Xây dựng mô hình đánh giá sự kích thích tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc thần kinh của một số dược liệu việt nam

UỶ BAN NHÂN DÂN TP.HCM ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO NGHIỆM THU Tên đề tài: Xây dựng mơ hình đánh giá kích thích tăng sinh biệt hóa tế bào gốc thần kinh số dược liệu Việt Nam Mã số đề tài: 291/HĐ-SKHCN ngày 21/12/2011 Chủ nhiệm đề tài: Ths Phan Kim Ngọc Ths Trương Hải Nhung Tp Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2015 UỶ BAN NHÂN DÂN TP.HCM ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO NGHIỆM THU Tên đề tài: Xây dựng mơ hình đánh giá kích thích tăng sinh biệt hóa tế bào gốc thần kinh số dược liệu Việt Nam Mã số đề tài: 291/HĐ-SKHCN ngày 21/12/2011 Chủ nhiệm đề tài: Ths Phan Kim Ngọc Ths Trương Hải Nhung Thành viên tham gia: ThS Phan Kim Ngọc 10 PGS.TS Trần Công Luận ThS Trương Hải Nhung 11 TS Trần Phi Hoàng Yến TS Phạm Văn Phúc 12 ThS Vũ Bích Ngọc CN Lê Minh Dũng CN Lâm Thái Thành CN Đỗ Quang Huy CN Đinh Thị Hồng Nhung CN Nguyễn Thuỳ Linh ThS Vương Gia Tuệ Tp Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2015 UỶ BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) Tên đề tài: Xây dựng mơ hình đánh giá kích thích tăng sinh biệt hóa tế bào gốc thần kinh số dược liệu Việt Nam Chủ nhiệm đề tài ThS Phan Kim Ngọc & ThS Trương Hải Nhung CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận) Tp Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2015 ! TĨM TẮT Việc nghiên cứu sàng lọc dược liệu thiên nhiên nhằm kích thích tăng trưởng biệt hóa tế bào gốc thần kinh hạn chế Việt Nam Thế giới Nghiên cứu nhằm đánh giá hoạt tính kích thích tăng sinh biệt hóa tế bào gốc thần kinh in vitro in vivo Sâm Ngọc Linh, Nấm Linh chi đỏ rau đắng biển); sở để phát triển sản phẩm bổ sung hay thuốc hỗ trợ/điều trị bệnh Đề tài thu nhận số kết quan trọng sau: - Đã thu nhận phân đoạn cao Sâm Ngọc Linh, phân đoạn cao Nấm Linh chi đỏ phân đoạn cao rau đắng biển Các cao thu nhận đạt yêu cầu cho thử nghiệm in vitro in vivo - Phân lập, nuôi cấy xác định đặc điểm tế bào gốc thần kinh chuột thu nhận từ não thai chuột Giải đông nuôi cấy tế bào gốc thần kinh người (H9) Đã thiết lập quy trình đánh giá khả tăng sinh neurosphere/tế bào lớp đơn - Bước đầu kết nghiên cứu cho thấy cao cồn tổng Nấm linh chi đỏ nồng độ 500 ug/ml, cao phân đoạn nước rau đắng biển với nồng độ 500 µg/ml cao cồn tổng sâm Ngọc linh (200 ug/ml) có kích thích tăng sinh tế bào gốc thần kinh So sánh loại dược liệu, cao cồn tổng Sâm Ngọc Linh cho hiệu kích thích tăng sinh tốt (sphere tăng 27% so với chứng âm), gia tăng biểu gen Ki67, Cyclin A, C D, kích thích tế bào vào pha G2/M hiệu so với phân đoạn khác Sâm Ngọc Linh, Nấm Linh chi Rau đắng biển - Đánh giá hiệu kích thích biệt hố phân đoạn cao chiết lên tế bào gốc thần kinh Kết cho thấy phân đoạn n-butanol rau đắng (200 ug/ml) có tác động gây biệt hoá mạnh - Đã xây dựng mơ hình chuột tiền bệnh Parkinson với biểu như: tăng biểu gen gây viêm gene th; tăng số lượng tế bào hoại tử vùng não Phân đoạn Sâm cồn tổng (500 mg/kg) có tác dụng hạn chế hoại tử tế bào vùng chất đen chuột, kích thích tăng biểu gene th ! 1! ! ABSTRACT The study screened the herbs that stimulate the growth and differentiation of neural stem cells today is still limited in Vietnam and around the world This study will evaluate the effects of Panax vietnamensis, Ganoderma lucidum and Bacopa monnieri on neural stem cells proliferation and differentiation in vitro and in vivo; this is the first step for the development of additional products or supports drug for treatment The research has gained some important results are as follows: - Isolation extractions of Panax vietnamensis, extractions Ganoderma lucidum and extractions of Bacopa monnieri All