BOY TE VIEN SOT RET KY SINH TRUNG VA CON TRUNG TRUNG UONG
XÁC ĐỊNH CƠ CẤU KÝ SINH TRUNG SOT RET TAI XÃ THANH, HUYỆN HƯỚNG HOÁ, TỈNH QUẢNG TRỊ
BẰNG KỸ THUẬT PCR
Cấp quản lý để tải: Cấp Viện
Đơn vị thực hiện: Tổ Sinh học Phân tử~ Khoa NGĐT SR
Chi tri dé tai: Bai Quang Phúc
Trang 2MỤC LỤC NOI DUNG Mục lục Các chữ viết tắt "Tóm tắt 1 Đặt vấn đề 2 Tổng quan
3.1 Nghiên cứu ở nước nưoài
2.2 Nghiên cứu trong nước
3 Phòng thí nghiệm, nguyên liệu và phương pháp 3.1 Phòng thí nghiệm và trang bi 3.2 Nguyên liệu 3.2.1 Hóa chất 3.2.2 Mẫu máu có KSTSR 3.3, Thời gian và địa diểm nghiên cứu 3.4 Phương pháp
Trang 3CÁC CHỮ VIẾT TẮT
PCR: Polymerase Chain Reaction - phản ứng chudi Polymerase Nested PCR: phan ting chuỗi Polymetase lồng
KSTSR: ký sinh trùng sốt rét
ADN: acid dezoxyribonucleic
ARN: acid ribonucleic
dNTPs: dezoxy nucleotide triphotphate
dATP: dezoxy adenosine triphotphate
dGTP: dezoxy guanosine triphotphate
dCTP: dezoxy cytosine triphotphate
TTP: dezoxy thymidine triphotphate
PBS: phosphate buffered saline
Tris: N-Tris (hydroxymethyl)
SDS: sodium dodecyl sulphate
EDTA: ethylenediamimetetraaetic acid
bp: base pair (cap bazo clia phân tử ADN)
Taq: Themophilus aquaticus
Taq Polymerase: enzyme Polymerase ciia Themophilus aquaticus
Trang 4
Chúng tôi đã áp dụng kỹ thuật phán ứng chuỗi polymerase lũng (Nesedi PCR) để khảo sát thành phân và cơ cấu 4 loài kệ sinh tràng sốt rét (KSTSR) trang người ở xã Thanh, huyện Hướng Hoá, tình Quảng Trị Các đôi mỗi được sử dụng là mỗi đặc hiệu đối với ting lodi: P falciparum, P.vivax, P.malatiae va Puovale Đoạn ADN khuôn đặc thù cho từng loài là gen ghỉ mã 18 đơn vị nhé ARN ribosome (18ssr-RNA), Két quá cho thấy cơ cấu KSE ở xã Thanh không phức tạp lắm, có sự tấn tại của 2 loài KSTSR trên người Trong đá nhiễm đơn
Pfalciparum chiém 65.8%, nhiém don P.vivax 16.424 Tỉ
loài KST 17.8% ệ nhiễm phối hợp 2
1 ĐẶT VẤN ĐỂ
Sốt rét là một bệnh nghiệm trọng, phổ biến ở Việt Nam Hàng chục triệu người vẫn sống Irons vùng sốt rét, tử vong đo sốt rét vấn là mối hiểm hoạ của
nhiều người, nhất là trẻ em Theo báo cá
11 thang dau nam 2002, toàn quốc có {70 5I8 bệnh nhân sốt rớt, 527 bệnh
nhân SRAT, 44 người tử vong do SR 42 114 KSTSR (trong đó 32 062 KST
P falciparum, 9 706 KST P.vhax, nhiễm phối hợp 346 trường hợp) Đặc biệt sơ kết công tác phòng chống sốt rết khủ vực miễn Trung và Tây Nguyên vẫn luôn là điểm nóng của bệnh sốt rết 0 SƠ kết
toàn quốc Cũng theo báo công tác phòng chống sốt rét 11 tháng đầu năm 2002, tỉnh Quảng Trị có 3 988 bệnh nhân sốt rét ( chiếm 2,3% tuàn quốc),
23 bệnh nhân SRAT( 4,4), tử vong do SR 1a 3(6,8%), KSTSR 1690 (4 toàn quốc), trong đó 1482 KST # fulciparum(87,7%), 204 KST P,vivax, phối hợp hai loài 4 Trong đó xã Thanh là xã trọng điểm về sốt rét, giáp với Lào, dân có sự
