Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm a h5n1 trên tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm

BKHCN-BYT VVSDT T¦ BKHCN-BYT VVSDT T¦ BKHCN-BYT vvsdt t− Bé khoa häc c«ng nghƯ – Bé y tÕ ViƯn VƯ sinh Dịch tễ trung ơng Yersin, Hà Nội báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật đề tài nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm a/h5n1 tế bào thận khỉ tiên phát quy mô phòng thí nghiệm m số : ĐTĐL-2006/02G GS.TSKH.Nguyễn THU VÂN 6374 14/5/2007 Hà nội 2007 Bản quyền 2007 thuộc Công ty vắcxin sinh phẩm số 1,Viện VSDTTƯ Đơn xin chép toàn phần tài liệu phải gửi đến Giám đốc Công ty vắcxin sinh phẩm số trừ trờng hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu Bộ khoa häc c«ng nghƯ – Bé y tÕ ViƯn VƯ sinh Dịch tễ trung ơng Yersin, Hà Nội báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật đề tài nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm a/h5n1 tế bào thận khỉ tiên phát quy mô phòng thí nghiệm m số : ĐTĐL-2006/02G GS.TSKH.Nguyễn THU VÂN Hà nội 2007 Bản thảo viết xong tháng 3/2007 Tài liệu đợc chuẩn bị sở kết thực Đề tài cấp Nhà nớc, mà số ĐTĐL-2006/02G đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ nhà nớc ĐTĐL-2006/02G nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm a/h5n1 tế bào thận khỉ tiên phát quy mô phòng thí nghiệm Cố vấn khoa học : GS.TSKH.Hoàng Thủy Nguyên Chủ nhiệm đề tài : GS.TSKH Nguyễn Thu Vân Các cán tham gia TS.Nguyễn Tuyết Nga Thạc sỹ Đinh Thúy Vân KS.Trịnh Tuấn Việt CNSH.Nguyễn Kim Dung Thạc sỹ Đoàn Văn Lu TS.Đỗ Thủy Ngân Thạc sỹ Nguyễn Thu Hằng CNSH.Nguyễn Hoàng Mai Thạc sỹ Nguyễn Bích Thủy TS.Nguyễn Quế Anh TS.Lê Quỳnh Mai Thạc sỹ Nguyễn Lê Khánh Hằng Cơ quan thùc hiƯn : ViƯn VƯ sinh DÞch tƠ Trung ơng chữ viết tắt ADN Desoxyribonucleic acid (axít desoxyribonucleic) ARN Ribonucleic acid (axÝt ribonucleic) BSA Bovine Serum Albumin CCID 50 Cell Culture Infectious Dose 50 (LiỊu g©y nhiƠm 50% tÕ bµo) CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm kiểm soát bệnh tật dự phòng- Mỹ) CPE Cytopathic effect tác động gây hủyhoại tế bào dpi day post infection Ngày sau gây nhiễm E.coli Escherichia coli ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (thử nghiệm miễn dịch gắn enzym) EID50 Effective infectious dose 50 (Liều gây nhiễm hiệu 50%) ED50 Effective dose 50 (Liều gây miễn dịch 50%) FDA Food and Drug Administration (Cơ quan quản lý thực phẩm vµ thc) HA Hemagglutination assay Thư nghiƯm ng−ng kÕt hång cầu HAU HA unit Đơn vị HA HI Hemagglutination inhibition øc chÕ ng−ng kÕt hång cÇu IVPI Intravenous Pathogenicity Index Chỉ số độ lực tiêm tĩnh mạch kD kiloDalton mARN message ARN ARN th«ng tin MDCK Madin-Darby Canine Kidney MDHQ Miễn dịch huỳnh quang MEM Minimum Essential Medium Môi trờng cần thiết tối thiểu ml mililit àg mcg MSV Master seed virus (Chñng gèc gièng) M.tuberculosis Mycobacterium tuberculosis Trùc khuÈn Lao nm nanomet NMWL Nominal Molecular Weight Limit ( KÝch cỡ giới hạn trọng lợng phân tử ) OD Optical Density MËt ®é quang häc PBS Phosphat Buffer Saline pfu Plaque Forming Unit (Đơn vị tạo đám hoại tử) PMKc Primary Monkey Kidney cells QC Quality Control KiÓm tra chÊt l−ỵng RNP Ribonucleoprotein RT- PCR Reverse transcription- Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymeraza phiên mà ngợc) rpm round per minute (Vòng/phút) RV Realase Virus Virut giải phóng rg Reverse genetics Di truyền ngợc SIV Simian Immunodefficiency Virus Virut gây suy giảm miễn dịch khỉ SV40 Simian Virus 40 SFV Simian Foamy Virus Virut t¹o bät cđa khØ SDS-PAGE Sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (điện di gel polyacrylamid) SRID Single Radial Immuno Diffusion Khuyếch tán miễn dịch vòng tròn đơn SPF Specific Pathogen Free Không có yếu tố gây bệnh đặc biệt TCYTTG Tổ Chức Y Tế Thế Giới TB Tế bào VX Vắcxin VABIOTECH Công ty vắcxin vµ sinh phÈm sè WSV Working seed virus ( Chđng s¶n xt) WHO World Health Organization Tỉ chøc Y tế giới mục lục Đặt vấn đề Phần : tổng quan 1.1 Đặc điểm chung virót cóm 1.2.CÊu tróc virion 1.3 CÊu tróc hệ gen virút Cúm protein mà hóa 1.4 Sự tái tổ hợp virút Cúm 1.5 Sự phát triển virút tế bào 1.6 Sinh bệnh