extraction/fraction qualified enough for in vitro and in vivo investigation - Isolated, cultured and characterised mouse neural stem cells derived from mouse fetal brain Thawed and cultured human neural stem cells (H9) This study also introduces a model for pharmaceutical screening on neural stem cells - In studies, alcoholic extraction of Ganoderma lucidum (500 ug/ml), aqueous extraction of Bacopa monnieri (500 ug/ml) and alcoholic extraction of ginseng (200 ug / ml) have affected on neural stem cell proliferation Alcoholic extraction of ginseng (200 ug / ml) was the best extraction compared to Ganoderma lucidum and Bacopa monnieri - We have investigated the effect of herbs on neural stem cell differentiation The results showed that n-butanol (200 ug/ml) was the best dose on neural stem cell differentiation - Pre-Parkinsonian mouse model were established by using MPTP (15mg/kg/day x days) With specific criteria: a Increased inflammatory gene expression and tyrosine hydroxylase enhanced synthesis; b Increasing the number of necrosis cells in the midbrain Alcoholic extraction of Panax vietnamensis (500 mg/kg) has reduced cell death and stimulated the th gene expression in the substantia nigra region ! ! 2! ! MỤC LỤC TÓM TẮT ABSTRACT MỤC LỤC DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH SÁCH BẢNG, BIỂU ĐỒ 10 DANH SÁCH HÌNH 12 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 23 1.1 Bệnh Parkinson 23 1.2 Tế bào gốc thần kinh (neural stem cell _ NSC) 26 1.2.1 Định nghĩa 26 1.2.2 Các vị trí thu nhận NSC 27 1.2.3 Ứng dụng tế bào gốc thần kinh 28 1.2.4 Nuôi cấy tế bào gốc thần kinh 30 1.3 Một số nghiên cứu sử dụng dược liệu tự nhiên để kích thích tế bào gốc thần kinh 33 1.4 Sâm Ngọc Linh 35 1.5 Nấm Linh chi đỏ 38 1.6 Rau đắng biển 42 1.7 Mô hình chuột bệnh Parkinson 45 CHƯƠNG II NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 51 2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu thu nhận phân đoạn dịch chiết dược thảo ứng viên (Sâm Ngọc Linh, Nấm Linh Chi đỏ Rau đắng biển) 51 2.1 Quy trình chiết Sâm Ngọc Linh 51 2.1 Quy trình chiết Rau đắng biển 52 2.1 Quy trình chiết Nấm Linh chi 54 2.1 Xử lý mẫu kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) 55 2.1 Phương pháp HPLC định lượng ganoderic acid A 55 2.1 Phương pháp sắc kí lớp mỏng 55 2.2 Nội dung 2: Nuôi cấy tế bào gốc thần kinh 56 ! 3! ! 2.2.1 Phương pháp thu nhận não thai chuột 57 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào gốc thần kinh từ não thai chuột 58 2.2.3 Phương pháp cấy chuyền tế bào gốc thần kinh 58 2.2.5 Phương pháp đánh giá khả tự làm tế bào gốc ứng viên 59 2.2.6 Phương pháp chứng minh tế bào ứng viên có biểu marker chuyên biệt tế bào gốc thần kinh 60 2.2.7 Phương pháp chứng minh tế bào ứng viên có biểu gene chuyên biệt tế bào gốc thần kinh 61 2.2.8 Phương pháp chứng minh tế bào ứng viên có khả biệt hóa thành tế bào astrocyte 62 2.3 Nội dung 3: Đánh giá tác động kích thích tăng sinh dược liệu lên khả tăng sinh tế bào gốc thần kinh in vitro 64 2.3.2 Phương pháp đánh giá chu kì tế bào 65 2.3.3 Phương pháp đánh giá biểu gen liên quan đến chu kì tế bào q-RT-PCR (theo phương pháp 2.2.7) 65 2.3.4 Phương pháp đo đường cong tăng trưởng tế bào thực thời (Hệ thống xCelligence) 65 2.4 Nội dung 4: Đánh giá tác động kích thích biệt hóa dược liệu lên khả biệt hóa tế bào gốc thần kinh in vitro 67 2.4.1 Phương pháp đánh giá gen liên quan đến q trình biệt hố qRTPCR (theo phương pháp 2.2.7) 68 2.4.2 Phương đánh giá biểu marker biệt hoá flow cytometry 68 2.4.3 Phương pháp nhuộm hoá miễn dịch tế bào 69 2.5 Nội dung 5: Đánh giá tác động kích thích tăng sinh, biệt hóa dược liệu lên tế bào gốc thần kinh in vivo mơ hình chuột bệnh Parkinson chuột bình thường 70 2.5.1 Quy trình tiêm MPTP cho chuột 70 2.5.2 Phương pháp đếm tế bào công cụ ITCN phần mềm Image J 1.49v 70 2.5.3 Phương pháp đánh giá biểu gene th sử dụng RT-PCR (theo phương pháp) 71 ! 