Xây dựng mô hình chuột nhắt trắng mus musculus var albino bị hoại tử xương chi do glucocorticoid

SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ * BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu ngày……………… ) XÂY DỰNG MÔ HÌNH CHUỘT NHẮT TRẮNG (Mus musculus var Albino) BỊ HOẠI TỬ XƯƠNG CHI DO GLUCOCORTICOID Thủ trưởng Cơ quan chủ trì đề tài (Họ tên, chữ ký, đóng dấu) Chủ nhiệm đề tài (Họ tên chữ ký) Đặng Kim Thành Đặng Thị Tùng Loan Giám đốc Sở Khoa học Công nghệ Chủ tịch Hội đồng nghiệm thu DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT Asp Asparaginase Asparaginase BMP Bone morphogenetic protein Protein tạo hình thái xương Dex Dexamethasone Dexamethasone ĐC Đối chứng FCM Flow cytometry Phân tích tế bào dịng chảy FSC Forward light scatter Tán xạ phương tới GC Glucocorticoid Glucocorticoid H&E Hematoxylin & eosin Hematoxylin & eosin OB Osteoblast Tạo cốt bào OCL Osteoclast Hủy cốt bào OCN Osteocalcin Osteocalcin OC Osteocyte Cốt bào Osteogenic cell Tế bào tạo xương Osteoprogenitor cell Tế bào tiền thân tạo xương Phosphate buffered saline Dung dịch muối đệm PBS phosphate PI Propidium iodide Propidium iodide Runx Runt-related transcription factor Yếu tố phiên mã có liên quan đến biệt hóa tạo cốt bào SSC TN Side scatter Tán xạ phương bên Thí nghiệm iv MỤC LỤC Tóm tắt đề tài i Mục lục ii Danh sách chữ viết tắt iv Danh sách bảng v Danh sách hình vi Phần mở đầu 1 Tổng quan 1.1 Giới thiệu 1.2 Mô hình động vật bệnh lí hoại tử xương 1.2.1 Sự tương đồng khác biệt xương người chuột 1.2.2 Mơ hình động vật bệnh lí hoại tử xương 1.2.3 Tác dụng gây hoại tử xương glucocorticoid 1.2.3.1 Giới thiệu 1.2.3.2 Vai trò apoptosis tế bào miễn dịch 1.2.3.3 Tác động lên tế bào xương 1.2.3.4 Các tác động lên mạch máu nuôi xương 1.2.3.5 Sự xuất huyết tủy 10 1.2.3.6 Glucocorticoid biến dưỡng mỡ 10 1.2.3.7 Các yếu tố nguy bệnh tiềm ẩn cá thể 11 Nội dung phương pháp 12 2.1 Nội dung: Xây dựng mơ hình chuột bị hoại tử xương chi theo liều lượng khác glucocorticoid 12 2.1.1 Mô tả nội dung 12 2.1.1.1 Đối tượng thí nghiệm 12 2.1.1.2 Hóa chất thí nghiệm gây hoại tử xương 12 2.2 Phương pháp nghiên cứu 13 2.2.1 Cơ sở thí nghiệm 13 2.2.1.1 Cơ sở chọn liều Dex 13 ii 2.2.1.2 Cơ sở chọn thời gian dùng Dex 13 2.2.2 Bố trí thí nghiệm 13 2.2.3 Các tiêu theo dõi / đánh giá 14 2.2.3.1 Đánh giá cấu trúc mô học qua mẫu xương nhuộm hematoxylin eosin 14 2.2.3.2 Phương pháp phân tích tế bào tủy xương Flow cytometry 17 2.2.3.3 Đánh giá biểu gen mã hóa cho BMP2, Runx2, OCN mức phiên mã 20 Kết thảo luận 27 3.1 Kết đánh giá tình trạng sinh lí chuột 27 3.1.1 Tình trạng sinh lí 27 3.1.2 Tỉ lệ chuột chết 27 3.1.3 Kết theo dõi thể trọng 29 3.2 Kết kiểm tra mô học 30 3.2.1 Kết kiểm tra mô xương lô đối chứng 30 3.2.2 Kết kiểm tra mô xương lơ thí nghiệm 32 3.2.3 Đánh giá tỉ lệ hoại tử xương 35 3.3 Kết đánh giá tình trạng tế bào tủy xương 36 3.3.1 Kết phân tích apoptosis tế bào tủy xương 36 3.3.2 Kết phân tích chu kì tế bào gốc trung mơ 38 3.3.2.1 Kết thu nhận tế bào gốc trung mô 38 3.3.2.2 Kết phân tích chu kì tế bào gốc trung mô 39 3.4 Kết đánh giá biểu gen mức phiên mã 42 3.4.1 Kết đánh giá biểu gen mã hóa cho BMP2 mức phiên mã 43 3.4.2 Kết đánh giá biểu gen mã hóa cho Runx2 mức phiên mã 44 3.4.3 Kết đánh giá biểu gen mã hóa cho OCN mức phiên mã 45 Kết luận đề nghị 48 Phụ lục vii Tài liệu tham khảo xvii iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số