học 1.7 Chẩn đoán virút Cúm 10 1.8 Đặc điểm dịch tễ học 10 1.9 Kỹ thuật di truyền ngợc 13 1.10 Dự phòng 15 1.11 Một số quy trình sản xuất vắcxin Cúm 19 Phần 2: vật liệu phơng pháp 21 2.1 Vật liệu 21 2.1.1 Tế bào 21 2.1.2 Virút 21 2.1.3 Kháng nguyên chuÈn A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) 22 2.1.4 ADN plasmit 22 2.1.5 VËt liệu trang thiết bị khác 23 2.2 Phơng pháp 23 2.1 Phơng pháp tạo virut tái tổ hợp 23 2.2.2 Sản xuất chủng giống gôc chủng sản xuất vắcxin H5N1 23 2.2.3 Thử nghiệm kiểm tra độc lùc cđa WSV rgA/H5N1 24 2.2.4 Quy tr×nh lùa chän khỉ 24 2.2.5 Quy trình sản xuất vắc xin Cúm H5N1 quy mô phòng thí nghiệm 25 2.2.6 Phơng pháp định lợng HA vắcxin 27 2.2.7 Phơng pháp sản xuất kháng huyết khỉ kháng H5N1 sử dơng thư nghiƯm SRID 28 2.2.8 C¸c thư nghiƯm huyết học 28 2.2.9 Các thử nghiệm xác định hiƯu gi¸ virót 28 2.2.10 C¸c thư nghiƯm kiĨm tra chất lợng 29 2.2.11 Đánh giá nhân lên virút trình nuôi cấy 34 2.2.12 Đánh giá tính an toàn đáp ứng miễn dịch thử nghiệm tiền lâm sàng 34 2.2.13 Phơng pháp thích ứng chủng NIBRG-14 tế bào PMKc Vero 35 2.2.14 Phơng pháp thích ứng chủng rgA/H5N1 tế bào Vero 35 Phần 3: Kết 35 3.1 Thiết lập hệ chủng gốc chủng sản xuất vắc xin Cúm rgA/ H5N1 với đầy đủ tiêu kỹ thuật theo quy định 36 3.2 Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắc xin Cúm rgA/H5N1 tế bào PMKc 43 3.3 Kết sản xuất thử nghiệm vắc xin Cúm quy mô phòng thí nghiệm 48 3.4 Kiểm tra chất lợng đánh giá đáp ứng miễn dịch vắcxin Cúm rgA/H5N1 động vật thực nghiệm 50 3.5 Kết nghiên cứu thích ứng chủng NIBRG-14 dòng tế bào PMKc, Vero rgA/H5N1 Vero 59 3.6 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho vắcxin cúm A/H5N1 mặt 64 Kết luận 70 Kiến nghị 72 Tài liệu tham khảo 73 Danh mục bảng báo cáo Bảng Tên bảng Trang Bảng Các đoạn ARN hệ gen virút Cúm A protein mà hóa Bảng Các vắcxin Cúm đà đợc đăng ký sử dụng giới 16 Bảng Hiệu giá virút rg 15T qua lần cấy trun 37 B¶ng KÕt qu¶ thư nghiƯm kiĨm tra độc tính chủng virút A/VN/1203,PR8 rgA/H5N1 chồn sơng 39 Bảng Kết phân tích tính kháng nguyên phơng pháp HI chủng vắcxin chủng bố mẹ 39 Bảng Kết so sánh chủng rgA/H5N1 với chủng NIBRG -14 (WHO) 40 Bảng Các phơng pháp kiểm tra khỉ 44 Bảng Quy trình kiểm tra khỉ 45 Bảng Kết nghiên cứu xác định quy trình gây nhiễm 45 Bảng 10 Kết nghiên cứu xác định hàm lợng nhôm hấp phụ tối u 48 Bảng 11 Kết kiểm tra trình sản xuất 49 Bảng 12 Kết hiệu giá kháng thể HI khỉ sau tiêm 50 Bảng 13 Tơng quan nồng độ huyết khỉ hàm lợng HA vắcxin Cúm thử nghiệm SRID 51 Bảng 14 Hàm lợng HA loạt vắcxin đợc định lợng theo phơng pháp SRID 52 Bảng 15 Kết thử nghiệm kiĨm tra vỊ mỈt sinh häc 53 33 Wilson I.A., Skehel J.J., Wiley D.C Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at resolution Nature, 1981, 289, 366–373 34 Skehel J.J., Wiley D.C Receptor binding and membrane fusion in virus entry: The influenza haemagglutinin Annu Rev Biochem 2000, 69, 531–569 35 McGeoch D., Fellner P., Newton C Influenza virus genome consists of eight distinct RNA species Proc Natl.Acad Sci USA , 1976, 73, 3045–3049 36 Ito T., Couceiro J.N.S.S., Kelm S., et al Molecular basis for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential J Virol., 1998, 72, 7367– 7373 37 Klenk H.D., Rott R., Orlich M., Blodorn J Activation of influenza A viruses by trypsin treatment Virology, 1975, 68, 426–439 38 Lazarowitz S.G., Choppin P.W Enhancement of the infectivity of influenza A and B viruses by proteolytic cleavage of the haemagglutinin polypeptide Virology, 1975, 68, 440–454 39 Stieneke-Grober A., Vey M., Angliker H., et al Influenza virus haemagglutinin with multibasic cleavage site is activated by furin, a subtilisin-like endoprotease EMBO J., 1992, 11, 2407–2414 40 Klenk H.D., Garten W Host cell proteases controlling virus pathogenicity Trends Microbiol., 1994, 2, 39–43 41 Klenk H.D., Garten W Host cell proteases controlling virus pathogenicity Trends Microbiol., 1994, 2, 39–43 42 Bosch F., Orlich M., Klenk H.D., Rott R The structure of the haemagglutinin, a determinant for the pathogenicity of influenza viruses Virology, 1979, 95, 197– 207 43 Kawaoka Y., Webster