Tạo và ứng dụng màng cellulose vi khuẩn tầm cao chiết dược liệu trong điều trị vết thương

Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị

Tinh dầu hương nhu trắng: sản phẩm do phòng thí nghiệm Hóa dược 401B2, Đại học Bách Khoa Tp.HCM cung cấp. Thành phần 100% tinh dầu được chiết xuất từ lá hương nhu trắng bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. Nước dừa vừa lấy ra khỏi trái được dùng để pha môi trường Hestrin – Schramm nuôi cấy vi khuẩn A.xylinum.

Nội dung nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu

Cơ sở phương pháp: Phương pháp định lượng protein của Bradford dựa trên liên kết giữa dạng anion của thuốc nhuộm Coomassie blue G250 với gốc arginyl của protein (nhưng không liên kết được với amino acid tự do) và được xác định bằng mật độ quang ở bước sóng 595 nm. Sau khi đã tính được I% ức chế, ta tiến hành xác định giá trị IC50 để đánh giá khả năng kháng viêm của mẫu thử cao dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng so với chứng dương Dexamethasone. Chất kháng khuẩn là những chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc từ vi khuẩn có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi khuẩn xác định.

Nguyên tắc: Phương pháp khuếch tán trên thạch được phát triển từ năm 1940 là phương pháp chính thức được sử dụng nhiều để thử nghiệm tính nhạy cảm kháng khuẩn với mục đích là xác định vòng ức chế [66]. Lấy miếng màng BC kích thước 1.5 x 1.5 cm tẩm tinh dầu/cao chiết lên mặt bản thạch, nồng độ của mẫu thử được chuẩn bị như bảng 2.4, dùng kẹp vô trùng ép sát màng vào bề mặt thạch. Màng có khả năng kháng khuẩn khi vùng thạch được phủ màng BC và vùng thạch xung quanh màng không có sự tăng sinh của vi khuẩn và có thể quan sát bằng mắt thường.

Sau khi có kết quả thử nghiệm đánh giá hiệu quả làm lành vết thương giữa cao chiết dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng, kết hợp với những thử nghiệm kháng viêm và kháng khuẩn, mẫu thử nào có hoạt tính mạnh hơn sẽ được chọn để tẩm lên màng BC tiếp tục thử nghiệm trên chuột. Nghiên cứu lựa chọn nồng độ cao chiết rễ dâu tằm để tẩm lên màng BC trong thử nghiệm in vivo là 25 mg/mL và 50 mg/mL vì ở thử nghiệm kháng khuẩn thì hiệu quả kháng khuẩn của cao dâu tằm khi ở nồng độ 50 mg/mL và 100 mg/mL chênh lệch không lớn.

Thu hoạch màng và đánh giá tính chất của màng BC tinh chế

Thông qua quá trình hô hấp tế bào, A.xylinum có khả năng chuyển đổi carbohydrate thành acetic acid và gluconic acid, làm giảm pH của môi trường lên men, đồng thời tổng hợp sợi cellulose tiết ra môi trường [67]. Màng BC được làm sạch với nước bởi vì màng có cấu trúc mạng 3 chiều, được hình thành bởi những đơn vị glucan đan xen lên nhau và ổn định bằng liên kết hydro nội phân tử [68]. Sau khi trải qua quá trình tinh chế, để đánh giá hiệu quả của toàn bộ quá trình tạo màng cũng như làm sạch màng thì màng cần được kiểm tra để xem chất lượng màng có phù hợp tiêu chí làm màng điều trị vết thương hay không.

Dựa vào màu sắc của phản ứng, cho thấy không xảy ra hiện tượng kết tủa ở ống nghiệm chứa màng BC tinh chế, trong khi ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy cho kết tủa nâu đỏ. Khả năng giữ ẩm của vật liệu giúp đẩy nhanh quá trình chữa lành vết thương và bảo vệ vết thương khỏi bị nhiễm bẩn, cũng như tạo điều kiện cho sự thâm nhập của hoạt chất vào vết thương và cho phép một cách dễ dàng và không gây đau khi thay băng, cũng như không làm tổn thương vùng da mới hình thành [71]. Kết quả trên cũng tương đồng với nghiên cứu của Lin và cộng sự khi nhận thấy khối lượng nước màng BC hút gấp từ 100% tới 200% khối lượng khô của nó [72].

Màng BC sau khi sấy bằng nhiệt sẽ không còn khả năng hút nước tốt như màng ban đầu, có thể là do quá trình sấy đã khiến sợi cellulose trong màng bị dính lại, dẫn đến các phân tử nước khó chui vào để liên kết. Kích thước trên cũng tương đồng với đường kính sợi cellulose (38.6 – 57.2 nm) do Illa và cộng sự nghiên cứu tạo màng trong môi trường Herman − Schermann [77].

