Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Ngơ Thị Hải Yến XÂY DỰNG MƠ HÌNH THIẾU OXY-TÁI CUNG CẤP OXY IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO CƠ TIM H9C2 CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỰ NHIÊN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2023 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Ngơ Thị Hải Yến XÂY DỰNG MƠ HÌNH THIẾU OXY-TÁI CUNG CẤP OXY IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO CƠ TIM H9C2 CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỰ NHIÊN Chuyên ngành: Sinh lý người động vật Mã số: 9420101.04 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Vũ Thị Thu Hà Nội – 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn PGS.TS Vũ Thị Thu Các kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Các nội dung lại chưa công bố công khai Hà Nội, ngày………tháng ……… năm 2023 Nghiên cứu sinh Ngô Thị Hải Yến LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Vũ Thị Thu, cô trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực đề tài luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy cô Bộ môn Sinh lý học sinh học người, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN truyền đạt kiến thức tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN giúp đỡ thực thủ tục cần thiết suốt q trình học tập Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thành viên Phịng Ni cấy tế bào động vật, Phòng Sinh học Phân tử tế bào, Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống; Phịng thí nghiệm thuộc Bộ mơn Sinh lý học sinh học người, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN tạo môi trường học tập tốt cung cấp phương tiện để tơi thực đề tài Tôi xin cảm ơn GS Han Jin GS Kim Hyoung Kyu, Trường Đại học Inje, Hàn Quốc tặng nguồn tế bào H9C2; PGS TS Nguyễn Hữu Tùng, Trường Đại học Phenikaa; TS Nguyễn Hà Ly, Viện Dược liệu Việt Nam cung cấp hoạt chất sử dụng nghiên cứu luận án Tơi xin cảm ơn Ths Đồn Thị Dậu, Bệnh viện Nhi Trung ương; Ths Nguyễn Thị Thúy Hằng, Chi cục ATVSTP Nam Định; Học viên cao học Dương Ngọc Thành, Trường Đại học Phenikaa thành viên nhóm nghiên cứu hỡ trợ tơi q trình thực đề tài luận án Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh-KTNN, Ban Giám hiệu Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Tập thể cán Bộ môn Động vật tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập thực luận án Luận án thực tài trợ kinh phí Đề tài Nafosted mã số 106-YS.06-2016.23 Đề tài cấp ĐHQGHN, mã số QG.22.03 Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè ln bên, động viên tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Nghiên cứu sinh Ngô Thị Hải Yến MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH…………………… ………… MỞ ĐẦU 14 CHƯƠNG TỔNG QUAN 18 1.1 BỆNH THIẾU MÁU CỤC BỘ CƠ TIM……………………………………………18 1.2 TÁI TƯỚI MÁU VÀ TỔN THƯƠNG TÁI TƯỚI MÁU 19 1.3 BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC, CHỨC NĂNG VÀ ĐỘNG HỌC CỦA TI THỂ TRONG TỔN THƯƠNG THIẾU MÁU CỤC BỘ- TÁI TƯỚI MÁU……………………………21 1.3.1 Rối loạn cấu trúc chức ti thể 21 1.3.2 Sự thay đổi động học ti thể 27 1.4 CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU TRONG TỔN THƯƠNG THIẾU MÁU CỤC BỘTÁI TƯỚI MÁU CƠ TIM 29 1.4.1 Con đường PGC-1α/SOD2 29 1.4.2 Con đường ROS/JNK 30 1.4.3 Con đường tín hiệu liên quan p53 31 1.5 MƠ HÌNH NGHIÊN CỨU THIẾU MÁU CỤC BỘ-TÁI TƯỚI MÁU CƠ TIM 32 1.5.1 Mơ hình thiếu máu cục