Nghiên cứu heparansulfate interacting protein người hhip ở mức độ mrna và protein tại một số loại mô ung thư

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI Báo cáo tổng kết nhiệm vụ hợp tác quốc tế khoa học công nghệ theo nghị định thư NGHIÊN CỨU HEPARAN SULFATE INTERACTING PROTEIN NGƯỜI (hHIP) Ở MỨC ĐỘ mRNA VÀ PROTEIN TẠI MỘT SỐ MÔ UNG THƯ Mã số: Chủ nhiệm đề tài: Cơ quan chủ trì: Cơ quan chủ quản: Thời gian thực hiện: 13MH1 PGS TS Tạ Thành Văn Trường Đại học Y Hà Nội Bộ Y tế 01/2006-6/2008 7031 18/11/2008 H Ni - 2008 Lời cảm ơn Ch nhim đề tài hợp tác quốc tế khoa học cơng nghệ theo Nghị định thư với Cộng hịa Italy xin chân thành cảm ơn cán nghiên cứu quan hợp tác phối hợp triển khai đề tài là: i) Trường Đại học Y Hà Nội Bệnh viện K Trung ương, Bộ Y tế; ii) nhà khoa học quan hỗ trợ triển khai đề tài là: Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Chủ nhiệm đề tài xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Y Hà Nội tập thể phòng Quản lý nghiên cứu khoa học, tập thể cán bộ mơn Hóa-Hóa sinh Labo trung tâm Y sinh học thuộc Trường Đại học Y Hà Nội ủng hộ tạo điều kiện thuận lợi để đề tài thực thi theo tiến độ đề Chủ nhiệm tập thể cán nghiên cứu xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Vụ Quản lý Khoa học Công nghệ ngành KT-KT, Vụ Hợp tác quốc tế thuộc Bộ Khoa học Công nghệ tạo điều kiện thuận lợi kinh phí quản lý suốt thời gian thực đề tài CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI PGS TS TẠ THÀNH VĂN DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI CHỦ TRÌ THỰC HIỆN Số TT Họ tên Chức vụ, đơn vị Học hàm, học vị Tạ Thành Văn, PGS TS Phó Trưởng Bộ mơn Hóa-Hóa sinh Trách nhiệm đề tài Chủ nhiệm đề tài Trưởng Labo trung tâm Y sinh học Trường Đại học Y Hà Nội Nguyễn Đăng Khoa TS Phó Trưởng Bộ mơn Miễn dịch-Sinh lý Chủ nhiệm đề tài bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội nhánh Tạ Văn Tờ, TS Trưởng Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh Chủ đề mục viên K Trung ương Trần Vân Khánh, TS Nghiên cứu viên chính, Labo trung tâm Chủ đề mục Y sinh học Trường Đại học Y Hà Nội Nguyễn Thị Hà, PGS TS Bộ mơn Hóa-Hóa sinh, Trường Đại học Chủ đề mục Y Hà Nội Trần Thị Chính, PGS TS Bộ môn Miễn dịch-Sinh lý bệnh, Chủ đề mục Trường Đại học Y Hà Nội Nguyễn Nghiêm Luật, PGS TS Phụ trách Bộ mơn Hóa-Hóa sinh Chủ đề mục Trường Đại học Y Hà Nội *Ghi chú: Trong trình thực thi đề tài, vào tình hình thực tế nội dung nghiên cứu, danh sách số cán tham gia nghiên cứu thay đổi so với đề cương ban đầu DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA THỰC HIỆN VÀ CƠ QUAN PHỐI HỢP Nội dung 1: Thu gom mẫu mô ung thư mô đối chứng Cơ quan tham gia: Bệnh viện K Trung ương; Bệnh viện Quân đội 108, Bệnh viện Hữu Nghị, Bệnh viện Việt Nam-Cuba; Trường ĐHY Hà Nội Những người tham gia thực hiện: Tạ Văn Tờ, Lý Tuấn Khải, Nguyễn Phương Ngọc, Đặng Thị Tuyết Minh, Nguyễn Nghiêm Luật Nội dung 2: Tách chiết RNA tổng số, tổng hợp cDNA Cơ quan tham gia: Trường Đại học Y Hà Nội Những người tham gia: Tạ Thành Văn, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Nguyễn Thị Phương Thúy, Nguyễn Vũ Trung, Nội dung 3: Định lượng RNA HIP Cơ quan tham gia: Trường Đại học tổng hợp Napoli, Trường Đại học Y Hà Nội Những người tham gia: Alfredo Fusco, Tạ Thành Văn, Trần Vân Khánh Nội dung 4: Tổng hợp HIP peptid, gắn với protein mang gây miễn dịch thỏ Cơ quan tham gia: Trường Đại học Y Hà Nội Những người tham gia: Alfredo Fusco, Nguyễn Đăng Khoa, Trần Thị Chính, Lê Ngọc Anh, Nội dung 5: Tinh chế kháng thể kháng HIP Cơ quan tham gia: Trường Đại học Y Hà Nội, Viện Công nghệ sinh học Những người tham gia: Trần Thị Chính, Nguyễn Đăng Khoa, Lê Ngọc Anh, Đinh Duy Kháng Nội dung 6: Đánh giá mức độ tổng hợp protein HIP Cơ quan tham gia: Trường Đại học Y Hà Nội, Trường Đại học KHTN-ĐHQG Những người tham gia: Nguyễn Thị Hà, Nguyễn Thu Thúy, Trần Vân Khánh, Nguyễn Trọng Tuệ, Phan Tuấn Nghĩa Triển khai kỹ thuật hóa mô miễn dịch Cơ quan tham gia: Bệnh viện K Trung ương, Trường Đại học Y Hà Nội Những người tham gia: Tạ Văn Tờ, Nguyễn Thanh Bình Báo cáo nghiệm thu đề tài 13MH1 MỤC LỤC DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI CHỦ TRÌ THỰC HIỆN DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA THỰC HIỆN VÀ CƠ QUAN PHỐI HỢP BÀI TÓM TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC 1.1 UNG THƯ VÚ 1.1.1 Tình hình dịch tễ 1.1.2 Các phương pháp chẩn đoán ung thư vú 1.1.3 Phân loại mô bệnh học ung thư vú 10 1.1.4 Phân loại giai đoạn ung thư vú 11 1.2 UNG THƯ TUYẾN GIÁP TRẠNG 12 1.2.1 Tình hình dịch tễ 13 1.2.2 Đánh giá mức độ tiến triển 14 1.2.3 Phương pháp chẩn đoán ung thư tuyến giáp trạng 14 1.3 UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 14 1.3.1 Tình hình dịch tễ 14 1.3.2 Những yếu tố sinh bệnh học 15 1.3.3 Bệnh học 18 1.3.4 Đánh giá mức độ tiến triển 18 1.3.5 Chẩn đoán ung thư đại trực tràng 20 1.4 UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT 20 1.4.1 Tình hình dịch tễ 21 1.4.2 Bệnh u phì đại lành tính tuyến tiền liệt 23 1.4.3 Bệnh ung thư tuyến tiền liệt 28 1.5 UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG 41 1.5.1 Tình hình dịch tễ 41 1.5.2 Những yếu tố liên quan đến ung thư vòm mũi họng 43 1.6 UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 47 1.6.1 Tình hình dịch tễ 47 1.6.2 Nguyên nhân, sinh bệnh học yếu tố nguy 49 Báo cáo nghiệm thu đề tài 13MH1 1.6.3 Tiến triển ung thư cổ tử cung 50 1.6.4 Mô bệnh học 50 1.6.5 Chẩn đốn 53 1.7 HEPARIN/HEPARANSULFATE INTERACTING PROTEIN (HIP) VÀ VAI TRỊ 57 TRONG UNG THƯ 1.7.1 Những nghiên cứu HIP 57 1.7.2 Vai trò HIP ung thư 61 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 