Tạo đàn cá sóc chuyển gen phát sáng ở quy mô thương mại

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ Tên đề tài: TẠO ĐÀN CÁ SÓC CHUYỂN GEN PHÁT SÁNG Ở QUY MÔ THƢƠNG MẠI Đơn vị chủ trì nhiệm vụ: Phịng Cơng nghệ sinh học Thủy sản Chủ nhiệm nhiệm vụ: ThS Mai Thu Thảo Cán tham gia: ThS Nguyễn Thành Vũ ThS Mai Nguyễn Thành Trung CN Nguyễn Hoàng Thụy Vy KS Trần Phạm Vũ Linh TS Nguyễn Quốc Bình Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2018 MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG BIỂU TÓM TẮT PHẦN THÔNG TIN CHUNG PHẦN NỘI DUNG KHOA HỌC I ĐẶT VẤN ĐỀ II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 II.1 Tổng quan cá s c 11 II.2 Tổng quan protein phát hu nh quang 12 II.3 Một số ph ng pháp chuyển gen tr n cá 13 II.4 Cá s c chuyển gen tại Trung t m Công nghệ sinh học TP.HCM 15 II.5 Th tr ng cá cảnh 17 II.5.1 Cá chuyển gen phát hu nh quang tr n gi i 17 II.5.2 Th tr ng cá cảnh TP.HCM 18 III VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 III.1 Vật liệu 18 III.2 Ph ng pháp 20 III.2.1 Tổng quan ph ng pháp nghi n cứu 20 III.2.2 Vi tiêm tạo cá sóc chuyển gen phát hu nh quang 21 b Chăm s c, cho sinh sản cá sóc 21 c Thu trứng, tách trứng tr c vi tiêm 22 d Vi tiêm tạo cá sóc chuyển gen 22 III.2.3 Kiểm tra biểu hiện trứng sau vi tiêm 23 III.2.4 Cho sinh sản tạo cá chuyển gen hệ sau 24 III.2.5 Tạo lai bất thụ gi a cá s c Việt Nam Oryzias curvinotus và cá medaka Nhật Bản Oryzias latipes) 25 IV KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 25 IV.1 Kết quả 25 IV.1 Chăm s c, cho sinh sản cá sóc: 25 IV.1.2 Tạo cá s c chuyển gen phát hu nh quang màu lục lam 26 a Vi tiêm v i plasmid pOCactaCFP tạo cá chuyển gen 26 b Kiểm tra biểu hiện cá chuyển gen thê hệ F0 26 c Kiểm tra di truyền gen chuyển (phát hu nh quang đến hệ sau 28 d Nh n giống đàn cá s c chuyển gen phát sáng màu lục lam 32 IV.1.3 Tạo cá s c chuyển gen phát hu nh quang màu đ 32 a Tạo plasmid pOCactaRFP 32 b Vi ti m plasmid pOCacta RFP tạo cá s c chuyển gen 33 c Kiểm tra di truyền và nh n giống đàn cá s c chuyển gen phát sáng màu đ 34 IV.1.4 Tạo cá chuyển gen phát sáng màu cam 36 IV.1.5 Tạo lai bất thụ gi a cá s c Việt Nam Oryzias curvinotus và cá medaka Nhật Bản Oryzias latipes) 38 IV.2 Thảo luận 39 V Kết luận 41 V.1 Nhận xét và đánh giá kết quả đạt đ ợc so v i yêu cầu 41 VI KIẾN NGH 41 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Acta: alpha actin CFP: Cyan fluorescent protein Eukaryote: tế bào nhân chuẩn FPs: Fluorescent proteins Gen phát hu nh quang: gen mã hóa cho protein có khả phát hu nh quang GFP: Green fluorescent protein GMO: Genetically modified organism OTC: Oxytetracilin Prokaryote: tế bào nh n s RFP: Red fluorescent protein YFP: Yellow fluorescent protein DANH MỤC HÌNH Hình Cá s c 11 Hình Cấu hình khơng gian của GFP 12 Hình Thao tác vi ti m vào phôi 15 Hình Cá s c chuyển gen phát hu nh quang giai đoạn ấu trùng 16 Hình Cá s c chuyển gen tr ởng thành 16 Hình Vector pDsRed2-1 19 Hình Vector pOCactaRFP 21 Hình Biểu hiện phát hu nh quang cá sóc hệ F0 đ ợc vi tiêm v i vector pOCactaCFP 27 Hình Biểu hiện phát sáng của cá sóc (O curvinotus) chuyển gen hệ F1 29 Hình 10 Cá s c chuyển gen phát hu nh quang hệ F2 31 Hình 11 Cá chuyển gen phát hu nh quang màu lục lam F3 32 Hình 12 Điện di tr n gel agarose 1,2 kiểm tra sản phẩm PCR vector pOCactaRFP 33 Hình 13 Biểu hiện phát sáng của phôi cá sóc (O curvinotus) chuyển gen hệ F0 34 Hình 14 Biểu hiện phát sáng của cá sóc (O curvinotus) chuyển gen hệ F2 35 Hình 15 Biểu hiện phát sáng của cá sóc (O curvinotus) chuyển gen hệ F2 35 Hình 16 Cá s c chuyển gen phát hu nh