đặc điểm khác biệt xương người xương chuột Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng 23 Bảng 2.2 Quy trình nhiệt phản ứng RT – PCR 24 Bảng 3.1 Tỉ lệ chuột chết lô 27 Bảng 3.2 Sự thay đổi trọng lượng trung bình chuột trước sau thí nghiệm 29 Bảng 3.3 Tỉ lệ chuột hoại tử lô 35 Bảng 3.4 Cường độ biểu gen mức phiên mã lơ thí nghiệm 43 v BÁO CÁO NGHIỆM THU Tên đề tài “Xây dựng mơ hình chuột nhắt trắng (Mus musculus var Albino) bị hoại tử xương chi glucocorticoid” Chủ nhiệm đề tài: Đặng Thị Tùng Loan Cơ quan chủ trì Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ - Số Phạm Ngọc Thạch, phường Bến Nghé, quận 1, TP Hồ Chí Minh Thời gian thực đề tài: 12 tháng (Từ tháng 01/2010 đến tháng 01/2011) Kinh phí duyệt: 80.000.000 đồng (tám mươi triệu đồng) Kinh phí cấp: theo TB số : TB-SKHCN ngày / / Mục tiêu: Tạo chuột mơ hình bị hoại tử xương chi glucocorticoid Nội dung  Xây dựng mơ hình chuột bị hoại tử xương chi theo liều lượng khác glucocorticoid  Đánh giá mức độ hoại tử xương chi chuột Sản phẩm đề tài a Mục tiêu đề tài: mục tiêu ngắn hạn: Tạo chuột mô hình bị hoại tử xương chi glucocorticoid b Nội dung thực TT Tóm tắt nội dung Sản phẩm cần đạt Tạo chuột mơ hình bị hoại tử xương chi gây Quy trình tạo chuột bị Dexamethasone hoại tử xương chi Tạo chuột mô hình bị hoại tử xương chi gây Quy trình tạo chuột bị Dexamethasone kết hợp với Asparaginase hoại tử xương chi Đánh giá biểu gen mã hóa cho BMP2, Runx2, OCN mức phiên mã (thay cho phương pháp Chụp X-quang xương chi chuột theo thời gian) Nhuộm hóa mơ HE xương chi chuột theo thời gian Kiểm tra chu kì phân chia tế bào tủy xương chuột theo thời gian Đánh giá mức độ hoại tử xương chuột mơ hình Bảng kết đánh giá theo thời gian liều lượng Dexamethasone mức độ hoại tử xương c Kết quả/sản phẩm nghiên cứu TT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học, kinh tế Quy trình tạo chuột mơ hình bị Quy trình đơn giản, hiệu hoại tử xương chi gây dễ thực tối ưu Dexamethasone hóa theo điều kiện phịng Ghi thí nghiệm Quy trình tạo chuột mơ hình bị Quy trình đơn giản, hiệu hoại tử xương chi gây dễ thực tối ưu Dexamethasone Asparaginase hóa theo điều kiện phịng thí nghiệm Chuột mơ hình bị hoại tử xương - Đã đánh giá mức độ chi hoại tử xương chi - Là chuột mô hình sử dụng nghiên cứu khác, đặc biệt thử nghiệm dược phẩm liệu pháp ghép tế bào Ít báo cáo Hội Hội nghị Toàn quốc nghị Sinh học, Cơng nghệ Sinh học Ít báo khoa học Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, Sinh học Tổng quan 1.1 Giới thiệu [1] Hoại tử xương tình trạng rối loạn thường gặp với 10.000 đến 20.000 ca mắc bệnh năm Mĩ Ở Bắc Mĩ, hàng năm, hoại tử xương dẫn đến – 18% 500.000 ca thay khớp háng Ở nước châu Á, tỉ lệ cao chiếm phần lớn ca phải thay khớp háng Ở Việt Nam, trước đây, hoại tử xương bệnh gặp Tuy nhiên, gần số lượng bệnh nhân mắc bệnh ngày gia tăng Chỉ riêng bệnh viện chấn thương chỉnh hình thành phố Hồ Chí Minh, hàng năm có 100 ca phải thay khớp bệnh Tại khoa Khớp, Bệnh viện Bạch Mai (Hà Nội), hoại tử xương đùi nằm số 15 bệnh khớp nội trú hay gặp Đây bệnh đa yếu tố có xu hướng gia tăng năm gần Các nguyên nhân gây hoại tử xương chấn thương, lạm dụng thuốc glucocorticoid (GC), dung nhiều bia, rượu, rối loạn đơng máu, … Trong đó, việc dùng liều cao hay thời gian dài thuốc GC nguyên nhân có mức phổ biến thứ hai, sau nguyên nhân chấn thương Hoại tử xương biến