4! ! 2.5.4 Phương pháp đánh giá hóa mơ miễn dịch [1, 4, 25, 26] 71 2.5.5 Phương pháp đánh giá hành vi vận động 75 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 77 3.1 Kết nội dung Nghiên cứu thu nhận phân đoạn dịch chiết Sâm Ngọc Linh, rau đắng biển nấm linh chi đỏ 77 3.1.1 Kết thu nhận cao chiết Sâm Ngọc Linh 77 3.1.2 Kết thu nhận cao chiết Nấm linh chi 80 3.1.3 Kết thu nhận cao chiết Rau đắng biển 82 Kết nội dung Nuôi cấy tế bào gốc thần kinh 83 3.2.1 Thu nhận nuôi cấy tế bào gốc thần kinh từ não chuột 83 3.2.2 Giải đông nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc thần kinh người 97 3 Kết nội dung 3: Đánh giá tác động kích thích tăng sinh dược liệu lên khả tăng sinh tế bào gốc thần kinh in vitro 98 3.3.1 Kết khảo sát tác động kích thích tăng dược liệu khác nồng độ khác dòng tế bào gốc chuột 98 3.3.2 Kết khảo sát tác động kích thích tăng sinh dược liệu khác nồng độ khác dòng tế bào gốc người 117 Kết nội dung 4: Đánh giá tác động kích thích biệt hóa dược liệu lên khả biệt hóa tế bào gốc thần kinh in vitro 122 3.4.1 Kết giá tác động kích thích biệt hố dược liệu lên khả biệt hoá tế bào gốc thần kinh chuột 122 3.4.2 Kết giá tác động kích thích biệt hố dược liệu lên khả biệt hoá tế bào gốc thần kinh người 123 Nội dung 5: Đánh giá tác động kích thích tăng sinh, biệt hóa dược liệu lên tế bào gốc thần kinh in vivo mơ hình chuột bệnh Parkinson chuột bình thường 123 3.5.1 Kết xây dựng mơ hình chuột bệnh Parkinson 123 3.5.2 Kết đánh giá hiệu hồi phục mơ hình chuột tiêm MPTP với liều cận cấp tính 15 mg/kg/liều/ngày x ngày cho uống cao cồn tổng sâm Ngọc Linh 134 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 140 ! 5! ! Kết luận 140 Kiến nghị 140 TÀI LIỆU THAM KHẢO 142 PHỤ LỤC 151 PHỤ LỤC SẢN PHẨM PHỤ LỤC ĐÀO TẠO PHỤ LỤC QUẢN LÝ ! 6! ! DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ Tiếng Anh Tiếng Việt giải thích BSA Bovine serum albumin Albumin từ huyết bò CNS central nervous system Hệ thần kinh trung ương DAT Dopamine Transporter Kênh vận chuyển dopamine DMEM Dulbecco’s modified eagle medium EGF epidermal growth factor bFGF Basic fibroblast growth factor ERK extracellular receptor kinase FBS fetal bonvine serum Huyết bào thai bò FGF-2 fibroblast growth factor Nhân tố tăng trưởng nguyên viết tắt Nhân tố tăng trưởng biểu mô Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi bào sợi GADPH Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase GFAP glial fibrillary acidic protein GPe Globus Pallidus external Bèo nhạt phần bên GPi Globus Pallidus internal Bèo nhạt phần bên HBSS Hank’s Balanced Salt Solution Dung dịch muối cân Hank H&E Hematoxylin and eosin HSC hematopoietic stem cell IL-1β interleukin 1β IL-2 interleukin IL-6 interleukin INF-γ interferon-γ iPSC induced pluripotent stem cell Tế bào gốc vạn cảm ứng LIF leukemia inhibitor factor Nhân tố ức chế bạch cầu MAO-A Monoamine oxidase A Enzyme oxy hóa monoamine A ! Tế bào gốc tạo máu 7! ! CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Thu nhận phân đoạn cao rau đắng biển (03 phân đoạn), nấm linh chi (03 phân đoạn) sâm ngọc linh (04 phân đoạn) - Nuôi cấy thành công tế bào gốc thần kinh từ não thai chuột trưởng thành đánh giá đặc tính gốc khả biệt hóa tế bào thu nhận đươc Giải đông nuôi cấy thành công tế bào gốc thần kinh người (dòng H9) - Đã thiết lập quy trình đánh giá khả tăng sinh neurosphere/tế bào lớp đơn Bước đầu kết nghiên cứu cho thấy cao chiết ethanol Nấm linh chi đỏ nồng độ 500 µg cho kết tăng sinh tốt Ở phân đoạn cao chiết rau đắng, phân đoạn nước với nồng độ 500 µg/ml cho kết kích thích tăng sinh cao Cao chiết tổng sâm Ngọc linh (200 µg/ml) cho kết tốt So sánh