quang màu cam 37 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Thống k tỉ lệ di truyền gen chuyển của dòng cá từ hệ F0 đến F1 28 Bảng Thống k tỉ lệ di truyền gen chuyển của dòng cá từ hệ F1 đến F2 30 Bảng Thống k biểu hiện của cá lai bắt cặp ch p gi a loài cá chuyển gen CFP và RFP 36 Bảng Thống k biểu hiện phát hu nh quang của cá lai gi a cá s c chuyển gen và cá medaka Nhật tính đến 13 03 2018 39 TÓM TẮT Cá cảnh Việt Nam và phát triển cách đa dạng v i ph ng pháp lai tạo cá khác Trong đ , ph ng pháp chuyển gen cá phát sáng hu nh quang vi ti m mang lại nhiều hứa hẹn cho ngành cá cảnh Việt Nam Cá s c Việt Nam Oryzias curvinotus đ ợc h a và cho sinh sản nh n tạo thành cơng phịng thí nghiệm tại Trung t m Công nghệ sinh học TP HCM Sau ph n lập đ ợc promoter alpha actin acta cá s c và tạo đ ợc vector pOCactaCFP d i điều khiển của promoter này, nh m nghi n cứu thực hiện ph ng pháp vi ti m vector pOCactaCFP vào phôi trứng cá s c tế bào, tạo cá hệ F0 sau vi ti m biểu hiện ánh sáng hu nh quang màu lục lam Ph p lai ph n tích cá biểu hiện phát hu nh quang hệ F0 tạo đ ợc cá chuyển gen hệ F1, F2 c biểu hiện mạnh toàn th n v i hệ số ph n li 1:1 Tính trạng phát hu nh quang đ ợc trì bền v ng đến hệ F2 cho thấy dòng cá chuyển gen này mang bản gen cá hệ sau của dòng chuyển gen này c biểu hiện phát hu nh quang giống Tiếp nối thành công của đề tài Ứng dụng di truyền ph n t tạo cá s c Medaka Oryzias curvinotus chuyển gen phát sáng hu nh quang phục vụ ch ng trình phát triển cá cảnh đ ợc thực hiện từ 2013-2015 vi ti m thành công vector pOCactaCFP vào phôi cá s c và cá sau vi ti m c biểu hiện phát hu nh quang mô c , đề tài "Tạo đàn cá s c chuyển gen phát sáng quy mô th ng mại" đ ợc triển khai để phục vụ ngành công nghiệp cá cảnh của thành phớ PHẦN THƠNG TIN CHUNG T n nhiệm vụ: Tạo đàn cá s c chuyển gen phát sáng quy mô th số: TS01 16-17) ng mại (Mã Đ n v chủ trì: Phịng Cơng nghệ sinh học Thủy sản Đ n v phối hợp chính: c Chủ nhiệm nhiệm vụ: ThS Mai Thu Thảo Cán tham gia thực hiện: Thành vi n chính: CN Nguyễn Hoàng Thụy Vy Thành vi n: ThS Nguyễn Thành Vũ, ThS Mai Nguyễn Thành Trung, KS Trần Phạm Vũ Linh Cố vấn khoa học: TS Nguyễn Quốc Bình Th i gian thực hiện: 24 tháng Từ tháng 2016 đến 12 2017 ) Kinh phí: 547.258.351 - Tổng dự tốn: 547.258.351 - Kinh phí s dụng: 538.309.887 Mục ti u nhiệm vụ: Tạo đ ợc 800 – 1000 cá s c chuyển gen phát hu nh quang màu lục lam biểu hiện mạnh toàn th n, di truyền ổn đ nh đến hệ F3 Các nội dung công việc thực hiện so v i đăng ký Th i gian bắt STT Nội dung đăng ký đầu – kết Thực hiện Đánh giá thúc) Nội dung 1: Vi 1/2016-6/2016 Vi ti m tạo đ ợc đàn Đ ng tiến ti m tạo cá s c cá chuyển gen hệ độ chuyển gen phát Fo 20 hu nh quang màu xanh lục lam Nội dung 2: Nhân 6/2016Tạo đ ợc 800 – Đ ng tiến giống tạo đàn cá 12/2017 1000 cá s c chuyển độ s c chuyển gen phát gen phát hu nh hu nh quang màu quang biểu hiện xanh lục lam mạnh toàn th n hệ F3, F4,F5 Nội dung (k Vi ti m tạo đ ợc V ợt tiến độ ng 6/20168 đ ng đề 12/2016 cƣơng): Vi tiêm tạo cá sóc chuyển gen phát hu nh quang màu đ Nội dung ng 12/2016đ ng đề 12/2017 cƣơng): Nhân giống tạo đàn cá s c chuyển gen phát hu nh quang màu đ cá thể cá chuyển gen hệ F0 Nội dung ng đ ng đề cƣơng: Cho lai gi a cá chuyển gen màu lục lam và cá chuyển gen màu đ để tạo cá chuyển gen màu cam Nội dung ng đ ng đề cƣơng: Cho lai gi a cá s c chuyển gen v i cá medaka Nhật hoang dại để tạo lai bất dục 6/201712/2017 Tạo đ ợc 10 - 20 cá V ợt tiến độ s c chuyển gen phát hu nh quang biểu hiện mạnh toàn th n hệ F1 10 2017-hiện tại Đã tạo đ ợc cá thể V ợt tiến độ lai phát hu nh quang