chứng nghiêm trọng việc lạm dụng GC Trong đó, thuốc lại dùng rộng rãi có hiệu điều trị đa dạng, từ giảm đau ức chế miễn dịch ca ghép tạng Diễn tiến triệu chứng bệnh hoại tử xương không rõ ràng giai đoạn đầu nên việc phát sớm bệnh khó Hoại tử xương không gây tử vong lại làm cho sinh hoạt ngày người bệnh gặp nhiều khó khăn, khả lao động giảm sút, chí hẳn khả lao động Bệnh thường tác động đến người trẻ độ tuổi 20 – 40 Mặt khác, chế hoại tử xương GC chưa hiểu rõ Ở người trưởng thành, khả tự phục hồi bệnh xương khớp nói chung hoại tử xương nói riêng không cao Do vậy, việc nghiên cứu bệnh biện pháp phòng, điều trị hỗ trợ điều trị bệnh cần thiết Nghiên cứu chế bệnh phương pháp điều trị phù hợp tiến hành nhiều đối tượng người động vật thí nghiệm (thỏ, chuột, chim, cừu, dê, chó, …) Tuy nhiên, liệu pháp điều trị thử nghiệm lại khó thực người Ở Việt Nam, phần lớn nghiên cứu đối tượng chủ yếu cải tiến phương pháp điều trị hành Cho đến nay, việc điều trị bệnh xương khớp gặp nhiều khó khăn (1) chưa có phác đồ điều trị xác, việc điều trị chủ yếu theo triệu chứng để lại nhiều tác dụng phụ nguy hại; (2) bệnh xương khớp khó phát phát muộn, bệnh trở nặng Đối với hoại tử chỏm xương đùi, phương pháp điều trị nhằm mục đích làm giảm đau làm chậm q trình hoại tử, hay thay toàn phần khớp háng hoại tử hồn tồn Khi đó, người bệnh phải chịu đựng tàn tật suốt đời thay phần chức bình thường Vì vậy, động vật thí nghiệm lựa chọn tốt cho việc nghiên cứu phương pháp điều trị hay hỗ trợ điều trị bệnh Trong đó, chuột đối tượng sử dụng phổ biến, thao tác thuận lợi có tính tương đồng tính trạng với người cao Nghiên cứu điều trị hoại tử xương có xu hướng tiếp cận với liệu pháp tế bào Bởi giả thuyết bệnh có nguyên từ tế bào nhiều nhà khoa học đồng thuận Một số nghiên cứu gần chứng minh bên cạnh hoại tử khuyết mạch, apoptosis tế bào xương suy giảm số lượng, tăng sinh tế bào gốc trung mô tế bào tiền thân tạo xương Vì thế, liệu pháp tế bào đánh hướng điều trị triển vọng bệnh Trong giới hạn đề tài, nghiên cứu khơng sâu vào việc tìm hiểu rõ nguyên nhân gây bệnh chế hoại tử xương GC Đề tài tập trung vào việc xây dựng quy trình tạo mơ hình bệnh lí thực nghiệm Mơ hình bệnh lí này, thành công, giúp cho thử nghiệm điều trị hoại tử xương phác đồ dược liệu ghép tế bào thực hiệu 1.2 Mô hình động vật bệnh lí hoại tử xương 1.2.1 Sự tương đồng khác biệt xương người chuột [9][23] Chuột loài gậm nhấm sử dụng nhiều phổ biến nghiên cứu sinh lí bệnh lí học người Nhìn chung, xương chuột xương người giống nhau, trừ vài điểm khác biệt cấu trúc đại thể (Bảng 1.1) Năm 2007, Đại học tổng hợp Jerusalem, giáo sư Itai Bab cs nhận thấy cấu tạo xương chuột hầu hết giống với xương người Trên nguyên tắc, cấu tạo xương chuột xương người có nhiều điểm tương đồng, trừ đặc điểm cấu tạo xương mặt, xương đuôi độ lớn tổng thể xương Theo đó, khớp xương nhau; xương địn tay khuỷu tay có số lượng chi tiết Cả người chuột dễ mắc chứng bệnh phong thấp (thấp khớp) bệnh còi xương (hay nhuyễn xương) Đồng thời, người chuột có tế bào xương tương đồng đến 99% Bảng 1.1 Một số đặc điểm khác biệt xương người xương chuột Xương người Xương chuột Kích thước Lớn Nhỏ Trọng lượng Nặng Nhẹ Tập trung vào hai chân Tập trung vào bốn chi 12 đốt xương ngực 13 đốt xương ngực đốt xương thắt lưng thắt lưng đốt xương xương đốt sống đốt xương cụt 27-31 đốt sống đuôi Số lượng đốt sống Đốt sống đuôi bị tiêu biến