bộ-tái tưới máu tim in vivo 32 1.5.2 Mơ hình thiếu máu cục bộ-tái tưới máu tim ex vivo 34 1.5.3 Mô hình thiếu máu cục bộ-tái tưới máu tim in vitro 34 1.6 TẾ BÀO CƠ TIM H9C2……………………………………………………………40 1.6.1 Nguồn gốc đặc điểm tế bào H9C2 40 1.6.2 Tình hình sử dụng tế bào H9C2 nghiên cứu bệnh tim 41 1.7 NGHIÊN CỨU HOẠT CHẤT CÓ TIỀM NĂNG BẢO VỆ TIM CHỐNG LẠI TỔN THƯƠNG THIẾU OXY-TÁI CUNG CẤP OXY………………………………………43 1.7.1 Naringin 44 1.7.2 Liquiritin 46 1.7.3 Sâm Ngọc Linh Majonoside R2 47 1.7.4 Sâm Vũ Diệp Araloside A Methyl Ester 49 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 51 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU………………………………………………………51 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ 51 2.2.1 Hóa chất 51 2.2.2 Dụng cụ, thiết bị 52 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………………………….53 2.3.1 Kế hoạch triển khai nghiên cứu 53 2.3.2 Chuẩn bị môi trường, hóa chất 54 2.3.3 Nuôi tế bào H9C2 54 2.3.4 Đánh giá ảnh hưởng DMSO lên khả sống tế bào 54 2.3.5 Gây mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy 55 2.3.6 Phân tích độc tính cao dược liệu, hợp chất tế bào H9C2 điều kiện bình thường 61 2.3.7 Thử tác dụng sản phẩm chiết từ dược liệu tế bào H9C2 giai đoạn tái cung cấp oxy 61 2.3.8 Phân tích tỉ lệ tế bào sống 62 2.3.9 Phân tích hàm lượng cardiolipin màng ti thể 62 2.3.10 Phân tích điện màng ti thể 63 2.3.11 Phân tích lượng gốc oxy phản ứng 63 2.3.13 Phân tích mức độ biểu hiện protein western blot 64 2.3.14 Chụp ảnh tế bào 65 2.3.15 Xác định tín hiệu huỳnh quang máy đếm tế bào theo dòng chảy 65 2.3.17 Phân tích số liệu 66 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 67 3.1 KẾT QUẢ THIẾT LẬP MƠ HÌNH THIẾU OXY-TÁI CUNG CẤP OXY.….… 67 3.1.1 Kết nuôi nồng độ DMSO phù hợp tế bào H9C2 67 3.1.1.1 Kết nuôi tế bào H9C2 67 3.1.1.2 Kết lựa chọn nồng độ DMSO phù hợp tế bào H9C2 68 3.1.2 Kết thiết lập mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy 69 3.1.2.1 Kết hồn thiện mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy sử dụng CoCl2 69 3.1.2.2 Kết thiết lập hồn thiện mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy sử dụng buồng hypoxia 71 3.1.2.3 Hiệu hoạt động mô hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy với đối chứng dương 77 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO H9C2 TRONG MƠ HÌNH THIẾU OXY-TÁI CUNG CẤP OXY………………………………………………… 84 3.2.1 Kết phân tích tác dụng bảo vệ Naringin mơ hình thiếu thiếu oxytái cung cấp oxy (mơ hình HR) 85 3.2.1.1 Tác dụng Naringin tỉ lệ sống tế bào điều kiện ni bình thường 85 3.2.1.2 Tác dụng Naringin tỉ lệ sống tế bào điều kiện bệnh lý 86 3.2.1.3 Tác dụng Naringin ti thể mơ hình HR 87 3.2.2 Kết phân tích tác dụng bảo vệ Liquiritin mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy (mơ hình HR) 92 3.2.2.1 Tác dụng Liquiritin tỉ lệ sống tế bào điều kiện ni bình thường 92 3.2.2.2 Tác dụng Liquiritin tỉ lệ sống tế bào điều kiện bệnh lý 93 3.2.2.3 Tác dụng Liquiritin ti thể mơ hình HR 94 3.2.3 Kết phân tích tác dụng bảo vệ cao Sâm Ngọc Linh Majonoside R2 mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy (mơ hình HR) 101 3.2.3.1 Tác dụng cao Sâm Ngọc Linh Majonoside R2 tỉ lệ sống tế bào điều kiện nuôi bình thường 101 3.2.3.2 Tác dụng cao Sâm Ngọc Linh Majonoside R2 tỉ lệ sống tế bào điều kiện bệnh lý 102 3.2.3.3 Tác dụng cao Sâm Ngọc Linh Majonoside R2 ti thể mơ hình HR 103 3.2.4 Kết