R.G Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus haemagglutinin expressed in mammalian cells Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85, 324–328 44 Klenk H.D., Garten W Host cell proteases controlling virus pathogenicity Trends Microbiol., 1994, 2, 39–43 45 Steinhauer D.A Role of haemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus Virology, 1999, 258, 1–20 46 Kawaoka Y., Naeve C.W., Webster R.G Is virulence of H5N2 influenza viruses in chickens associated with loss of carbohydrate from the haemagglutinin Virology, 1984, 139, 303–316 47 Kawaoka Y., Webster R.G Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus haemagglutinin expressed in mammalian cells Proc Natl Acad Sci.USA , 1988, 85, 324–328 48 Choppin P.W Replication of influenza virus in a continuous cell line: High yield of infective virus from cells inoculated at high multiplicity Virology, 1969, 39, 130–134 76 49 Schulman J.L., Palese P Virulence factors of influenza A viruses: WSN virus neuraminidase required for plaque production in MDBK cells J Virol., 1977, 24, 170–176 50 Allen H., McCauley J., Waterfield M., Gething M.J Influenza virus RNA segment has the coding capacity for two polypeptides Virology, 1980, 107, 548–551 51 Lamb R.A, Lai C.J Conservation of the influenza virus membrane protein (M1) amino acid sequence and an open reading frame of RNA segment encoding a second protein (M2) in H1N1 and H3N2 strains Virology, 1981, 112, 746–751 52 Winter G., Fields S Cloning of influenza cDNA into M13: The sequence of the RNA segment encoding the A/PR/8/34 matrix protein Nucleic Acids Res, 1980, 8, 1965–1974 53 Lamb R.A Genes and proteins of the influenza viruses In: Krug RM, ed The influenza viruses New York: Plenum, 1989, 1–87 54 Hay A.J., Wolstenholme A.J., Skehel J.J., Smith M.H The molecular basis of the specific anti-influenza action of amantadine EMBO J., 1985, 4, 3021–3024 55 Kilbourne E.D., ed Influenza 1987, Plenum Medical, New York 56 Yamashita M., Krystal M., Fitch W.M., Palese P Influenza B virus evolution: cocirculating lineages and comparison of evolutionary pattern with those of influenza A and C viruses Virology, 1988, 163, 112-122 57 Kanegae Y., Sugita S., Endo A et al Evolutionary pattern of the haemagglutinin gene of influenza B viruses isolated in Japan: Cocirculating lineages in the same epidemic season J Virol., 1990, 64, 2860-2865 58 Cox N.J., Bender C.A The molecular epidemiology of influenza viruses Sem Virol., 1995, 6,359-370 59 Webster R.G., Bean W.J., Gorman O.T., Chambers T.M., Kawaoka Y Evolution and ecology of influenza A viruses Microbio Rev., 1992, 56, 152-179 60 Kawaoka Y., Krauss S., Webster R.G Avian –to – human transmission of the PB1 gene of influenza A virus in the 1957 and 1968 pandemics J Virol., 1989,63, 4603-4608 61 Hinshaw V.S., Webster R.G., Easterday B.C., & Bean W.J Replication of avian influenza A viruses in mammals Infect Immun., 1981, 34, 354-361 62 Kida H., Ito T., Yasuda J et al Potential for transmission of avian influenza viruses to pigs J.Gen Virol., 1994, 75, 2183-2188 63 Gorman O.T., Bean W.J., Kawaoka Y., Donatelli I., Guo Y., Webster R.G Evolution of influenza virus nucleoprotein genes: implications for the origin of H1N1 human and classical swine viruses J.Virol., 1991, 65, 3704-3714 64 Scholtissek C., Schultz U., Ludwig S., & Fitch W.M The roel of swine in the origin of pandemic influenza In: Hannoon C., Kendal A.P., Klenk H.D., Ruben 77 F.L Options for the control of influenza II Excerpt Medica, Amsterdam, 1993, 193-201 65 Ludwig S., Stitz L., Planz O., Van H., Fitch W.M & Scholtissek C European swine virus as a possible source for the next influenza pandemic? Virology, 1995, 212, 555-561 66 Nerome K., Kanegae Y., Shortridge K.F., Sugita S., Ishida M Genetic analysis of porcine H3N2 viruses originating in southern China J Gen Virol., 1995, 76, 613-624 67 Katsuda K., Sato S., Shirahata T et al Antigenic and genetic characteristics of H1N1 human influenza virus isolated from pigs in Japan J.Gen Virol., 1995, 76, 1247-1249 68 Reina J., Baca V.F., Blanco I., and Munar M Comparison of Madin-Darby Canine