Jane Rogers cs nhận thấy khoảng 30 ngàn gen người, tương đồng với gen chuột đến 80%, cao tương đồng gen người gen khỉ Hiện nay, nhà khoa học sử dụng đồ gien chuột để nghiên cứu nhằm tìm phương pháp phịng chống chữa bệnh cho người 1.2.2 Mơ hình động vật bệnh lí hoại tử xương[2][11][13][17][19][28][29][31] [60][63] Trên giới, hoại tử xương nghiên cứu nhiều đối tượng chuột (Hirano, 1988; Norman, 1998; Levin, 1999; Weinstein, 2000; Shabat, 2004; Yang, 2008; Kerachian, 2006 – 2010; Han, 2010], thỏ (Kawai, 1978; Wang, 1979; Irisa, 2001; Kabata, 2005; Matsuya, 2008), chó (Griss, 1974; Takaoka, 1981; A B Cấu trúc sụn đầu xương chuột lô tiêm thuốc (Hình B) bị vỡ, khơng nhận rõ tế bào sụn có bè xương chết nằm xen lẫn C D Các hốc xương chết khơng có tế bào (cốt bào) bè xương chuột lô tiêm Dex (Hình D) E F Thành phần mỡ tăng mơ tủy chuột hoại tử (Hình F) Hình 3.4 Sự khác biệt cấu trúc xương lô đối chứng thí nghiệm (nhuộm H&E; A, B, E, F: 100X; C, D: 200X) 34 3.2.3 Đánh giá tỉ lệ hoại tử xương Sự hoại tử xảy vùng khác mức độ hoại tử nhiều Việc đánh giá hoại tử xương dựa nhiều tiêu chuẩn theo phương pháp sử dụng Bằng phương pháp nhuộm H&E, tiêu chuẩn Arlet sử dụng nhiều nhất; theo đó, xương xác định bị hoại tử có tình trạng sau xảy ra: - Các hốc xương khuyết tế bào cốt bào chết - Sự thoái hóa nhân cốt bào - Sự hoại tử vùng gần kề mô sụn, mô tủy, mô Bảng 3.3 Tỉ lệ chuột hoại tử lô Lô TN ĐC Dex4 Dex4+ Dex6 Dex6+ Dex8 Dex8+ 0/5 4/10 6/8 5/10 5/5 7/10 5/5 Tỉ lệ mẫu xương hoại tử Kết tổng kết số lượng chuột bị hoại tử xương trình bày Bảng 3.3 dựa đánh giá mô xương theo tiêu Tỉ lệ chuột hoại tử có hướng tăng theo nồng Dex tăng; điều phù hợp với nhiều nghiên cứu báo cáo (Wang cs, 2000; Zhang cs, 2008; Yang cs, 2008; Powell cs, 2010) Sự gia tăng thể rõ lô Dex8, Dex4 Dex6 có tỉ lệ tăng khơng đáng kể Nhận định bị giới hạn số lượng chuột cho lô không đủ lớn cho kết rõ ràng Đồng thời, ghi nhận đáng ý lơ có sử dụng Asp với Dex, chuột bị hoại tử nhiều hơn; chuột tiêm Asp hay nước muối 0,9% khơng có dấu hiệu Số lượng chuột bị hoại tử nhiều lô Dex6+ Dex8+ (100%) Đồng thời, tỉ lệ chuột chết hai lô cao (>60%) Trong thực tế, Asp thường sử dụng kèm với thuốc GC điều trị số bệnh có ảnh hưởng đến dược lí Dex (Steinherz, 1994; Yang, 2008) [7] Nhưng tác dụng phụ Asp nhiều nặng nề; tác động gây sốc dị kháng nguyên gây rối loạn đông máu, làm chậm tạo xương yếu tố liên quan chặt chẽ với bệnh hoại tử xương [13][28] 35 Hình 3.5 Đồ thị tỉ lệ chuột hoại tử lô (%) Kết thí nghiệm cho thấy hiệu gây hoại tử xương nhiều sử dụng Dex liều cao có kết hợp với Asp (Dex6+, Dex8+) Tuy nhiên, việc sử dụng phối hợp Asp có tác động làm giảm sức sống gây chết chuột cao (46,7 – 66%) Đồng thời, xét hiệu kinh tế, việc sử dụng Asp khơng thiết thực Vì vậy, mơ hình gây hoại tử xương tối ưu xây dựng dựa việc sử dụng Dex Sự hoại tử xương tăng liều sử dụng hay tích lũy Dex tăng apoptosis cốt bào [57] Trong ba liều 4, 6, mg/kg Dex, hiệu gây hoại tử xương cao lô Dex8; nhiên, lô này, tỉ lệ chuột chết cao hẳn so với hai lơ Dex4 Dex6 Do đó, sử dụng liều Dex mg/kg cho hiệu tốt 3.3 Kết đánh giá tình trạng tế bào tủy xương 3.3.1 Kết phân tích apoptosis tế bào tủy xương Dịch tủy xương sau thu nhận xử lí với dung dịch li giải hồng cầu nhằm loại bỏ phần lớn hồng cầu tế bào mỡ Như vậy, huyền phù tế bào lúc lại chủ yếu tế bào có nhân (bạch cầu, tế bào gốc tế bào tiền thân, tế bào