giao lưu qua lại mạnh mẽ vì vậy việc nghiên cứu cơ cấu KSTSR tại đây là việc làm cần thiết Trong công tác phòng chống sốt rét, việc xác định chính xác tác nhân gây bệnh trên người bệnh là môi khởi đâu quan trọng chờ việ để ra các biện pháp đúng giải quyết sau đó, nhất là các vùng có bệnh sốt rét lưu hành cao, lây nhiễm thường xuyên xây ra quanh năm giữa vật chủ (người) và vectơ (muỗi)
Trang 5
nhiễm c:
đều, nên khó phát hiện, phân biệt diy dé va chính xác thành phần, cơ cấu các
Jodi KSTSR trong máu bệnh nhân và muỗi truyền bệnh không đồng
lai KST trong bệnh nhân sốt rét tại thời điểm lấy máu, Có nhiều phương pháp xác định loài :
- Phát hiện KSTSR bảng kính hiến vi đã được áp dụng từ năm 1880 đến nay vẫn thục tế và đáng tìn cậy, Thuận lợi của phương pháp nầy là rẻ tiền, có
thể thực hiện được ở mọi diều kiện Hơn nữa việc đào tạo cán bộ để nhận biết
được KSTSR chỉ trong thời gian nuắn Những cán bộ soi kính lâu năm, nhiều kinh nghiệm có thể phát hiện KSTSR ở độ chính xác cao Một bất lợi nhỏ của kỹ thuật nay là khú phát hiện dược những trường hợp có mật độ nhiễm KST thấp hoặc nhiễm phối hợp hai hay nhiều loài, trong đó chỉ có một loài trội hẳn về số lượng Dù sao kỹ thuật soi kính hiển vi để khảo sát dịch tễ học KSTSR
`_ văn là phương pháp phù hợp nhất
- Kỹ thuật phát hiện kháng thể
ng như kháng nguyên KST trong người
và muỗi cũng đã được áp dụng thành công từ những năm 1950 |8, 19]
- Những năm gần đây, việc áp dụng các test chẩn đoán nhanh như ParaSight™-F test, ICT, Paracheck-P-.T, OptiMaI |L6J cũng được áp dụng rộng
rãi Tuy nhiền kỹ thuật còn hạn chế là độ nhạy chưa cao và vẫn có khả năng đương tính khi đã điều trị khôi bệnh
- Phương pháp có độ nhạy và chính xác cao hơn là kỹ thuật lai ADN của
KST với probe đánh dấu biotin {6 13] Kỹ thuật này phức tạp, tốn nhiều thời gian Hầu hốt các hóa chất phái nhập theo bộ sinh phẩm (kiO, vi vậy hiện nay it
được sử dụng,
- Áp dụng các kỹ thuật sinh học phản tữ đã đạt dến trình độ cao hiện nay là sử đụng kỹ thuật phản ứng chudi Polymerase (PCR - Polymerase Chain Reaction) | L5] Kỹ thuật có độ nhạy và chính xác cao có khả năng phát hiện được những trường hợp có mật độ nhiễm KST thấp (LKST/50ul máu)
Trang 6(18 small subunit ribosomal RNA - 18 ssr-RNA) Doan gen nay di duge xée định trình tự và đặc hiệu cho mỗi loài trong 4 Joai [10,11,21,22} Sut khde nhau về trình tự oligonucleotidc của 4 loài chu phép thiết kế những đôi mồi đặc hiệu loài phù hợp cho kỹ thuật PCR Sử dụng kỹ thuật được gọi là PCR lồng (Nested PCR) cho phép tăng độ nhạy lên hàng triệu lấn so với kỹ thuật PCR đơn (single PCR)
Vii
cân thiết, vì vậy chúng tôi tiên hành dé tai nay
áp dụng kỹ thuật mới trong nghiên cứu cho độ chính xác cao là rất