loại dược liệu, cao tổng Sâm Ngọc Linh cho hiệu kích thích tăng sinh tốt (sphere tăng 27% so với chứng âm), gia tăng biểu gen Ki67, Cyclin A, C D, kích thích tế bào vào pha G2/M hiệu so với phân đoạn khác Sâm Ngọc Linh, Nấm Linh chi rau đắng biển - Đánh giá hiệu kích thích biệt hố phân đoạn cao chiết lên tế bào gốc thần kinh Kết cho thấy cao phân đoạn n-butanol rau đắng biển (200 µg/ml) có tác động gây biệt hố mạnh - Đã xây dựng mơ hình chuột tiền bệnh Parkinson với biểu như: tăng biểu gen gây viêm gene th; tăng số lượng tế bào hoại tử vùng não - Cao tổng Sâm Ngọc Linh (500 mg/kg) có tác dụng hạn chế hoại tử tế bào vùng chất đen chuột, kích thích tăng biểu gene th Kiến nghị - Hướng nghiên cứu nên tiếp tục đầu tư thực tiếp để triển khai ứng dụng ! 140! ! - Khảo sát thêm nồng độ cao chiết mơ hình tế bào gốc thần kinh để tối ưu hố mơ hình Nghiên cứu đánh giá nồng độ khác phân đoạn Sâm Ngọc Linh - Tiến hành thêm đánh giá khả kích thích biệt hố dược liệu tế bào như: flow cytometry, hoá miễn dịch tế bào,… - Đối với mơ hình chuột Parkinson: kéo dài thêm thời gian xử lý MPTP chuột (10 ngày, 15 ngày 20 ngày) Khảo sát thêm nồng độ khác cao tổng Sâm Ngọc Linh - Khảo sát nhóm hoạt chất hay hoạt chất định tác dụng Sâm Ngọc Linh rau đắng biển ! ! 141! ! TÀI LIỆU THAM KHẢO http://atlas.brain-map.org/atlas?atlas=1 - atlas=1&plate=100960073&structure-=374&x=5280&y=3744&zoom=3&resolution=16.75&z=5 [cited http://ino.sagepub.com/content/2/4/222/F1.expansion.html [cited http://www.download.thelancet.com/journals/laneur/article/PIIS14744422%2809%2970062-6/fulltext [cited http://www.lifetechnologies.com/vn/en/home/life-science/proteinbiology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resourcelibrary/pierce-protein-methods/overview-immunohistochemistry.html [cited Ajith, T.A., N.P Sudheesh, D Roshny, G Abishek, and K.K Janardhanan (2009), "Effect of Ganoderma lucidum on the activities of mitochondrial dehydrogenases and complex I and II of electron transport chain in the brain of aged rats", Exp Gerontol, 44(3): p 219-23 Azari, H., M Rahman, S Sharififar, and B.A Reynolds (2010), "Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.", J Vis Exp, 45 Beitz, J.M (2014), "Parkinson's disease: a review", Front Biosci (Schol Ed), 6: p 65-74 Bezard, E., C.E Gross, and J.M Brotchie (2003), "Presymptomatic compensation in Parkinson's disease is not dopamine-mediated", Trends Neurosci, 26(4): p 215-21 Birks, J., E.V Grimley, and M Van Dongen (2002), "Ginkgo biloba for cognitive impairment and dementia", Cochrane Database Syst Rev, (4): p CD003120 10 Bové, J., D Prou, C Perier, and S Przedborski (2005), "Toxin-Induced Models of Parkinson's Disease", NeuroRx, 2(3): p 484-94 11 Carter, Ava C., Brandi N Davis-Dusenbery, K Koszka, Justin K Ichida, and K Eggan (2014), "Nanog-Independent Reprogramming to iPSCs with Canonical Factors", Stem Cell Reports, 2(2): p 119-126 ! 142! ! 12 Cheung, W.M., W.S Hui, P.W Chu, S.W Chiu, and N.Y Ip (2000), "Ganoderma extract activates MAP kinases and induces the neuronal differentiation of rat pheochromocytoma PC12 cells", FEBS Lett, 486(3): p 291-6 13 Cho, I.-H (2012), "Effects of Panax ginseng in Neurodegenerative Diseases", Journal of Ginseng Research, 36(4): p 342-353 14 Choi, Y.T., C.H Jung, S.R Lee, J.H Bae, W.K Baek, M.H Suh, J Park, C.W Park, and S.I Suh (2001), "The green tea polyphenol (-)epigallocatechin gallate attenuates beta-amyloid-induced neurotoxicity in cultured hippocampal neurons", Life Sci, 70(5): p 603-14 15 Chowdhuri, D.K., D Parmar, P Kakkar, R Shukla, P.K Seth, and R.C Srimal (2002), "Antistress effects of bacosides of Bacopa monnieri: modulation of Hsp70 expression, superoxide dismutase and cytochrome P450 activity in rat brain", Phytother Res, 16(7): p 