Nghiên cứu tạo màng cellulose vi khuẩn tầm cao chiết dược liệu và định hướng ứng dụng trong điều trị vết thương

TỔNG QUAN

Vi khuẩn Acetobacter xylinum và màng cellulose vi khuẩn

Màng cellulose vi khuẩn được tổng hợp từ một số loại vi khuẩn, trong đó vi khuẩn

Acetobacter xylinum cho hiệu quả tổng hợp màng tốt nhất [1] Do đó, mục này sẽ làm rõ đặc điểm vi khuẩn Acetobacter xylinum cũng như điều kiện hình thành màng cellulose vi khuẩn từ loài này Tìm hiểu về tính chất của màng cellulose vi khuẩn, những ưu điểm nổi trội của nó so với cellulose thực vật và ứng dụng của màng vào các ngành công nghiệp hiện nay

Acetobacter xylinum được phát hiện lần đầu tiên bởi A.J Brown vào năm 1886 do khả năng sản xuất cellulose Trong tự nhiên, vi khuẩn A.xylinum được tìm thấy trong đất và trên trái cây rụng mục nát [2] A.xylinum là vi khuẩn Gram (-) Độ dài của vi khuẩn

A.xylinum nằm trong khoảng từ 2 đến 10 àm với chiều rộng trong phạm vi 0.5 đến 1 àm Vi khuẩn A.xylinum là một loại vi sinh vật hiếu khớ, do đú cần oxy để tồn tại Thụng tin cụ thể về vị trí phân loại của vi khuẩn A.xylinum được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1 1 Vị trí phân loại của vi khuẩn Acetobacter xylinum [2]

Tên khoa học Acetobacter xylinum Đặc điểm nổi bật của vi khuẩn này là khả năng tổng hợp glucose thành cellulose chỉ thông qua một quá trình tổng hợp A.xylinum có khả năng chống lại những thay đổi đột ngột như sự mất nước của môi trường nuôi cấy, độ pH, sự hiện diện của các chất độc hại và sinh vật gây bệnh Vi khuẩn A.xylinum hình que, thẳng hoặc đôi khi có dạng cong, độ dài của vi khuẩn trong khoảng 2 − 3 àm, bề ngang khoảng 0.6 − 0.8 àm, vi khuẩn cú thể di động hoặc không, thường có sự sắp xếp riêng lẻ, đôi khi thành một chuỗi Các tế bào vi khuẩn được bao bọc bên ngoài bởi chất nhầy tạo váng nhăn có thành phần là hemicellulose [3]

Hình dạng của A.xylinum được thể hiện qua hình 1.1

Hình 1 1 Ảnh chụp vi khuẩn Acetobacter xylinum và màng BC thông qua kính hiển vi điện tử quét (SEM) [4]

Khoảng phát triển của vi khuẩn A.xylinum khá rộng, vi khuẩn có thể phát triển ở điều kiện pH từ 3 − 8, nhiệt độ phát triển trong khoảng 12 − 30 °C Ở 37 °C, vi khuẩn này bị thoái hóa hoàn toàn ngay cả trong môi trường tối ưu A.xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế nhiều nghiên cứu thường bổ sung thêm acetic acid vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn để hạn chế sự xâm nhiễm của các khuẩn lạ

1.1.2 Đặc tính của màng cellulose vi khuẩn (BC)

Màng BC đang được nghiên cứu và phát triển rộng rãi trong nhiều năm qua bởi nó sở hữu tính chất độc đáo so với màng cellulose thực vật Cấu trúc và tính chất của màng

BC thông qua mục 1.1.2.1 và 1.1.2.2

1.1.2.1 Cấu trúc của màng BC

Cellulose là một polymer tự nhiên được sản xuất bởi nhiều loại sinh vật, bao gồm thực vật, nấm và vi khuẩn Trong khi cellulose không phổ biến trong cấu trúc tế bào của vi khuẩn, nó là thành phần chính của thành tế bào thực vật và được tìm thấy trong gỗ, vỏ hạt và các cấu trúc khác Các phân tử cellulose lớn được tạo thành từ chuỗi liên kết của D-glucose, liên kết thông qua liên kết 1,4-β-glycosidic để tạo thành cấu trúc tuyến tính.

Hình 1 2 Liên kết giữa các phân tử glucose trong màng BC

Cellulose từ thực vật và vi khuẩn có cùng công thức phân tử (C6H10O5)n, song khác nhau về tính chất vật lý và hóa học Cellulose từ vi khuẩn sở hữu tính chất ưu việt hơn như độ kết tinh cao, cấu trúc siêu mỏng, khả năng hút nước tối ưu và độ bền cơ học vượt trội khi ngậm nước.

6] a - Cellulose sinh học b – Cellulose thực vật

Hình 1 3 Cấu trúc của cellulose sinh học và cellulose thực vật

Các sợi của cellulose sinh học mỏng hơn 100 lần so với cellulose thực vật, điều này làm cho nó trở thành vật liệu có độ xốp cao Phân tích cấu trúc cho thấy phân tử cellulose sinh học có dạng vi sợi, các vi sợi này kết hợp với nhau tạo thành các bó sợi, các bó sợi kết hợp tạo các thớ sợi có đường kính từ 1.5 – 2 nm với chiều dài microfibrill tầm 50 −

1.1.2.2 Tính chất của màng BC

Màng BC có nhiều đặc tính tuyệt vời và độc đáo Đầu tiên là nó có độ tinh khiết cao Nghiên cứu của Zhang và cộng sự đã cho thấy BC có độ tinh khiết rất cao (gần 100% cellulose) và không chứa hemicellulose hoặc lignin [7, 8] Cellulose cấu tạo màng BC có thành phần hóa học tương tự cellulose thực vật nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau Đặc điểm nổi bậc khác của BC là khả năng giữ nước cao và tính ưa nước của nó Hàm lượng nước có thể lên đến 98% trong gel BC pellicle, tức là khoảng 50 lần trọng lượng của sợi, khiến nó giống hydrogel hơn [8]

Các sợi cellulose có thể ở dạng I và I, đây là loại cellulose có trong thành tế bào thực vật và tảo Màng thu được bằng phương pháp nuôi cấy tĩnh có chứa nhiều I hơn là nuôi cấy động Cellulose I tạo cấu trúc bền hơn I Cellulose sinh học có chứa đến gần 60% là I trong khi ở thực vật chỉ tầm 30% Khả năng ngậm nước của cellulose sinh học cao từ 96 – 98.2% Ở thực vật cellulose I chiếm phần lớn [9] Ngoài ra, độ bền kéo của BC cũng lớn hơn cellulose thực vật, đạt khoảng 114 GPa, gần bằng nhiều sợi tổng hợp có độ bền cao [10]

1.1.3 Nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo màng BC

BC được sản xuất bởi các loài vi khuẩn khác nhau, chẳng hạn như Gluconacetobacter (trước đây là Acetobacter), Agrobacterium, Aerobacter, Achromobacter, Azotobacter, Rhizobium, Sarcina và Salmonella, trong đó A xylinum cho hiệu quả tổng hợp BC tốt nhất [1] Các loài Komagataeibacter spp có khả năng sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau, chẳng hạn như hexoses, glycerol, dihydroxyacetone, pyruvate và dicarboxylic acid Trong trường hợp này chúng sinh tổng hợp cellulose với hiệu suất chuyển hóa là gần 50% Một số yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp màng BC bao gồm: phương pháp nuôi cấy (nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy động), thành phần của môi trường nuôi cấy (nguồn carbon, nguồn nitơ, các chất kích thích sinh trưởng) Ngoài ra, còn có yếu tố khác ảnh hưởng đến hiệu suất thu màng như: nhiệt độ, pH, tỷ lệ cấy

Nuôi cấy vi khuẩn ở môi trường thích hợp sẽ tạo thành các hạt cellulose dạng lưới liên kết theo không gian 3 chiều với nhau [11] Vi khuẩn A.xylinum cần oxy để tồn tại, do đó tốc độ trao đổi khí quyết định hiệu suất tổng hợp BC Khi nuôi cấy động sử dụng cánh khuấy, hạt BC phân tán trong môi trường và cho năng suất cao hơn so với nuôi cấy tĩnh, vì lượng oxy trao đổi nhiều [12] Tuy nhiên, nuôi cấy động không thể hình thành màng BC với kích thước mong muốn Phương pháp nuôi cấy tĩnh sẽ giúp hình thành màng BC nổi trên bề mặt môi trường, kích thước của màng phụ thuộc vào diện tích bề mặt của dụng cụ nuôi cấy

A.xylinum sử dụng carbon từ nhiều nguồn đường khác nhau, tùy thuộc vào chủng mà nguồn đường có thể thay đổi Những loại đường hay được sử dụng nhất là: glucose, fructose, mannitol, sorbitol Nguồn carbon cho hiệu suất thấp hơn là glycerol, galactose, saccharose [13]

Môi trường cơ bản cho các nghiên cứu về cellulose vi khuẩn là môi trường do Hestrin và Schramm thiết lập có chứa cao nấm men và tryptone Đã có nhiều nghiên cứu thay đổi nguồn tryptone như nước ngâm ngô (corn steep liquor) [13], nguồn nitơ này được cho là có hiệu quả nhất, cho tốc độ tăng trưởng và năng suất sinh tổng hợp cellulose cao so với các nguồn nitơ khác

Các chất kích thích tăng trưởng

Bệnh học về bỏng

Bỏng là tổn thương cấp tính của cơ thể gây nên bởi sức nhiệt, hóa chất, điện năng, bức xạ Da là bộ phận thường bị tổn thương nhất khi bị bỏng, sau đó đến các lớp sâu dưới da (gân, cơ, xương, khớp, mạch máu, thần kinh,…) và một số cơ quan (đường hô hấp, ống tiêu hoá, mắt, bộ phận sinh dục,…) [24] Tìm hiểu về cơ chế tổn thương bỏng và phân loại cấp độ bỏng giúp cho quá trình điều trị bỏng được hiệu quả và hạn chế tổn thương cho người bệnh