Mục tiêu của để tài là:
Xác dịnh thành phân, cơ cấu KST trong mắu bệnh nhân sối rét tại xã Thanh, Huyện Hướng hoá, tink Quang Tri
2 TỔNG QUAN
Có 4 loài Plasmodium kf sinh wen ngudi: falciparum P.vivax,
P.malariae Poovale
Chẩn đốn lồi KST từ trước tới nay chủ yếu sử dụng phương pháp soi kính hiển vì bằng cách phát hiện những hình thái đặc trưng
Theo GS Vil Thi Phan {4] cơ cấu và phân bố loài KSTSR trên thế giới như sau:
+ Khu vực châu Phí nhiệt đới: có đủ mặt 4 loài Pasmodiam, trong đó P.falciparum chiếm 70-80%,
+ Khu vực Trung Á gồm 3 loai: Pfeleiparum, Pvivax, P.malariae, wong đó
P falciparum la chi yeu
+ Khu vực Đông Á
- Bắc Trung Quốc: ray chiếm tới 96%, P falciparum: We va P.malariae: 1%
- Nam Trung Quốc: cơ cấu KST cũng tương tự như Bắc Trung Quốc
- Mianma: Pfulciparun: chiếm 52%, P.vivas, 38.5%, Pmalaride: 95%
Trang 7- Lao: KSTSR có 3 loài Pj/dcipdrum: 70-80%, P.vivax:
Pumalariae: 0.5-1%,
- Campuchia: có 2 loai Pfaleiparum: 88%, P.vivax: 12%
- Malaixia: P falelparum: 73%, Pavivax 24% Panalariag: We
= Indonexia: phat hi¢n duce ca 4 loai: Pfalciparum: 84%, P.vivax: 14%:
Pmalariae: 21% và đã phát hiện được 1 tường hợp P.ousle,
= Philippine: cùng có dủ 4 loài P/cipurem: B5%, Pha 14%:
P.malariae: 1% và P.ovale có nhưng h
- Ở Việt Nam, theo số liệu điều tra của những năm gần đây (1976 - 1978 và 1991 - 1994) có 3 loài Plasmodium: P,#ilcjparem ở vùng SR lưu hành nặng chiếm từ 70-80%, P.ubux chiếm từ 18-27% + Pamalariae chiếm từ 1-3%.,
3.1 Nghiên cứu ở nước ngoài:
âm 1985, nhà hóa học người Mỹ Kany Mullis đã phát minh kỹ thuật ĐPCR và được giải thudng Nobel nam 1993
- Năm 1988, kỹ thuật PCR hoàn thiện nhữ việc tách và tỉnh khiết được cnzym Polymerase chịu nhiệt từ vị khuẩn Themophilus aquaticus (Tag-Polymerase) [15) Từ đó, kỹ thuật PCR dược ứng dụng rộ học và nông nghiệp, khoa học hình sự [5,14] rãi trong y học, sình học, được ~ Nam 1991, các tá 3 Tirasophon, W., Ponglikitmongkol, M và cộng sự đã áp dụng kỹ thuật PCR để phát hiện loai Pfadeiparum ở Thái Lan [20]
- Năm 1992, Brova, E.C, Kain, K,C PipichknLLT sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện những trường hợp nhiém phoi hop Pfaleiparum va Pvivax ma kink hiển vỉ không phát hiện dược [9]
- Năm 1993, Snounou.G VirigakosoLS., Zhu.X.D,„ Thaithong, S., Brown, K.N sử dụng kỹ thuật Nested PCR để phân tích 25 mầu máu nhiễm KSTSR của tạm SR Borai (Thái Lan) cho kết quả 8/25 trường hợp nhiễm phối hợp 2 và 3
loai Plasmodium, tong đồ có một trường hợp nhiễm phối hợp 4 loài Plasmodium (18
+ Gin đây nhất của các tác giả F.Kawamou, Qiúu, M.UTeneia, that POR va k¥ thuat nhuden Acridine Orange (AQ) di
1.§/Tantular sử dụng