phân tích tác dụng cao Sâm Vũ Diệp Araloside A Methyl Ester mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy (mơ hình HR-CoCl2) 113 3.2.4.1 Tác dụng cao Sâm Vũ Diệp Araloside A Methyl Ester tế bào H9C2 điều kiện nuôi bình thường 113 3.2.4.2 Tác dụng cao Sâm Vũ Diệp Araloside A Methyl Ester tỉ lệ sống tế bào điều kiện bệnh lý 114 3.2.4.3 Tác dụng cao Sâm Vũ Diệp Araloside A Methyl Ester ti thể mơ hình HR-CoCl2 116 CHƯƠNG BÀN LUẬN 122 4.1 MƠ HÌNH THIẾU OXY-TÁI CUNG CẤP OXY SỬ DỤNG TẾ BÀO H9C2… 122 4.1.1 Nồng độ DMSO phù hợp tế bào H9C2 122 4.1.2 Mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy thiết lập sử dụng tế bào H9C2 hoạt động hiệu 123 4.1.2.1 Mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy sử dụng CoCl2 124 4.1.2.2 Buồng thiếu oxy thiết kế đáp ứng tiêu chí đề đủ điều kiện để sử dụng nghiên cứu 125 4.1.2.3 Hiệu hoạt động mô hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy thiết lập với đối chứng dương 126 4.2 TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO H9C2 HƯỚNG ĐÍCH TI THỂ CỦA HOẠT CHẤT TRONG MƠ HÌNH THIẾU OXY-TÁI CUNG CẤP OXY IN VITRO…………… .128 4.2.1 Naringin có khả bảo vệ tế bào H9C2 mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy thơng qua việc bảo tồn cấu trúc chức ti thể 128 4.2.2 Liquiritin có khả bảo vệ tế bào H9C2 mơ hình HR thơng qua việc bảo tồn hàm lượng điện màng ti thể; ức chế stress oxy hóa tải ion Ca2+ ti thể 131 4.2.3 Cao Sâm Ngọc Linh Majonoside R2 có khả bảo vệ tế bào H9C2 thơng qua bảo tồn ti thể điều hịa mức biểu hiện protein tín hiệu 134 4.2.4 Cao Sâm Vũ Diệp Araloside A Methyl Ester bảo vệ tế bào H9C2 mô hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy gây CoCl2 140 4.2.5 Cao dược liệu hợp chất có tác dụng bảo vệ tế bào tim chống lại tổn thương HR hướng đích điều hòa ti thể 141 KẾT LUẬN 145 KIẾN NGHỊ 146 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ 147 TÀI LIỆU THAM KHẢO 148 PHỤ LỤC 167 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Viết đầy đủ tiếng Anh Giải nghĩa Tiếng việt AAME Araloside A Methyl Ester Saponin từ Sâm Vũ Diệp CAT Catalase Enzyme catalase Chloromethyl 2′,7′- Chất nhuộm huỳnh dichlorodihydrofluorescein diacetate quang H2O2 CL Cardiolipin Lipid màng ti thể DMSO Dimethyl sulfoxyde ETC Electron transport chain FBS Fetal bovine serum Huyết thai bê JNK c-Jun N-terminal kinase Protein kinase GSH-Px Glutathione peroxidase HR Hypoxia-reoxygenation HIF-1α Hypoxia-inducible factor 1-alpha LIQ Liquiritin MCU Mitochondrial calcium uniporter MR2 Majonoside R2 CM-H2DCFDA mPTP Chuỗi vận chuyển điện tử Enzyme glutathione peroxidase Thiếu oxy-tái cung cấp oxy Mitochondrial permeabiliti transition pore NAO Nonyl Acridine Orange Nar Naringin NEC NecroX-5 OXPHOS Oxidative Phosphorylation Yếu tố gây điều kiện thiếu oxy 1α Kênh vận chuyển ion Ca2+ đơn độc Lỗ màng ti thể Chất nhuộm cardiolipin Phosphoryl hóa oxy hóa PHỤ LỤC TÁC DỤNG CỦA LIQUIRITIN ĐỐI VỚI TẾ BÀO TRONG MÔ HÌNH BỆNH LÝ Bảng P5.1 Tỉ lệ tế bào sống điều kiện thường có Liquiritin Nhóm tế bào LIQ (µM) ĐC 12 24 60 120 240 600 1200 Lần 100 101.00 100.92 97.58 102.20 108.10 111.65 95.52 25.76 Tỉ lệ tế bào sống (% so với ĐC) Lần Lần Trung bình 100 100 100 98.87 100.49 100.12 101.29 108.87 103.69 103.08 101.81 100.82 111.09 106.90 106.73 103.43 107.17 106.23 103.29 99.40 104.78 98.71 89.46 94.56 29.36 23.57 26.23 p so với ĐC SD 1.12 4.49 2.88 4.45 2.47 6.26 4.70