nội mô, …) Kết phân tích apoptosis tế bào phương pháp flow cytometry trình bày hình ảnh (Hình 3.6) số liệu (phụ lục 1.3) Vùng P4 xác định vùng tế bào apoptosis Vùng có đặc điểm FSC cao SSC có xu hướng giảm, chứng tỏ kích thước tế bào tăng độ phức tạp tế bào 36 tăng Đây đặc điểm tế bào necrosis (tế bào phình to tính tồn vẹn màng ngun sinh) hay giai đoạn apoptosis muộn (nhân phân mảnh màng tính nguyên vẹn) A B C Hình 3.6 Kết phân tích flow cytometry tế bào tủy xương A Đối chứng, B Lô Dex4, C Lô Dex6 Từ hình ảnh kết phân tích FCM, khác biệt nhận thấy mật độ tế bào vùng P4 lô đối chứng hai lơ thí nghiệm hai lơ thí nghiệm sử dụng liều Dex khác Sự necrosis tế bào có xu hướng tăng liều dùng Dex cao Điều phù hợp với số liệu cung cấp phần mềm CELLQuest máy FASC Calibur Theo đó, số lượng tế bào thuộc vùng P4 lơ Dex4 có tăng nhẹ so với lơ đối chứng (ĐC: 4,6%; Dex4: 5,3%); đó, tỉ lệ lô Dex6 cao hẳn (9,7%) Nguyên nhân gia tăng necrosis tế bào tủy phần nhiều hoại tử xương đùi cho dù hoại tử không xảy tồn xương đùi Sự chết tế bào gián tiếp gây tác động làm giảm nguồn máu nuôi xương GC Sự hư hại mạch hay tăng sản tế bào mỡ dẫn đến nghẽn mạch hoại tử hay apoptosis nhiều loại tế bào khu trú xương Tác động trực tiếp GC thực kết hợp GC thụ thể GR Bởi GR diện nhiều tế bào xương (tạo cốt bào, hủy cốt bào cốt bào) nên tác động thuốc đến xương rõ ràng (McCarthy, 1990; Doherty, 1995; Weinstein, 2000; Shibahara, 2000; Eberhardt, 2001; Gangji, 2003; Calder, 2004; O’Brien, 2004) Đồng thời, GC cịn có tác dụng lên tế bào thuộc tủy tế bào gốc trung mô (Suh, 2005; Lee, 2006; Wang, 37 2008), tế bào nội mô (Vogt, 2001; Feng, 2010), nguyên bào sợi (Hernigou, 1999), tế bào miễn dịch [8] Một điều đáng ghi nhận tác động GC thường phụ thuộc vào nồng độ Phản ứng miễn dịch GC thơng qua đường truyền tín hiệu Fas; cụ thể, phối tử thụ thể Fas gắn vào huy động hoạt hóa protein liên quan, sau xảy tương tác với caspase 3; từ gây apoptosis tế bào miễn dịch tế bào xương [45] Như vậy, kết phân tích FCM tế bào tủy xương phù hợp với nghiên cứu trước nhiều tác giả nước phần chứng tỏ tác dụng thuốc GC theo liều lên apoptosis tế bào tủy Điều góp phần vào phát triển bệnh hoại tử xương 3.3.2 Kết phân tích chu kì tế bào gốc trung mơ Nhằm tìm hiểu rõ ảnh hưởng GC lên hư hại sụn xương, tế bào MSC sử dụng để phân tích Bởi tế bào có vai trị quan trọng lên tạo sụn xương hay nói khác tế bào tế bào nguồn biệt hóa thành tế bào sụn, tạo cốt bào, cốt bào tế bào Đồng thời, chất tiết (các cytokine hormone tăng trưởng, …) MSC sản xuất có khả kích thích phát triển mơ liên quan Các tế bào cịn có khả ảnh hưởng đến phát triển bệnh hoại tử xương chúng biệt hóa thành tế bào mỡ nồng độ GC phù hợp, dẫn đến tăng sản bất thường tế bào mỡ MSC phân lập từ dịch tủy xương đùi chuột theo quy trình cải tiến ni mơi trường DMEM/F12 10% FBS, 1% kháng sinh Sau đó, chúng nhuộm với PI phân tích sức sống tăng trưởng phương pháp FCM 3.3.2.1 Kết thu nhận tế bào gốc trung mô Dịch huyền phù tủy xương vừa thu nhận chứa nhiều quần thể tế bào khác (hồng cầu, bạch cầu, tế bào mỡ, tế bào gốc trung mô, tế bào gốc tạo máu, …) Chúng có hình dạng, trạng thái khác mơi trường 38 A B Hình 3.7 Tế bào bám dính tế bào gốc trung mơ (A Sau 24 giờ, 200X, B Sau ngày, 400X) Sau 24 ni cấy, tế bào bám dính xuất hiện, chúng tế bào gốc trung mô (MSC) Lúc này, môi trường nuôi thay nhằm hạn chế bám loại tế bào khác Sau