Nghiên cứu ứng dụng dầu vỏ hạt điều hấp thu trên hạt nano ldhs để phòng trừ sâu hại

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN HÀN LÂM KH&CN VN VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG DẦU VỎ HẠT ĐIỀU HẤP THU TRÊN HẠT NANO LDHs TRONG PHÒNG TRỪ SÂU HẠI NGUYỄN THỊ NHƯ QUỲNH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/ 2015 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN HÀN LÂM KH&CN VN VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG DẦU VỎ HẠT ĐIỀU HẤP THU TRÊN HẠT NANO LDHs TRONG PHÒNG TRỪ SÂU HẠI CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) NGUYỄN THỊ NHƯ QUỲNH CƠ QUAN QUẢN LÝ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/ 2015 MỤC LỤC TIÊU ĐỀ TRANG Mục lục Tóm tắt Abstract Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình Phần mở đầu 1 Tên đề tài Mục tiêu Nội dung Đặt vấn đề Chương 1: Tổng quan tài liệu 1.1 Anacardic acid 1.1.1 Sơ lược nguyên liệu 1.1.2 Anacardic acid 1.1.3 Thành phần cấu tạo 1.1.4 Ứng dụng AnAc 1.1.5 Phương pháp tách chiết AnAc 14 1.2 Tổng quan vật liệu nano LDHs 16 1.2.1 Khái quát chung vật liệu nano Mg/Al LDHs 16 1.2.2 Cơ chế hấp phụ giải hấp phụ anion hữu 21 1.2.3 Ứng dụng LDHs 22 1.3 Tổng quan sâu khoang 30 1.3.1 Đặc điểm hình thái –sinh học 30 1.3.2 Tình hình dịch hại 31 Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu chung 33 2.1 Vật liệu - Hóa chất 33 2.1.1 Vật liệu thí nghiệm 33 2.1.2 Hóa chất để tạo hạt nano MgAl LDH 33 2.1.3 Hóa chất để tách chiết AnAc 33 2.1.4 Hóa chất để phân tích 33 2.2 Thiết bị 34 2.3 Nội dung nghiên cứu 34 2.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu tổng hợp vật liệu nano LDHs 34 2.3.2 Nội dung 2: Tách chiết anacardic acid (AnAc) từ dầu vỏ hạt điều 37 2.3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu hấp phụ AnAc dầu vỏ hạt điều lên vật liệu LDHs tạo chế phẩm phòng trừ sâu hại 2.3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu giải hấp phụ AnAc từ chế phẩm LDHs-AnAc 40 43 2.3.5 Nội dung 5: Nghiên cứu xây dựng quy trình tạo chế phẩm thuốc trừ sâu nano sinh học 44 2.3.6 Nội dung 6: Đánh giá hiệu tác động chế phẩm LDHs-AnAc sâu hại rau ăn điều kiện phịng thí nghiệm 2.3.7 Nội dung 7: Khảo sát khả phòng trừ sâu hại rau ăn nhà lưới 45 50 2.3.8 Nội dung 8: Đánh giá độc tính chế phẩm AnAc – LDHs phương pháp thử độc tính cấp xác định LD50 chuột 52 2.3.9 Nội dung 9: Đánh giá tác động LDH-AnAc lên số chủng vi sinh vật đất (Bacillus subtilis, Lactobacillus sp., Azotobacter sp., Erwinia sp E coli) 53 2.3 Phương pháp phân tích 55 2.3.1 Phân tích sắc ký lỏng cao áp 55 2.3.2 Xác định hàm lượng AnAc thông qua hàm lượng polyphenol phương pháp Folin – Ciotalteau 55 2.4 Các phương pháp phân tích đặc tính cấu trúc hạt nano LDHs 56 2.5 Phương pháp phân tích thống kê 57 Chương 3: Kết nghiên cứu 58 3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu tổng hợp vật liệu nano LDH 58 3.1.1 Ảnh hưởng tỉ lệ nồng độ CM MgCl2 /AlCl3 lên trình tạo vi hạt LDHs 58 3.1.2 Ảnh hưởng pH lên trình tạo vi hạt LDHs 60 3.1.3 Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng lên trình tạo vi hạt LDHs 63 3.1.4 Ảnh hưởng nhiệt độ nung đến trình tạo vi hạt nano