65 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 65 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 66 2.2.1 Quy trình tách chiết RNA tổng số từ mô u xơ mô ung thư 66 2.2.2 Xác định nồng độ, độ RNA, cDNA phương pháp quang phổ kế 72 2.2.3 Phương pháp điện di acid nucleic 72 2.2.4 Phương pháp RT-PCR bán định lượng 73 2.2.5 Quy trình tạo tinh chế kháng thể 77 2.2.6 Đánh giá mức độ protein HIP mô ung thư mô đối chứng 82 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 84 3.1 TẠO VÀ TINH CHẾ KHÁNG THỂ 84 3.1.1 Kết phát kháng thể kháng phức hợp hHIP-KLH huyết thỏ 84 3.1.2 Kết tinh chế kháng thể kháng phức hợp hHIP-KLH từ huyết thỏ 84 3.2 UNG THƯ VÚ 86 3.2.1 Phân bố mẫu mô theo typ bệnh học giai đoạn 86 3.2.2 Kết tách chiết RNA tổng số tổng hợp cDNA 88 3.2.3 Kết phân tích PCR bán định lượng HIP dựa gen nội chuẩn GAPDH 90 3.2.4 Kết Western blot xác định mức độ biểu protein HIP mô ung thư vú so với mô đối chứng 97 3.3 UNG THƯ GIÁP 102 3.3.1 Phân bố mẫu theo typ mô bệnh học giai đoạn 102 3.3.2 Kết tách chiết RNA tổng số tổng hợp cDNA 103 3.3.3 Kết phân tích PCR bán định lượng HIP dựa gen nội chuẩn GAPDH 105 3.3.4: Kết Western blot xác định mức độ thể protein HIP mô ung thư giáp so Báo cáo nghiệm thu đề tài 13MH1 với mô đối chứng 3.4 UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 111 116 3.4.1 Phân bố mẫu theo typ mô bện học giai đoạn 116 3.4.2 Kết tách chiết RNA tổng hợp cDNA 122 3.4.3 Kết phân tích PCR bán định lượng HIP dựa gen nội chuẩn GAPDH 124 3.4.4 Kết Western blot xác định biến đổi protein HIP mơ ruột lành tính, mơ polyp mô ung thư đại trực tràng 3.5 UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT 130 134 3.5.1 Phân bố mẫu theo typ mô bệnh học giai đoạn 134 3.5.2 Kết tách chiết RNA tổng số tổng hợp cDNA 138 3.5.3 Kết phân tích PCR bán định lượng HIP dựa gen nội chuẩn GAPDH 141 3.5.4 Kết Western blot xác định biến đổi protein HIP mô phì đại lành tính, PIN độ cao vµ ung th− TTL 147 3.6 UNG THƯ VỊM MŨI HỌNG 151 3.6.1 Phân bố theo mô bệnh học 151 3.6.2 Kết tách chiết RNA tổng số tổng hợp cDNA 152 3.6.3 Kết phân tích PCR bán định lượng HIP dựa gen nội chuẩn GAPDH 154 3.7 UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 157 3.7.1 Phân bố mẫu theo typ mô bệnh học giai đoạn 157 3.7.2 Kết tách chiết RNA tổng số tổng hợp cDNA 158 3.7.3 Kết phân tích PCR bán định lượng HIP dựa gen nội chuẩn GAPDH 160 CHƯƠNG BÀN LUẬN 164 4.1 THU THẬP MẪU 164 4.2 TÁCH CHIẾT RNA TỔNG SỐ VÀ TỔNG HỢP cDNA 166 4.3 PCR BÁN ĐỊNH LƯỢNG HIP DỰA TRÊN GEN NỘI CHUẨN GAPDH Ở CÁC MẪU MÔ UNG THƯ VÀ MÔ ĐỐI CHỨNG 168 4.4 XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ THỂ HIỆN HIP Ở CÁC MẪU MÔ UNG THƯ VÀ MÔ ĐỐI CHỨNG 175 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN 179 5.1 KẾT LUẬN 179 5.2 Ý NGHĨA THỰC