Trang 8phái hiện được ở Việt Nam 10 trường hợp nhiễm P.ovale, 48 trường hợp P.malariae Cũng theo thông báo này cho biết các nước láng giếng của Việt Nam như Thái Lan, Mianma Lào Índonexia đêu có P.ovale và P,nalariae ở
một tỉ lệ đáng kể [12]
3.2 Nghiên cứu (rong nước:
~ Năm 1995, Lẻ Đình Công, Lê Đức Đào và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật PCR với đôi môi đặc hiệu để xác định loài /ziejparum [1 |
- Năm 1996, Lê Đình Công Le Đức Đào và cộng sự đã áp đụng kỹ thuật Nestcd PCR để xác định 4 loài //4smediwm trên người ở tỉnh Khánh Hòa "Trong tổng số 198 trường hợp, có 9 trường hợp nhiễm P.ovale, tỉ lệ nhiễm phối hợp rất cao [2]
- Năm 1997-1999, Lê Đức Đào và cộng sự đã áp dụng k¥ thuat Nested
PCR để nghiên cứu cơ cấu KSTSR trong 3 ứnh Lâm Đông, Bình Phước va Dac
Lắc, Kết-quả cho thấy tại 3 tỉnh có sự tồn tại của 4 loài KSISR trên người
Trong đó P,/6lciparum chiếm 55,1
523%, P.ovale chiếm 2% [3] %, P.vivax chiếm 37,5%, Pmalariae chiếm
- Năm 2002 Bùi Quang Phúc, Lê Đức Đào, và cộng sự đã áp đụng kỹ thuật Nested PCR nghiên c và lưu hành cả 4 loài Ki cơ al
R uren ngudi P falciparum, P.vivax, Pamalariae về P.ovale Tỉ lệ nhiễm phối hợp 2 loài, 3 loài, 4 loài KST trong một bệnh nhân rất cao 15/210 ( KST P/alriparum với P.vivax chiếm phân lớn 65/115 (< 56,52%) 34,76%) Trong số bệnh nhân nhiễm phối hợp, tỉ lệ nhiễm 2 loài 3 PHÒNG THÍ NGHIỆM, NGUYẼ 3.1 Phòng thí nghiệm và trang bi: LIỆU VÀ PHƯƠNG PH
Phòng thí iệm được bố tr buồng riêng biệt - Buồng 1; Bảo quản và xử lý dụng cụ
- Buồng 2: Bảo quản và pha chế các chất tham gia phản ứng
Trang 9
- Budng 4: Pha cdc chat tham gia phdn dng PCR lén 1 vi PCR lén 2: Phan dng PCR được thực hiện trên máy luân nhiệt Eppendof 5330 (sản xuất tại Đức) và GenAmp* System 9700 - Buồng 5: Phân tích sản phẩm PCR: Phân tích sản phẩm trên hệ thống chụp ảnh và phân tích kỹ thuật số Œ12S 8000 Các buồng được trang bị dụng cụ đủ cho kỹ thuật PCR 3.2 Nguyên liệ 3.2.1 Hóa chất:
* Hóa chất dùng để tách tỉnh khiết ADN:
* Hóa chất ding cho phan img PCR: * Hoa chal ding cho dién di
*# Hóa chất dùng hiện màu:
3.2.2 Mẫu máu có KSTSR thu thập trén giấy thấm Whatman 3 MM
3.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu:
* Thời gian nghiên cứu: từ thang | đến tháng 12 năm 2003 * Địa điểm nghiên cứu ~_ Thực địa: xã Thanh, lu = Phang thí nghiệm: Viện sốt rút - KST-CTTƯ n Hướng Hoá, Tỉnh Quảng Trị 3.4, Phương pháp:
3.4.1 Phương pháp thu thập mẫu máu có KST:
Chúng tôi sử dụng phương pháp lấy máu trên đầu ngón tay, xác định KSTF
bằng kỹ thuật nhuộm giêm sa và Para-Check, Những bệnh nhân có KST được
lấy 304d-504H.máu nhỏ Ì ím Whatnan 3MM trước khi điều trí
Phương pháp thu thập mầu máu từ đầu ngón tay dễ dàng, không đòi hỏi nhiều dụng cụ phức tạp và cũng phù hợp với phương pháp phân tích PCR
giấy!