LDHs 64 3.2 Nội dung 2: Tách chiết anacardic acic (AnAc) từ dầu vỏ hạt điều 66 3.2.1 Tách chiết AnAc 66 3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ ethanol để hòa tan CNSL 66 3.2.3 Khối lượng Ca(OH)2 67 3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu hấp phụ AnAc dầu vỏ hạt điều lên vật liệu LDHs tạo chế phẩm phòng trừ sâu hại 75 3.3.1 Ảnh hưởng nồng độ AnAc đến trình hấp phụ 75 3.3.2 Ảnh hưởng pH phản ứng đến trình hấp phụ AnAc lên hạt nano LDH 77 3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng đến trình hấp phụ AnAc lên hạt nano LDHs 78 3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu giải hấp phụ AnAc từ chế phẩm LDHs-AnAc 79 3.4.1 Ảnh hưởng pH tới khả giải hấp phụ AnAc LDHs-AnAc 79 3.4.2 Ảnh hưởng thời gian tới khả giải hấp phụ AnAc LDHs 82 3.5 Nghiên cứu xây dựng quy trình tạo chế phẩm thuốc trừ sâu LDHs-AnAc 83 3.6 Đánh giá hiệu lực chế phẩm LDH-AnAc sâu hại rau ăn (sâu khoang) phịng thí nghiệm 86 3.6.1 Nồng độ chế phẩm 86 3.6.2 So sánh hiệu lực thành phần chế phẩm 93 3.6.3 So sánh khả tiêu diệt sâu chế phẩm hoạt chất abamectin Lambda-cyhalothrin 94 3.7 Nội dung 7: Đánh giá khả phòng trừ ấu trùng sâu khoang nhà lưới 96 3.8 Nội dung 8: Đánh giá độc tính LDH-AnAc chuột 97 3.9 Nội dung 9: Đánh giá tác động LDHs-AnAc lên số chủng vi sinh vật đất 100 Chương 4: Kết luận – Kiến nghị 106 Tài liệu tham khảo Phụ lục Phụ lục chuyên môn Phụ lục sản phẩm Phụ lục quản lý 107 TÓM TẮT Đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng dầu vỏ hạt điều hấp phụ lên hạt nano MgAl LDHs phòng trừ sâu hại” cấp kinh phí Sở KH&CN Tp HCM tiến hành Viện Sinh học Nhiệt đới từ tháng 6/2013 đến tháng 11/2015 Đề tài thực với mục tiêu tổng hợp hạt nano LDH, tách chiết Anacardic acid (AnAc) từ dầu vỏ dầu vỏ hạt điều (CNSL), tạo hạt nano LDH mang hoạt chất Anacardic acid (AnAc) làm thuốc trừ sâu sinh học Trong nghiên cứu này, chế phẩm sau tổng hợp thử nghiệm hiệu lực diệt sâu quy mô phịng thí nghiệm đối tượng ấu trùng sâu khoang, thử nghiệm độc tính chuột nhắt trắng chủng Swiss thử nghiệm độc tính mơi trường chủng Bacillus subtilis; E Coli; Azotobacter sp.; Lactobacillus sp Erwinia sp Kết thu sau: - Hạt nano MgAl LDHs tổng hợp phương pháp đồng kết tủa với tỷ lệ Mg:Al 1:2 50oC, pH 12/24h với diện tích bề mặt đạt 115,96 m2/g - Các AnAc tách từ dầu vỏ hạt (CNSL) gồm có 04 loại AnAc với số nối đơi khơng bão hịa n = – 3, loại n = nhiều chiếm 43%, với lượng AnAc tổng đạt 67,7% AnAc sau tách chiết hấp phụ trực tiếp lên hạt nano MgAl LDHs đạt hiệu suất 99% - Khả hoạt động hạt nano LDHs-AnAc điều kiện khác khảo sát thông qua việc đánh giá khả giải hấp phụ AnAc Hạt nano LDHs-AnAc giải hấp phụ tốt dung dịch đệm carbonate pH= Kết nghiên cứu cho thấy rằng, hạt nano LDHs có khả nhả chậm tốt, thời gian để nhả hết 99% hoạt chất hấp phụ ngày - Hoạt tính hạt nano LDHs-AnAc xác định hiệu lực diệt sâu Kết thử nghiệm hoạt lực chế phẩm ấu trùng sâu khoang ngày tuổi cho thấy, hạt nano LDHs không gây chết ấu trùng sâu Nhưng hoạt chất AnAc nồng độ 0,64 g/l có hiệu lực gây chết cho ấu trùng sâu khoang đạt 57,9% sau ngày thí nghiệm chế phẩm L-A0,64 (hạt nano mang AnAc) với nồng độ có hiệu lực 