TIỄN 180 Báo cáo nghiệm thu đề tài 13MH1 CHƯƠNG TỔNG QUÁT HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ 181 6.1 KẾT QUẢ VỀ KHOA HỌC 181 6.2 TỔNG HỢP CÁC SẢN PHẨM ĐẠT ĐƯỢC SO VỚI ĐĂNG KÝ 183 6.3 TRÌNH ĐỘ KHOA HỌC CƠNG NGHỆ 184 6.4 KHẢ NĂNG ÁP DỤNG 184 6.5 ĐÀO TẠO 185 6.6 HỢP TÁC QUỐC TẾ 185 6.7 DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH Đà CƠNG BỐ 186 6.8 CÁC HỘI NGHỊ/HỘI THẢO TRONG NƯỚC VÀ QUỐC TẾ 187 6.9 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ 188 TÀI LIỆU THAM KHẢO 189 Báo cáo nghiệm thu đề tài 13MH1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh ung thư bệnh phổ biến, có xu hướng vượt xa dần bệnh tim mạch mức độ thường gặp tỉ lệ tử vong Bệnh gặp không nước phát triển mà với nước phát triển, có Việt Nam Theo ước tính Tổ chức Y tế giới, hàng năm tồn cầu có khoảng 10 triệu người mắc bệnh ung thư có khoảng triệu người chết bệnh [6, 44, 46] Ở nước ta, theo số liệu thống kê sơ Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh số tỉnh thành, ước tính năm có thêm 150.000 trường hợp mắc ung thư tỉ lệ tử vong 50% [6, 17] Trước tình hình kể từ năm 2008, Bộ Y tế đưa "Chương trình phịng chống bệnh ung thư" vào danh sách Chương trình mục tiêu quốc gia với mức độ đầu tư nhiều chục tỷ đồng/năm Chương trình gồm nội dung tổng thể từ khảo sát, điều tra đánh giá, phân vùng/khu vực, tăng cường hệ thống chẩn đoán điều trị [22] Ung thư vú ung thư cổ tử cung hai loại ung thư phổ biến phụ nữ, nam giới ung th− tuyến tiền liệt loại ung th phổ biến, loại ung th chiếm tỉ lệ tử vong cao nam nữ Trong đó, ung th đại trực tràng đứng hàng thứ t nam giới sau ung th gan, phổi dày, đứng hµng thø ba sau ung th− cỉ tư cung, ung th vú nữ giới [6, 17, 20] Bệnh cân hai giới, nam nhiều nữ chút (51%), độ tuổi mắc bệnh từ 41 70, gặp dới 30 tuổi Bệnh ung th tuyến giáp trạng (UTTGT) chiếm tỷ lệ 1% loại ung th, tỷ lệ mắc bệnh cao nớc có bệnh bớu địa phơng UTTGT gia tăng ngời xạ trị vùng đầu cổ để điều trị bệnh lành tính lúc trẻ, xạ trị sau tuổi 21 có nguy gây UTTGT UTTGT có liên quan với u lành tuyến giáp Tỷ lệ mắc bệnh ®iỊu chØnh theo ti (Age Adjusted Incidence Rate/ AAIR) chiÕm dới 3/100.000 cho nam giới năm tăng gấp hay lần nữ giới [6, 17] Báo cáo nghiệm thu đề tài 13MH1 Bệnh ung thư khơng ảnh hưởng đến sức khoẻ mà cịn ảnh hưởng trầm trọng đến tâm sinh lý, chất lượng sống bệnh nhân Nhiều phương pháp lâm sàng cận lâm sàng ứng dụng để góp phần phát sớm, chẩn đốn xác định, tiên lượng theo dõi bệnh [1-3, 8, 14] Tuy nhiên cần phải nói đa số phương pháp kỹ thuật ứng dụng thường phát bệnh giai đoạn muộn, việc điều trị tiên lượng bệnh thách thức lớn nhà Y học Một giải pháp coi hữu hiệu loại bệnh chẩn đoán sớm để có biện pháp can thiệp sớm Hiện nay, nhà khoa học đang sâu nghiên cứu phát marker ung thư mới, đặc hiệu, ứng dụng rộng rãi góp phần