3.4.2 Phương pháp tách tỉnh khiết ADN:
"Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn 2 phương pháp tách, tỉnh khiết ADN: a- Phương pháp Kain KC Lamar vé cong sug (1995):
Trang 10- Thêm vào mdi tube Imt PBS pH 7,4 06 chia 0.5% saponin
-U anbiet do 372C trong thời gian 30 phút,
~ Ly tâm 12000vdng/ph x 10 phút, loại bỏ dịch nỗi - Rửa 3 lần, mỗi lần Iml dung dịch đệm PBS pH 7.4 - Thêm vào mỗi tube 150] 10% dang dich Chelex 100 ~ Đun sôi 8 phút - Ly tâm 12000vöng/ph x 10 phút, thủ địch nổi và bảo quản ở nhiệt độ -20%C b- Phương pháp tách bằng QIA-kit Các trường hợp khó ly giải hồng cầu được sử dụng phương pháp này 3.4.3, Phản ứng PCR:
Phan ding PCR dé nhan han gen djc higu cua Plasmodium goi 1a Nested 1 Hai môi Ptu5 x Plu6 sử dụng cho phản ứng Nested { ed uinh ny Oligonucleotide như bảng I: Bảng 1: Trình tự Oligonucleotide méi, Kiểu phản Ï Kỹ hiệu Ì - T Kích thước sia | ï Trình tự | Ì ứng đặc biệu | môi phdmPCR | Plasmodiuns VÌ G7 G100 HA AACiea [c8 gems Net! | pig | S71 AAA TIGTEGCAG ITA AKA có FAL |
P falciparum [FIN AAG TOGTTT GGG ANA ACC AAA TAI ATT
| Nest2 FAL2 F ACA TAN TGA ACTEAA FEA TOA CTA COO OTC |
: '
vm | FUGC HC TAG CTI AAT CES CATT AAC TG TAC" |
VIV2 | FACT TCC AAG UU AA AN AGA AAG TCUTIAY
Trang 11
Thành phần phản ứng trong tổng thể tích 20 jul nly sau: 3 T 1 10 x PCR buffer: (300 mM KCI, 100 mM uis - HCL, pH§.3, Ĩ 12,001 115 mM MgCl, L mg/ml gelatin) - dNTPs(20mM) — — - 2001 | Plus (125AM), Lou LPM6 (1250M) 10g Taq polymerase - —_ |1,0w1d đơn vũ Dịch chiết ADN — 3,001 HO - l 10/01 Điều kiện cho phan img Nested 1 1a:
Thước 12 98°C - 5 phiit (Tiên sử lý) Bước 2: SH -2 phút {Mỗi tiếp xúc)
Bước 3: 72% -2 phút - (Kéo dài mỗi Dước4: 94C~l phút - (Biểntính) Bước Š:- Lập lại từ hước 2 đến bước 4: 25 chu kỳ Bước G6: SSĐC -2 phút Bước 7: 72% - 8 phút Bước B:- Hạ nhiệt dộ 25C
Phản ứng PCR để nhân bản gen đặc hiệu cho từng loài ##ufcjpdrum,
PDax Panalaride, P.avale được gọi là Nested 2 Trình tự Oligonieleotide đặc
sted 2 ahu Nested từ sân phẩm Nested 1 Điều kiện phản ứng
cho từng loài như tnong bản;
1, chỉ khác ADN khuôn được lã
Trang 12P faiciparum P vivax 3 PAL Y oe FAL? Nest 2 ia Y1 ——~ W2 \ ñ Soe aa P ovale š 12 bp h — Ề o> 800 bp
Trang 133.4.4 Phương pháp phân tích kết qua:
Sản phẩm PCR dược phân tích bằng kỹ thuật điện đi agarose gel 2,0% có chứa ethidtum bromide 25ug/ml
Hình ảnh sản phẩm PCR trên agarosc gel 2,0% được xử lý bằng hệ thống chụp ảnh và phản tích kỹ thuật số GDS — 8000 véi phan mém Labworks
- Kích thước sản phẩm PCR dic higu P falciparum : 205 base pairs (bp)
- Kích thước sân phẩm PCR đã
hiệu P.vwax : 120 bọ