Kidney Cells (MDCK) with a Green Monkey Continuous Cell line (Vero) and Human Lung embryonated cells (MRC-5) in the isolation of influenza A virus from Nasopharyngeal Aspirates by Shell Vial culture J Clin Micro., 1997, 35 (7), 1900-1901 69 Scholtissek C., Rohde W., Von Hoyningen V., Rott R On the origin of the human influenza virus subtypes H2N2 and H3N2 Virology, 1978, 87, 13-20 70 Webster R.G., Kawaoka Y., Taylor J Weinberg R., Paoletti E Efficacy of nucleoprotein and haemagglutinin antigens expressed in fowlpox virus as vaccine for influenza in chickens Vaccine, 1991, 9, 303-308 71 Matrosovich M., Zhou N., Kawaoka Y and Webster R The surface glycoprotein of H5 influenza viruses isolated from humans, chickens and wild aquatic birds have distinguishable properties J.Virol , 1999, 73, 1146-1155 72 Subbarao K., Klimov A., Katz J., Regnery H., Lim W., Hall H et al Characterization of an avian influenza A (H5N1) virus isolated from a child with a fatal respiratory illness Science, 1998, 279, 393-396 73 Peiris J.S., Yu W.C., Leung C.Y., Ng W.F., Nicholls J.M., et al Re-emergence of fatal human influenza A subtype H5N1 disease Lancet, 2004, 363,617-619 74 Lee C.W., Suarez D.L., Tumpey T.M., Sung H.W., Kwon Y.K., Lee Y.J et al Chracterization of highly pathogenic H5N1 avian influenza A virus isolated from South Korea.J Virol., 2005, 79, 3692-3702 75 Mahy B.W.J Mutants of influenza virus In: Palese P., & Kingsbury D.W (eds) Genetics of Influenza virus, 1993, Springer-Verlag, New York, 192-242 76 Luytjes W., Krystal M., Enami M., Pavin J D., and Palese P Amplification, expression and packaging of a foreign gene by influenza virus Cell 1989;58; 1107-1113 77 Neumann G., Zobel A., and Hobom,G RNA polymerase I-mediated expression of influenza viral RNA molecules Virology ;1994; 202; 477-479 78 78 Neumann G., Watanabe T., Ito H., Watanabe S., Goto H., Gao P., Hughes M., Perez D.R., Donis R., Hoffmann E., Hobom G., and Kawaoka Y Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs Proc Natl Acad Sci.; 1999;96;9345–9350 79 Liu M, Wood JM, Ellis T, Krauss S, Seiler P et al Preparation of standardized, efficacious agricultural H5N3 vaccine by reverse genetics Viroloy 2003;314;580590 80 Wood JM, Major D, Newman RW, Dunleavy U, Nicolson C, Robertson JS, Schild GC Preparation of vaccines against H5N1 influenza Vaccine 2002;20;S84-S87 81 Tian G, Zhang S, Li Y, Bu Z, Liu P, Zhou J, Li C, Shi J, Yu K, Chen H Protective efficacy in chickens, geese and ducks of an H5N1 –inactivated vaccine developed by reverse genetics Virology 2005;341;153-162 82 Nicolson C, Major D., Wood JM, Roberson JS generation of influenza vaccine viruses on Vero cells by reverse genetics : an H5N1 candidate vaccine strain produced under a quality system Vaccine 2005;23;2943-2952 83 WHO guidance on development of influenza vaccine reference viruses by reverse genetics WHO/CDS/CSR/GIP/2005.6 84 Ferko B., Egorov A., Romanova J et al Influenza virus as a vector for mucosal immunization In: Frontiers of RNA virus research, 1977, The Oji International Seminar in Natural Science, Kyoto, Japan, 18 85 Rodrigues M., Li S., Mutara K., Rodrigues D et al Influenza and vaccinia viruses expressing malaria CD8+ T and B cell epitopes J Immunol., 1994, 153, 46364638 86 Gilleland H.E., Gilleland L.B., Staczek J et al Chimeric influenza viruses incorporating epitopes of outer membrane protein F as a vaccine against pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa Behring Ins Mitt., 1977, 98, 291-301 87 Gorse G.J., Otto E.E., Powers D.C., Chambers G.W., Eickhoff C.S., Newman F.K Introduction of mucosal antibodies by live attenuated and inactivated influenza virus vaccines in the chronically ill elderly J Infect.Dis., 1996, 173, 285-290 88 Powers D.C., Murphy B.R., Fries L.F., Adler W.H., Clements M.L Reduced infectivity of cold-adapted influenza A H1N1 viruses in the elderly : correlation with serum and local antibodies J.Am.Geriatr.Soc., 1992, 40, 163-167 89 Shaw M.W., Arden N.H., Maassab H.F New aspects of influenza viruses Clin Microbiol.Rev., 1992, 5, 74-92 90 Danenberg H.D., Ben-Yehuda