chẩn đốn sớm số loại hình bệnh ung thư [8, 14, 15] Sử dụng kỹ thuật microarray đánh giá hoạt hóa/ức chế gen tế bào ung thư, nhà khoa học phát nhiều gen hoạt hóa bị ức chế hàng chục lần dòng tế bào ung thư so với dòng tế bào tương ứng bình thường Các gen ứng cử viên đầy triển vọng việc chẩn đoán sớm, tiên lượng theo dõi ung thư Bởi lẽ biến đổi gen xuất sớm nhất, biến đổi protein trước có biến đổi hình thái chức tế bào [78, 79] Nằm số gen bị hoạt hóa q trình phát sinh phát triển ung thư, gen Heparansulfate Interactirng Protein (HIP) phát lần nhóm GS Daniel Carson, Hoa Kỳ ứng cử viên đầy triển vọng hứa hẹn cho việc chẩn đoán số loại hình ung thư [48-52] Gen HIP mã hóa protein cã 155 aa, trọng lượng ph©n tử khoảng 18 kDa đợc tổng hợp dòng tế bào nội mạc tế bào biểu mô trởng thành HIP có khả thúc đẩy, tăng cờng trình liên kết tế bào - tế bào, đặc biệt HIP có khả gắn đặc hiệu chọn lọc với Heparin/Heparansulfate (HP/HS) để qua điều hòa trình lu giữ giải phóng yếu tố phát triển phụ thuộc HP/HS khoảng gian bào [48-52] Nhiều nghiên cứu thÕ giíi ®· cho thÊy, HIP Báo cáo nghiệm thu đề tài 13MH1 Quá trình chuyển màng thực sau: - Hai gel điện di đồng thời, vị trí mẫu - Một gel sau điện di cho ngâm đệm chuyển 10 phút (glycine 2.9g, tris 5,8g, SDS 0.37g, methanol 200 ml, DW cho đủ 1l) để chuyển màng, gel ngâm nhuộm dung dịch coomasine - Màng PVDF cắt diện tích gel, hoạt hóa methanol 10 giây - Sau ngâm gel đệm chuyển đủ thời gian, xếp gel, màng giấy đệm Whatman 3MM vào hệ thống chuyển màng theo vị trí cực nguồn điện, nhúng hệ thống bể đệm máy - Chuyển màng điều kiện lạnh, 6mA cm2 màng, thời gian chuyển màng 120 phút - Kết thúc giai đoạn chuyển protein từ gel sang màng, màng PVDF lấy nhuộm với đỏ Ponceau S 10 phút, mục đích kiểm tra chất luợng chuyển protein sang màng - Rửa màng đệm TBS-T 10 phút (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 0.1% v/v) - Tiếp thay đệm ngâm màng đệm blocking TBS-T-BSA (TBS-T có BSA 5%) 60 phút - Nhỏ kháng thể bậc (huyết thỏ kháng protein HIP) vào đệm phủ nồng độ cuối khoảng ug/ml (tương ứng với độ pha loãng 1:5000), thời gian gắn kháng thể cho qua đêm 4oC - Rửa màng đệm TBS-T lần, lần 10 phút 25 Báo cáo nghiệm thu đề tài 13MH1 - Pha loãng kháng thể bậc (kháng IgG thỏ gắn Alkali photphatase) đệm blocking, TBS-T-BSA, 1:20000 lần (nồng độ cuối khoảng 0,5 - ug/ml) cho ngâm màng thời gian 60 phút 37oC - Lặp lại bước rủa TBS-T lần, lần 10 phút - Bước cuối cho phát triển màu trực tiếp với dung dịch chất BCIP/NBT, băng protein HIP gắn cộng hợp kháng thể có màu xanh tím sẫm trắng màng PVDF nhờ phản ứng giữ enzym chất - Kết ghi lại phim chụp ảnh III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT RNA TỔNG SỐ VÀ TỔNG HỢP cDNA Với quy trình tách chiết mơ tả phần phương pháp, tiến hành tách chiết RNA tổng số 30 mẫu gồm