1.2.1 Cơ chế tổn thương bỏng

Có nhiều nguyên nhân gây bỏng, chẳng hạn bỏng do nhiệt, dòng điện, hóa chất hoặc bức xạ

Nguyên nhân thường gặp nhất (khoảng 80% − 86% tổng số trường hợp), chia thành hai nhóm chính: bỏng do nhiệt khô (lửa, hoặc tia lửa) và bỏng do nhiệt ướt (nước sôi, thức ăn nóng sôi, hơi nước nóng) [25] Ngoài chấn thương cục bộ tại vị trí bỏng, chấn thương do nhiệt có thể dẫn đến sốc bỏng khi diện tích bỏng rộng (khoảng 20% tổng diện tích bề mặt cơ thể hoặc lớn hơn) [26]

Tổn thương bỏng điện là do nhiệt được tạo ra khi năng lượng điện đi qua cơ thể, gây tổn thương sâu ở mô Mức độ của tổn thương phụ thuộc vào đường đi của dòng điện, điện trở của dòng điện chạy qua các mô, cường độ và thời gian của dòng điện Các loại dòng điện khác nhau gây ra mức độ tổn thương khác nhau Ví dụ, dòng điện xoay chiều nguy hiểm hơn dòng điện một chiều vì thường gây ra ngưng tim, rung thất [27]

Tổn thương bỏng hóa chất xảy ra do tiếp xúc với da với các tác nhân hóa học, chẳng hạn như axit mạnh, kiềm hoặc hợp chất hữu cơ Tính chất và thời gian tiếp xúc với những tác nhân này sẽ ảnh hưởng đến mức độ tổn thương trên da.

Bỏng bức xạ là tổn thương xảy ra trên da hoặc mô, cơ quan sau khi tiếp xúc lâu dài với bức xạ Trong số các loại bỏng, bỏng bức xạ là loại ít phổ biến nhất, chủ yếu là cháy nắng do tiếp xúc lâu dài với tia cực tím (UV) Các nguyên nhân liên quan khác là sử dụng bức xạ ion hóa trong công nghiệp, tiếp xúc nhiều với xạ trị (như tia X và năng lượng hạt nhân) Bỏng bức xạ thường dẫn tới ung thư vì bức xạ ion có khả năng làm hỏng cấu trúc DNA.

1.2.2 Phân loại các cấp độ bỏng

Da là một cơ quan che phủ lớn nhất của cơ thể, có nhiều chức năng, thay đổi theo từng vùng Da gồm 3 lớp: Biểu bì (epidermis), trung bì (chân bì, dermis), hạ bì (hypodermis)

Biểu bì và trung bì ngăn cách nhau bởi màng đáy [28] Cấu trúc da được thể hiện qua hình 1.6 [28]

Có nhiều cách phân loại bỏng, dựa vào triệu chứng lâm sàng, mô bệnh học, diễn biến tại chỗ Trên thực tế lâm sàng, tổn thương bỏng xếp thành 2 nhóm: bỏng nông và bỏng sâu

Bỏng nông: Tổn thương một phần da Vết thương tự liền nhờ quá trình biểu mô hoá từ tế bào mầm, tế bào biểu mô của ống lông, tuyến bã, tuyến mồ hôi

Bỏng sâu là tổn thương toàn bộ lớp da, trung bì và mô dưới da Sau khi rụng hoại tử, vùng tổn thương sẽ hình thành mô hạt Nếu diện tích tổn thương nhỏ hơn 5 cm, vết thương sẽ tự liền sẹo theo cơ chế vết thương phần mềm thông thường Còn đối với diện tích tổn thương lớn hơn, vết thương cần được ghép da để che phủ.

Hiện nay, Viện Bỏng Quốc gia áp dụng cách chia độ sâu tổn thương bỏng làm 5 độ của

Lê Thế Trung, trong đó bỏng nông: bỏng một phần da, bao gồm bỏng độ I, độ II, độ III và bỏng sâu: độ IV, độ V

Bỏng độ I: Viêm da cấp sau bỏng

Tổn thương ở lớp nông của thượng bì (lớp sừng) Tổn thương vị thể: sung huyết, phù nề, xuất tiết vùng tổn thương Biểu hiện ban đỏ, nề, đau rát Sau 2 − 3 ngày, tổn thương khỏi có thể thấy lớp nông của thượng bì bong ra, không để lại rối loạn về màu sắc [29]

Bỏng độ II: Bỏng biểu bì

Tổn thương các lớp thượng bì, nhưng lớp tế bào mầm và màng đáy hầu như còn nguyên vẹn Vi thể thấy mạch máu ở hạ bì, trung bì giãn rộng, sung huyết Dịch huyết tương thoát qua thành mạch thấm vào lớp biểu bì đã bị tổn thương ở phía trên tạo nốt bỏng Đặc trưng là nốt bỏng vòm mỏng, chứa dịch trong hoặc vàng nhạt Đáy nốt bỏng màu hồng, ướt, thấm dịch xuất tiết Nốt bỏng có thể hình thành muộn sau 12, 24 hoặc 48 giờ

[29] Sau 3 − 4 ngày, dịch nốt bỏng một phần hấp thu, phần bay hơi tạo albumin đông đặc trong nốt bỏng Sau 8 − 13 ngày, tổn thương tự khỏi, không để lại sẹo [26]

Bỏng độ III: Bỏng trung bì

Tổn thương toàn bộ lớp biểu bì, tới một phần trung bì, các phần phụ của da nằm sâu ở trung bì phần lớn còn nguyên vẹn Bỏng độ III biểu hiện chủ yếu là nốt bỏng hoặc đám da hoại tử Nốt bỏng trung bì có tính chất vòm dày, dịch nốt bỏng đục, màu đỏ, hồng máu Đáy nốt bỏng màu đỏ, xuất huyết, tím sẫm Cảm giác đau còn nhưng giảm [29]

Bỏng độ IV: Bỏng toàn bộ da, bỏng sâu dưới lớp trung bì

Các lớp biểu bì, trung bì và hạ bì đều bị tổn thương Tất cả tổ chức biểu mô của da đều bị hủy hoại Trên lâm sàng thường biểu hiện dưới hai hình thức hoại tử khô và hoại tử ướt Khi vết bỏng hẹp thì có khả năng tự khỏi nhờ hiện tượng biểu mô hóa từ bờ vết thương lan ra phủ kín tổ chức hạt Nếu vết thương bỏng rộng, khả năng tự khỏi không thể thực hiện được, nhất thiết phải ghép da [29]

Bỏng độ V: Bỏng sâu các lớp dưới da

Tổn thương bỏng lan sâu tới cơ, gân, xương, khớp, tạng… Loại bỏng này thường gây nhiều biến chứng, gây khó khăn cho việc điều trị [26].

Quá trình lành vết thương mất da và vai trò của các loại màng sử dụng che phủ vết thương

Nghiên cứu về quá trình lành vết thương nhằm hiểu rõ về những yếu tố tác động đến vết thương Từ đó có thể đưa ra lộ trình và biện pháp điều trị phù hợp Mục này sẽ làm rõ các giai đoạn cũng như những yếu tố tác động đến quá trình làm lành vết thương, các loại băng dùng để che phủ vết thương hiện nay

1.3.1 Các giai đoạn của quá trình lành vết thương

Trong tất cả các loại vết thương, quá trình lành vết thương diễn ra qua ba pha: pha rỉ dịch (hay pha viêm), pha tăng sinh, pha tái tạo

Pha viêm kéo dài khoảng 72 giờ nhờ sự hoạt hóa của hệ thống đông máu và sự giải phóng các chất trung gian hóa học khác như từ tiểu cầu, yếu tố tăng trưởng nguồn gốc tiểu cầu (PDGF), yếu tố hoạt hóa tiểu cầu (PAF), thromboxane, serotonin, adrenalin và các yếu tố bổ thể [30]

Giai đoạn viêm: giãn mạch tại chỗ do tác dụng của các chất histamin, serotonin và kinin làm tính thấm thành mạch tăng cao trong 48 giờ − 72 giờ đầu với sự hiện diện của chất hoạt hóa mao mạch làm gia tăng lưu lượng máu đến vết thương dẫn đến tăng cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho quá trình lành sẹo Đồng thời sự hiện diện của bạch bào và đại thực bào có vai trò tiêu diệt vi khuẩn và các chất lạ [31]

Sự nhiễm khuẩn: trong các vết thương bị nhiễm vi khuẩn gây bệnh, các bạch cầu hạt liên tiếp di cư, điều này gây kéo dài thời kỳ sửa chữa thứ nhất, dẫn đến chậm lành vết thương rõ rệt và có thể hình thành áp xe [31]

Giai đoạn thứ hai của quá trình tái tạo vết thương là giai đoạn tăng sinh, bao gồm tái tạo biểu mô, tăng sinh sợi, hình thành collagen, hình thành tân mạch và co vết thương.