biểu hiện mạnh toàn thân hệ F1 Tạo đ ợc 80 - 100 V ợt tiến độ cá sóc chuyển gen phát hu nh quang biểu hiện mạnh toàn thân hệ F1, F2 PHẦN NỘI DUNG KHOA HỌC I ĐẶT VẤN ĐỀ Theo tổ chức Nông nghiệp và L ng thực Li n Hiệp Quốc Food and Agriculture Organization of the United Nations tổng công nghiệp cá cảnh c giá tr 15 t USD uất cá cảnh tăng từ 181 triệu USD đến 372 triệu USD khoảng th i gian 2000-2011 Hiện nay, 90 cá cảnh đ ợc xuất nhập là cá n c ngọt Các n c c giá tr xuất nhập cá cảnh l n là Singapore, Mỹ, Hồng Kông, Nhật Bản Chỉ tính năm 2013, giá tr xuất của Singapore là 56 triệu USD cho th tr ng 80 n c tr n khắp gi i (FAO, 2017) TP.HCM là n i buôn bán sản xuất và xuất cá cảnh l n n c Trong 10 tháng đầu năm 2017, xuất cá cảnh của TP.HCM đạt 16,25 triệu con, tăng 14,5 so v i k năm 2016 Theo thống k của Chi cục Thủy sản – Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn TP.HCM, mục ti u của thành phố năm 2017 là sản xuất 140-150 triệu cá cảnh, tăng 10-15 so v i năm 2016 Trong đ , sản l ợng cá cảnh xuất dự kiến đạt 18 – 20 triệu v i giá tr kim ngạch là 20 – 25 triệu USD, tăng từ 15 - 20 so v i năm 2016 Đến năm 2020, sản l ợng sản xuất cá cảnh dự kiến đạt 150 – 180 triệu con, xuất đạt 40 – 50 triệu v i kim ngạch xuất đạt 40 – 50 triệu USD Nguyễn Hiền, 2017 Tuy c tiềm l n nh ng giá tr xuất cá cảnh của n c ta cịn m tớn Kh khăn hiện là nhiều giống cá cảnh đ ợc a chuộng tr n th tr ng gi i lại ch a đ ợc ph p nhập Việt Nam, giống cá cảnh đ ợc bán ch a đủ đa dạng để thu h t nhiều khách hàng h n n a Tại hội thảo Hiện trạng và tiềm phát triển cá cảnh tại Việt Nam Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn TP.HCM, Hội Nghề cá Việt Nam tổ chức ngày 19.11.2015 tại TP.HCM, đại biểu thống ý kiến cần tập trung nghiên cứu tạo loài cá m i c giá tr cao để đáp ứng đ ợc th tr ng và ngoài n c Nguyễn Anh, 2015 Th tr ng cá cảnh Việt Nam xuất hiện nhiều loài cá m i, đa dạng chủng loại và màu sắc nh ng ch a c loài cá chuyển gen phát hu nh quang nào đ ợc th ng mại h a Chính vì thế, Trung t m Công nghệ sinh học TP HCM triển khai đề tài Ứng dụng di truyền ph n t tạo cá sóc – Medaka (Oryzias curvinotus) chuyển gen phát sáng hu nh quang phục vụ ch ng trình phát triển cá cảnh (2013 - 2015 và tạo thành công cá chuyển gen c khả phát hu nh quang lục lam toàn th n nh ng n i c biểu hiện của mô c Đề tài ph n lập promoter acta của cá s c, sau đ gắn th m gen phát hu nh quang sau promoter và thực hiện chuyển gen vào cá s c V i mục ti u tạo đàn cá s c chuyển gen phát hu nh quang đáp ứng nhu cầu và ngoài n c, đề tài Tạo đàn cá sóc c uyển gene p át sáng quy m t ƣơng mại đ ợc thực hiện hai năm 2016-2017 10 Bảng Thống k tỉ lệ di truyền gen chuyển của dòng cá từ hệ F1 đến F2 Dịng cá Sớ trứng hệ thu F1) Số trứng Tỉ lệ Giá tr Ng ng chuyển chuyển ph p kiểm tin cậy gen gen (%) đ nh Chi (Chi test test square square, 0.05%) C1 55 28 50,9 0,02 3,84 C2 42 20 45,5 0,36 3,84 C3 39 17 43,6 0,64 3,84 C4 23 13 56,5 0,39 3,84 C5 88 52 59,1 2,91 3,84 C6 43 22 51,2 0,02 3,84 Kết quả thống k cho thấy qua ph p lai ph n tích, dòng cá C1, C2, C3, C4, C5, C6 di truyền lại cho hệ sau v i tỉ lệ 1:1 độ tin cậy 95 Do đ khẳng đ nh tính trạng gen chuyển phát hu nh quang đ ợc trì ổn đ nh từ F đến hệ F2 tu n thủ theo đ nh luận Mendel tính trạng bản gen phát hu nh quang đ ợc chuyển vào Mặt khác, cá thể cá chuyển gen phát triển bình th ng Kết quả tr n cho thấy nh m nghi n cứu chọn lọc thành cơng dịng cá chuyển gen c biểu hiện mạnh trì ổn đ nh đến hệ F2 v i biểu hiện phát hu nh quang mạnh toàn th n Từ đ c thể khẳng đ nh dòng cá I biểu hiện phát hu nh quang là cá chuyển gen