639-45 16 Date, I., D.L Felten, and S.Y Felten (1990), "Long-term effect of MPTP in the mouse brain in relation to aging: neurochemical and immunocytochemical analysis", Brain Res, 519(1-2): p 266-76 17 de Ostrovich, K.K., I Lambertz, J.K.L Colby, J Tian, J.E Rundhaug, D Johnston, C.J Conti, J DiGiovanni, and R Fuchs-Young (2008), "Paracrine Overexpression of Insulin-Like Growth Factor-1 Enhances Mammary Tumorigenesis in Vivo", The American Journal of Pathology, 173(3): p 824-834 18 DeFeudis, F.V and K Drieu (2000), "Ginkgo biloba extract (EGb 761) and CNS functions: basic studies and clinical applications", Curr Drug Targets, 1(1): p 25-58 19 Dhanasekaran, M., B Tharakan, L.A Holcomb, A.R Hitt, K.A Young, and B.V Manyam (2007), "Neuroprotective mechanisms of ayurvedic antidementia botanical Bacopa monniera", Phytother Res, 21(10): p 965-9 20 Ferrari, D., E Binda, L.D Filippis, and A.L Vescovi, solation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique , in Curr Protoc Stem Cell Biol 2010 ! 143! ! 21 Fleming, S.M., J Salcedo, P.-O Fernagut, E Rockenstein, E Masliah, M.S Levine, and M.-F Chesselet (2004), "Early and Progressive Sensorimotor Anomalies in Mice Overexpressing Wild-Type Human α-Synuclein", The Journal of Neuroscience, 24(42): p 9434-9440 22 Fujii, T., B.C Fuchs, S Yamada, G.Y Lauwers, Y Kulu, J.M Goodwin, M Lanuti, and K.K Tanabe (2010), "Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor", BMC Gastroenterology, 10: p 79-79 23 Fukuda, T (2001), "Neurotoxicity of MPTP", Neuropathology, 21(4): p 323-32 24 Fuller, R.W and S.K Hemrick-Luecke (1990), "Tissue concentrations of MPTP and MPP+ after administration of lethal and sublethal doses of MPTP to mice", Toxicol Lett, 54(2-3): p 253-62 25 Gage, G.J., D.R Kipke, and W Shain (2012), "Whole animal perfusion fixation for rodents", J Vis Exp, 65: p 3564 26 Hare, D.J., J.L George, L Bray, I Volitakis, A Vais, T.M Ryan, R.A Cherny, A.I Bush, C.L Masters, and P.A Adlard (2014), "The effect of paraformaldehyde fixation and sucrose cryoprotection on metal concentration in murine neurological tissue", Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 29(3): p 565-570 27 HK, S and D BN (1997), "Neuropsychopharmacological effects of the Ayurvedic nootropic Bacopa monniera Linn (Brahmi) ", Ind J Pharmacol 29(S359) 28 Ho, A and M Blum (1998), "Induction of interleukin-1 associated with compensatory dopaminergic sprouting in the denervated striatum of young mice: model of aging and neurodegenerative disease", J Neurosci, 18(15): p 5614-29 29 Huang, X., C.A Whitworth, and L.P Rybak (2007), "Ginkgo biloba extract (EGb 761) protects against cisplatin-induced ototoxicity in rats", Otol Neurotol, 28(6): p 828-33 ! 144! ! 30 Hunot, S., N Dugas, B Faucheux, A Hartmann, M Tardieu, P Debre, Y Agid, B Dugas, and E.C Hirsch (1999), "FcepsilonRII/CD23 is expressed in Parkinson's disease and induces, in vitro, production of nitric oxide and tumor necrosis factor-alpha in glial cells", J Neurosci, 19(9): p 3440-7 31 Hurley, L.L and Y Tizabi (2013), "Neuroinflammation, neurodegeneration, and depression", Neurotox Res, 23(2): p 131-44 32 Hwang, Y.J., E.J Lee, H.R Kim, and K.A Hwang (2013), "NF-kappaBtargeted anti-inflammatory activity of Prunella vulgaris var lilacina in macrophages RAW 264.7", Int J Mol Sci, 14(11): p 21489-503 33 I, A., J A, V C, R MA, and R H ( 2002), "Differential modulation of growth and glutathione metabolism in cultured rat astrocytes by 4hydroxynonenal and green tea polyphenol, epigallocatechin-3-gallate ", Neurotoxicology, 23: p 289-300 34 Inomata, T., N Ebihara, T Funaki, A Matsuda, Y Watanabe, L Ning, Z Xu, A Murakami, and E Arikawa-Hirasawa (2012), "Perlecan-deficient mutation impairs corneal epithelial structure", Invest