Ngay sau khi các nguyên bào sợi tổng hợp các sợi collagen, hoạt động gián phân của chúng ngừng lại Mật độ tế bào và sự tạo mạch của vết thương giảm đi trong khi các sợi collagen trưởng thành Sự hình thành sẹo được bắt đầu Sự lắng đọng collagen và sự định hướng nguyên bào sợi đều được quyết định bởi fibronectin, chất tạo nên các chất căn bản ngoại bào ở thời kỳ này

Hyaluronic acid làm tăng chuyển động và phân chia tế bào Sự chuyển động của tế bào trong tổ chức hạt mới được hình thành phụ thuộc vào sự có mặt của hyaluronic acid vì hyaluronic acid có tác dụng tạo điều kiện thuận lợi cho sự kết dính và phân tách của mối tiếp xúc giữa các lớp tế bào và cơ chất nền [33] Các proteoglycan: cũng như hyaluronic acid và collagen, các proteoglycan được tái tổng hợp liên tục trong suốt quá trình tái tạo vết thương [34]

Collagen: trong vết thương đang lành, collagen được sản xuất rất nhiều Collagen tăng lên song song với việc hình thành mạch máu tân tạo Vết thương bị kéo dài quá thời gian không chỉ do sự tích lũy mà còn do cả chất lượng của collagen [34]

Nếu biểu bì bị tổn thương, quá trình biểu bì hóa bắt đầu từ mép vết thương Ở những vết thương nông, các tế bào đáy còn nguyên vẹn có thể tái tạo vùng tổn thương thông qua quá trình phân bào và biệt hóa thành tế bào biểu bì trưởng thành Tuy nhiên, ở các vết thương sâu và rộng, quá trình tái tạo biểu bì chỉ giới hạn ở ngoại vi vết thương Do giới hạn của sự co vết thương và tái tạo biểu bì, vết thương rộng và sâu không thể lành sẹo bình thường và cần phải ghép da Ghép da giúp lấp đầy vết thương và ngăn ngừa nhiễm trùng.

Sự trưởng thành của biểu bì: đây là giai đoạn cuối của quá trình liền vết thương, sẹo trở nên rõ ràng và chắc hơn, sẹo nhạt màu dần Quá trình này gắn liền với hiện tượng sửa chữa và tổ chức lại các thành phần của sẹo Sự hình thành tân mạch giảm dần cho đến lúc sẹo trở thành vô mạch Giai đoạn này điều chỉnh kéo dài từ 12 − 18 tháng [34]

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lành vết thương

Vết thương chậm lành được biểu thị bằng khuyết hổng hoặc suy yếu làm cho việc khép kín vết thương bị chậm lại Các đặc điểm của vết thương chậm liền: chậm khép kín, có nhiều các chất thối rữa, có mủ, lưu thông mạch kém, ứ trệ tĩnh mạch, viêm mạch, viêm các mạng lưới mao mạch, nhiễm trùng vết thương [32] Yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình lành vết thương bao gồm: độ ẩm vết thương, lượng máu đến vết thương và nhiễm trùng vết thương Độ ẩm Độ ẩm thích hợp ảnh hưởng tích cực đến quá trình liền sẹo [32] Tỷ lệ tái tạo biểu bì có liên quan trực tiếp đến tình trạng ẩm ướt của vết thương Để hở, vết thương sẽ khô, sự tái tạo biểu bì và sự di chuyển của các tế bào sừng ở bên dưới lớp vảy tiết khô chậm hơn vết thương ẩm và băng kín Tại đây mức di chuyển của tế bào biểu bì nằm gần với bề mặt vết thương Sự hình thành của vảy tiết bị ức chế nếu bề mặt của vết thương được giữ ẩm bằng lớp băng kín hay lớp gạc có phết thuốc mỡ polysporin Khi vết thương có đủ độ ẩm, bề mặt da được che kín, lớp biểu bì di chuyển nhanh hơn trên đáy vết thương ẩm ướt, bệnh nhân sẽ có được sẹo nông hơn, nhỏ hơn, nhẵn hơn và mềm mại hơn, thường cũng ít bị nhiễm khuẩn hơn [35]

Lượng máu đến vết thương

Mức độ tiêu thụ oxy rất cao và thay đổi trong các giai đoạn của quá trình liền vết thương Các nguyên nhân nhiễm trùng, máu tụ, dị vật, thao tác kỹ thuật không đúng đều dẫn đến tình trạng thiếu máu tổ chức tại chỗ và gây nên tình trạng thiếu oxy làm ảnh hưởng đến quá trình lành vết thương [32, 35]

Nhiễm trùng vết thương được biểu thị bằng các chất thối rữa (vảy tiết, các chất hoại tử, các khối fibrin) và mủ Các biểu hiện về mạch máu thường thấy là ứ trệ tĩnh mạch, lưu thông động mạch kém, viêm mạch nói chung và viêm mạng lưới mao mạch nói riêng Hơn nữa vết thương có thể bị nhiễm vi khuẩn, nấm hoặc virus Tất cả những điều kiện nói trên cuối cùng dẫn đến giảm trao đổi chất và vì vậy làm cho việc khép kín vết thương bị chậm lại Vi khuẩn gây bệnh nhiễm Staphylococcus aureus, Streptococcus haemolyticus, Pseudomonas aeruginosa thường sản xuất các độc tố và enzyme hủy hoại mô và gây kéo dài tình trạng viêm, làm chậm sự lành vết thương [32, 35]

1.3.3 Các loại băng che phủ vết thương

Băng vết thương phải có một trong những chức năng sau: [36] (1) Có khả năng hút dịch rỉ và các độc tố trên bề mặt vết thương; (2) Duy trì môi trường ẩm cho vết thương; (3) Hấp phụ mùi; (4) Cho phép thông khí; (5) Tạo ra sự cách nhiệt; (6) Có khả năng cản vi khuẩn, bảo vệ vết thương khỏi sự nhiễm khuẩn; (7) Có tác động làm sạch vết thương loại bỏ mô chết và những tiểu phân lạ; (8) Không độc, không kích ứng; (9) Lấy ra dễ dàng khỏi vết thương, không gây tổn thương Các loại băng phổ biến và chỉ định dùng được trình bày như bảng 1.2 [36, 37]

Bảng 1 2 Các loại băng dùng để che phủ vết thương

Loại băng Đặc điểm Chỉ định

Tính thấm hút cao, thường dùng đặt vào trong vết thương

Cần có băng phủ ngoài

Vết thương sâu, khuyết mô, nhiễm khuẩn có dẫn lưu, rò

Tính thấm hút tốt, sợi cotton thông thoáng bề mặt

Có thể tẩm nước muối sinh lý để làm ẩm vết thương lớn

Sử dụng rộng rãi cho những vết thương sâu

Nhét dẫn lưu vết thương sâu

Có màu da, làm từ hydroactive, có keo dính mặt sau

Lớp đệm thấm dịch tiết vừa phải, giữ vết thương luôn ẩm

Bít bề mặt không cho oxy tiếp xúc vết thương

Những vết thương cạn, mô hạt đỏ

Loại băng Đặc điểm Chỉ định

Miếng mỏng trong suốt bằng polymer

Thấm hút dịch dẫn lưu và cung cấp độ ẩm cho vết thương, làm mát da

Vết thương cạn, mô hạt đỏ, vết thương mất da, vết bỏng nhỏ

Loét ép (loét tỳ) độ I, II

Mềm nhẹ, khả năng thấm hút tùy độ dày

Tạo độ ẩm bề mặt vết thương

Vết thương cạn, mô hạt đỏ

Film polyurethane có băng dính phía sau, có nhiều lỗ thoát hơi

Duy trì độ ẩm vết thương, không có tính thấm hút

Vết thương cạn, mô hạt đỏ, ít dịch

Bảo vệ vùng dễ tỳ đè, có thể dùng thay băng keo

Một trong những loại băng được phát triển và có nhiều ưu điểm so với các loại băng truyền thống đó là màng sinh học: màng sinh học có nguồn gốc từ mô tự nhiên, gồm nhiều dạng, có thể là sự kết hợp giữa collagen, elastin và lipid Hiện nay, nhiều loại polymer sinh học như collagen, fibrin, fibronectin, hyaluronic acid đã được dùng làm màng che phủ vết thương trên da Không giống như polymer tổng hợp, polymer sinh học trơ với vết thương do đó chúng đóng vai trò quan trọng trong tiến trình làm lành vết thương trên da Màng sinh học có các khả năng: (1) Giữ ẩm tốt; (2) Giảm sự mất protein và chất điện giải của dịch tiết vết thương; (3) Cản khuẩn; (4) Giảm đau; (5) Tái tạo mô, giảm thời gian làm lành vết thương, đặc biệt vết thương sâu và rộng; (6) Ức chế sự tạo thành nguyên bào sợi quá mức, giảm sự co rút vết thương Một số loại màng sinh học điển hình như màng collagen, màng ối đông khô

Một số dược liệu dùng trong điều trị vết thương

Cây hương nhu trắng có tên khoa học là Ocimum gratissium L thuộc họ Lamiaceae

(Hoa môi) Loài này được Linnaeus mô tả khoa học đầu tiên năm 1753 Phân loại khoa học [38]:

Bảng 1 3 Phân loại khoa học của cây hương nhu trắng

Tên nước ngoài Shrubby basil, wild basil

Tên thường gọi Hương nhu trắng Đặc điểm hình thái và phát triển

Hương nhu trắng là cây thảo sở hữu mùi thơm đặc trưng Thân vuông, cao tới 3 m, chia nhiều cành; lá mọc đối chéo, xanh lục sẫm ở mặt trên và nhạt hơn ở mặt dưới; hoa xim mọc thành cụm ở nách lá Quả bế tư, màu nâu sậm, đường kính khoảng 1 mm Ở Việt Nam, hương nhu trắng ưa sáng, thích nghi tốt với khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới.