c khả làm cá bố mẹ cho phát triển đàn cá cảnh 30 A1 A2 B1 B2 C1 C2 D H n 10 Cá sóc chuyển gen phát hu nh quang hệ F2 A1, A2: phơi cá sóc chuyển gen ngày tuổi sau đ d i ánh sáng th ng (A1) ánh sáng kích thích phát xạ CFP (A2) vật kính 4X B1, B2: ấu trùng cá sóc chuyển gen ngày sau nở d i ánh sáng th ng (B1) ánh sáng kích thích phát xạ CFP (B2) vật kính 4X C1, C2: ấu trùng cá sóc chuyển gen ngày sau nở d i ánh sáng th ng (C1) ánh sáng kích thích phát xạ CFP (C2) vật 31 kính 4X D: cá sóc chuyển gen tr ởng thành 60 ngày sau nở d LED (450nm – 490nm) i ánh sáng đèn Khác v i cá c biểu hiện hu nh quang thể khảm hệ F0, cá chuyển gen hệ F1 F2 c biểu hiện toàn th n đ ợc quan sát d i kính hiển vi phát hu nh quang và đèn LED ánh sáng thích hợp 450 nm – 490 nm) Tín hiệu hu nh quang cá hệ F1 F2 biểu hiện đều, ổn đ nh tất cả giai đoạn từ l c hình thành phôi đến tr ởng thành cho thấy gen mã h a protein phát hu nh quang đ ợc di truyền và biểu hiện bền v ng đến nhiều hệ sau Qua đ cho thấy thành công việc tạo cá chuyển gen phát hu nh quang màu lục lam biểu hiện bền v ng đến hệ sau d N ân gi ng đàn cá sóc c uyển gen p át sáng màu lục l m Từ hệ F2, cá thể cá biểu hiện đều, ổn đ nh tín hiệu hu nh quang mô c , nh m nghi n cứu tiếp tục cho nh n giống tạo đàn cá chuyển gen phát sáng cách tiếp tục cho lai gi a cá thể cá chuyển gen v i cá hoang dại Cá chuyển gen đ ợc cho lai v i cá đực hoang dại theo tỉ lệ cái:đực là 1:1 và cá đực chuyển gen đ ợc cho lai v i cá hoang dại v i tỉ lệ cái:đực là 3:1 Các cá thể cá đ i cũng đ ợc di truyền ổn đ nh gen mã h a protein phát hu nh quang theo tỉ lệ 1:1 Hiện tại, cá chuyển gen phát hu nh quang màu lục lam đ ợc di truyền đến hệ F5, cá phát triển bình th ng, số l ợng khoảng 1000 tháng tuổi H n 11 Cá chuyển gen phát hu nh quang màu lục lam F3 IV.1.3 Tạo cá sóc c uyển gen p át u n qu ng màu đ Quy trình tạo cá s c chuyển gen phát hu nh quang màu đ đ ợc thực hiện t tự nh v i cá chuyển gen phát hu nh quang màu lục lam ng a Tạo plasmid pOCactaRFP Vector pOCactaRFP c promoter acta đ ợc chèn phía tr c đoạn gen phát hu nh quang RFP Kiểm tra lại vector pOCactaRFP phản ứng PCR v i mồi xuôi là mồi bắt cặp v i promoter acta, mồi ng ợc bắt cặp v i gen RFP cho sản phẩm dự kiến 1533 bp Kết quả điện di xác nhận thành công việc tạo vector pOCactaRFP 32 H n 12 Điện di tr n gel agarose 1,2 kiểm tra sản phẩm PCR vector pOCactaRFP V i mồi xuôi bắt cặp v i promoter acta, mồi ng ợc bắt cặp v i gen RFP Giếng 1, 2: Sản phẩm PCR pOCactaRFP Giếng M: Thang DNA kb Giếng - : Chứng m b Vi tiêm pl smid pOC ct RFP tạo cá sóc c uyển gen Trong tr ng hợp vi ti m tạo cá s c chuyển gen phát sáng hu nh quang màu đ , c 1172 trứng giai đoạn tế bào đ ợc vi ti m Trong số đ , 130 trứng 11,09 đ ợc nở thành công và c 14 130 10,77 cá sau nở ngày tuổi c biểu hiện ánh sáng hu nh quang RFP tr n c thể đ ợc kiểm tra d i kính hiển vi hu nh quang Số cá c biểu hiện mạnh toàn th n là 2,3 và 11 cá thể lại 8,46 c biểu hiện yếu yếu, kết quả này cũng t ng đồng v i kết quả vi ti m tạo cá s c chuyển gen màu lục lam 33 A2 A1 B2 B1 H n 13 Biểu hiện phát sáng của phơi cá sóc (O curvinotus) chuyển gen hệ F0 A1, A2: phơi cá sóc chuyển gen ngày tuổi sau đ d i ánh sáng th ng (A1) ánh sáng kích thích phát xạ RFP (A2) vật kính B1, B2: cá s c sau nở ngày tuổi đ ợc quan sát d i ánh sáng th ng B1 và ánh sáng kích thích phát xạ RFP (B2) vật kính Cá và phơi c biểu hiện thể khảm c Kiểm tr di truyền n ân gi ng đàn cá sóc c uyển gen p át sáng màu đ  Kiểm tr di truyền từ t ệ F0 s ng t ệs u Ph p lai đ ợc thực hiện t ng tự nh v i cá chuyển gen phát hu nh quang màu lục lam Trong