89,5% sau ngày thí nghiệm Như vậy, chế phẩm có hạt nano mang hoạt chất có hiệu lực diệt sâu cao so với hoạt chất dạng tự với nồng độ Kết cho thấy, chế phẩm hoạt chất AnAc có khả ức chế ấu trùng sâu khoang chủ yếu theo phương thức ức chế tượng lột xác, kéo dài vịng đời, gây biến dạng khơng gây tượng ngán ăn - Độc tính hạt nano LDHs-AnAc động vật kiểm tra chuột Kết cho thấy hoạt chất AnAc, hạt nano MgAl LDHs, chế phẩm LDHs-AnAc khơng gây độc tính cấp cho chuột thí nghiệm - Kết thí nghiệm tác động chế phẩm đến môi trường cho thấy, hoạt chất AnAc có khả ức chế vi khuẩn gram âm gram dương tùy thuộc vào loại vi khuẩn mà hiệu lực nồng độ ức chế khác hầu hết gây ức chế liều cao Giá trị LC50 chế phẩm LDHs-AnAc chủng Bacillus subtilis, Lactobacillus sp., E coli, Erwinia sp.và Azotobacter sp 0,04 g/l; 0,18 g/l; 0,128 g/l; 0,06 g/l 0,094 g/l ABSTRACT Project “Applied research on absorbing cashew nut shell oil into MgAl LDH nanoparticles for pest control” was funded by Department of Science and Technology of Ho Chi Minh City and was conducted at Institute of Tropical Biology from 06/2013 to 11/2015 Our target is synthesis of nanoparticles that can carry anacardic acid (AnAc) active compounds, extracted from cashew nut shell oil (CNSL), to make biological pesticide In this research, the synthesized products were tested insecticidal effect on cut worm larvae (Spodoptera litura) at laboratory scale Besides, the product toxicities, for animal, were tested on Swiss white mice strains, and for the impact on environment were tested on some soil microoganisms such as Bacillus subtilis, E Coli, Azotobacter sp., Lactobacillus sp., and Erwinia sp for biosafety puporse The detail results are expressed as following: - - - - MgAl LDHs were synthesized by co-precipitation method with the ratio Mg/Al was 1:2 at 50oC, pH 12 for 24 hours and the surface area was 115,96 m2/g AnAcs were isolated from CNSL with four types (unsaturated double bound n = 03, n=3 prominent) The total AnAc quantity after isolation was 67,7% This AnAcs were directly absorbed on MgAl LDHs nanoparticles with 99% adsorption efficiency The operation of LDHs-AnAc in different environmental conditions was tested through assessing the de-absorption of AnAc from LDHs-AnAc The results indicated that AnAc can be released very well from LDHs-AnAc hybrid in carbonate buffer at pH9 The results showed that, LDHs-AnAc hybrid nanoparticles also showed good properties such as slow releasing of AnAc for days with high efficiency at 99% The activity of LDHs-AnAc was tested through insecticidal effect After days testing, LDHs showed no lethal effect on cut worm larvae while AnAc and LDHsAnAc hybrid at 0,64 g/l concentration killed 57,9% and 89,5% of cut worm larvae, respectively This result shows the insecticidal effect of LDHs-AnAc hybrid is higher than AnAc alone at the same concentration of AnAc In addition, both AnAc free and LDHs-AnAc hybrid caused inhibition in cut worm larvae Spodoptera litura through preventing molting phenomenon, prolong lifespan, and causing abnormal in phenotype The toxicity of LDHs-AnAc on animal was tested on mice Under the