- Kích thước sản phẩm PC đặc higu Pamaluriae +144 bp - Kích thước sản phẩm PCR đặc hiệu /#⁄ovd/e —— :786 bp, Phương pháp xử lý sở liệu Số liệu được xử lý bản: Sốt rết, e chương tình thống kế y-sinh học tại Khoa NGĐT 4.KẾT QUÁ
“Tổng số mẫu thu thập từ xã Thanh huyện Hướng Hoá, tỉnh Quảng Trị là 152
mẫu Số mẫu phân tích bằng k¥ thuat Nested PCR là 152 Kết quả về thành
phần, cơ cấu và tỉ lệ nhiễm phối hợp KST như trong bằng 2
Bang 2: Thành phần và cơ cấu KST xã Thanh, huyện Hướng Hoá, tỉnh Quảng trị [fe ei Sane „ Nhiễm phối hop 2 Í Nhiễm phối oe I Nhiém don | hop 3,4 loai
Kết quả bảng 2, 3 cho thấy thành phản và cơ cấu KST của xã Thanh, huyện Tướng Hoá, nh Quảng Trị không đã dạng và phúc tạp, Có sự tồn tại và lưu hành 2 loài KSTSR trên người P/afcipuum P.eivax 'TÍ lệ nhiễm phối hợp 2 loài
Trang 14KST trong một bệnh nhân không cao 27/152 (x 178%) Nhiễm don Pfaleiparam 65.8%, nhiễm dun P.vivax Tà 16,4% Trong số các bệnh nhân có KSTSR thi sy cé mat cita Pfaleiparum rất cao 127/152 (83.6%), KSTSR ta xa Thanh i lếm phối hợp | I Nested POR(%) “Trên hình ảnh điện di sản phẩm PCR thấy rõ kích thước sản phẩm PCR đặc hiệu
Trang 15cu 3A
M
Hình 1: Hình ảnh diện di sản phẩm PCR những bệnh nhân nhiễm don Pf
Trang 16936 Hình 4 : Hình ảnh dién di sin phdm PCR beah nhan nhiém dom va phéi hợp
Hình 5: Iồnh ảnh diện đi sản phẩm 'CR những bệnh nhân nhiễm phối hợp 2 loài Nhiềm phối họp // + Zac M: MarkerpHR322/11e41TL
Thành phần loài KST SR xã Thanh huyện Hướng Hoá được biểu hiện trong bảng 4 Bang 4: Tý lệ thành phần loài KST xã Thanh, huyện Hướng Hoá [ | | Pm | Po Nested PCR(%)+ 71 Ì 29 0 0 { Giêm sa (%› 66.1 339 0 0
Qua bảng 4 cho thấy thành phản loài KSTSR ở xã Thanh có 2 loài Pfaiciparum, P.vivas, trong đó tỷ lệ P,/òcinarae chiếm phân lớn 7%, tỷ lệ P.vivar 29%
Trang 17OP falciparum HIP vivax
2 mẫu thú thập được tai
Quảng Trị có tỉ lệ nhiễm phối hợp 2 lồi khơng cao (17,80) Thành phần KST trong xã không đa dạ
Thanh, huyện Hướng Hoá, tính à phức tạp có 2 loài KSTSR trên người Tỉ lệ
Pfalciparum chiếm da số 7I%, Pavisax chiếm 29% chưa phát hiện được Pumalariae và P,ovule, So sánh với 4 tính đã khảo sát trước đây Lâm Đông, Bình Phước Đắc Lắc, Giá Lai tí lệ nhiễm phối hợp ở xã Thanh thấp hơn nhiều (
1748 % so với 54,76% - 34/6, 0< 001) Tỷ
(¢ P falciparum cao hon (7% so với 55,1%, p<(V01), điều này rất thuận lợi cho các thử nghiệm in vivo tại khu vực này
Trong số các mẫu thu thập được có 3 mẫu kết quả Paracheck (+),Giêm sa Am tính, nhưng PCR cho ka qua P/uleiparum, diéu nay ching tổ có KST nhưng đưới ngưỡng phát biện của kính hiển vi, chứng mình độ nhạy hơn hẳn cia PCR
