường nuôi cấy LVM được bổ sung từ 20 đến 60 mg/l ABA. Tiếp tục gia 182 tăng nồng độ ABA lên 80, 100 và 120mg/l, tỷ lệ phôi soma hình thành có xu hướng giảm (từ 24,33 xuống 183 còn 15,3%, bảng 5). Như vậy, nồng độ 80mg/l ABA được xem là phù hợp cho tạo phôi soma thông nhựa. 184 Hình thái, màu sắc phôi cũng được ghi nhận là tốt và có tiềm năng phát triển tạo cây xanh. 185 Bảng 5: Hiệu quả của nồng độ ABA đến tạo phôi soma 186 TT Nồng độ ABA (mg/l) Tỷ lệ tạo phôi soma (%) 1 0 0 c 2 20 7 ± 2,65bc 3 40 7,3 ± 3,84 bc 4 60 12 ± 2,0 b 5 80 24,33± 3,52 a 6 100 16,5± 3,5ab 7 120 15,3± 3,84 ab - Môi trường LVM; 150mg tiền phôi; 10g/l phytagel. 187 - Các chữ a, b và c là mức độ sai khác có ý nghia thống kê ở 95%. 188 Nồng độ ABA trong nghiên cứu này cao hơn kết quả đạt được trên red spruce do Harry & Thorpe (1991) 189 công bố trước đó. Theo đó, các tác giả này ghi nhận 40µM ABA (≈10,57mg/l) cần được bổ sung vào môi 190 trường nuôi cấy tiền phôi của red spruce để có được sự phát triển bình thường của phôi. Nhưng ở Picea 191 glauca thì để phôi phát triển bình thường, môi trường nuôi cấy chỉ cần bổ sung 12 µM là đủ (Attree và cộng 192 sự. 1990). Người ta cho rằng khoảng 6 giờ sau khi bổ sung ABA, thay đổi trong mức độ thể hiện gene và 193 việc tổng hợp protein đã được phát hiện. Một loạt các phản ứng khác do hiệu ứng của thể hiện gene được 194 phát hiện ở 24 giờ sau khi bổ sung ABA (Dunstan và cộng sự. 1998). Ngược lại, Lelu và cộng sự (1999) đã 195 43 ghi nhận ABA ở nồng độ 60-120µM là cần thiết cho việc tạo phôi soma của các loài quả nón. Điều này có 196 thể thấy phản ứng của các loài quả nón khác nhau với nồng độ ABA bổ sung cũng rất khác nhau. 197 198 MỘT SỐ HÌNH ẢNH TẠO PHÁT SINH PHÔI VÀ PHÔI SOMA 199 200 201 202 203 204 Ghi chú: Một số hình ảnh các bước tạo phát sinh phôi và phôi soma thông nhựa. 205 (A) Phôi non sau 4 tuần nuôi cấy; (B) Nhân sinh khối thể tiền phôi soma (embryogenesis); (C)(D) Tế bào 206 tiền phôi nhìn dưới kính hiển vi; (E): Hình thành phôi soma; (F): Phát triển lá mầm. 207 208 IV. KẾT LUẬN 209 Nghiên cứu tạo phát sinh phôi và tạo phôi soma Thông nhựa đã được thực hiện bằng nuôi cấy phôi non. 210 Trong số các môi trường dinh dưỡng, môi trường LVM được ghi nhận có hiệu quả nhất cho tạo phát sinh 211 phôi. Để duy trì và nhân nhanh khối tiền phôi, nồng độ glutamine (500mg/l) được ghi nhận là thích hợp. Thí 212 nghiệm ảnh hưởng của một số yếu tố đến tạo phôi soma cho thấy phytagel 10g/l có hiệu quả tốt. Bên cạnh 213 đó, nên bổ sung đường maltose (90g/l) và ABA (80mg/l) để thu được số lượng và chất lượng được cải thiện 214 của phôi soma. Việc nghiên cứu tạo cây xanh từ phôi soma và nuôi cấy cây con trong vườn ươm đang 215 được tiến hành. 216 217 TÀI LIỆU THAM KHẢO 218 Attree SM, Budimir S & Fowke LC, 1990: Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from cultured 219 shoots and cotyledons of seedlings from stored seeds of black and white spruce (Picea mariana & Picea 220 glauca). Can.J. Bot. 68: 30-34. 221 Dunstan DI; Dong J-Z; Carrier DJ & Abrams S, 1998: Events following ABA treatment of spruce somatic 222 embryos. In vitro Cel Dev. Biol-Plant. 34: 159-168. 223 Gupta P.K., Durzan D.J. 1986. Plantlet regeneration via somatic embryogenesis from subcultured callus 224 of mature embryos of Picea abies (Norway spruce). In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant 22: 225 685–688. 226 Harry IS & Thorpe TA, 1991: Somatic embryogenesis and plantlet regenration from mature zygotic 227 embryos of red spruce. Bot Gaz. 152. 446-452). 228 Iraqi D and Tremblay FM, 2001. The role of sucrose during maturation of black spruce (Picea mariana) 229 and white spruc (Picea glauca) somatic embryos. Physiol. Plant.111: 381-388. 230 Klimaszewska K and Smith DR, 1997: Maturation of somatic embryos of Pinus strobus is promoted by a 231 high concentration of gellan gum. Physiol Plant.100: 949-957. 