Ophthalmol Vis Sci, 53(3): p 1277-84 35 Jang, M.H., H.K Chang, M.C Shin, T.H Lee, Y.P Kim, E.H Kim, and C.J Kim (2003), "Effect of ginseng radix on c-Fos expression in the hippocampus of streptozotocin-induced diabetic rats", J Pharmacol Sci, 91(2): p 149-52 36 Javitch, J.A., R.J D'Amato, S.M Strittmatter, and S.H Snyder (1985), "Parkinsonism-inducing neurotoxin, N-methyl-4-phenyl-1,2,3,6 - tetrahydropyridine: uptake of the metabolite N-methyl-4-phenylpyridine by dopamine neurons explains selective toxicity", Proc Natl Acad Sci U S A, 82(7): p 2173-7 37 Jiang, K.Y and Z.N Qian (1995), "Effects of Panax notoginseng saponins on posthypoxic cell damage of neurons in vitro", Zhongguo Yao Li Xue Bao, 16(5): p 399-402 38 Kirkham, D.L., L.K Pacey, M.M Axford, R Siu, D Rotin, and L.C Doering (2006), "Neural stem cells from protein tyrosine phosphatase sigma ! 145! ! knockout mice generate an altered neuronal phenotype in culture", BMC Neurosci, 7: p 50 39 Kozina, E.A., G.R Khakimova, V.G Khaindrava, V.G Kucheryanu, N.E Vorobyeva, A.N Krasnov, S.G Georgieva, L Kerkerian-Le Goff, and M.V Ugrumov (2014), "Tyrosine hydroxylase expression and activity in nigrostriatal dopaminergic neurons of MPTP-treated mice at the presymptomatic and symptomatic stages of parkinsonism", J Neurol Sci, 340(1-2): p 198-207 40 Kunte, K.B and Y Kuna (2013), "Neuroprotective effect of Bacopa monniera on memory deficits and ATPase system in Alzheimer’s disease (AD) induced mice", Journal of Scientific and Innovative Research, 2(4): p 719-735 41 Langston, J.W., P Ballard, J.W Tetrud, and I Irwin (1983), "Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis", Science, 219(4587): p 979-80 42 Lawson, L.J., V.H Perry, P Dri, and S Gordon (1990), "Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain", Neuroscience, 39(1): p 151-70 43 Lee, J.H., S.R Kim, C.S Bae, D Kim, H Hong, and S Nah (2002), "Protective effect of ginsenosides, active ingredients of Panax ginseng, on kainic acid-induced neurotoxicity in rat hippocampus", Neurosci Lett, 325(2): p 129-33 44 Lieu, C.W., S.S Lee, and S.Y Wang (1992), "The effect of Ganoderma lucidum on induction of differentiation in leukemic U937 cells", Anticancer Res, 12(4): p 1211-5 45 Limpeanchob, N., S Jaipan, S Rattanakaruna, W Phrompittayarat, and K Ingkaninan (2008), "Neuroprotective effect of Bacopa monnieri on betaamyloid-induced cell death in primary cortical culture", J Ethnopharmacol, 120(1): p 112-7 46 Lin, T., M Liu Y Fau - Shi, X Shi M Fau - Liu, L Liu X Fau - Li, Y Li L Fau - Liu, G Liu Y Fau - Zhao, and G Zhao, "Promotive effect of ! 146! ! ginsenoside Rd on proliferation of neural stem cells in vivo and in vitro", (1872-7573 (Electronic)) 47 Lin, T., Y Liu, M Shi, X Liu, L Li, Y Liu, and G Zhao (2012), "Promotive effect of ginsenoside Rd on proliferation of neural stem cells in vivo and in vitro", J Ethnopharmacol, 142(3): p 754-61 48 McGonigle, P (2014), "Animal models of CNS disorders", Biochem Pharmacol, 87(1): p 140-9 49 Miller, D.B., S.F Ali, J.P O'Callaghan, and S.C Laws (1998), "The impact of gender and estrogen on striatal dopaminergic neurotoxicity", Ann N Y Acad Sci, 844: p 153-65 50 More, S.V., S Koppula, I.S Kim, H Kumar, B.W Kim, and D.K Choi (2012), "The role of bioactive compounds on the promotion of neurite outgrowth", Molecules, 17(6): p 6728-53 51 Müller-Tidow, C., P Ji, S Diederichs, J Potratz, N Bäumer, G Köhler, T Cauvet, C Choudary, T van der Meer, W.