ngày, tế bào bám dính phát triển định hướng, tăng sinh nhanh Chúng có dạng hình thoi bám chặt vào bề mặt giếng Sau 10 ngày, tế bào phát triển phủ kín bề mặt giếng tách khỏi bề mặt trypsin để cấy chuyền tăng sinh Tế bào sau hai lần cấy chuyền, số lượng tế bào đủ để thực phân tích FCM Hầu hết tế bào tế bào gốc trung mô (MSC) 3.3.2.2 Kết phân tích chu kì tế bào gốc trung mơ Khi dịng tế bào đơn nhuộm với PI qua máy flow cytometer, tế bào phân tích kiện Mỗi kiện biểu diễn dấu chấm đỏ đồ thị Nhiều kiện phân tích cho biết mật độ tế bào Trên đồ thị, vùng tế bào chết kí hiệu R3 Những tế bào chết chết theo chương trình (apoptosis) hay hoại tử (necrosis) Những tế bào chết có đặc điểm: màng nhân thoái biến, DNA bị phân mảnh Do đó, chúng phân tích thuộc vùng có số lượng nhiễm sắc thể 2n 39 B A C Hình 3.8 Kết phân tích chu kì tế bào gốc trung mô (A Lô ĐC, B Lô Dex4, C Lơ Dex6) Kết phân tích chu kì tế bào gốc trung mơ trình bày Hình 3.8 đồ thị Hình 3.9 Tỉ lệ tế bào chết Tỉ lệ tế bào chết lô tiêm thuốc cao nhiều so với lô đối chứng (xấp xỉ lần), chứng tỏ Dex có tác động gây tổn thương tế bào MSC Từ kết suy luận cho thấy nguồn tế bào MSC có suy giảm số lượng tác dụng GC Vấn đề tương đồng với kết luận Hernigou trình bày vào năm 1999 ơng nghiên cứu suy giảm tập đoàn tế bào MSC bệnh nhân điều trị GC Đồng thời, kết phân tích (theo hình 3.9) phù hợp với kết phân tích tế bào tủy xương Các quần thể tế bào thành viên tủy xương nhiều bị ảnh 40 hưởng thuốc GC; từ đó, kết phân tích tất tế bào tủy xương có khác biệt rõ ràng đối chứng thí nghiệm Tỉ lệ bào sống pha Mức độ tổn thương tế bào đánh giá qua số lượng tế bào sống pha chu kì, thể vùng R2 Các tế bào vùng R2 phân bố cụ thể vào pha Go/G1, S, G2/M tương ứng với vùng M3, M2, M1 đồ thị DNA (phụ lục 1.3) Vùng M4 biểu thị số lượng tế bào trạng thái lệch bội thể (số lượng nhiễm sắc thể nhiều 4n) Hình 3.9 Đồ thị tỉ lệ phần trăm tế bào sống, chết lô Tỉ lệ tế bào pha Go/G1 chiếm ưu so với pha cịn lại tất lơ (kể đối chứng) (xấp xỉ 90% so với tổng số tế bào sống) Điều hồn tồn phù hợp : (1) phần lớn tế bào gốc thể không tăng sinh, chúng tăng sinh mạnh có kích thích phù hợp; (2) điều kiện nuôi cấy in vitro, tế MSC tủy xương chuột sau lần cấy chuyền thứ hai (passage 2) có khả tăng sinh thấp 41 so với passage sau Từ passage thứ ba trở sau, MSC tăng sinh mạnh, thời gian tăng gấp đôi (doubling time) khoảng 18 Pha S G2/M đặc trưng cho tăng sinh tế bào Nếu tính tế bào sống (phụ lục 1.3), kết tỉ lệ tế bào pha S ảnh hưởng thuốc đến tế bào MSC chuột lô đối chứng thí nghiệm Chỉ số tăng sinh (Proliferation Index) lơ thí nghiệm cao đối chứng Số liệu lô Dex4 cao hẳn so với lô đối chứng lơ Dex6 (có số 9,9; 7,8 9,3) Kết hoàn toàn trái ngược với nghiên cứu Wang, Chang giả thuyết đặt [14][15][55] Theo đó, tăng sinh tế bào MSC giảm đáng kể cá thể bị hoại tử xương so với đối chứng Sự nghịch lí biện luận sau: tỉ lệ tế bào MSC chết lô thí nghiệm cao; phần lớn tế bào phân tích chết (Dex4 : 87%; Dex6 : 89,2%), tỉ lệ cao nhiều so với lô đối chứng (12,7%) Dưới góc độ này, kết phân tích FCM tế bào MSC phù hợp với kết phân tích FCM tế bào tủy xương Dex có ảnh hưởng đến tế bào tủy xương nói chung tế bào gốc MSC tủy xương nói riêng Từ đó, kết luận việc sử dụng Dex, in vivo, ức chế sống tế bào tủy xương in vitro, ức chế sống tế bào gốc trung mô tủy xương theo nồng độ sử dụng 3.4 Kết đánh giá biểu gen mức phiên mã Về