số cá thể cá F0 c biểu hiện mạnh toàn th n, c cá thể b đột biến kiểu hình x ng sống l ng b gấp kh c n n không đ ợc chọn để lai Hai cá thể lại c c khả di truyền lại tính trạng phát hu nh quang cho hệ F1 và di truyền theo tỉ lệ 1:1 50 phôi c phát hu nh quang, 50 phôi không phát hu nh quang Dựa theo kết quả lai của cá chuyển gen phát hu nh quang màu lục lam, cá thể cá F1 c biểu hiện phát hu nh quang mạnh đ ợc chọn lai v i cá thể cá s c hoang dại theo tỉ lệ 1:1 Trứng đ ợc soi kiểm tra biểu hiện sau 5-10 ngày Kết quả cho thấy dòng cá F1 đ ợc chọn lai c khả di truyền tính trạng phát sáng cho hệ F2 và tỉ lệ gi a phôi phát sáng và phôi không phát sáng là 1:1 Cá 34 chuyển gen phát sáng màu đ phát triển bình th tr n tháng tuổi ng, số l ợng hiện tại khoảng 100 H n 14 Biểu hiện phát sáng của cá sóc (O curvinotus) chuyển gen hệ F2 A1, A2: phôi cá sóc chuyển gen 10 ngày tuổi sau đ d i ánh sáng th ng (A1) ánh sáng kích thích phát xạ RFP (A2) vật kính Phôi c biểu hiện mạnh toàn th n H n 15 Biểu hiện phát sáng của cá sóc (O curvinotus) chuyển gen hệ F2 35 Cá s c chuyển gen phát sáng hu nh quang màu đ RFP c biểu hiện mạnh toàn th n đ ợc quan sát d i ánh sáng đèn LED 450 nm – 490 nm) IV.1.4 Tạo cá c uyển gen p át sáng màu c m Cá s c chuyển gen phát sáng hu nh quang mang màu cam đ ợc tạo cách thực hiện ph p lai cá chuyển gen CFP v i cá đực chuyển gen RFP và cá đực chuyển gen CFP v i cá chuyển gen RFP Các ph p lai theo tỉ lệ đực : là 1:1 Trứng sau thụ tinh đ ợc thu và ấp 240C, phôi đ ợc kiểm tra phát hu nh quang kính hiển vi v i lọc B-2A, cá đ ợc kiểm tra d i ánh sáng đèn LED 450 nm – 490 nm) Kết quả cho thấy số cá nở c dạng kiểu hình: phát sáng màu cam, phát sáng màu đ , phát sáng màu lục lam, không phát sáng theo tỉ lệ 1:1:1:1 Bảng Thống k biểu hiện của cá lai bắt cặp ch p gi a loài cá chuyển gen CFP và RFP Số cá 150 Số cá Số cá biểu biểu hiện phát hiện phát sáng sáng màu cam màu lục toàn th n lam toàn thân 35 37 Số cá biểu hiện phát sáng màu đ toàn th n Số cá không biểu hiện phát sáng 38 40 Kết quả này lần n a khẳng đ nh tính trạng gen chuyển (phát hu nh quang) đ ợc trì ổn đ nh từ hệ bố mẹ sang tu n thủ theo đ nh luận Mendel tính trạng (1 bản gen phát hu nh quang đ ợc chuyển vào) 36 H n 16 Cá s c chuyển gen phát hu nh quang màu cam Cá s c chuyển gen phát hu nh quang màu cam đ ợc quan sát d i ánh sáng th ng A1; cá s c chuyển gen phát hu nh quang màu cam và màu đ đ ợc quan sát d i ánh sáng th ng B1; cá chuyển gen phát hu nh quang màu cam c biểu hiện mạnh toàn th n đ ợc quan sát d i ánh sáng đèn LED 450 nm – 490 nm) A2; cá chuyển gen phát hu nh quang màu cam và màu đ đ ợc quan sát d i ánh sáng đèn led B2 37 IV.1.5 Tạo l i bất t ụ gi cá sóc Việt N m Oryzias curvinotus) cá med N ật Bản Oryzias latipes) a C o sin sản cá med N ật Cá medaka Nhật đ ợc nuôi điều kiện môi tr ng t ng tự nh cá s c, cá đ ợc nuôi l n tháng tuổi đ ợc tiến hành cho sinh sản bể 30l v i mật độ khoảng 50 con, tỉ lệ đực là 1:2 1:3 Phôi cá medaka phát triển bình th ng, tỉ lệ sống của phôi là 80-90 , cá sống h n tuần tuổi chiếm 80 số cá nở đ ợc Cá phát triển bình th ng b L i gi cá med N ật cá sóc c uyển gen p át u n qu ng Chọn cá thể medaka Nhật tháng tuổi cá đ ợc ấp từ phôi mua b n Nhật, d ng theo điều kiện phịng ni cá cho lai v i cá đực chuyển gen phát hu nh quang tháng tuổi màu lục lam màu đ theo tỉ lệ 1:1 Cá đực chuyển gen phát hu nh quang màu lục lam là cá thuộc hệ F5, cá đực chuyển gen phát hu nh quang màu đ thuộc hệ F3 Cá s c chuyển gen phát hu nh quang hệ tr n lần l ợt theo màu sinh sản tốt cho sinh sản loài Các cặp cá lai đ ợc nuôi ri ng, trứng đ ợc