Phát hiện các loài KST trong cùng mội mẫu máu thường khó đạt được
Trang 18Tuy nhiên kết quả của chúng tôi trong nghiên cứu này không có sự khác biệt
Tớn giữa 2 phương pháp (p>0.05), chúng tôi cần phân tích số lượng mẫu lớn hơn
nữa, và lấy mẫu ở nhiều dịa điểm hơn nữa để có được cơ cấu KST của tinh Quảng Trị cũng như của cả nước
Kỹ thuật PCR là kỹ thuật chính xác, đòi hỏi mức độ chuyên dụng cao Kết quả thu được đáng tin cay và phù hợp với các kết quả nghiên cứu tại các nước
khie [17, 18] dang sir dung
hỏi trang thiết bị hiện đại hoá chất đất tiền, Nhưng v
ÿ thuật tương tự Phân tích bằng kỹ thuật PCR đòi
Trang 196.1 Kết luận: Quá số liệu thụ dược bằng kỹ thuật Nostcd PCR chúng tôi có một số kết luận sau: 1
lành phán KSTSR irén ngudi G xa Thanh cé 2 loai: P falciparum 71%, P.vivas 29 %.Chua phat hiện duge P.malariae va P.ovate
2 Cơ cấi
phối hợp 2 loài 17,8%
6.2 Để xuất:
ấu KSTSR: Pfuciparuru chiếm 65,85%, P.vivax: 16,4% Tỷ lệ
Nghiên cứu cơ cấu KST trên điện rộng hơn nữa trên địa bàn tình Quảng
Trang 20TAT LIEU THAM KHAO
1 Lê Đình Công, Lẻ Đức Đạo, Nguyễn Duy Sỹ Ngó Việt Thành, Nguyễn Mai
(1995) Ap dung kỹ thuật phản ứng tổng hợp chuỗi
polymerase (PCR-Polymerase Chain Reaction) dé chan dodn ky sinh trùng sốt rót và các bệnh ký vinh trùng Hương, Nguyễn Văn Tuả rết P.ulciparum Thông tin phòng chẳng bệnh sối Số 3, 1904, tr: 19-24
2 Lê Đình Công, Lê Đức Đào, Bùi Quang Phúc, Nguyễn Văn Tuấn, Nguyễn Duy Sỹ, Lục Nguyễn Tuyên, Nguyễn Thanh Bình Nguyễn Thái Bình (1996) Chân đoán phân biệt 4 loài ký sinh trùng sốt rút trên người bằng kỹ thuật phẩn "hỏng tìn phòng chống bệnh sốt rết S64, 1996 Tr: 26-33 ting chudi Polymerase về các bệnh ký sinh rằng
3 Lê Đức Đào Nguyễn Văn Tuấn Bùi Quang Phúc(2001) Nghiên cứu cơ cấu Ký sinh trùng sốt rét tại 3 tỉnh Lâm Đồng, Bình Phước, Đắc Lắc bằng kỹ thuật PĐCR Kỹ yết công trình nghiên cứ khoa học 1996-2000, 195-200
4 Vũ Thị Phan (1996) (ích tẻ học bệnh sốt rét và phòng chống sốt rét ở Nam, Nba xuat ban y học
5 Babiker, H A et al (1995) Gene flow and cross-mating in Plasmodium falciparum in house-hols in Tanzania village Parasitology ILL, 433-442
6 Barkers, R.IHJ, (1990) DNA probe diagnosis of paras
Parasitol 70, 494 - 499
c infection Exp
7 Barker, R.HJ Banchonggaksorn, T., Courval J.M Suwonkerd, W.,
Rimwungtragoon, K and Winh, DỊ, (1992) A simple method to detect P fatciparum directly from blood samples using the polymerase chain reacton
Am J Trop Med Hye 46 416 - 426
Trang 21
3 Brown, A.E Kain, K.C Pipithkul J andWebster, H.K (1992)
Demonstration by the polymerase chain reaction of mixed P falciparum and