A., Zakay-Rones Z., Friedman G Dehydroepiandroesterone (DHEA) treatment reverses the impaired immune response of old mice to influenza vaccination and protects from influenza infection Vaccine, 1995, 13, 1445-1448 79 91 Ott G., Barchfel G.L., Van Nest G Enhancement of humoral response against human influenza vaccine with the simple submicron oil/water emulsion adjuvant MF59 Vaccine, 1995, 3, 1557-1562 92 Martin J.T Enhanced immunogenicity of Chiron Biocine adjuvanted influenza vaccine in the elderly In: Brown L.E., Hampson A.W., Webster R.G (eds) Options for the control of Influenza, Elsevier, Amsterdam, 1996, 3, 647-652 93 Ronco J New Influenza vaccines workshop 12, 1996, Symposium reports for the options for the control of influenza III meeting, Australia 94 Hayden F.G Combinations of antiviral agents for treatment of influenza virus infections J Antimicrobial Chemother, 1986, 18 (suppl B), 77-83 95 Appleyard G Amantadine-resistance as a genetic marker for influenza viruses J Gen.Virol., 1977, 36, 249-255 96 John J.T., James D.C., Kenneth M.Z., Thomas R., Mark W Safety and Immunogenicity of an Inactivated subvirion influenza A (H5N1) vaccine N.Engl.J.Med., 2006, 354 (13), 1343-1351 97 Jean-Louis B., Christian P., Odile L., Catherin G., Melanie S., John W., Katjia H., Maria C.Z Safety and immunogenicity of an inactivated split-virion influenza A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) vaccine: phase I randomized trial Lancet, 2006, 367, 1657-1664 80 Trích lợc điểm thuyết minh đề tài nghiên cứu B1-2-TMKHCN Thuyết minh đề tài nghiên cứu khoa học phát triển công nghệ1 I Thông tin chung đề tài Tên đề tài Mà số : ĐTĐL-2006/02G Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm A/H5N1 tế bào thận khỉ tiên phát qui mô phòng thí nghiệm Thêi gian thùc hiƯn: 12 th¸ng (Tõ th¸ng 01/2006 đến tháng 12/2006) Cấp quản lý Nhà nớc X Kinh phÝ: 3.400 triƯu ®ång, ®ã: Ngn Tỉng số (triệu đồng) - Từ Ngân sách nghiệp khoa häc 1.400 - Tõ ngn tù cã cđa c¬ quan 2.000 - Từ nguồn khác Không Thuộc Chơng trình (ghi rõ tên chơng trình, có) Thuộc Dự án KH&CN2 (ghi rõ tên dự án KH&CN, có) X Đề tài độc lập Lĩnh vực khoa học Tự nhiên; Kỹ thuật (Công nghiệp, XD, GT, ); Nông, lâm, ng nghiệp; X Y dợc Chủ nhiệm đề tài Họ tên: Nguyễn Thu Vân Năm sinh: 1952 Nam/Nữ: Nữ Học hàm: Giáo s Học vị: Tiến sĩ khoa học Chức danh khoa học: Giáo s Điện thoại: Năm đợc phong học hàm: 2002 Năm đạt học vị: 1995 Chức vụ: Giám đốc công ty Cơ quan: 8211500 Fax: 9717721 Nhà riêng: 6366735 Mobile: 0903457399 E-mail: thuvan@vabiotechvn.com Tên quan công tác: Công ty vắcxin sinh phẩm số 1, Viện Vệ Sinh Dịch Tễ TrungƯơng Số 1, Yersin, Hµ Néi Lý Th−êng KiƯt, Hµ Néi Địa quan: Địa nhà riêng: Cơ quan chủ trì đề tài Tên quan chủ trì đề tài: Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương Điện thoại: 8213241 Fax: 8210853 E-mail: nihe@hnn.vnn.vn Website: Địa chỉ: Số 1, phố Yersin, Hà Nội Họ tên thủ trởng quan: Nguyễn Trần Hiển Số tài khoản: Ngân hàng: Tên quan chủ quản đề tài: Bộ Y Tế II Nội dung Khoa học công nghệ đề tài 10 Mục tiêu đề tài (bám sát cụ thể hoá mục tiêu đặt hàng - có đặt hàng) Xây dựng đợc qui trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm rgH5N1 tế bào thận khỉ tiên phát qui mô phòng thí nghiệm Đánh giá tính an toàn đáp ứng miễn dịch vắcxin sản xuất đợc động vật thực nghiệm 13 Nội dung nghiên cứu ứng dụng triển khai thực nghiệm (Liệt kê mô tả nội dung nghiên cứu ứng dụng triển khai thực nghiệm cần tiến hành để đạt đợc mục tiêu đặt ra, đó, chØ râ nh÷ng néi dung míi, néi dung quan träng để tạo sản phẩm, công nghệ chủ yếu; hoạt động để chuyển giao kết nghiên cứu ®Õn ng−êi sư dơng; dù kiÕn nh÷ng néi dung cã tính rủi ro giải pháp khắc phục - có) - Sản xuất kiểm tra Chủng virút rgH5N1 gốc (Master Seed Virus) chủng sản xuất (WSV) (từ chủng tái tổ hợp đợc điều chế Phòng thí nghiệm GS Kawaoka, trờng ĐH Tổng hợp Tokyo) Chọn lựa khỉ đạt tiêu chuẩn để đa vào sản xuất theo tiêu chuẩn qui định TCYTTG dùng khỉ để sản xuất vắcxin (Phơng pháp huyết häc) (Recommendation for the production and Control of Poliomyelitis vaccine inactivated - - (WHO technical Report Series, No 910,2002) Kiểm