Hình 1 7 Một số hình ảnh của cây hương nhu trắng

Năm 2004, Maria cùng các cộng sự đã tiến hành chưng cất tinh dầu từ lá cây hương nhu trắng bằng 3 phương pháp là: chưng cất lôi cuốn hơi nước (SD), chưng cất có sự hỗ trợ vi sóng (MO) và chưng cất bằng CO2 siêu tới hạn (SC) Sau đó, tiến hành phân tích thành phần tinh dầu bằng máy sắc ký khí, đầu dò khối phổ (GC-MS) Thành phần (%) các hợp chất trong tinh dầu từ 3 phương pháp chưng cất trên được trình bày ở bảng 1.4 Trong đó, chiếm tỷ lệ cao chất là các chất Eucalyptol (1), Eugenol (2), (E)-β- Caryophyllene (3), β-Selinene (4), α-Selinene (5) [41]

Bảng 1 4 Thành phần tinh dầu hương nhu trắng

Hợp chất SD % MO % SC % α-Pinene 0.7 - - β-Pinene 2.6 - -

(E)- β-Caryophyllene (3) 5.3 10.5 5.6 α-Humulene 0.8 1.6 0.8 γ-Muurolene 2.3 4.7 1.6 β-Selinene (4) 5.5 15.3 7.7 α-Selinene (5) 2.6 6.1 2.4

Năm 2017, nhóm nghiên cứu do Joshi dẫn đầu đã tiến hành chưng cất hơi nước hoa nhung trắng để thu được tinh dầu Sau đó, họ phân tích thành phần hóa học của tinh dầu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) Phương pháp này giúp xác định các hợp chất có trong tinh dầu, qua đó hiểu rõ hơn về thành phần và đặc tính của nó.

40 hợp chất có trong tinh dầu Trong đó, 3 hợp chất chiếm thành phần lớn nhất là: eugenol (2), α-bulnesene (6) và β-caryophyllene (3) với tỷ lệ lần lượt là 57.1%, 15.6% và 14.2% [42]

Hình 1 8 Cấu trúc các hợp chất có ở lá hương nhu trắng

Vào năm 2020, nhóm nghiên cứu của N.C.Hương đã tiến hành xác định thành phần hóa học của tinh dầu hương nhu trắng bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) Kết quả nghiên cứu cho thấy tinh dầu hương nhu trắng chứa 5 thành phần chính, trong đó có eugenol.

(2) (59.448%), trans-β-Ocimene (7) (10.382%), β-Cubebene (8) (11.783%), caryophyllene (3) (6.966%) và copaene (9) (2.479%) [43]

Hình 1 9 Cấu trúc các hợp chất có trong tinh dầu hương nhu trắng

Trong y học cổ truyền, hương nhu trắng (Ocimum gratissium L.) được sử dụng để điều trị một số bệnh như: ho, viêm phổi, sốt, viêm, thiếu máu, tiêu chảy, nhiễm nấm và vi khuẩn [44] Ở Cameroon, nước ép từ lá cây hương nhu trắng dùng để điều trị chóng mặt, nhức đầu, cảm lạnh, đau thắt ngực và ho Ngoài ra, các sản phẩm từ hương nhu trắng được dùng để điều trị nhiễm trùng tai, bệnh da liễu và nhãn khoa [45]

Nghiên cứu về hoạt tính sinh học

Năm 2014, Venuprased và cộng sự đã khảo sát khả năng kháng gốc tự do DPPH của cao chiết lá hương nhu trắng trong ethanol 70% Kết quả cho thấy giá trị IC50 là 470 ± 28.6 àg/mL Nghiờn cứu cũng chỉ ra những chất trong lỏ hương nhu trắng cú liờn quan đến khả năng kháng gốc tự do DPPH là: oleanolic acid, nevadensin, rosmarinic acid và eugenol [46]

Năm 2014, Okoye và cộng sự đã khảo sát khả năng kháng viêm của cao chiết hexan và tinh dầu cây hương nhu trắng Nhóm nghiên cứu đã tiến hành gây phù tai chuột, sau đó bôi cao chiết, tinh dầu và chứng dương Kết quả cho thấy cao chiết hexane cho hiệu quả kháng viêm cao nhất với phần trăm ức chế viêm sau 2 giờ đạt 85.84% tại nồng độ 50 àg/tai, trong khi tinh dầu và chứng dương đạt phần trăm ức chế là 52.57% và 41.59%

Các nghiên cứu của Orafidiya và cộng sự, cũng như Chang và cộng sự, đã chứng minh hiệu quả phục hồi vết thương của tinh dầu hương nhu trắng Thử nghiệm trên thỏ cho thấy tinh dầu này cải thiện đáng kể các giai đoạn viêm và tăng sinh của vết thương, với sự cải thiện đáng chú ý sau 3 ngày điều trị.

Cây dâu tằm có tên khoa học là Morus alba L là một loại thực vật có hoa trong họ

Moraceae Loài này được Carl Linnaeus mô tả khoa học lần đầu tiên vào năm 1753

Bảng 1 5 Phân loại khoa học của cây dâu tằm

Tên nước ngoài White mulberry, Common mulberry, Silkworm mulberry Đặc điểm hình thái và phát triển

Cây dâu tằm là loài cây thân gỗ cao 2 – 3 m; rễ ăn sâu và rộng có thể lên đến khoảng 3 m, phân bố nhiều ở tầng đất 10 – 30 cm Thân nhiều nhựa không gai, trên thân cành có nhiều mầm; vỏ có nốt sần, mủ trắng như sữa; cành mềm, khi còn non có lông, sau nhẵn có màu xám trắng; chồi nách nhỏ màu nâu vàng Lá mọc so le, hình bầu dục hoặc hình tim, có mũi nhọn ở đầu, phiến nguyên hay đôi khi chia 3 – 5 thùy, mỏng và mềm, dài khoảng 5 – 10 cm, rộng 4 – 8 cm, mép có răng cưa đều Mặt trên của lá màu lục sẫm hay lục xám, mặt dưới màu lục nhạt hơn, nổi rõ các gân lớn chạy từ cuống lá và nhiều gân nhỏ hình mạng lưới, có lông tơ mịn rải rác trên gân lá; cuống dài 2 – 4 cm, mảnh và có lông thưa [51]

Cây dâu tằm ưa ẩm và ánh sáng, thích nghi tốt với nhiệt độ từ 25 - 32°C Khi nhiệt độ ngoài 40°C hoặc dưới 12°C, cây sẽ hạn chế sinh trưởng Mùa hoa thường rơi vào tháng 4 - 5, còn mùa quả là từ tháng 5 - 7 Dâu tằm ưa khí hậu mát, thích hợp với vùng nhiệt đới và ôn đới (vào mùa hè) Ở Việt Nam, cây tập trung chủ yếu ở Tây Nguyên và rải rác ở Đồng bằng sông Cửu Long.

Hình 1 10 Một số hình ảnh của cây dâu tằm

Năm 2002, Jiang Du cùng các cộng sự đến từ trường Đại học Hong Kong, Trung Quốc thực hiện nghiên cứu rễ cây dâu tằm chiết với ethanol 70% (v/v) Tiến hành chạy sắc ký cột silica gel và các phương pháp phân tích phổ, cấu trúc của các hợp chất phân lập trong cao chiết được xác định (hình 1.11): moralbanone (1), kuwanon S (2), mulberroside C

(3), cyclomorusin A (4), eudraflavone B hydroperoxide (5), oxydihydromorusin (6), leachianone G (7) và α-acetyl-amyrin (8) Trong đó, hợp chất mulberroside C (3) chiếm hàm lượng cao nhất và moralbanone (1) ít nhất [52]

Hình 1 11 Cấu trúc các hợp chất có ở rễ dâu tằm

Năm 2017, Ming Li và các cộng sự tiến hành phân lập cao ethyl acetate của vỏ rễ dâu tằm Nghiên cứu được thực hiện trên dịch chiết ethanol 75% (v/v) thu được 900 g cao/10.0 kg nguyên liệu khô Sau khi tiến hành chạy sắc kí cột với nhiều hệ dung môi có độ phân cực khác nhau, kết hợp các phương pháp phân tích phổ, hai hợp chất mới được phân lập bao gồm một flavone mới là dioxycudraflavone A (9) và một 2- arylbenzofuran mới (5-hydroxyethyl moracin M) (10) Trong số bảy hợp chất đã biết cũng được tìm thấy trong nghiên cứu này bao gồm: sanggenon V (11), morusin (4), morusignin L (12), licoflavone C (13), moracin C (14), alfafuran (15) và mulberrofuran

G (16) (hình 1.12), hai hợp chất (4) và (12) thu được với hàm lượng cao vượt trội lần lượt 2.0 g/10.0 kg nguyên liệu khô và 1.5 g/10.0 kg nguyên liệu khô [53]

Hình 1 12 Cấu trúc các hợp chất vỏ rễ dâu tằm

Vỏ rễ dâu tằm (tang bạch bì) có nhiều công dụng như kháng viêm, bảo vệ gan thận, hạ huyết áp, lợi tiểu, trị ho, giảm đau Trong y học cổ truyền, tang bạch bì thường được dùng để chữa ho khan, ho ra máu, phù thũng, cao huyết áp và có thể dùng tươi hoặc sấy khô tán bột Còn cành của cây dâu tằm (tang chi) có vị đắng, tính bình, có tác dụng trừ phong, được dùng để chữa các bệnh ho hen do phế nhiệt, phù chân.

Nghiên cứu về hoạt tính sinh học

Năm 2003, Park và cộng sự đã đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết methanol vỏ rễ dâu tằm Nhóm tác giả tiến hành phân lập hợp chất Kuwanon G (17) từ vỏ rễ cây dâu tằm và tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của hợp chất này với các chủng vi khuẩn Kết quả, giá trị MIC đối với vi khuẩn Streptococcus mutans và Staphylococcus aureus là 8 àg/mL và 125 àg/mL [55]

Hình 1 13 Công thức cấu tạo hợp chất Kuwanon G từ vỏ rễ dâu tằm

Năm 2013, nghiên cứu của Kaushik và cộng sự đã chứng minh khả năng hỗ trợ chữa lành vết thương của cao chiết lá dâu tằm trên mô hình chuột bị mất da Kết quả cho thấy, cả cao ethanol và cao nước của lá dâu tằm đều có hiệu quả đáng kể trong việc thúc đẩy quá trình lành thương Cụ thể, sau 16 ngày điều trị, tỷ lệ lành vết thương đạt 99,33% và 81,83% tương ứng, vượt trội so với nhóm sử dụng thuốc dương tính Aloe Vera (81,83%).