thu và quan sát biểu hiện phát hu nh quang của phôi sau 10 ngày Kết quả lai gi a cá s c chuyển gen và cá medaka Nhật đ ợc trình bày nh bảng 38 Bảng Thống k biểu hiện phát hu nh quang của cá lai gi a cá s c chuyển gen và cá medaka Nhật tính đến 13 03 2018 Sớ trứng thu đ ợc Số trứng phát triển thành phôi Số phôi c biểu hiện phát hu nh quang Phôi nở thành cá Số cá sống đ ợc sau tuần Cá sóc 200 chuyển gen CFP x cá medaka WT 40 19 13 Cá sóc 85 chuyển gen RFP x cá medaka WT 18 10 Theo thống k c thể thấy số trứng phát triển thành phôi thấp khoảng 20 Tuy nhi n, số phôi phát triển sau tuần thì số phôi c biểu hiện phát hu nh quang chiếm t lệ khoảng 50 , phù hợp v i đ nh luật di truyền tính trạng của Menden IV.2 T ảo luận Đề tài thành công việc tạo cá s c chuyển gen phát sáng màu lục lam, đ , cam, chọn đ ợc dòng cá chuyển gen phát sáng mạnh toàn th n và c khả trì ổn đ nh cho hệ sau Đã b c đầu tạo lai bất dục gi a cá s c chuyển gen và cá medaka Nhật Tuy nhi n, cần phải c th m th i gian để kiểm tra cá thể F để chắn cá khơng cịn khả sinh sản Mục ti u của đề tài là tạo sản phẩm cá s c chuyển gen phát hu nh quang c thể th ng mại đ ợc Tr n gi i, cá cảnh chuyển gen phát sáng đ ợc th ng mại từ l u Tuy nhi n, Việt Nam khái niệm cá cảnh chuyển gen v n m i Đặc biệt, cá s c là cá bản đ a của Việt Nam, lầ đầu ti u đ ợc nghi n cứu chuyển gen phát hu nh quang tr n gi i 39 Tuy nhiên, công nghệ chuyển gen này phải đối mặt v i hai ch ng ngại l n: là vấn đề an toàn thực phẩm GMO , và hai là nh ng lo ngại ảnh h ởng của cá biến đổi gen đến môi tr ng sinh thái chúng mơi tr ng tự nhi n B n cạnh nh ng mối quan t m lo ngại tr n, thì nghi n cứu ứng dụng của công nghệ biến đổi gen tạo cá chuyển gen phát sáng hu nh quang tr n hai đối t ợng cá ngựa vằn, cá medaka v ng mắc mặt đạo đức sinh học (Gong và cộng sự, 2001; Gong và cộng sự, 2003) Theo báo cáo tổng hợp của Hallerman năm 2004, vào 12 2003 c quan li n quan và tổ chức FDA của Mỹ tổ chức đánh giá tính rủi ro của loài cá ngựa vằn biến đổi gen nguy c c hay không ảnh h ởng đến môi tr ng sinh thái Một kết luận cuối đ ợc đ a ra: "Bởi vì cá cảnh chuyển gen không đ ợc s dụng cho mục đích làm thức ăn, cho n n ch ng không đe dọa đến vấn đề an toàn thực phẩm Không c chứng nào cho thấy nh ng nh ng cá ngựa vằn biến đổi gen đe dọa môi tr ng h n so v i cá ngựa vằn tự nhi n mà từ l u đ ợc bán rộng rãi tại Hoa K Trong tr ng hợp không c nguy c r ràng gì đối v i sức kh e cộng đồng, FDA không c lý gì để điều chỉnh điều luật nghi m cấm phát triển loài cá chuyển gen đặc biệt này" Từ cá ngựa vằn chuyển gen đ ợc đ a th tr ng cá cảnh vào năm 2003, không c bất k báo cáo nào vấn đề sinh thái li n quan đến việc bán loài cá này Hallerman 2004 T ng tự nh báo cáo của Hallerman, cá s c chuyển gen phát hu nh quang cũng không đ ợc s dụng cho mục đích làm thức ăn Cá s c chuyển gen đ ợc th ng mại là cá bất dục, không c khả sinh sản cho hệ sau n n tránh đ ợc việc phát tán nguồn gen môi tr ng b n ngoài Cá s c chuyển gen sinh sản bình th ng, tính trạng gen chuyển di truền ổn đ nh và bền v ng, đàn cá s c chuyển gen hiện tại là nguồn cá giống quan trọng, c thể đem sinh sản số l ợng l n để phục vụ mục ti u th ng mại h a Hiện tại t lệ phôi sống của cá lai gi a cá s c chuyển gen và cá medaka thấp 10-20 , nhi n, đ ợc lai v i số l ợng l n cũng thu đ ợc nguồn phôi đáng kể Cá s c là mô hình đầu ti n nghi n cứu việc chuyển gen phát hu nh quang tr n mô c Dựa vào thành công của đề tài này, nh m nghi n cứu mong muốn c thể áp dụng công nghệ chuyển gen l loài cá khác c giá tr kinh tế cao h n nh : cá thần ti n, cá thủy tinh, cá mắt ngọc, … 