tra tế bào thận khỉ tiên phát chai nuôi tế bào (theo thờng qui TCYTTG) virút ngoại lai: SV40, Herpes B, Foarming, hấp phụ hồng cầu, Tuberculosis ( virút ngoại lai bắt buộc phải kiểm tra để loại trừ khỏi tế bào thận khỉ tiên phát sử dụng để sản xuất vắcxin, yêu cầu bắt buộc TCYTTG) (Recommendation for the production and Control of Poliomyelitis vaccine inactivated (WHO technical Report Series, No 910,2002) Cấy chuyển nhiều đời tế bào thận khỉ tiên phát để có đợc chủng thích nghi, hiệu gía virút HA đủ cao để đa vào sản xuất đạt xuất cao Kiểm tra vô trùng, xác định hiệu giá virút, xác định hiệu giá HA, kiểm tra tính ổn định di truyền phơng pháp xác định trình tự, kiểm tra tính kháng nguyên, tính không gây bệnh chồn sơng gà Sản xuất lợng chủng gốc đủ cho sản xuất lâu dài (300 lọ) lợng chủng sản xuất từ chủng gốc đủ cho 1-2 năm sử dụng (300 lọ) Đóng lọ 1ml/lọ bảo quản -70oC Xây dựng qui trình sản xuất vacxin cúm rgH5N1 tế bào thận khỉ tiên phát Macacca mulatta Các giai đọan cần đợc nghiên cứu thử nghiệm tìm điều kiện tối u đảm bảo trình sản xuất chất lợng sản phẩm ổn định đảm bảo thông số kỹ thuật theo qui định 2.1 Qui trình lựa chọn khỉ để sản xuất tế bào TKTP - Chọn lựa khỉ đạt tiêu chuẩn để đa vào sản xuất theo tiêu chuẩn qui định TCYTTG dùng khỉ để sản xuất vắcxin (Phơng pháp huyết học) - Kiểm tra tế bào thận khỉ tiên phát chai nuôi tế bào (theo thờng qui TCYTTG) virút ngoại lai: SV40, Herpes B, Foarming, hÊp phơ hång cÇu, Tuberculosis ( virút ngoại lai bắt buộc phải kiểm tra để loại trừ khỏi tế bào thận khỉ tiên phát sử dụng để sản xuất vắcxin, yêu cầu b¾t bc cđa TCYTTG) (Recommendation for the production and Control of Poliomyelitis vaccine inactivated (WHO technical Report Series, No 910,2002) 2.2 Qui trình gây nhiễm - Liều virút tối u cần gây nhiễm tế bào thận khỉ tiên phát để đạt hiệu giá cao - Thời gian nhiệt độ gây nhiễm - Thời gian gặt phơng pháp gặt 2.3 Qui trình bất hoạt - Đông tan Ly tâm loại bỏ xác tế bào Bất hoạt formaldehyt Nồng ®é formaldehyt Thêi gian bÊt häat vµ nhiƯt ®é bÊt hoạt Kiểm tra độ bất họat thời gian bất hoạt khác (MDCK, PMKc trứng gà có phôi) 2.4 Qui trình tinh khiết - Siêu lọc cô đặc - Tinh khiết virút (siêu ly tâm phân vùng dung dịch gradient đờng) - Kiểm tra độ tinh khiết, hàm lợng kháng nguyên (SDS-PAGE, SRID, Lowry) - Kiểm tra vắcxin cúm rgH5N1 bán thành phẩm (prôtêin, hàm lợng HA, bất hoạt) 2.5 Qui trình pha vắcxin thành phẩm - Nghiên cứu hàm lợng nhôm tối u dùng để hấp phụ - Pha vắcxin bán thành phẩm cuèi cïng ë nång ®é HA tèi −u - Läc vô trùng - Hấp phụ với hydrôxyt aluminium Sản xuất thử nghiệm vắcxin cúm quy mô phòng thí nghiệm - Sản xuất thử nghiệm 05 loạt liên tiếp (5.000 ml = 5.000 liều) phòng thí nghiệm đạt yêu cầu TCYTTG mặt an tòan, công hiệu, vô khuẩn, chí nhiệt tố thành phần hóa học Chọn lựa khỉ đạt tiêu chuẩn để đa vào sản xuất theo tiêu chuẩn qui định TCYTTG dùng khỉ để sản xuất vắcxin (Phơng pháp huyết học) Kiểm tra tế bào thận khỉ tiên phát chai nuôi tế bào (theo thờng qui TCYTTG) virút ngoại lai: SV40, Herpes B, Foarming, hấp phụ hồng cầu, Tuberculosis ( virút ngoại lai bắt buộc phải kiểm tra để loại trừ khỏi tế bào thận khỉ tiên phát sử dụng để sản xuất vắcxin, yêu cầu bắt buéc cña TCYTTG) (Recommendation for the production and Control of Poliomyelitis vaccine inactivated (WHO technical Report Series, No 910,2002) G©y nhiễm tế bào TKTP với chủng sản xuất Gặt virút Ly tâm loại bỏ xác tế bào Bất hoạt virút Thẩm tích cô đặc Tinh khiết Định lợng hàm lợng HA bán thành phẩm Pha vắcxin bán thành phẩm Kiểm tra vắcxin bán thành phẩm Đóng lọ 1ml/lọ, dán nhÃn, đóng hộp Kiểm tra vắcxin thành phẩm - - Kiểm tra đánh giá chất lợng đáp ứng miễn dịch vắcxin cúm rgH5N1 động vật thùc nghiƯm - KiĨm tra v« khn KiĨm tra an toàn chung chuột lang chuột nhắt trắng Kiểm tra công hiệu (hàm lợng HA) kỹ thật SRID Kiểm tra đáp ứng miễn dịch chuột nhắt trắng Kiểm tra chí nhiệt tố Kiểm tra thành phần hóa học: pH, Prôtêin tổng số, Merthiolate, Formaldehyt, Aluminium Nghiên cứu khả sử dụng chủng NIBRG-14 NIBSC cung cấp để sản xuất vắcxin cúm A/H5N1 tế bào PMKC rgH5N1 tế bào Vero mặt : - Khả thích ứng dòng tế bào Liều