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

Mục tiêu chung của đề tài là tạo ra màng BC tẩm dược liệu (tinh dầu hương nhu trắng và cao chiết rễ dâu tằm) và đánh giá hoạt tính sinh học của nó Để đạt được mục tiêu trên, cần thực hiện các nội dung cụ thể như sau:

• Nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo ra màng BC

• Tinh chế màng BC từ màng BC thô thu được

• Đánh giá tính chất của màng BC tinh chế

• Đánh giá khả năng kháng viêm, kháng khuẩn và chữa lành vết thương của cao dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng

• Tẩm dược liệu lên màng BC tinh chế

Đánh giá hoạt tính sinh học của màng BC trên các chủng vi khuẩn nhằm xác định khả năng kháng khuẩn của màng Ngoài ra, nghiên cứu cũng tiến hành thử nghiệm in vivo trên chuột để đánh giá khả năng làm lành vết bỏng của màng BC sau khi được tẩm dược liệu Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin về tiềm năng ứng dụng của màng BC trong các sản phẩm y tế.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài cung cấp thông tin về các điều kiện để thu được màng BC với hiệu suất tốt Hơn nữa, đề tài còn giúp đánh giá được hiệu quả điều trị vết thương của màng BC thành phẩm khi kết hợp với dược Ý nghĩa thực tiễn: Đánh giá và tìm ra giải pháp cải thiện tính chất của màng BC, ứng dụng trong việc điều trị vết thương.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu

Chủng vi khuẩn tạo cellulose: Chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum do bộ môn Công nghệ Sinh học (CNSH), Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp

Các chủng vi khuẩn sử dụng trong thử nghiệm sinh học

− Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) ATCC 43300

− Staphylococcus epidermidis (Phân lập từ mẫu bệnh phẩm, bộ môn CNSH cung cấp) Động vật thử nghiệm: Chuột nhắt trắng khỏe mạnh chủng Thụy Sĩ (Swiss Albino) có trọng lượng từ 20 – 25 gram, giống đực được mua từ Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh Chuột được nuôi trong lồng (kích thước 15 x 26 x 36 cm), chia đều thành 6 ô nhỏ được ngăn cách với nhau bằng lưới kim loại, mỗi chuột nuôi trong 1 ô Chuột mua về được để thích nghi với điều kiện môi trường thí nghiệm ít nhất 7 ngày, thức ăn (Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp) và nước uống được cung cấp đầy đủ mỗi ngày

Nguyên vật liệu thử nghiệm:

Cao chiết rễ dâu tằm: sản phẩm do phòng thí nghiệm Hóa dược 401B2, Đại học Bách

Để chiết suất rễ dâu tằm, rễ được thu thập từ Đà Lạt, xử lý bằng cách rửa sạch, phơi khô và cắt nhỏ Sau đó, mẫu được phơi khô với nhiệt độ và ánh sáng vừa phải trong 2 ngày, xay đến kích thước khoảng 2 mm và bảo quản cùng gói hút ẩm Tiếp theo, mẫu được chiết bằng ethanol 93° trong điều kiện nhiệt độ 45 ℃, thời gian 47 phút, lặp lại 2 lần với tỷ lệ mẫu thô/dung môi là 1/6 (g/mL) Dịch chiết được lọc chân không, cô quay để loại bỏ dung môi, thu được cao chiết có độ ẩm dưới 12%.

Tinh dầu hương nhu trắng: sản phẩm do phòng thí nghiệm Hóa dược 401B2, Đại học

Bách Khoa Tp.HCM cung cấp Thành phần 100% tinh dầu được chiết xuất từ lá hương nhu trắng bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Nước dừa: nước dừa được thu lấy từ cơ sở sản xuất kẹo dừa Nước dừa vừa lấy ra khỏi trái được dùng để pha môi trường Hestrin – Schramm nuôi cấy vi khuẩn A.xylinum

Dung dịch NaCl 0.9% Việt Nam

Phẩm màu xanh Evans Trung Quốc

Mueller Hinton Broth Ấn Độ

Thuốc thử Fehling Trung Quốc

− Máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV- Vis Thermo Genesys 10S UV-Vis

− Máy đo màu JZ-350, Trung Quốc

− Nồi hấp tiệt trùng autoclave

− Tủ an toàn sinh học cấp 2

− Cân phân tích SATORIUS UP 2215, Nhật

− Tủ sấy UN110 Memmert, Đức

Nội dung nghiên cứu

Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Hình 2 1 Quy trình nghiên cứu tổng quát

Chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum được hoạt hóa và nuôi cấy tạo màng BC thô trong điều kiện nuôi cấy tĩnh Màng BC thô thu được sẽ tinh chế để làm sạch màng, sau đó thực hiện đánh giá tính chất vật lý và hóa học của màng Bên cạnh đó, thí nghiệm đánh giá khả năng kháng viêm, kháng khuẩn và làm lành vết thương của cao dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng được tiến hành Sau đó, cao dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng được tẩm lên màng BC để đánh giá khả năng kháng khuẩn và làm lành vết thương trên chuột

Tẩm dược liệu lên màng BC Đánh giá tính chất của dược liệu

Nuôi cấy vi khuẩn tạo màng BC thô Đánh giá tính chất của màng BC tinh chế

Tinh chế màng BC Đánh giá hiệu quả của màng BC tẩm dược liệu

Phương pháp nghiên cứu

Luận văn được thực hiện ở phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ 401B2 và phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học 108B2, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Đại học Bách Khoa Tp.HCM

Quy trình hoạt hóa giống Acetobacter xylinum được thực hiện như hình 2.2

Hình 2 2 Quy trình hoạt hóa giống Acetobacter xylinum

Giống vi khuẩn Acetobacter xylinum được kích hoạt bằng cách nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy Hestrin – Schramm ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ Sau khi hoạt hóa, giống được kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp đổ đĩa và đảm bảo không có sự nhiễm tạp của vi sinh vật lạ Tiếp đó, giống được hoạt hóa lần thứ hai trong điều kiện tương tự với lần đầu tiên Cuối cùng, giống được chuyển sang nuôi trong bốn bình chứa môi trường nuôi cấy để tiếp tục hoạt hóa ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ.

Cho vào erlen chứa môi trường

2.3.2 Lên men thu màng BC thô

Quá trình lên men A.xylinum thu BC trong điều kiện nuôi cấy tĩnh Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình này cần nghiên cứu như nguồn dinh dưỡng, pH môi trường, lượng giống sử dụng ban đầu Nguồn dinh dưỡng bao gồm nguồn carbon, nguồn nitơ, nước dừa Điều kiện lên men thu màng BC trong nghiên cứu được cải tiến theo kết quả tối ưu điều kiện lên men của Pou và cộng sự [59] Quy trình lên men thu màng BC thô như hình 2.3

Hình 2 3 Quy trình lên men thu màng BC thô

Tiến hành hút 5 mL dịch giống Acetobacter xylinum cho vào các khay inox 304 (kích thước 15 x 10 x 4 cm) chứa 50 mL môi trường Toàn bộ quá trình được thực hiện trong tủ cấy vô trùng, sau đó bọc khay bằng giấy bạc Nuôi ở nhiệt độ phòng trong thời gian

Thời gian: 7 ngày Cho vào khay inox Điều kiện lên men

2.3.3 Tinh chế màng BC thô

Hình 2 4 Quy trình thu BC tinh chế

Nguyên tắc: xử lý màng BC thô bằng dung dịch Na2CO3 để phá vỡ tế bào vi khuẩn và loại peptone còn lại trong môi trường nuôi cấy Quá trình xử lý được gia nhiệt để tăng thêm hiệu quả và rút ngắn thời gian xử lý [60]

Các bước tinh chế bao gồm:

− Tách màng BC: trong quy trình nuôi cấy tĩnh, lớp BC được tạo thành nổi trên bề mặt môi trường thành một lớp màng dày Tách lấy màng BC, rửa nhiều lần bằng nước cất

Ngâm mẫu vật trong dung dịch Na2CO3 5% trong 24 giờ, đồng thời lắc trên máy lắc ngang với tốc độ 210 vòng/phút Sau đó, rửa mẫu nhiều lần bằng nước cất Tiếp tục ngâm và lắc mẫu trong nước cất trong 24 giờ.