mô xơ lành ung thư vú Sau trình tách chiết, tiến hành xác định chất lượng, nồng độ độ RNA phương pháp đo quang phổ kế điện di gel agarose (hình 3.1) Tất mẫu RNA thu có độ tinh cao, dao động từ 1,8 - 1,9 28S rRNA 18S rRNA Hình 3.1: Ảnh điện di RNA tổng số gel agarose 0,8% 26 Báo cáo nghiệm thu đề tài 13MH1 Nhận xét: Kết điện di RNA gel agarose cho thấy RNA tách đạt yêu cầu, không đứt gẫy, gồm băng rõ nét rRNA 28S 18S Điều cho thấy, phương pháp tách chiết RNA nêu tốt, đảm bảo cho thí nghiệm KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PCR BÁN ĐỊNH LƯỢNG HIP DỰA TRÊN GEN NỘI CHUẨN GAPDH Để xác định mức độ chép HIP, thực kỹ thuật RT-PCR mẫu cDNA mô đối chứng mô ung thư Sử dụng cặp mồi đặc hiệu thiết kế dựa trình tự gen HIP mơ tả phần quy trình kỹ thuật, chúng tơi thu đoạn gen HIP có kích thước 504 bp (hình 3.2) Chúng tơi khuyếch đại gen GAPDH tất mẫu nghiên cứu Đây gen nội chuẩn sử dụng để đánh giá chất lượng sản phẩm RNA ước lượng cDNA sử dụng phản ứng RT-PCR bán định lượng Sử dụng cặp mồi đặc hiệu thiết kế dựa trình tự gen GAPDH công bố GenBank, đoạn gen GAPDH khuếch đại có kích thước 350 bp (hình 3.2) U xơ vú Ung thư vú HIP GAPDH (A) 27 M Báo cáo nghiệm thu đề tài 13MH1 Mô giáp lành Ung thư giáp M HIP GAPDH (B) Mô lành Polyp HIP GAPDH (C) 28 Ung thư M Báo cáo nghiệm thu đề tài 13MH1 U xơ PIN ®é cao Ung th− M HIP GAPDH (D) Hình 3.2 Kết phản ứng RT-PCR gen HIP GAPDH mô đối chứng mô ung thư vú (A), ung thư giáp (B), ung thư đại trực tràng (C) ung thư tuyến tiền liệt (D) Nhận xét: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR cho thấy mồi HIP GAPDH đặc hiệu, thể vạch sáng, rõ nét, điều chứng tỏ điều kiện phản ứng RT-PCR (như mô tả phần phương pháp) để nhân đoạn gen HIP hồn tồn thích hợp Đậm độ tương đối đồng vạch GAPDH mô ung thư mô đối chứng cho thấy lượng DNA khuôn cho phản ứng PCR tương đối Trong đó, có khác biệt rõ ràng đậm độ vạch HIP mô ung thư so với mô đối chứng 29 Báo cáo nghiệm thu đề tài 13MH1 KẾT QUẢ WESTERN BLOT XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN PROTEIN HIP Ở MÔ UNG THƯ SO VỚI MÔ ĐỐI CHỨNG Để đánh giá mức độ biểu HIP mô u xơ vú lành tính so với mơ ung thư, chúng tơi sử dụng kỹ thuật Western blot Đây phương pháp hiệu để xác định protein đặc hiệu Lượng mơ (protein tồn phần) ước định tương đương cho giếng điện di dựa vào độ hấp thụ mật độ quang dung dịch hồ tan mơ sau pha lỗng nhiều lần bước sóng 280 nm Bản gel trước hết nhuộm Comassie blue để đánh giá lượng protein tổng số giếng Kết cho thấy, sử dụng phương pháp đo quang để ước định lượng protein tổng số cho giếng điện di tin cậy (hình 3.3 A, 3.4 A, 3.5 A, 3.6 A) Bản gel sau sử dụng để tiến hành kỹ thuật Western blot tiến hành để đánh giá mức độ biểu protein HIP mô ung thư giáp so với mô lành đối chứng Kết cho thấy vạch protein HIP (24 kDa) quan