Hoạt tính sinh học của cao chiết rễ dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng

Năm 2014, Eo và cộng sự đã tiến hành xác định khả năng kháng viêm của cao chiết rễ dâu tằm thông qua thử nghiệm ức chế sản sinh NO trên tế bào RAW264.7 của chuột, ông đưa ra kết luận cao chiết rễ dõu tằm cho khả năng ức chế sản sinh NO ở nồng độ 5 àg/mL. Hoạt tính kháng viêm của cao rễ dâu tằm thấp hơn so với tinh dầu hương nhu trắng, tuy nhiên giá trị IC50 chênh lệch không đáng kể, do đó cần tiếp tục thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của 2 loại dược liệu này. Nhóm tác giả nhận thấy các hợp chất phenolic chiếm hàm lượng lớn trong cao chiết rễ dâu tằm như: gallic acid, pyrocatechol, (-)-epicatechin, caffeic acid, p-coumaric acid, moracin M, kuwanon G,… Giỏ trị MIC của cỏc hợp chất này với chủng S.aureus là 2 − 16 àg/mL và chủng MRSA là 2 − 32 àg/mL [86].

Gabriela (2022) và cộng sự đó phõn lập hợp chất flavonoid (kuwanon E, kuwanon U, kuwanon T, kuwanon C và morusin) trong cao chiết rễ dõu tằm và cho kết quả thử nghiệm MIC đối với chủng MRSA từ 2 − 8 àg/mL [87]. Khả năng kỵ nước của tinh dầu giúp nó dễ dàng xâm nhập vào màng tế bào vi khuẩn Gram (+), làm tăng tính thấm của tế bào và làm rò rỉ các thành phần tế bào, gây độc và mất cân bằng pH trong tế bào vi khuẩn [89, 90]. Sau khi tiến hành thử nghiệm kháng viêm và kháng khuẩn của cao dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng cho kết quả cao chiết dâu tằm cho hoạt tính kháng khuẩn tốt hơn, nhưng hoạt tính kháng viêm lại thấp hơn tinh dầu hương nhu trắng.

Rễ và lá dâu tằm chứa nhiều hợp chất flavonoid (prenylated flavonoid, chalcone, anthocyanin, kuwanon C và kuwanon T,.) cũng như những hợp chất chuyển hóa thứ cấp khác như: terpenoid, alkaloid, phenolic acid, stilbenoid và coumarin. Cao dâu tằm thể hiện khả năng kháng khuẩn mạnh hơn tinh dầu hương nhu trắng đối với 3 chủng Gram (+) là S.aureus, MRSA, S.epidermidis, trong khi chủng Gram (-) P.aeruginosa không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn.

Kết quả kháng khuẩn và làm lành vết thương của màng BC tẩm dược liệu

Điều này có thể giải thích khả năng làm lành vết thương nhanh của cao dâu tằm tốt hơn tinh dầu hương nhu trắng là do khả năng kháng khuẩn đối với chủng Gram (+) mạnh hơn. Màng BC tẩm cao chiết rễ dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng Để đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của màng BC kết hợp với cao chiết dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng, nghiên cứu tiến hành trên 4 chủng vi khuẩn lúc trước, đó là: S.aureus, MRSA, P.aeruginosa, S.epidermidis. Cao chiết rễ dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng có khả năng kháng trên chủng vi khuẩn Gram (+) mạnh hơn Gram (-) bởi vì vi khuẩn Gram (-) có có một lớp màng LPS (lipopolysaccharide) bên ngoài ngăn chặn sự xâm nhập của hoạt chất vào tế bào vi khuẩn, trong khi vi khuẩn Gram (+) thì không có lớp màng ngoài này [96], điều này có thể giải thích cho hiệu quả ức chế đối với 3 chủng Gram (+) là S.aureus, MRSA và S.epidermidis của cao chiết rễ dõu tằm khỏ rừ rệt, trong khi chủng Gram (-) P.aeruginosa không có hiệu quả ức chế.

Hiệu quả làm lành vết thương của màng BC tẩm cao chiết rễ dâu tằm Sau khi so sánh khả năng làm lành vết thương trên chuột của cao chiết rễ dâu tằm và tinh dầu hương nhu trắng, kết quả cho thấy cao chiết rễ dâu tằm có khả năng làm lành vết thương tốt hơn. Dựa vào đồ thị, có thể thấy màng BC tẩm cao dâu tằm ở nồng độ 50 mg/mL cho khả năng lành vết thương nhanh nhất, tiếp theo là màng BC tẩm EtOH:Glycerin và màng BC tẩm cao dâu tằm nồng độ 25 mg/mL. Kết quả cho thấy độ lành vết thương cao nhất khi chuột được điều trị bằng vật liệu này, cụ thể độ lành vết thương trên chuột sau 10 ngày là 92.4%, cao hơn so với điều trị bằng gạc nano bạc (81.3%).

So với băng gạc thông thường khi thay băng sẽ làm trầy da do gạc khô dính vào vết thương, khi điều trị bằng màng composite thì vết thương luôn ẩm do khả năng hút nước của màng, do đó dễ dàng thay màng mà không ảnh hưởng đến vết thương [97]. Do đó, khi tẩm màng BC kết hợp với dược liệu lên vết thương sẽ giúp giải phóng từ từ những hợp chất trong màng, tăng cường khả năng tiếp xúc của vết thương với chất điều trị.