− Sau 24 giờ, rửa nhiều lần với nước cất, lặp lại bước ngâm và lắc

2.3.4 Đánh giá tính chất của màng BC tinh chế

Thực hiện các thử nghiệm để đánh giá tính chất của màng BC sau khi tinh chế Các thử nghiệm để kiểm tra độ tinh khiết của màng và tính chất vật lý của màng

Rửa màng với nước cất

Ngâm trong Na2CO3 5% đến khi màng trắng

2.3.4.1 Kiểm tra độ tinh khiết màng BC tinh chế

Kiểm tra độ tinh khiết của màng nhằm đảm bảo màng BC sau khi xử lý đã được loại các tạp chất Các tạp chất được khảo sát là glucose, protein của vi khuẩn, dư lượng peptone trong môi trường nuôi cấy và pH của màng BC

Tìm sự hiện diện của glucose trong màng BC sau khi tinh chế Định tính glucose trong màng BC bằng thuốc thử Fehling Màng BC tinh chế 10 cm x

10 cm được xay nhỏ, cho vào 50 mL nước cất, lắc kỹ với máy lắc trong 3 giờ Dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện glucose trong dịch chiết màng Mẫu chứng âm là nước cất và mẫu chứng dương là dung dịch D − glucose Phản ứng dương tính với sự xuất hiện tủa nâu đỏ trong ống nghiệm

Tìm sự hiện diện của protein trong màng BC tinh chế

Cơ sở phương pháp: Phương pháp định lượng protein của Bradford dựa trên liên kết giữa dạng anion của thuốc nhuộm Coomassie blue G250 với gốc arginyl của protein (nhưng không liên kết được với amino acid tự do) và được xác định bằng mật độ quang ở bước sóng 595 nm

Màng BC tinh chế với kích thước 10 cm x 10 cm được xay nhỏ cho vào 50 mL nước cất, lắc kỹ với máy lắc trong 3 giờ Sử dụng dịch chiết làm mẫu thử Mẫu chứng âm là nước cất và mẫu chứng dương là dung dịch peptone 1% Cho lần lượt mẫu dịch chiết, dung dịch peptone 1% và nước cất vào các ống nghiệm với thể tích 1 mL Thêm 5 mL thuốc thử Bradford vào các ống nghiệm Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Đo OD595 và ghi nhận kết quả

Xác định pH của màng BC tinh chế

Sau khi tinh chế pH của màng phải nằm trong khoảng pH trung tính Đo pH dịch chiết màng bằng máy đo pH Cân và cho màng BC đã xay nhỏ vào 1 bình nón chứa nước cất theo tỷ lệ màng và nước là 1:100 (w/v) Đặt bình vào máy lắc ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ Lấy dịch chiết và đo pH dung dịch ở mỗi bình bằng pH kế, lặp lại 3 lần

2.3.4.2 Đánh giá tính chất vật lý của màng BC tinh chế

Màng BC tinh chế dùng để tạo màng trị bỏng phải đạt được những tính chất sau: mềm mại, dẻo dai, mỏng, có khả năng áp sát vào da, có tính che phủ tốt Ngoài ra, màng có độ ẩm thích hợp, có khả năng hút nước và hợp chất

Phương pháp xác định trọng lượng khô của màng BC

Chuẩn bị màng BC tinh chế kích thước 5 x 2 cm ngâm ngập nước Lấy ra để ráo nước, sấy khô màng ở 70 ℃ trong 5 giờ, sau đó cân màng Trọng lượng khô là khối lượng sau khi sấy đến khối lượng không đổi

Phương pháp khảo sát khả năng hút nước của màng BC

Phương pháp được tiến hành và điều chỉnh theo nghiên cứu của Fijałkowski và cộng sự

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Thu hoạch màng và đánh giá tính chất của màng BC tinh chế

Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn A.xylinum, màng BC thô được hình thành Sau khi tinh chế, màng BC được loại bỏ tạp chất và cải thiện tính chất ngoại quang Các thử nghiệm tiếp theo bao gồm kiểm tra độ tinh khiết và đặc tính vật lý của màng BC tinh chế.

3.1.1 Kết quả tạo màng BC thô

Giống vi khuẩn Acetobacter xylinum sau khi được hoạt hóa để đạt lượng vi khuẩn

10 8 CFU/mL môi trường nuôi cấy được sử dụng để lên men trong điều kiện nuôi cấy tĩnh để tạo màng BC Sau thời gian nuôi cấy tĩnh 7 ngày, màng BC được hình thành Tiến hành thu màng BC để tiếp tục những thử nghiệm tiếp theo Màng BC thu được sau khi lên men có màu nâu sẫm, bề mặt màng trơn, thể hiện qua hình 3.1

Hình 3 1 Màng BC thô thu được sau khi lên men

Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, môi trường lên men trở nên đục hơn do vi khuẩn tăng sinh khối Thông qua quá trình hô hấp tế bào, A.xylinum có khả năng chuyển đổi carbohydrate thành acetic acid và gluconic acid, làm giảm pH của môi trường lên men, đồng thời tổng hợp sợi cellulose tiết ra môi trường [67]

Vì màng được tạo thành trong điều kiện giàu peptone và glucose, do đó cần phải tiếp tục tinh chế màng để loại bỏ những hợp chất bám trên màng Màng BC thô thu hoạch sẽ được trữ trong hộp nhựa chứa nước cất để tiếp tục cho giai đoạn tinh chế

Màng BC thô còn chứa nhiều vi khuẩn A.xylinum và những chất chuyển hóa trong quá trình lên men Quá trình tinh chế màng trong Na2CO3 5% và rửa lại với nước giúp màng sạch hơn, cải thiện ngoại quan của màng Sau quá trình tinh chế màng BC, màng đã trắng trong, không bị biến đổi ở nhiệt độ cao

Hình 3 2 Màng BC sau khi tinh chế

Màng BC được làm sạch với nước bởi vì màng có cấu trúc mạng 3 chiều, được hình thành bởi những đơn vị glucan đan xen lên nhau và ổn định bằng liên kết hydro nội phân tử [68] Do đó, màng có những tính chất vượt trội như khả năng giữ nước cao, độ bền cơ học cao và khả năng tương thích sinh học

3.1.3 Đánh giá tính chất của màng BC tinh chế

Sau khi trải qua quá trình tinh chế, để đánh giá hiệu quả của toàn bộ quá trình tạo màng cũng như làm sạch màng thì màng cần được kiểm tra để xem chất lượng màng có phù hợp tiêu chí làm màng điều trị vết thương hay không Do đó cần tiến hành kiểm tra độ tinh khiết, tính chất vật lý của màng

3.1.3.1 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của màng

Kiểm tra sự hiện diện của glucose

Phản ứng tạo thành kết tủa nâu đỏ của glucose và thuốc thử Fehling giúp nhận biết được sự hiện diện của glucose trong màng

1 Ống chứng chứa môi trường nuôi cấy

3, 4, 5 Ống chứa màng BC đã tinh chế

Hình 3 3 Kết quả định tính glucose của màng BC tinh chế

Dựa vào màu sắc của phản ứng, cho thấy không xảy ra hiện tượng kết tủa ở ống nghiệm chứa màng BC tinh chế, trong khi ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy cho kết tủa nâu đỏ Do đó, quá trình tinh chế màng BC đã làm sạch glucose

Kiểm tra sự hiện diện của peptone

Ngoài glucose, môi trường nuôi cấy chứa nhiều peptone, có bản chất là protein Phương pháp định lượng protein của Bradford được sử dụng để xác định hàm lượng protein còn lại trong màng sau khi tinh chế Đường chuẩn albumin được mô tả trong Hình 3.4.

Hình 3 4 Đồ thị độ hấp thu của albumin

Kết quả định lượng protein trong màng BC tinh chế được thể hiện qua bảng 3.1 Kết quả cho thấy hàm lượng protein còn lại trong màng ở nồng độ rất thấp Quá trình tinh chế màng đã giúp màng tinh khiết hơn

Bảng 3 1 Kết quả định lượng protein trong màng BC tinh chế

Nồng độ protein (àg/mL)

Lần 1 Lần 2 Lần 3 0.480 0.479 0.481 27.84 ± 0.06 pH của màng BC tinh chế

Sau 3 lần đo, giá trị pH của màng BC tinh chế đạt 7.55 ± 0.01 Giá trị này nằm trong khoảng pH cho phép của màng đắp lên vết thương là từ 6 tới 7.85, theo nghiên cứu của Wilson Vết thương có độ pH trung tính sẽ mau lành hơn và ít xảy ra nguy cơ nhiễm trùng [69]

3.1.3.2 Kết quả đánh giá tính chất vật lý của màng

Xác định khối lượng khô của màng

Khối lượng của màng BC ban đầu và sau khi sấy khô được thể hiện qua bảng 3.2

Bảng 3 2 Khối lượng khô của màng BC tinh chế

Màng BC kích thước 9 x 4.5 (cm)

Khối lượng ban đầu (g) Khối lượng sau sấy (g) 28.82 ± 1.36 0.20 ± 0.01

Kết quả cho thấy khối lượng màng BC ban đầu và sau khi sấy chênh lệch rất cao, khối lượng màng sau khi sấy đạt 0.69% so với khối lượng ban đầu Điều này cho thấy màng

BC có lượng nước rất cao Trong nghiên cứu của Eskilson và cộng sự cũng nhận thấy khối lượng nước trong màng BC chiếm đến hơn 99% khối lượng của màng [70]

Khả năng hút nước của màng BC tinh chế

Khả năng hút ẩm và thoát dịch là đặc tính quan trọng trong ứng dụng của màng sinh học cellulose (BC) trong việc băng bó vết thương Khả năng giữ ẩm của màng BC giúp đẩy nhanh quá trình lành thương và bảo vệ vết thương khỏi nhiễm trùng, đồng thời tạo điều kiện thẩm thấu của hoạt chất vào vết thương, giúp việc thay băng dễ dàng, không đau và không làm tổn thương vùng da non đang hình thành.