treating of LDHs-AnAc, AnAc, MgAl LDHs, the mice expressed no acute toxicity For testing the impacts of LDHs-AnAc hybrid, LDHs, and AnAc on environment, different soil microorganisms were used LDHs-AnAc compounds and AnAc alone showed low impact on the soil microorganisms and only inhibited them at high dose of AnAc In detail, the LC50 values of LDHs-AnAc for Bacillus subtilis, Lactobacillus sp., E coli, Erwinia sp and Azotobacter sp are 0,04 g/l, 0,18 g/l, 0,128 g/l, 0,06 g/l and 0,094 g/l, respectively HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM ĐỐI VỚI CHỦNG Azotobacter sp DC LDHs A5 (AnAc 0.4 g/l) AL5 (CP 0.4 g/l) A4 (AnAc 0.2 g/l) AL4 (CP 0.2 g/l) A3 (AnAc 0.1 g/l) AL3 (CP 0.1 g/l) [PL-40] A2 (AnAc 0.05 g/l) AL2 (CP 0.05 g/l) A1 (AnAc 0.025 g/l) AL1 (CP 0.025 g/l) HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM ĐỐI VỚI CHỦNG Bacillus subtilis DC LDHs A5 (AnAc 0.4 g/l) AL5 (CP 0.4 g/l) [PL-41] A4 (AnAc 0.2 g/l) AL4 (CP 0.2 g/l) A3 (AnAc 0.1 g/l) AL3 (CP 0.1 g/l) A2 (AnAc 0.05 g/l) AL2 (CP 0.05 g/l) A1 (AnAc 0.025 g/l) AL1 (CP 0.025 g/l) [PL-42] HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM ĐỐI VỚI CHỦNG E.coli DC LDHs A5 (AnAc 0.4 g/l) AL5 (CP 0.4 g/l) A4 (AnAc 0.2 g/l) AL4 (CP 0.2 g/l) A3 (AnAc 0.1 g/l) AL3 (CP 0.1 g/l) [PL-43] A2 (AnAc 0.05 g/l) A1 (AnAc 0.025 g/l) AL2 (CP 0.05 g/l) AL1 (CP 0.025 g/l) HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM ĐỐI VỚI CHỦNG Erwinia sp DC LDHs A5 (AnAc 0,4 g/l) [PL-44] AL5 (CP 0.4 g/l) A4 (AnAc 0.2 g/l) AL4 (CP 0.2 g/l) A3 (AnAc 0.1 g/l) AL3 (CP 0.1 g/l) HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM ĐỐI VỚI CHỦNG Lactobacillus sp DC LDHs A5 (AnAc 0.4 g/l) AL5 (CP 0.4 g/l) [PL-45] A4 (AnAc 0.2 g/l) AL4 (CP 0.2 g/l) A3 (AnAc 0.1 g/l) AL3 (CP 0.1 g/l) A2 (AnAc 0.05 g/l) A1 (AnAc 0.025 g/l) [PL-46] AL2 (CP 0.05 g/l) AL1 (CP 0.025 g/l) PHỤ LỤC SẢN PHẨM Quy trình sản xuất chế phẩm Quy trình sản xuất chể phẩm trai qua hai giai đoạn tương ứng với hai bước chính: Một là, tách chiết AnAc từ dầu vỏ hạt điều để làm nguyên liệu Hai là, hấp phụ hoạt chất AnAc lên hạt nano MgAl LDHs phương pháp đồng kết tủa trực tiếp AnAc q trình tổng hợp hạt nano Do đó, quy trình tách chiết, quy trình tổng hợp hạt nano tạo chế phẩm trình bày chung thành 01 quy trình gồm hai bước Bước 1: Quy trình tách chiết AnAc từ dầu vỏ hạt điều CNSL - Chuẩn bị dung dịch CNSL Dung dịch CNSL sấy 600C 48h để làm giảm độ ẩm trước tiến hành thí nghiệm - Hịa tan dung môi: + Cân xg CNSL thêm vào 4x ml dung môi (tỷ lệ 1:4) + Khuấy cho tan, ly tâm loại bỏ cặn, thu dịch để thực phản ứng bước - Tạo thành calcium anacardate từ CNSL + Cho Ca(OH)2 vào erlen chứa dịch CNSL thu bước tỷ lệ Ca(OH)2: dung dịch CNSL = 1:5 Khuấy từ 500 vòng/ phút + Sau phản ứng, ly tâm thu kết tủa, rửa kết tủa lần ethanol + Làm khô kết tủa calcium anacardate 500C 48h + Nghiền mịn để thu bột calcium anacardate - Phản ứng acid – base: + Hòa tan mẫu calcium anacardate ethanol + Thêm vào HCl 10M, khuấy máy khuấy từ nhiệt độ 50 0C phút Sau để nguội - Tách anacardic chiết lỏng – lỏng: + Cho dung dịch vào bình lóng + Thêm vào 15 ml petrolium light, đậy nắp, lắc mạnh sau để lên giá, mở