gây nhiễm tối u; Thời gian nuôi cấy thời gian gặt; Hiệu giá virút; Hiệu giá HA Xây dựng tiêu chuẩn sở - Tiêu chuẩn tính vô khuẩn Tiêu chuẩn an toàn chung Tiêu chuẩn chí nhiệt tố Tiêu chuẩn công hiệu (SRID chuột nhắt trắng) Tiêu chuẩn pH Tiêu chuẩm hàm lợng formaldehyt tồn d Tiêu chuẩn chất bảo quản Merthiolate Tiêu chuẩn hàm lợng nhôm Tiêu chuẩn prôtêin tổng số 16 Tiến độ thực (phù hợp với nội dung đà nêu mục 13) Các nội dung, công việc chủ yếu cần đợc thực (các mốc đánh giá chủ yếu) Sản phẩm phải đạt Thời gian (bắt đầu, kết thúc) Ngời, quan thùc hiƯn S¶n xt kiểm tra hệ chủng giống gốc giống sản xuất - Sản xuất kiểm tra chủng gốc (MSV) Chọn khỉ sạch, kiểm tra khỉ đa vào sản xuất, chuẩn bị tế bào, kiểm tra tế bào, gây nhiễm virút, gặt virút, kiểm tra vô trùng, hiệu giá virút hiệu giá HA Chủng giảm độc lực, an tòan khả gây bệnh, ổn định mặt sinh học phân tử, hiệu giá virút, hiệu giá HA 1-3/2006 - Sản xuất kiểm tra chủng sản xuất (WSV) Chọn khỉ sạch, kiểm tra khỉ đa vào sản xuất, chuẩn bị tế bào, kiểm tra tế bào, gây nhiễm virút, gặt virút, kiểm tra vô Lê Quỳnh Mai Nguyễn Khánh Hằng (Viện VSDTH) Nguyễn Tuyết Nga Đinh Thúy Vân (Vabiotech) trùng, hiệu giá virút hiệu giá HA - Nghiên cứu liều gây nhiễm tối u, thời gian gây nhiễm, nhiệt độ thời gian gặt Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm rgH5N1 - Kỹ thuật lựa chọn khỉ - Kỹ thuật gây nhiễm tế bào - Qui trình tinh chế virút - Qui trình bất hoạt virút - Cô đặc, thẩm tích, hấp phụ - Pha chế đóng lọ Quy trình công nghệ cho công đọan đảm bảo ổn định hiệu suất tòan trình sản xuất 1-6/2006 Nguyễn Thu Vân Nguyễn Tuyết Nga Trịnh Tuấn Việt Đinh Thúy Vân (Vabiotech) Sản xuất thử nghiệm 05 lọat vắcxin liên tiếp qui mô phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn chất lợng - Sản xuất thử nghiệm 05 loạt liên tiếp (5.000 ml = 5.000 liều) phòng thí nghiệm đạt yêu cầu TCYTTG mặt an tòan, công hiệu, vô khuẩn, chí nhiệt tố thành phần hóa học - Chọn lựa khỉ đạt tiêu chuẩn để đa vào sản xuất theo tiêu chuẩn qui định TCYTTG dùng khỉ để sản xuất vắcxin (Phơng pháp huyết học) - Kiểm tra tế bào thận khỉ tiên phát chai nuôi tế bào (theo thờng qui TCYTTG) virút ngoại lai: SV40, Herpes B, Foarming, hÊp phơ hång cÇu, Tuberculosis ( virút ngoại lai bắt buộc phải kiểm tra để loại trừ khỏi tế bào thận khỉ tiên phát sử dụng để sản xuất vắcxin, yêu cầu bắt buộc TCYTTG) - Gây nhiễm tế bào TKTP với chủng sản xuất - Gặt virút - Bất hoạt virút - Thẩm tích cô đặc - Tinh khiết - Định lợng hàm lợng HA bán thành phẩm - Pha vắcxin bán thành phẩm - Kiểm tra vắcxin bán thành phẩm - Đóng lọ 1ml/lọ, dán nhÃn, đóng hộp - Kiểm tra vắcxin thành phẩm Quy trình công nghệ cho hiệu suất, chất lợng sản phẩm ổn định yêu cầu qui định cho vắcxin cúm 4-8/2006 Nguyễn Thu Vân Nguyễn Tuyết Nga Trịnh Tuấn Việt Đinh Thúy Vân Đỗ Thủy Ngân Nguyễn Quế Anh (Vabiotech) Đánh giá kiểm tra chất lợng phòng thí nghiệm mặt : - Vô khuẩn, - An toàn, - Công hiệu chuột - Chất gây sèt - pH , - Merthiolate ; - Formaldehyt ; - Prôtêin tổng số ; - Hàm lợng HA ; - Hàm lợng nhôm Qui trình kiểm tra chất lợng lọat vắcxin đạt tiêu chuẩn chất lợng - 10/06 Nguyễn Thu Vân Đỗ Thủy Ngân Nguyễn Hòang Mai Lê Thu Hằng Nguyễn Quế Anh (Vabiotech) Tìm hiểu khả thích ứng nhân lên chủng NIBRG-14 giòng tế bào rgH5N1 Vero - Thích ứng chủng NIBRG-14 tế bào PMKC Vero - Kiểm tra hiệu giá virút HA chủng NIBRG-14 loại tế bào - Thích ứng chủng rgH5N1 tế bào vero Xây dựng tiêu chuẩn sở cho vắcxin cúm A/H5N1 mặt : - Vô khuẩn, - An toàn, - Công hiệu - Chất g©y sèt - pH , - Merthiolate ; - Formaldehyt ; - Prôtêin tổng số ; - Hàm lợng HA ; - Hàm lợng nhôm Các thông số kỹ thuật chủng NIBRG-14 thích ứng tế bào Vero PMKC, rgH5N1 tế bào Vero -6/2006 Nguyễn Tuyết Nga Đinh Thúy Vân (Vabiotech) Bảng tiêu chuẩn sở đạt yêu cầu qui định tối thiểu TCYTTG làm sở trình TTKĐQG cho phép xuất xởng 10-11/06 Nguyễn Thu Vân Đỗ Thủy Ngân Nguyễn Hòang Mai Lê Thu Hằng Nguyễn Quế Anh (Vabiotech) Báo cáo đánh giá nghiệm thu - Xử lý số liệu ; - Viết báo cáo ; - Đánh giá nghiệm thu - Báo cáo tóan tài Các báo cáo nghiệm thu khoa học tài theo nội dung mục tiêu đà đăng ký 11-12/06 Ngun Thu V©n Ngun Tut Nga