sát rõ mẫu có khác biệt rõ rệt mức độ biểu protein HIP mô ung thư so với mô đối chứng (hình 3.3 B, 3.4 B, 3.5 B, 3.6 B) 30 Báo cáo nghiệm thu đề tài 13MH1 10 11 M 10 11 M (A) (B) Hình 3.3: Hình ảnh điện di SDS-PAGE (A) kết Western blot (B) đánh giá mức độ biểu protein HIP thể tế bào ung thư vú khác giai đoạn II M: Marker protein; 1-2: thể ống; 3-5: thể tuỷ; 6-8: thể tiểu thuỳ; 9-11: thể tuyến 31 Báo cáo nghiệm thu đề tài 13MH1 10 11 M 10 11 M (A) Hình 3.4: Hình ảnh điện di SDS-PAGE (A) kết Western blot (B) đánh giá mức độ biểu protein HIP mô ung thư giáp so với mô đối chứng M: Marker protein; - 9: mô ung thư; 10 - 11: mô lành 32 Báo cáo nghiệm thu đề tài 13MH1 M (A) M (B) Hình 3.5: Hình ảnh điện di SDS-PAGE (A) western blot (B) đánh giá mức độ biểu protein HIP mô ung thư đại trực tràng so với mô đối chứng mô polyp M: Marker protein; 1-2: mẫu lành; 3-5: polyp; 6-10: ung thư 33 Báo cáo nghiệm thu đề tài 13MH1 10 11 M (A) 10 11 M (B) Hình 3.6: Hình ảnh điện di SDS-PAGE (A) kết Western blot (B) đánh giá mức độ biểu protein HIP mơ phì đại lành ung thư tuyến tiền liệt M: Marker protein; 1-5: mô lành; 6-11: ung thư 34 Báo cáo nghiệm thu đề tài 13MH1 Nhận xét: Kết Western blot cho thấy vạch protein HIP đặc hiệu, rõ nét Điều chứng tỏ rằng, quy trình tạo tinh chế kháng thể tốt, kháng thể thu có độ đặc hiệu cao Các điều kiện quy trình thực phản ứng Western blot tốt, ổn định HIP tăng cường tổng hợp tương đối rõ mơ ung thư so với mơ lành tính đối chứng IV KẾT LUẬN Từ kết đề cập trên, rút số kết luận sau: - Hồn thiện quy trình tách chiết RNA, tổng hợp cDNA tối ưu điều kiện phản ứng RT-PCR bán định lượng HIP, GAPDH - Hoàn thiện quy trình tạo tinh chế kháng thể HIP đặc hiệu - Hoàn thiện tối ưu điều kiện phản ứng Western blot 35 Báo cáo nghiệm thu đề tài 13MH1 Tài liệu tham khảo Tạ Thành Văn (1989) Heparin: Sự tương tác với protein Tạp chí nghiên cứu Y học 6, 69-72 Jacobs, A.L., Julian, J.A., Sahin, A.A., and Carson, D.D (1997) Heparin/Heparansulfate interacting protein expression and functions in human breast cancer cells and normal breast epithelia Cancer Research 57, 5148-5154 Liu S., Smith, E Sott, Julian, J., Rohde, H.L, Karin, J Norman., and Carson, D.D (1996) cDNA Cloning and expression of HIP, a novel cell surface heparan sulfate/heparin-binding protein of human uterine Epithelial cells and cell lines Journal of biological chemistry.271, 11817-11823 De Nigris, F., Visconti, R.,Fusco, A., et al (1998) Overexpression of the HIP gene coding for a heparin/ heparin sulfate – binding protein in human thyroid carcinomas Cancer Res 58, 4745-4751 Wang, Y., Cheong, D., Chan, S., Chuan Hooi, S (1997) heparin/heparan sulfate interacting protein gene expression is up – regulated in human colorectal carcinoma and correlated with differentiation status and