-Y.I Chan, C Nieduszynski, W.H Colledge, M Carrington, H.P Koeffler, A Restle, L Wiesmüller, J Sobczak-Thépot, W.E Berdel, and H Serve (2004), "The Cyclin A1-CDK2 Complex Regulates DNA Double-Strand Break Repair", Molecular and Cellular Biology, 24(20): p 8917-8928 52 Peh, G.S., R.J Lang, M.F Pera, and S.M Hawes (2009), "CD133 expression by neural progenitors derived from human embryonic stem cells and its use for their prospective isolation.", Stem Cells Dev , 18(2): p 269-82 53 Reynolds, B.A and S Weiss (1992), "Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system", Science, 255(5052): p 1707-10 54 Santaguida, M., K Schepers, B King, A.J Sabnis, E.C Forsberg, J.L Attema, B.S Braun, and E Passegue (2009), "JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal", Cancer Cell, 15(4): p 34152 ! 147! ! 55 Shinomol, G.K., R.B Mythri, M.M Srinivas Bharath, and Muralidhara (2012), "Bacopa monnieri extract offsets rotenone-induced cytotoxicity in dopaminergic cells and oxidative impairments in mice brain", Cell Mol Neurobiol, 32(3): p 455-65 56 Shukia, B., N.K Khanna, and J.L Godhwani (1987), "Effect of Brahmi Rasayan on the central nervous system", J Ethnopharmacol, 21(1): p 65-74 57 Shults, C.W (2003), "Coenzyme Q10 in neurodegenerative diseases", Curr Med Chem, 10(19): p 1917-21 58 Suslov, O.N., V.G Kukekov, T.N Ignatova, and D.A Steindler (2002), "Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres", Proc Natl Acad Sci U S A, 99(22): p 14506-11 59 SY, J., B K, S YH, and S KS (2003), "Green tea catechins as a BACE1 (beta-secretase) inhibitor.", Bioorg Med Chem Lett, 13: p 3905–3908 60 Tansey, M.G and M.S Goldberg (2010), "Neuroinflammation in Parkinson's disease: its role in neuronal death and implications for therapeutic intervention", Neurobiol Dis, 37(3): p 510-8 61 Tillerson, J.L and G.W Miller (2003), "Grid performance test to measure behavioral impairment in the MPTP-treated-mouse model of parkinsonism", Journal of neuroscience methods, 123(2): p 189-200 62 Tofighi, R., M Moors, R Bose, W.N Ibrahim, and S Ceccatelli (2011), "Neural stem cells for developmental neurotoxicity studies", Methods Mol Biol, 758: p 67-80 63 Tran, Q.L., I.K Adnyana, Y Tezuka, T Nagaoka, Q.K Tran, and S Kadota (2001), "Triterpene saponins from Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis) and their hepatocytoprotective activity", J Nat Prod, 64: p 456-61 64 Uabundit, N., J Wattanathorn, S Mucimapura, and K Ingkaninan (2010), "Cognitive enhancement and neuroprotective effects of Bacopa monnieri in Alzheimer's disease model", J Ethnopharmacol, 127(1): p 26-31 65 Uddin Biswas, M.H., C Du, C Zhang, J Straubhaar, L.R Languino, and K.C Balaji (2010), "Protein Kinase D1 Inhibits Cell Proliferation through ! 148! ! Matrix Metalloproteinase (MMP) -2 and -9 Secretion in Prostate Cancer", Cancer research, 70(5): p 2095-2104 66 Volpicelli, F., C Perrone-Capano, P Da Pozzo, L Colucci-D'Amato, and U di Porzio (2004), "Modulation of nurr1 gene expression in mesencephalic dopaminergic neurones", J Neurochem, 88(5): p 1283-94 67 Wang, B., G Feng, C Tang, L Wang, H Cheng, Y Zhang, J Ma, M Shi, and G Zhao (2013), "Ginsenoside Rd maintains adult neural stem cell proliferation during lead-impaired neurogenesis", Neurol Sci, 34(7): p 11818 68 Wang, M., J.R Doucette, and A.J Nazarali (2011), "Conditional Tetregulated over-expression of Hoxa2 in CG4 cells increases their proliferation and delays their differentiation into oligodendrocyte-like cells expressing myelin basic protein", Cell Mol Neurobiol, 31(6): p 875-86 69 Wang, Q., H Zheng, Z.F Zhang, and Y.X Zhang (2008), "[Ginsenoside Rg1 modulates COX-2 expression in the substantia nigra of mice with MPTP-induced Parkinson disease through the P38 signaling pathway]", Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao, 28(9): p 1594-8 70 Xu, L., W.F Chen, and M.S Wong (2009), "Ginsenoside Rg1 protects dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson's disease through the IGFI receptor signalling pathway", Br J Pharmacol, 158(3): p 738-48 