Ngun Q Anh Đỗ Thủy Ngân (Vabiotech) 7 18 Yêu cầu chất lợng số lợng kết quả, sản phẩm KH&CN dự kiến tạo (Kê khai đầy đủ, phù hợp với dạng kết đà nêu mục 17) 18.1 Yêu cầu kỹ thuật, tiêu chất lợng sản phẩm dự kiến tạo (dạng kết I) Mức chất lợng Mẫu tơng tự (theo Cần đạt tiêu chuẩn nhất) Trong nớc Thế giới Dự kiến số lợng, quy mô sản phẩm tạo Tên sản phẩm cụ thể tiêu chất lợng chủ yếu sản phẩm Đơn vị đo Chđng virót gièng gèc rgH5N1 (MSV) chđng Chđng giảm độc lực, an tòan đạt thông số kỹ tht nh− phơ lơc kÌm theo Ch−a cã Ch−a cã 300 lä (1ml/lä) Chđng virót gièng s¶n xt rgH5N1 (WSV) chñng - nt - Ch−a cã Ch−a cã 300 lọ (1ml/lọ) Vắcxin cúm rgH5N1 đảm bảo tiêu chuẩn an toàn, công hiệu, vô khuẩn thành phần hóa học : - Protein toàn phần - Thimerosal - Formaldehyt - Hydrôxyt Aluminium - pH - Chất gây sốt - An toàn - Vô khuẩn liều Đạt yêu cấu tối thiểu vắcxin cúm TCYTTG Ch−a cã 5000 liÒu (1ml/liÒu) ≤ 300 mcg/ml ≤ 0,012g% ≤0,02g% ≤1200 mcg/ml 5,5 – 7,5 ≤ 1,3oC/3 th An toàn Vô khun 18.2 Yêu cầu khoa học sản phẩm dự kiến tạo (dạng kết II, III) Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học dự kiến đạt đợc Ghi Qui trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm rgH5N1 tế bào thận khỉ tiên phát (Từ sản xuất chủng đến vắcxin thành phẩm) Phơng pháp tạo virút tái tổ hợp ổn định đảm bảo chất lợng vắcxin sản xuất theo qui trình theo h−íng dÉn cđa TCYTTG (WHO guidance on development of influenza vaccine reference viruses by reversed genetics (WHO/CDS/CSR/GIP/2005.6) Theo qui tr×nh chuyển giao công nghệ Trờng ĐH quốc gia Tokyo Nhật Bản theo phong pháp di truyền ngợc từ chủng A/VN/1194/2004 vµ PR 8 theo tû lƯ 2:6 Phơng pháp sản xuất chủng giống gốc chủng sản xt v¾cxin H5N1 Theo h−íng dÉn cđa TCYTTG (WHO guidance on development of influenza vaccine reference viruses by reversed genetics (WHO/CDS/CSR/GIP/2005.6) Theo qui trình thực chuẩn (SOP) Công ty DENKASEIKEN Nhật Bản Phơng pháp định lợng HA vắcxin (SRID) Tiêu chuẩn sở cho thành phần Các thử nghiệm kiểm tra chất vắcxin cúm A/H5N1 sản xuất đợc theo hớng dẫn lợng: WHO - Protein toàn phần - Thimerosal (Production of pilot lots of inactivated influenza - Formaldehyt vaccine from reassortants derived from avian - Hydr«xyt Aluminium influenza viruses (WHO/CDS/CSR/RMD/2003.5) - pH (WHO Recommendation for the Production and - ChÊt g©y sèt Control of Inactivated Influenza vaccine) - An toµn - Vô khuẩn Phơng pháp đánh giá tính an toàn đáp ứng miễn dịch súc vật thực nghiệm Tiêu chuẩn sở cho vắcxin cúm A/H5n1 sản xuất tế bào thận khỉ tiên phát: - Protein toàn phần Thimerosal Formaldehyt Hydrôxyt Aluminium pH Chất gây sốt An toàn Vô khuẩn Công hiệu (HA BTP) Tiêu chuẩn sở cho chủng virút cúm A/H5N1 sản xuất tế bào thận khỉ tiên phát Tiêu chuẩn sở cho thành phần vắcxin cún A/H5N1 sản xuất đợc theo hớng dẫn WHO (Production of pilot lots of inactivated influenza vaccine from reassortants derived from avian influenza viruses (WHO/CDS/CSR/RMD/2003.5) (WHO Recommendation for the Production and Control of Inactivated Influenza vaccine) Tiêu chuẩn sở theo SOP VABIOTECH TTKĐQG theo hớng dẫn WHO (WHO Recommendation for the Production and Control of Inactivated Influenza vaccine) ≤ 300 mcg/ml ≤ 0,012g% ≤0,02g% ≤1200 mcg/ml 5,5 7,5 1,3oC/3 th An toàn Vô khun 15 mcg/ml Tiêu chuẩn sở theo qui định chung TCYTTG cho chủng virút cúm A/H5N1 tái tỉ hỵp (WHO guidance on development of influenza vaccine reference viruses by reversed genetics 9 Bảng báo cáo phân tích tiêu chí kỹ thuật loạt vắcxin dạng bán thành phẩm bao gồm: - Hàm lợng HA (SRID) - Prôtêin tổng số 10 Bảng báo cáo phân tích tiêu chí kỹ thuật loạt vắcxin dạng thành phẩm - Vô khuẩn - An tòan - Công hiệu (trên chuột nhắt) - Công hiêu (SRID) - ChÝ nhiÖt tè - pH - Merthiolate - Formaldehyt - Hydroxyt Aluminium (WHO/CDS/CSR/GIP/2005.6) Tiêu chuẩn sở sở theo qui định chung TCYTTG tiêu chÝ kü tht nµy theo h−íng dÉn cđa WHO (WHO Recommendation for the Production and Control of Inactivated Influenza vaccine) Tiêu chuẩn sở sở theo qui định chung TCYTTG tiêu chí kỹ thuật theo h−íng dÉn cđa WHO (WHO Recommendation for the Production and Control of Inactivated Influenza vaccine) 10