vivax infection undertected by conventional microscopy Frans R Sec Trop
Med Hyg 86, 609 - 612
10 McCutchan, T.F.„ Cru, V.F., Lai, A Gunderson, J,H„ Elwood, H.J., and Sogin, M.L, (1988) Primary sequence of two small ribosomal RNA genes from PJfatciparum Mol Biochem Parasitol 28, 63 - 68
11 Gorman, M., Mons B and Scaifi, J (1991) The complete sequence of a P matariae ss-RNA gene and its comparison to the other Plasmodials ssr-RNA
genes M Biochem, Purcstiol, 43, 281 - 288,
12, F.Kawamow, Q.Liu M.U.Ferreira, ES.Tantular How prevalent are Plasmodium ovale and Plasmodium matariae in East’ Asia? Parasitology
Today, vol 15, N° 10 1999,
13 Mikio Kimura, Hirofumi Miyake, Hye-Sook Kim, Manabu Tanabe, Meiji Arai, Shintaro Kawai, Akio Yamane and Yusuke Wataya(1995) Species- Specific PCR Detection of Malaria Parasites by Microtiter Plate Hybridization: Clinical study with Mularia patients Journal of Clinical Microbiology Sept, 2342 - 2346
14, Paul, R E L ct al (1996), Mating pattems in malaria parasite population of Papua New Guinea Seience 269 1709-1711
15, Saiki, R.K., Gelfand, DH Stoffel, S., Shart, S.J., Higuchi, R Hom, G1 Mbllis, K.B., and Erlish, H.A (1988) Primer directed enzymatic amplification of DNA with a thermos table DNA polymerase Science 239, 487 - 491
16 Shiff, C.J., Premji, Z., and Minjus, JN (1993) The rapid manual parasight” - F test A new diagnostic tool for P falciparum infection Trans, R Soc Trop Med Hyg 87, 646 - 644
17 Snounou, G Viriyakosol, S Jarra’ W Thai Thong,
(1993) [dentification of the four human malaria speci
„ and Brown, K.N
in fiel samples by the polymerase chain reaction of a high prevalence if mixed infection, Mol
Biochem Parasitol, $8, 283 - 292
Trang 2218 Snounou, G., Viriyakosol S Zhu, X.P Jarra, W., Pinheiro, L Rosario,
V.E.D., Thai Thong, $ and and Brown K.N (1993) High sensitivity of detection of Human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction Mol, Biochem, Parasitol 61 315 - 320
19 Taylor, D.W and Voller, A (1993) The development and validation of a simple antigen detection ELISA for P.fedciparum mataria Trans R Soc Trop Med Hyg 87,29 - 31
20 Tirasophon, W Ponylikitmongkol, ML, Wilairal, P., Hoonsaeng V., and
Panyim, S, (1981) A novel detection of a single P,falciparum in infection
blood Biochem Brophy Res Commun 173, 179 - T4
21 Waters, A.P and McCutchan, T.F (1989) Rapid sensitive diagnosis of
malaria based on ribosomal RNA Laneet 1343 - 1346,
22 Waters, AP and McCutchan, T.F (1989) Patial sequence of the axesually
expressed ssr-RNA gene of P.vivex Mol Biochem ParasHol, 61, 315 — 320