nắp bình lóng để dung dịch tách lớp + Thu dịch phía trên, rửa lại lần 20 ml nước khử ion + Cô quay sấy khô dung dịch sau tách chiết, thu nhận anacardic acid Etanol 70% CNSL AnAc + HCl 10M Ca2+ (1:5) Sấy chân không Calcium anacardate Hình 3.23 Quy trình sản xuất AnAc từ CNSL Bước 2: Quy trình tạo chế phẩm thuốc trừ sâu LDHs-AnAc (hình 3.24) - Dung dịch phản ứng A: MgCl2.6H2O 0.2M AlCl3.6H2O 0.1M, đánh sóng siêu âm sục khí N2 để loại bỏ bọt khí CO2 - Dung dịch phản ứng B: AnAc hòa tan ethanol tuyệt đối theo tỉ lệ 2:1 - Dung dịch NaOH 2M đánh sóng siêu âm để loại bỏ bọt khí - Tiến hành phản ứng:  Hịa tan dung dịch B thể tích NaOH 2M, sục khí N2  Đặt bình chứa dung dịch A lên máy khuấy từ gia nhiệt 500C, sục khí N2 liên tục  Nhỏ giọt từ từ dung dịch B vào dung dịch A  Điều chỉnh pH hỗn hợp NaOH 2M  Bịt kín màng parafin, sử dụng máy lắc ủ để lắc với tốc độ 150 vòng/phút 48h 300C để ổn định cấu trúc hạt  Các phân tử không tham gia phản ứng, hòa tan hỗn hợp loại bỏ cách ly tâm bỏ dịch, rửa nước cất 03 lần Kiểm tra hiệu suất hấp phụ cách xác định hàm lượng phenol lại dịch sau ly tâm thuốc thử Folin khối lượng hạt tạo thành Mg2++Al3+ = 2:1 NaOH 1M + 5.12 g AnAc Hỗn hợp dung dịch có pH = 11 Khuấy 800 -1000 vịng/phút Ủ 24 – 48h/to phịng Hình thành hạt nano LDHs mang AnAc Rửa nhiều lần nước khử ion Dung dich MgAl LDHs-AnAc Chế phẩm MgAl LDHs-AnAc Hình 3.24 Quy trình sản xuất chế phẩm MgAl LDHs-AnAc HEC 0.5% Đánh giá chế phẩm: - Các tiêu đánh giá chế phẩm - pH = ± 0.5 - Màu sắc: màu nâu - Tỷ trọng: 1.01 ± 0.2 g/ml - Nồng độ AnAc = 5.12g/100ml Ước tính giá thành sản phẩm Hóa chất cần sử dụng cho kg Lượng cần sử dụng dầu (kg/l) Dầu điều Cồn 0.3 Ca(OH)2 0.2 HCl 0.4 Eter dầu hỏa 0.203 MgCl2 0.12 AlCl3 0.5 NaOH 20 Điện tiêu thụ Công sản xuất Đơn giá 13200 Thành tiền (vnđ) 13200 19000 76000 72000 21600 47000 9400 80000 32000 79000 16037 71000 8520 43000 21500 2200 44000 200000 200000 Tổng 442,257 Theo quy trình sản suất kg dầu điều tạo lít chế phẩm Giá cho lít chế phẩm khoảng 64,000 vnđ (sáu mươi tư ngàn đồng chẵn) Trong đó, lít chế phẩm pha 100 lít để phun đồng phun cho 1000 m2 trồng rau Quy trình sản xuất dạng thực nghiệm Có thể sử dụng CNSL để sản xuất thuốc trừ sâu theo quy trình sau: Bước 1: sơ chế CNSL để loại bỏ sáp tạp chất cồn 70o Bước 2: Hấp phụ CNSL lên hạt nano LDHs trực tiếp trình tổng hợp (tương tự quy trình trên) - Dung dịch phản ứng A: MgCl2.6H2O 0,2M AlCl3.6H2O 0,1M, đánh sóng siêu âm sục khí N2 để loại bỏ bọt khí CO2 - Dung dịch phản ứng B: CNSL hòa tan ethanol tuyệt đối theo tỉ lệ 2:1 - Dung dịch NaOH 2M đánh sóng siêu âm để loại bỏ bọt khí - Tiến hành phản ứng:  Hịa tan dung dịch B thể tích NaOH 2M, sục khí N2  Đặt bình chứa dung dịch A lên máy khuấy từ gia nhiệt 500C, sục khí N2 liên tục  Nhỏ giọt từ từ dung dịch B vào dung dịch A  Điều chỉnh pH hỗn hợp NaOH 2M  Các phân tử khơng tham gia phản ứng, hịa tan hỗn hợp loại bỏ cách ly tâm bỏ dịch, rửa nước cất 03 lần Mg2++Al3+ = 2:1 NaOH 2M + 5,12 g CNSL Hỗn hợp dung dịch có pH = 11 Khuấy 800 -1000 vòng/phút Ủ 24 – 48h/to phịng Hình thành hạt nano LDHs mang CNSL Dung dich MgAl LDHs-CNSL Chế phẩm MgAl LDHs-CNSL HEC 0,5% PHỤ LỤC QUẢN LÝ