232 Klimaszewska K, Bernier-Cardou M, Cry DR, Sutton BCS, 2000. Influence of gelling agents on culture 233 medium gel strength, water availability, tissue water potential, 234 A B D C E F b a 44 and maturation response in embryogenic cultures of Pinus strobus L. In Vitro Cell Dev Biol—Plant 235 .36:279-286. 236 Klimaszewska K; Park YS; Overton C; Maceachero I and Bonga JM, 2001: Optimized somatic 237 embryogenesis in Pinus strobus L . In vitro Cell Dev Biol-Plant. 37: 392-399. 238 Lelu MA; Cadou MB & Klimasewska K, 2006: Simplified and improved somatic embryogenesis for clonal 239 propagation of Pinus pinaster (Ait.). Plant Cell Rep. 25: 767-776. 240 Lelu MA; Bastien C; Drugeault A; Gouez ML and Klimaszewska K, 1999: Somatic embryogenesis and 241 plantlet development. I. Pinus sylvestris and Pinus pinaster on medium with and without growth regulators. 242 Physiol. Plant. 105: 719-728. 243 Lipavska H; Svobodova H; Albrechtova J; Kumstyrova L; Vagner M and Vondrakova Z, 2000. Somatic 244 embryogenesis in Norway spruce: carbohydrate status during embryo maturation and the effect of 245 Polyethylene glycol treatment. In vitro Cell. Dev. Biol-Plant. 36: 260-267. 246 Litvay J.D., Verma D.C., Johnson M.A. 1985. Influence of loblolly pine (Pinus taeda) culture medium and 247 its components on growth and somatic embryogenesis of the wild carrot (Daucus carota). Plant Cell Reports 248 4: 325–328. 249 Percy RE; Klimaszewska K and Cyr DR, 2000: Evaluation of somatic embryogenesis for clonal 250 propagation of western white pine . Can.J.For Res. 30: 1867-1876. 251 Salajova T. Salaj J & Kormutak A, 1999: Initiation of embryogenesis tissues and plantlet regeneration 252 from somatic embryos of Pinus nigra . Arn.Plant Sci. 145: 33-40. 253 Salajova T, Salaj J, 2005. Somatic embryogenesis in Pinus nigra: embryogenic tissue initiation, 254 maturation and regeneration ability of established cell lines. Biol Plant 49:333–339 255 Shoji M, Sato H , Nakagawa R. Funada R, Kubo T and Ogita S, 2005. Influence of osmotic pressure on 256 somatic embryo maturation in Pinus densiflora J For Res (2006) 11: 449-453 257 Tang, W.; Ouyang, F.; Guo, Z. C, 1998. Plant regeneration though organogenesis 258 from callus induced from mature zygotic embryos of loblolly pine. Plant Cell Rep. 17:557-560;. 259 Tang W, Guo ZC and OUYANG F, 2001. Plant regeneration from embryogenic cultures initiated from 260 mature Loblolly pine zygotic embryos. In Vitro Cell. Dev. Biol-Plant 37: 558 - 563. 261 262 STUDY ON INVITRO INITIATION AND MATURATION OF EMBRYOGENESIS FROM PINUS 263 MERKUSII. 264 265 Vuong Dinh Tuan, Nguyen Xuan Cuong, Phan Thi My Lan. 266 South Forest Science Sub-Institute 267 268 SUMMARY 269 Induction of initiation and zygotic embryo formation has been studied on Pinus merkusii. Immature zygotic 270 embryos show good response to modified Litvey’s cultue medium supplemented with 2,4-D (2,0mg/l) and BA 271 (3,0mg/l) in initiation. Addition of 500mg/l glutamine to the culture medium has increased proliferartion rate of 272 embryogenic tissues upto 3 times in the first week of culture. Combination of 90g/l maltose and 80mg/l ABA 273 in LVM solidified by 10g/l phytagel shows a higher effect than sucrose at the same concentration in 274 maturation of embryogenic tissues. Factors influence on plantlet regeneration from somatic embryos and 275 transferring to nursery is under study. 276 Keywords: Pinus merkusii, initiation and somatic embryo formation, maltose & sucrose 277 . 38 NGHIÊN CỨU TẠO PHÔI SOMA THÔNG NHỰA 1 (PINUS MERKUSII) TRONG ĐIỀU KIỆN INVITRO 2 3 Vương Đình Tuấn, Nguyễn Xuân Cường, Phan Thị Mỵ Lan 4 Phân viện Nghiên cứu Khoa học Lâm nghiệp. về tạo phôi soma trên Thông nhựa (Pinus merkusii) ở Việt 28 Nam. Vì thế, nghiên cứu này góp phần xây dựng kỹ thuật tạo thể phát sinh và phôi soma từ phôi non Thông 29 nhựa nhằm góp phần tạo. chất điều hòa sinh trưởng (2,4-D) và BA 122 cũng tác động đến gia tăng sinh khối. 123 41 3.3. Nghiên cứu tạo phôi soma 124 *Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ phytagel đến tạo phôi soma.