Hình 3 5 Kết quả đánh giá khả năng hút nước của màng BC

Từ đồ thị, nhận thấy khối lượng nước của màng BC hút gấp từ 1.695 tới 2.043 lần so với khối lượng khô của màng Khối lượng nước được hút vào màng tỉ lệ thuận với thời gian ngâm màng Cụ thể, khi ngâm màng 2 giờ thì màng giữ lượng nước gấp 1.695 và khi ngâm màng 24 giờ thì gấp 2.043 lần so với khối lượng khô Kết quả trên cũng tương đồng với nghiên cứu của Lin và cộng sự khi nhận thấy khối lượng nước màng BC hút gấp từ 100% tới 200% khối lượng khô của nó [72] Màng BC sau khi sấy bằng nhiệt sẽ không còn khả năng hút nước tốt như màng ban đầu, có thể là do quá trình sấy đã khiến sợi cellulose trong màng bị dính lại, dẫn đến các phân tử nước khó chui vào để liên kết

Do đó, khả năng hút nước của màng BC sẽ giảm khi sấy khô

Khả năng thoát nước của màng BC tinh chế

Kết quả đánh giá khả năng hút nước của màng BC được thể hiện qua đồ thị hình 3.6

Hình 3 6 Kết quả đánh giá khả năng thoát nước của màng BC

Hoạt tính sinh học của cao chiết rễ dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng

Nhằm tối ưu số lượng động vật thử nghiệm đối với thử nghiệm làm lành vết thương của màng BC tẩm dược liệu trên chuột, cao chiết rễ dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng được so sánh hoạt tính sinh học thông qua thử nghiệm kháng viêm, kháng khuẩn và làm lành vết thương Sau đó, dựa vào kết quả thu được sẽ chọn ra loại dược liệu có hoạt tính tốt hơn để tẩm lên màng BC cho thử nghiệm in vivo

3.2.1 Kết quả so sánh khả năng kháng viêm

Quá trình viêm dẫn đến tăng lưu lượng máu, tiết dịch protein và chất lỏng huyết tương, và tăng sự di chuyển của bạch cầu (chủ yếu là bạch cầu trung tính) bên ngoài các mạch máu vào trong các mô bị thương Điều này được đặc trưng bởi thay đổi mạch máu rõ rệt, bao gồm giãn mạch và tăng tính thấm mao mạch được gây ra bởi sự hiện diện của các chất trung gian gây viêm khác nhau Kết quả kháng viêm của mẫu thử và chứng dương được thể hiện qua giá trị IC50 ở đồ thị hình 3.9

Hình 3 9 Giá trị IC 50 của các mẫu thử trong thử nghiệm kháng viêm

Theo dữ liệu trong Hình 3.9, giá trị IC50 của mẫu thử và chứng dương có sự khác biệt đáng kể Giá trị IC50 càng thấp, khả năng ổn định màng tế bào hồng cầu trong thử nghiệm kháng viêm càng mạnh Trong số các mẫu thử nghiệm, dexamethasone thể hiện khả năng kháng viêm tốt nhất với giá trị IC50 nhỏ nhất.

= 597.52 ± 59.29 àg/mL), tiếp theo là tinh dầu hương nhu trắng (IC50 = 1494.54 ± 101.62 àg/mL) và cao dõu tằm (IC50 = 1653.44 ± 72.35 àg/mL) Giỏ trị IC50 của dexamethasone thấp hơn 1.77 lần so với cao dâu tằm và 1.5 lần so với tinh dầu hương nhu trắng Tinh dầu hương nhu trắng cho khả năng kháng viêm tốt hơn so với cao dâu tằm, tuy nhiên sự khác biệt ở giá trị IC50 không có ý nghĩa khi phân tích ANOVA (p > 0.05)

Nhiều nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng kháng viêm của cao chiết dâu tằm và hương nhu trắng Năm 2014, Ajayi và cộng sự đã đánh giá khả năng kháng viêm của cao chiết ethanol lá hương nhu trắng thông qua khả năng bảo vệ màng tế bào hồng cầu Kết quả cho thấy tại nồng độ 1250 àg/mL, cao chiết bảo vệ 30% màng tế bào hồng cầu, trong khi chứng dương Indometacin bảo vệ 38% Thông qua thí nghiệm định tính, nhận thấy trong cao chiết có nhiều flavonoid và tannin [78] Eugenol là thành phần chính trong tinh dầu hương nhu trắng, có tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, kháng oxy hóa, đặc tính chống ung thư và giảm đau [79] Năm 2021, Sethuram và cộng sự đã đánh giá khả năng ổn định màng tế bào hồng cầu của nhũ tương eugenol-bạc Kết quả cho thấy khả năng bảo vệ màng tế bào hồng cầu đạt 80.56% ở nồng độ 20 àg/mL [80] Năm 2014,

Eo và cộng sự đã tiến hành xác định khả năng kháng viêm của cao chiết rễ dâu tằm thông qua thử nghiệm ức chế sản sinh NO trên tế bào RAW264.7 của chuột, ông đưa ra kết luận cao chiết rễ dõu tằm cho khả năng ức chế sản sinh NO ở nồng độ 5 àg/mL Hợp chất kuwanon C, kuwanon G hoặc morusin trong cao chiết rễ dâu tằm có thể đóng vai trò quan trọng trong tác dụng kháng viêm của nó [81]

Hoạt tính kháng viêm của cao rễ dâu tằm thấp hơn so với tinh dầu hương nhu trắng, tuy nhiên giá trị IC50 chênh lệch không đáng kể, do đó cần tiếp tục thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của 2 loại dược liệu này

3.2.2 Kết quả so sánh khả năng kháng khuẩn

Khả năng kháng khuẩn của hợp chất có liên quan mật thiết đến việc thúc đẩy lành vết thương, những chất kháng khuẩn tốt sẽ ngăn sự xâm nhiễm của vi khuẩn và hạn chế nhiễm trùng vết thương [82] Vi khuẩn Staphylococcus aureus là chủng vi khuẩn Gram (+) gây nhiễm trùng mủ ở cộng đồng và tại bệnh viện S.aureus thường không gây nhiễm trùng trên da khỏe mạnh, tuy nhiên, nếu nó xâm nhập vào các mô bên trong hoặc máu, vi khuẩn này có thể gây ra nhiều loại nhiễm trùng nghiêm trọng [83] Việc điều trị vi khuẩn này vẫn còn nhiều thách thức do sự xuất hiện của các chủng đa kháng thuốc như

MRSA (Tụ cầu vàng kháng Methicillin) [84] Staphylococcus epidermidis là vi khuẩn

Gram (+), nó là nguyên nhân chính gây ra nhiễm trùng bệnh viện Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn Gram (-), vi khuẩn có thể gây nhiễm trùng ở những người khỏe mạnh Nhiễm trùng Pseudomonas aeruginosa thường gặp ở những người có tình trạng suy giảm miễn dịch như giảm bạch cầu trung tính, bỏng, cấy ghép nội tạng

Pseudomonas aeruginosa có khả năng kháng kháng sinh mạnh, do đó việc điều trị vi khuẩn này hiện nay rất khó khăn [85] Khả năng kháng khuẩn của cao dâu tằm và tinh dầu hương nhu được thể hiện qua bảng 3.4

Bảng 3 4 Đường kính vòng ức chế của cao dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng

Chú thích: S.a: Staphylococcus aureus; MRSA: Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus; P.a: Pseudomonas aeruginosa; S.e: Staphylococcus epidermidis

Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy, cao dâu tằm có khả năng kháng mạnh hơn tinh dầu hương nhu trắng ở 3 trên 4 chủng vi khuẩn thử nghiệm Tuy nhiên, cao dâu tằm cho khả năng kháng trên các chủng Gram (+) mà không có khả năng kháng trên chủng Gram (-) Cụ thể, đối với chủng S.aureus, tại nồng độ 100 mg/mL cho đường kính vòng ức chế của cao dâu tằm đạt 20.97 ± 0.67 mm, lớn nhất trong những vi khuẩn Gram (+), trong khi của tinh dầu hương nhu trắng là 17.40 ± 0.52 mm Hiệu quả ức chế vi khuẩn S.aureus của cao dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng có sự khác nhau về ý nghĩa thống kê (p < 0.005) Đối với chủng MRSA, từ nồng độ 3.125 mg/mL đến nồng độ 50 mg/mL thì cao dâu tằm cho đường kính ức vòng ức chế lớn hơn tinh dầu hương nhu trắng Đối với chủng P.aeruginosa, cao dâu tằm không có khả năng ức chế, còn tinh dầu hương nhu trắng cho đường kính vòng ức chế lớn nhất là 10.70 ± 0.26 mm Đối với chủng

S.epidermidis, đường kính vòng ức chế của cao dâu tằm lớn hơn tinh dầu hương nhu trắng ở những nồng độ khảo sát Cao dâu tằm cho hiệu quả ức chế vi khuẩn S.epidermidis ngay tại nồng độ khảo sát thấp nhất Cụ thể đường kính ức chế là 10.97 ± 0.40 mm tại 3.125 mg/mL Hiệu quả ức chế vi khuẩn S.epidermidis của cao dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng có sự khác nhau về ý nghĩa thống kê (p < 0005)

Hoạt tính kháng khuẩn của cao dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng được thể hiện thông qua nhiều nghiên cứu Zhu và cộng sự (2021) đã đánh giá khả năng kháng khuẩn của các hợp chất phân lập từ cao chiết rễ dâu tằm đối chủng S.aureus và MRSA Nhóm tác giả nhận thấy các hợp chất phenolic chiếm hàm lượng lớn trong cao chiết rễ dâu tằm như: gallic acid, pyrocatechol, (-)-epicatechin, caffeic acid, p-coumaric acid, moracin

M, kuwanon G,… Giỏ trị MIC của cỏc hợp chất này với chủng S.aureus là 2 − 16 àg/mL và chủng MRSA là 2 − 32 àg/mL [86] Gabriela (2022) và cộng sự đó phõn lập hợp chất flavonoid (kuwanon E, kuwanon U, kuwanon T, kuwanon C và morusin) trong cao chiết rễ dõu tằm và cho kết quả thử nghiệm MIC đối với chủng MRSA từ 2 − 8 àg/mL [87] Hợp chất phenolic có khả năng thấm vào màng tế bào và phá vỡ màng Ngoài ra hợp chất phenolic còn là tác nhân ức chế bơm efflux, là một loại protein xuyên màng giúp vi khuẩn trục xuất những độc tố ra khỏi chúng

Nghiên cứu của Matasyoh và cộng sự (2007) đã đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của tinh dầu hương nhu trắng đối với chủng vi khuẩn S aureus và P aeruginosa Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng ở nồng độ tối ưu, tinh dầu hương nhu trắng có khả năng ức chế sự phát triển của cả hai loại vi khuẩn này, cho thấy tiềm năng trong việc ứng dụng trong các sản phẩm kháng khuẩn trong tương lai.