nguyên tắc, hormone steroid, Dex, có khả xuyên qua lớp đôi phospholipid màng tế bào Vào tế bào chất, chúng gắn kết với thụ thể để thành phức hợp hoạt động Phức hợp vào nhân tác động lên phiên mã dịch mã gen, đặc biệt gen tham gia vào trình tạo xương Runx2, BMP2, OCN ĐC Dex4 Dex6 Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm RT-PCR GAPDH 42 Trong phân tích này, mRNA tổng số tách từ xương đùi chuột chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) Sự khuếch đại DNA thực phản ứng PCR máy luân nhiệt Sản phẩm PCR điện di quan sát bàn UV bước sóng 254nm Sự biểu marker đánh giá với biểu GAPDH làm đối chứng nội Sự biểu GAPDH tất mẫu rõ ràng có xu hướng tăng dần từ đối chứng đến lô Dex6 Điều chứng tỏ kết tách mRNA phản ứng RT-PCR với chu trình thiết lập thực thành cơng Nhìn chung, vạch biểu marker diện tất mẫu xương với mức độ khác 3.4.1 Kết đánh giá biểu gen mã hóa cho BMP2 mức phiên mã Qua quan sát hình 3.11 kết bảng 3.4 cho thấy biểu gen BMP2 mức mRNA giảm theo nồng độ Dex tăng Kết phù hợp với giả thiết đặt nghiên cứu trước Dex4 ĐC Dex6 700 bp 627 bp 600 bp Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm RT-PCR BMP2 BMP2 biểu mạnh đối chứng giảm lô Dex4 Dex6 Xét cường độ, biểu BMP2 đối chứng mạnh gấp lần so với lô Dex4 gấp 16 lần so với lô Dex6 Điều đồng nghĩa với mức độ tạo hay sửa chữa xương hư hỏng lô Dex4 Dex6 thấp bình thường Bảng 3.4 Cường độ biểu gen mức phiên mã lơ thí nghiệm GAPDH BMP2 Runx2 OCN ĐC 22888 33853 30196 38931 Dex4 18735 13959 1735 3307 Dex6 31575 2923 87 43 Theo Chang cs (2006), biểu gen mã hóa BMP2 giảm sau trị liệu GC; cá nhân dễ bị ảnh hưởng giảm biểu gen mã hóa cho BMP2 OCN GC thường dễ mắc hoại tử xương Nghiên cứu in vitro Yeh (2009) có kết luận tác dụng ức chế tạo xương GC [61][62] Một tác nhân khác gây hoại tử xương việc uống nhiều bia, rượu Nhiều nghiên cứu chứng minh nghiện rượu làm xương yếu hoại tử Yeh cs cho việc thu nạp nhiều rượu gây bệnh hoại tử xương giống tác động GC; mặt phân tử, biểu gen tạo xương (như BMP2, OCN Runx2) tế bào tiền thân tạo xương giảm [61] Hình 3.12 Kết điện di sản phẩm RT-PCR gen mã hóa cho BMP2 OCN Yeh cs 3.4.2 Kết đánh giá biểu gen mã hóa cho Runx2 mức phiên mã Các vạch kích thước 685 bp (Hình 3.13) biểu thị cho sản phẩm RT-PCR Runx2 lane đối chứng sáng rõ hẳn so với lane Dex4 Dex6 Tương tự kết phân tích biểu BMP2, biểu Runx2 mức phiên mã có xu hướng giảm nồng độ Dex sử dụng tăng ĐC 700 bp Dex4 Dex6 685 bp 600 bp Hình 3.13 Kết điện di sản phẩm RT-PCR Runx2 44 Kết phân tích cường độ biểu gen mức phiên mã thực phần mềm ImageJ củng cố kết hình ảnh điện di Theo đó, biểu Runx2 giảm mạnh lô thí nghiệm có sử dụng Dex so với đối chứng, từ mức giảm hàng chục lần (14 lần Dex4) đến hàng trăm lần (xấp xỉ 478 lần lô Dex6) Việc sử dụng steroid làm giảm biểu gen trình bày nghiên cứu in vitro (Yeh cs, 2008; Li cs, 2005) In vivo, biểu gen Runx2 tế bào trung mô từ người bệnh hoại tử xương glucocorticoid hay rượu giảm (Yeh, 2009) Từ kết này, suy luận đưa tạo cốt bào tủy xương chuột mơ hình Dưới tác dụng Dex, apoptosis OB gia tăng biệt hóa tạo chúng giảm dẫn đến diện tế bào so với lơ đối chứng Do đó, biểu Runx2 rõ ràng bị ảnh hưởng nguyên Trong nghiên cứu này, biểu Runx2 tỉ lệ thuận với biểu BMP2 lô cung cấp chứng rõ ràng suy giảm biệt hóa thành tạo cốt bào tế bào tiền thân tủy xương chuột mô hình 3.4.3 Kết đánh giá biểu gen mã hóa cho OCN mức