71 Yoon, H.M., K.J Jang, M.S Han, J.W Jeong, G.Y Kim, and J.H Lee (2013), "Ganoderma lucidum ethanol extract inhibits the inflammatory response by suppressing the F-kappaB and toll-like receptor pathways in lipopolysaccharide-stimulated BV2 microglial cells", Exp Ther Med, 5: p 957-963 72 Zhang, R., S Xu, Y Cai, M Zhou, X Zuo, and P Chan (2011), "Ganoderma lucidum Protects Dopaminergic Neuron Degeneration through Inhibition of Microglial Activation", Evid Based Complement Alternat Med, 2011: p 156810 73 Zhou, J., M.Z Wu, S Taniyasu, H Besso, O Tanaka, Y Saruwatari, and T Fuwa (1981), "Dammarane-saponins of sanchi-ginseng, roots of Panax ! 149! ! notoginseng (Burk); F.H Chen (Araliaceae): Structures of new saponins, notoginsenosides-R1 and –R2, and identification of ginsenoside-Rg2 and – Rh1", Chem Pharm Bull., 29: p 2844-2850 74 Zhu, W.W., Z.L Liu, H.W Xu, W.Z Chu, Q.Y Ye, A.M Xie, L Chen, and J.R Li (2005), "[Effect of the oil from ganoderma lucidum spores on pathological changes in the substantia nigra and behaviors of MPTP-treated mice]", Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao, 25(6): p 667-71 ! 150! ! PHỤ LỤC ! ! ! - Phụ lục sản phẩm - Phụ lục đào tạo - Phụ lục quản lý 151! ! PHỤ LỤC SẢN PHẨM - Quy trình phân lập tế bào gốc thần kinh từ não thai chuột - Quy trình đánh giá hiệu kích thích tăng sinh dược liệu mơ hình tế bào gốc thần kinh in vitro - Quy trình đánh giá hiệu khả kích thíc biệt hố dược liệu mơ hình tế bào gốc thần kinh - Quy trình tạo mơ hình chuột bệnh Parkinson - Kết đánh giá hiệu điều trị dược liệu lên tế bào gốc thần kinh in vivo mơ hình chuột Parkinson (đã trình bày báo cáo nghiệm thu) - Kết đánh giá hiệu kích thích tăng sinh biệt hố dược liệu tế bào gốc thần kinh chuột in vivo (đã trình bày báo cáo nghiệm thu - Quy trình thu nhận cao chiết thơ phân đoạn dược liệu - Bảng phân tích hiệu dược liệu tế bào gốc thần kinh in vitro (đã trình bày báo cáo nghiệm thu) - Bảng phân tích hiệu dược liệu tế bào gốc thần kinh vi vivo chuột bệnh Parkinson chuột bình thường (đã trình bày báo cáo nghiệm thu) - Bài báo khoa học: • báo quốc tế thuộc ISI • báo tạp chí nước ngồi • tham gia hội nghị quốc tế • tham gia hội nghị nước ! ! ! 1! ! PHỤ LỤC ĐÀO TẠO " Trình độ đại học: cử nhân Tôn Long Tuấn - Phân lập, nuôi cấy bảo quản tế bào gốc thần kinh từ thai chuột nhắt trắng Lê Minh Dũng - Phân lập, nuôi cấy bảo quản tế bào gốc thần kinh từ não thai chuột nhắt trắng Phan Thị Ngọc Yên - Khảo sát tác động cao chiết thô sâm ngọc linh (Panax vietnamensis) đến tăng sinh tế bào gốc thần kinh Đặng Thanh Long - Đánh giá tác động cao chiết thô sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) lên tăng sinh tế bào gốc thần kinh phân lập từ thai chuột nhắt trắng Hồng Minh Triết - Khảo sát tăng trưởng tế bào gốc thần kinh phân lập từ não thai chuột nhắt trắng Nguyễn Nhật Nam - Đánh giá tác động cao chiết rau đắng biển (Bacopa monnieri (L) Wesst) lên tăng sinh tế bào gốc thần kinh phân lập từ não thai chuột nhắt trắng Mus musculus var Albino Nguyễn Thị Mai Đan - Khảo sát ảnh hưởng cao chiết nấm linh chi (Ganoderma lucidum) lên tế bào gốc thần kinh phân lập từ não thai chuột nhắt trắng Mus musculus var Albino Đoàn Xuân Hiển – Khảo sát tác động cao chiết rau đắng biển (Bacopa monnieri) lên tăng sinh biệt hoá tế bào gốc thần kinh chuột Đỗ Quang Huy - Nghiên cứu tạo mơ hình chuột mang bệnh Parkinson cảm ứng hố chất 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6 Tetrahydropyridine (MPTP) " Trình độ thạc sĩ: 01 (đã duyệt đề cương) Lê Minh Dũng – Khảo sát tác động dịch chiết Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) lên tăng sinh biệt hoá mơ hình tế bào gốc thần kinh người ! 2! ! PHỤ LỤC QUẢN LÝ ! - Xác nhận tốn kinh phí - Hợp đồng thực đề tài - Thuyết minh đề tài 3!