Kết quả kháng khuẩn và làm lành vết thương của màng BC tẩm dược liệu

Việc so sánh khả năng kháng khuẩn khi tẩm cao chiết rễ dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng khi tẩm lên màng BC giúp củng cố thêm kết quả kháng khuẩn từ thử nghiệm trước của 2 loại dược liệu Từ đó, lựa chọn cao chiết rễ dâu tằm tẩm lên màng BC trong thử nghiệm làm lành vết thương in vivo

3.3.1 Kết quả kháng khuẩn của màng BC tẩm cao chiết rễ dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng

Màng BC được ngâm trong những nồng độ khác nhau của cao chiết rễ dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng trong 12 giờ (hình 3.13) Nồng độ của cao chiết dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng tẩm lên màng BC là 25 mg/mL, 33.33 mg/mL, 50 mg/mL và 100 mg/mL

Màng BC tẩm cao chiết rễ dâu tằm Màng BC tẩm tinh dầu hương nhu trắng

Nghiên cứu đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của màng BC kết hợp cao chiết rễ dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng trên 4 chủng vi khuẩn phổ biến: S.aureus, MRSA, P.aeruginosa và S.epidermidis Kết quả được thể hiện trong hình 3.14, minh chứng cho hiệu quả kháng khuẩn mạnh mẽ của hỗn hợp màng BC và các thành phần từ thiên nhiên.

Hình 3 14 Hoạt tính kháng khuẩn của màng BC tẩm dược liệu đối với 4 chủng vi khuẩn

Hình 3.14 cho thấy màng BC tẩm cao dâu tằm có đường kính vòng ức chế đối với chủng

S.aureus, MRSA, S.epidermidis lớn hơn so với tẩm tinh dầu hương nhu trắng Màng BC tẩm cao chiết dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng không thể hiện khả năng ức chế đối với chủng P.aeruginosa Màng BC không tẩm dược liệu không có khả năng ức chế 4 chủng vi khuẩn trên thể hiện qua việc không tạo được vòng ức chế Đường kính của vòng ức chế được thể hiện cụ thể qua bảng 3.5

Bảng 3 5 Đường kính vòng ức chế của màng BC tẩm cao dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng (mm)

Chú thích: S.a: Staphylococcus aureus; MRSA: Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus; P.a: Pseudomonas aeruginosa; S.e: Staphylococcus epidermidis Đối với chủng S.aureus, màng BC tẩm cao dâu tằm tại nồng độ 100 mg/mL có đường kính kháng khuẩn (27.86 ± 0.27 mm) lớn hơn 3 mm so với màng BC tẩm tinh dầu hương nhu trắng (24.16 ± 0.18 mm) Phân tích ANOVA cho thấy hiệu quả kháng khuẩn khi tẩm cao dâu tằm mạnh hơn tẩm tinh dầu hương nhu trắng tại các nồng độ khảo sát là có ý nghĩa thống kê (p < 0.05) Kết quả trên phù hợp với thử nghiệm của cao dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng ở mục trước Đối với chủng MRSA, ở nồng độ 25 mg/mL đến 33.33 mg/mL thì màng BC tẩm cao dâu tằm cho đường kính ức chế lớn hơn so với màng tẩm tinh dầu hương nhu trắng Tuy nhiên ở nồng độ cao hơn thì cho kết quả ngược lại Tại nồng độ 50 mg/mL thì sự khác biệt khi tẩm 2 loại dược liệu này không có ý nghĩa thống kê, trong khi nồng độ 100 mg/mL thì có sự khác biệt thống kê Đối với chủng S.epidermidis, màng BC tẩm cao dâu tằm cho hiệu quả ức chế tốt hơn so với tẩm tinh dầu hương nhu trắng Ở nồng độ 25 mg/mL, đường kính vòng ức chế khi tẩm cao dâu tằm (20.25 ± 0.35 mm) lớn hơn so với tinh dầu hương nhu trắng (19.80 ± 0.14 mm) Tương tự ở nồng độ 33.33 mg/mL và 50 mg/mL, sự chênh lệch về đường kính ức chế không lớn Phân tích ANOVA cho thấy sự khác biệt của 2 dược liệu không có ý nghĩa thống kê tại những nồng độ này (p > 0.05) Tuy nhiên, ở nồng độ 100 mg/mL thì đường kính ức chế của màng BC tẩm cao dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê (p < 0.001) Qua đó cho thấy màng BC tẩm cao dâu tằm có hoạt tính kháng chủng S.epidermidis mạnh hơn tẩm tinh dầu hương nhu trắng

Xu hướng tổng hợp vật liệu cellulose vi khuẩn kết hợp với các chất kháng sinh, chất kháng khuẩn vô cơ, chất kháng khuẩn hữu cơ đang phát triển mạnh mẽ Do đó nhiều nghiên cứu đánh giá khả năng kháng khuẩn của vật liệu cellulose tổng hợp để làm tiêu chí lựa chọn trong điều trị vết thương Khalid (2017) và cộng sự đã tổng hợp nanocomposites BC-TiO2 để đánh giá khả năng kháng khuẩn và làm lành vết thương trên chuột Kết quả kháng khuẩn cho thấy vật liệu làm ức chế sự phát triển của chủng

Escherichia coli và S.aureus lần lượt là 81 ± 0.4% và 83% [94] Volova (2018) và cộng sự đã tổng hợp vật liệu BC nạp nano bạc để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Kết quả cho thấy tại nồng độ nano bạc 0.01 M, đường kính vòng ức chế đối với chủng S.aureus và P.aeruginosa là 15 ± 1.58 mm và 14 ± 2.11 mm Vật liệu cũng không gây độc trên tế bào NIH 3T3 của chuột [95]

Chiết xuất rễ dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng thể hiện khả năng kháng khuẩn mạnh hơn trên vi khuẩn Gram(+) so với Gram(-) Nguyên nhân là vi khuẩn Gram(-) có một lớp màng lipopolysaccharide (LPS) bên ngoài ngăn cản hoạt chất xâm nhập vào tế bào vi khuẩn Trong khi đó, vi khuẩn Gram(+) không có lớp màng ngoài này Điều này lý giải tại sao chiết xuất rễ dâu tằm ức chế hiệu quả đối với các chủng Gram(+) như S.aureus, MRSA và S.epidermidis, nhưng không có tác dụng ức chế đối với chủng Gram(-) P.aeruginosa.

3.3.2 Hiệu quả làm lành vết thương của màng BC tẩm cao chiết rễ dâu tằm

Sau khi so sánh khả năng làm lành vết thương trên chuột của cao chiết rễ dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng, kết quả cho thấy cao chiết rễ dâu tằm có khả năng làm lành vết thương tốt hơn Do đó cao chiết rễ dâu tằm được chọn để tiến hành tẩm lên màng

Kết quả cho thấy sau khi tiến hành tạo vết thương và xử lý màng BC tẩm cao chiết rễ dâu tằm với nồng độ 25 mg/mL và 50 mg/mL trên chuột, vết thương trên chuột có sự thay đổi theo thời gian được thể hiện trên hình 3.15 và hình 3.16.

Hình 3 15 Sự thay đổi vết thương trên chuột khi điều trị bằng màng BC tẩm cao chiết dâu tằm

Thông qua hình 3.15, nhận thấy vết thương ở lô chuột được điều trị bằng màng BC lành nhanh hơn so với lô chứng âm Độ lành vết thương ở các lô chuột được thể hiện thông qua đồ thị hình 3.16

Hình 3 16 Đồ thị độ lành vết thương của màng BC tẩm cao dâu tằm (%)

Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng âm (* = p < 0.05, *** = p < 0.001)

Dựa vào đồ thị, có thể thấy màng BC tẩm cao dâu tằm ở nồng độ 50 mg/mL cho khả năng lành vết thương nhanh nhất, tiếp theo là màng BC tẩm EtOH:Glycerin và màng

BC tẩm cao dâu tằm nồng độ 25 mg/mL Độ co vết thương có sự khác biệt giữa các lô từ ngày thứ 7 trở đi, cụ thể chuột đắp màng BC tẩm cao ở nồng độ 50 mg/mL cho độ co vết thương là 39.40 ± 7.62%, cao hơn 53.19% so với lô bệnh (25.72 ± 4.94%) Sự khác biệt trong điều trị bằng màng BC tẩm cao dâu tằm nồng độ 50 mg/mL và lô chứng âm có ý nghĩa thống kê, cụ thể, so sánh 2 lô này ở ngày 7 và 10 cho p < 0.05, ở ngày 13 và

16 cho p < 0.001 Ở ngày 16, độ lành vết thương ở lô màng BC tẩm cao dâu tằm nồng độ 50 mg/mL là 98.10 ± 2.44%, cao hơn 26.61% so với lô chứng âm (77.48 ± 4.08%)

Khả năng làm lành vết thương của vật liệu cải tiến có nguồn gốc cellulose vi khuẩn được phát triển và thực hiện ở nhiều nghiên cứu Năm 2020, Qui và cộng sự đã đánh giá khả năng làm lành vết thương trên chuột thông qua vật liệu composite nguồn gốc từ màng

Nghiên cứu trên chuột cho thấy màng composite làm từ vật liệu BC giúp lành vết thương nhanh hơn đáng kể (92,4% sau 10 ngày) so với băng gạc nano bạc (81,3%) Ưu điểm của màng composite là giữ ẩm cho vết thương nhờ khả năng hút nước, giúp thay màng dễ dàng mà không làm tổn thương vết thương Năm 2021, Wahid và cộng sự đã chứng minh sự kết hợp của BC, ε-polylysine và polydopamine cũng thúc đẩy quá trình lành vết thương trên chuột.

14 ngày điều trị, cao hơn đáng kể so với chuột ở lô chứng âm (70%) [98]