phiên mã 500 bp 456 bp 250 bp Dex6 Dex4 ĐC Hình 3.14 Kết điện di sản phẩm RT-PCR OCN Sự biểu mức phiên mã OCN giảm rõ rệt lơ thí nghiệm Dex4 so với lơ đối chứng (Hình 3.14) khơng biểu lơ Dex6 Xét cường độ biểu GAPDH OCN lô, tỉ lệ biểu OCN mRNA đối chứng mạnh xấp xỉ 10 lần so với lô Dex4 Mức độ biểu OCN khác phản ánh khác biệt chức khống hóa chất tạo cốt bào Theo đó, hoạt động khống hóa chất xương suy giảm theo nồng độ sử dụng Dex tăng 45 Tác động ức chế Dex đến khống hóa chất thể rõ ràng lô Dex6 Kết phù hợp với nhiều nghiên cứu tác giả nước OCN protein chất xương bị ảnh hưởng việc điều trị GC Sự biểu OCN giảm mạnh tế bào tạo xương (osteogenic cells) xử lí với GC in vitro in vivo Điều xảy tế bào hay tế bào tiền thân bệnh nhân hay động vật bị hoại tử xương GC hay lạm dụng thức uống có cồn (Chang cs, 2006; Yeh cs, 2008, 2009) Sự giảm biểu OCN dẫn đến tạo xương bị suy yếu [6] Kết suy luận hai nguyên nhân: (1) Sự suy giảm số lượng tạo cốt bào hay trình hình thành tạo cốt bào bị hạn chế tác dụng GC (có liên quan phù hợp đến kết phân tích FCM mục 3.1.3) Điều phù hợp với nhiều nghiên cứu báo cáo [27][34][38] (2) Hoạt động chức tạo cốt bào bị tác động GC theo hướng làm suy giảm OCN marker biệt hóa hoàn toàn tế bào tiền thân tạo xương thành OB, thường biểu mạnh vào giai đoạn cuối trình tạo xương [46] Ảnh hưởng GC lên biệt hóa tế bào in vitro in vivo tùy theo nồng độ GC sử dụng Việc xử lí tế bào gốc tủy xương với Dex làm ức chế trình tiết OCN [44] Xét đến mối liên hệ biểu OCN hoại tử xương, cường độ biểu gen mã hóa cho protein chất giảm mạnh tế bào tạo xương bệnh nhân hoại tử xương GC hay nghiện rượu [20][21][22][36][56] Kết luận đánh giá hoại tử xương lô Sự biểu BMP2, Runx2 OCN giảm lơ có xử lí với Dex dấu hiệu cho thấy mơ xương q trình tái tạo trì xương bị ảnh hưởng Tác động gây hại xương có xu hướng phát triển theo liều lượng Dex tăng Đồng thời, kết phân tích FCM cho thấy có suy giảm sức sống tế bào tủy xương tế bào gốc trung mô theo tăng nồng độ GC sử dụng Xét nghiệm mô phương pháp nhuộm H&E cho thấy tỉ lệ hoại tử thật tăng sử dụng liều Dex tương đối cao (Dex8) liều này, tỉ lệ chuột chết cao Do đó, sử 46 dụng Dex liều thấp có hiệu phù hợp Từ kết trên, Dex6 nhận thấy liều gây hoại tử hiệu Liều Dex sử dụng cho thí nghiệm sau đánh giá hiệu làm phục hồi hoại tử xương phương pháp ghép tế bào tủy xương 47 Kết luận đề nghị Kết luận Dựa mục tiêu đặt kết trình bày chương 3, đề tài kết luận sau: Mơ hình chuột hoại tử xương: - Kết thí nghiệm cho thấy đề tài thực mơ hình bệnh lí hoại tử xương chuột nhắt trắng glucocorticoid - Liều tiêm Dex mg/kg đánh giá có hiệu gây hoại tử xương hiệu kinh tế tốt với số lượng chuột chết hai (2/15) tỉ lệ chuột hoại tử 5/10 - Các phân tích cho thấy tác động gây tổn hại xương Dex tăng liều dùng thuốc tăng Tác dụng Asp thể rõ việc thúc đẩy hoại tử xương gây tác dụng phụ nặng nề (chuột chết 47 – 67%) Vì vậy, mơ hình chuột bị hoại tử xương chi thực quy trình gây hoại tử xương Dexamethasone liều mg/kg với kết tương đối tốt, quy trình dễ thực tốn có tính ứng dụng cao Đề nghị Hoại tử xương glucocorticoid có chế sinh bệnh phức tạp chưa biết rõ ràng Vì vậy, việc nghiên cứu mơ hình bệnh lí cần mở rộng quy mơ thí nghiệm phương pháp, kĩ thuật kiểm tra, đánh giá, phân tích mang tính tồn diện Từ đó, kết nghiên cứu củng cố sản phẩm tạo có chất lượng, tính ứng dụng cao cho nghiên cứu, thử nghiệm sau 48