40 V K t luận V.1 N ận xét đán giá t đạt đƣợc so v i yêu cầu Đề tài hoàn thành tốt ti u đăng ký đề c ng là vi ti m và tạo đ ợc đàn cá s c chuyển gen màu lục lam, thực hiện th m ti u ngoài đề c ng là vi ti m, tạo đàn cá s c chuyển gen màu đ , tạo cá s c chuyển gen màu cam và tạo lai bất thụ gi a cá s c chuyển gen và cá medaka Nhật VI KIẾN NGHỊ Tiếp tục trì đàn cá s c chuyển gen phát sáng ba màu: lục lam, đ , cam Nhanh ch ng tạo đ ợc cá chuyển gen phát sáng bất dục để c thể th ng mại ngoài th tr ng Hoàn thành thủ tục giấy t để đem sản phẩm cá s c chuyển gen th ng mại Tiếp tục áp dụng công nghệ chuyển gen l n đối t ng cá khác nh : cá thần ti n, cá thủy tinh, cá mắt ngọc,… PHẦN SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Đề tài tham gia báo cáo hội ngh khoa học toàn quốc nghi n cứu và giảng dạy sinh học Việt Nam lần thứ II, đ ợc diễn vào 20 2016 Đại học s phạm Đà Nẵng, báo cáo vi n là ThS Mai Nguyễn Thành Trung Đề tài tham gia triển lãm poster tại hội ngh khoa học tr thủy sản toàn quốc 2017, đ ợc diễn vào 28 2017 Đại học Quốc tế- Đại học Quốc gia TP HCM Đề tài đào tạo đ ợc c nh n ngành Công nghệ sinh học – Đại học Công nghiệp thực phẩm TP HCM PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO I TIẾNG VIỆT Nguyễn Anh 2015 Hội thảo Hiện trạng và tiềm phát triển cá cảnh tại Việt Nam http://thuysanvietnam.com.vn/hoi-thao-hien-trang-va-tiem-nang-phattrien-ca-canh-tai-viet-nam-article-13843,tsvn 21-11-2015 Nguyễn Thành Vũ, Mai Nguyễn Thành Trung, Nguyễn Quốc Bình 2016 Ứng dụng di truyền ph n t tạo cá s c – Medaka (Oryzias curvinotus) chuyển gen phát sáng hu nh quang phục vụ ch ng trình phát triển cá cảnh (Mã số: TS01 13-15) 41 II TIẾNG ANH Alieva N.O., Konzen K.A., Field S.F., Meleshkevitch E.A., Hunt M.E., Beltran-Ramirez V., Miller D J., Wiedenmann J., Salih A., Matz M.V (2008), Diversity and evolution of coral fluorescent proteins , PLoS One, 16, (7), 1-12 Burns J.C., Friedmann T., Driever W., Burrascano M., Yee J.K (1993), Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells , Proceedings of the National Academy of Sciences, 90 (17), 8033 – 8037 Cho YS, Lee SY, Kim DS, Nam YK (2010) Spawning performance, embryonic development and early viability under different salinity conditions in a Euryhaline Medaka Species, Oryzias dancena Korean J Ichthyol 22:25–33 Cho Y.S., Lee S.Y., Kim Y.K., Kim D.S., Nam Y.K 2011 , Functional ability of cytoskeletalb-actinregulator to drive constitutive and ubiquitous expression of a luorescent reporter throughout the life cycle of transgenic marine medaka Oryzias dancena , Transgenic Research, 20, 1333-1355 Chou C.Y., Horng R.S., Tsai H.J 2001 Uniform GFP-expression in transgenic medaka (Oryzias latipes) at the F0 generation Transgenic research, 10, 303-315 Chourrout D, Guyomard R, Houdebine L-M (1986) High efficiency gene transfer in rainbow trout (Salmo gairdneri Rich.) by microinjection into egg cytoplasm Aquaculture 51:143–150 FAO Aquaculture Newsletter, no 56, April- 2017 Gong Z, Ju B, Wan H (2001) Green fluorescent protein (GFP) transgenic fish and their applications Genetica 111:213–25 Gong Z, Wan H, Tay TL, et al (2003) Development of transgenic fish for ornamental and bioreactor by strong expression of fluorescent proteins in the skeletal muscle Biochem Biophys Res Commun 308:58–63 Hallerman E (2004) Glofish, the first GM animal commercialized: profits amid controversy Inf Syst Biotechnol http://www.isb.vt.edu/articles/jun0405.htm Hellweg M (2013) The Ricefish: An Odd and Interesting Group Trop Fish Hobbyist http://www.tfhmagazine.com/details/articles/the–ri