metastasis Cancer Res 59, 2989-2994 Andrew L Jacobs, JoAnne Julian, Aysegula A Sahin, and Carson, D D (1997) Heparin/Heparan Sulfate Interacting Protein Expression and Function in Human Breast Cancer cells and normal Breast Epithelia Cancer Res 57, 51485154 Behring EA, kitasato S Uber das Zustan dekomnun der Diphtherie-Immunitat und der Tetanus-Immunitat bei Thieren: Dtsch med Wochenschr 1890: 49, 11134 Koeler, G., and C Milstein (1975) Continuous cultuves of fused cells secrecting antibody of predefined specificity Nature 258, 495-497 Birch J.R., Lennox E.S (1995) Monoclonal antiboies, A Jonh Wiley & Son, 36 Báo cáo nghiệm thu đề tài 13MH1 INC 10 http//www.piercenet.com/Imject Maleimide Activated Carrier Protein 11 Vũ Triệu An (1998) Miễn dịch học NXB Y học, 34-39 12 Đinh Duy Kháng (2006) Nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp virus Dengue týp sử dụng chẩn đoán sốt Dengue/Sốt xuất huyết Dengue Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật Đề tài Bộ Khoa học Cơng nghệ, 61-63 13 Phan Tơn Hồng (2005) Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát Heparansulfate interacting protein bệnh nhân ung thư vú Luận văn Thạc sỹ Y học, Trường ĐH Y Hà Nội, 57-60 14 Tạ Thành Văn, M.C Farach-Carson (2002) Tổng hợp nghiên cứu tác dụng protein tái tổ hợp (rhHIP) phát triển dòng tế bào sợi phân lập từ mơ lợi phì đại Nghiên cứu Y học số đặc biệt, 55-60 15 Larry H Rohde et al (1996) Cell surface expression of HHIP, a novel Heparin/ Heparansulfate binding protein, of human uterine epithelial cells and cell line Journal of Biological chemistry 271, 11824-11830 16 Van-Thanh, T., Carson, D et al (2002) Heparansulfate interacting protein (HHIP/L29) negatively regulates growth responses to basic fibroblast growth factor in gingival fibroblasts Journal of Dental Research 81, 247-252 17 J Sambrook, E.F Fritsch, T Maniatis, Molecular Cloning- A laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1983, 18.4718.75 18 Roche, Roche Molecular Biochemiscal, Lab FAQS, Find a Qick Solution, Roche Diagnostics GmbH 2005, 125-160 19 Lê Ngọc Anh, Phạm Đăng Khoa, Trần Thị Chính Tạ Thành Văn (2007) Tạo tinh chế kháng thể kháng heparansulfate interacting protein người (hHIP) từ thở Tạp chí nghiên cứu Y học 2, 1-5 37 Báo cáo nghiệm thu đề tài 13MH1 20 Trần Vân Khánh Tạ Thành Văn (2007) Ứng dụng phương pháp PCR bán định lượng định lượng xác định mức độ chép heparansulfate interacting protein (HIP) mơ ung thư Tạp chí nghiên cứu Y học 38 Báo cáo nghiệm thu đề tài 13MH1 KẾT QUẢ HỘI ĐỒNG NGHIỆM THU QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ Quy trình I: Quy trình tách chiết RNA tổng số từ mơ, tổng hợp cDNA PCR bán định lượng Quy trình II: Quy trình tạo tinh chế kháng thể Quy trình III: Đánh giá mức độ protein HIP mơ ung thư mô đối chứng 39