Higashijima S, Okamoto H, Ueno N, et al (1997) High-Frequency Generation of Transgenic Zebrafish Which Reliably Express GFP in Whole Muscles or the Whole Body by Using Promoters of Zebrafish Origin Dev Biol 192:289–299 Hostetler H.A., Stephanie L.P., William M.M 2003 , High efficiency production of germ-line transgenic japanese medaka (Oryzias latipes) by electroporation with direct current-shifted radio frequency pulses , Transgenic Research, 12 (4), 413-424 42 Labas Y.A., Gurskaya N.G., Yanushevich Y.G., Fradkov A.F., Lukyanov K.A., Lukyanov S.A., Matz M.V 2001 , Diversity and evolution of the green fluorescent protein family , Current Issue, 99 (7), 4256-4261 Lu J.K., Chen T.T., 1993 , Transgenic fish as model for studying fish growth International Congress of Comparative Endocrinology, 94 Maclean N., Talwar S 1984 , Injection of cloned genes into rainbow trout eggs , Journal of Embryology and Experimental Morphology, 82, 187 Maclean N, Laight RJJ (2000) Transgenic fish: an evaluation of benefits and risks Fish Fish 1:146–172 Mohammad Hayat, Christopher Joyce, Tim Towners, et al (1991) Survival and integration rate of channel catfish and common carp embryos microinjected with DNA at various developmental stages Aquaculture 99: 249-255 Nam Y.K, Maclean N., Fu C., Pandian T.J., Eguia M.R.R (2007), Development of transgenic fish: Scientific background , Methodologies of transgenic fish, volume 3, 61-94 Pan X, Zhan H, Gong Z (2008) Ornamental expression of red fluorescent protein in transgenic founders of white skirt tetra (Gymnocorymbus ternetzi) Mar Biotechnol 10:497–501 doi: 10.1007/s10126-008-9094-9 Parenti LR (2008) A phylogenetic analysis and taxonomic revision of ricefishes, Oryzias and relatives (Beloniformes, Adrianichthyidae) Zool J Linn Soc 154:494–610 doi: 10.1111/j.1096-3642.2008.00417.x Patricia Culp, Christiane Nuslein-Volhard, Nancy Hopkins (1991) Highfrequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs Proc Natl Acad Sci USA Vol.88, pp 7953-7957 Porazinski SR, Wang H, Furutani-Seiki M (2010) Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism J Vis Exp 5–8 doi: 10.3791/1937 Sin F.Y.T, Bartley A.L, Walker S.P, Sin I.L, Symonds J.E, Hawke L, Hopkins C.L 1993 , Gene-Transfer in Chinook Salmon (Oncorhynchus-Tshawytscha) by Electroporating Sperm in the Presence of Prsv-Lacz DNA Aquaculture, 117, 5769 Stuart GW, McMurray J V, Westerfield M (1988) Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos Development 103:403–12 Sudha P.M., Low S., Kwang J., Gong Z 2001 , Multiple tissue transformation in adult zebrafish by gene gun bombardment and muscular injection of naked DNA , Marine Biotechnology, (2), 119 – 125 Tsien R.Y 1998 , The Green Fluorescent Protein , Annual Review of Biochemistry, 67, 509 – 544 Uliczka F., Pisano F., Kochut A., Opitz W., Herbst K., Stolz T., Dersch P 2011 , Monitoring of Gene Expression in Bacteria during Infections Using an 43 Adaptable Set of Bioluminescent, Fluorescent and Colorigenic Fusion Vectors, PLoS One, 6, 1-6 Yang F, Moss L G., Phillips G.N 1996 , The molecular structure of green fluorescent protein , Biotechnolog, 14, 1246-1251 Tài liệu website: https://baomoi.com/tp_ho_chi_minh_lac_quan_voi_tang_truong_xuat_khau_c a_canh/c/23950182.epi http://sonongnghiep.hochiminhcity.gov.vn http://shop.glofish.com ………, ngày tháng năm 20 ………, ngày tháng năm 20 Đơn vị c ủ tr t ực iện C ủ n iệm đề tài ………, ngày tháng năm 20 ………, ngày tháng năm 20 P ó Giám đ c p ụ trác Phòng QLKH-HTQT ………, ngày tháng năm 20 Giám đ c 44

Định dạng
Số trang	44
Dung lượng	1,78 MB