Nghiên cứu chọn tạo giống khổ qua lai f1 momordica charantia cho vùng đông nam bộ

ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM VIỆN NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG KẾT KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG KHỔ QUA LAI F1 (Momordica charantia) CHO VÙNG ĐÔNG NAM BỘ Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Phan Đặng Thái Phương (ký tên) Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) Thành phố Hồ Chí Minh- 2017 LỜI CAM ĐOAN Đề tài “Nghiên cứu chọn tạo giống khổ qua lai F1 Momordica charantia cho vùng Đông Nam bộ” cơng trình nghiên cứu nhóm nghiên cứu Các số liệu điều tra thu thập thực tế địa phương, số liệu đề tài hồn tồn trung thực Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng nhóm nghiên cứu chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác TS Phan Đặng Thái Phương TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Hiện nay, nhập giống rau vấn đề thời thách thức ngành trồng rau nước Việc tự sản xuất hạt giống, số có giống khổ qua chiến lược hấp dẫn nhiều doanh nghiệp sản xuất thương mại giống trồng nước Vì vậy, đề tài tiến hành với mục tiêu sản xuất giống khổ qua suất cho vùng Đông Nam từ nguồn vật liệu di truyền giống khổ qua địa Kết nghiên cứu đề tài thu thập thành công thông tin trồng, sản xuất thương mại trái khổ qua vùng Đông Nam Tây Ngun Nguồn vật liệu gồm 80 mẫu dịng/giống có nguồn gốc hoang dã địa thu thập Tổng số 12 mẫu 80 mẫu đánh giá sàng lọc có đặc tính suất triển vọng độ cao bao gồm mẫu: 05, 09, 17, 19, 33, 37, 38, 43, 52, 62, 69 70 Các mẫu giống vật liệu khởi đầu quan trọng trình lai tạo cải tiến giống khổ qua F1 suất Trong 94 tổ hợp lai tạo thử nghiệm, 01 tổ hợp lai (69x43) đánh giá tổ hợp lai có triển vọng cải tiến suất khổ qua Giống khổ qua lai F1-NLU kết q trình lai tạo dịng khổ qua 69 (dịng bố) mang đặc tính trọng lượng lớn (150-300 gram) lai với dòng khổ qua 43 (dòng mẹ) mang đặc tính sai (200-250 quả/cây) Năng suất đánh giá thử nghiệm đồng ruộng giống khổ qua lai F1-NLU 4,65 kg/cây giai đoạn thu hoạch (60 ngày sau trồng) SUMMARY OF RESEARCH CONTENT Recently, vegetable seed import has been a news and challenge issue for vegetable growing of Vietnam Hybrid variety seed production such as hybrid bitter gourd seed by using materials of the wild and native species is a very attractive strategy for many producing and trading seed companies Therefore, the purpose of this research is to produce high yield bitter gourd variety for Southeast region of Vietnam The results of the study are: - Informative investigation on planting, producing and trading bitter gourd variety of the farmer and the small trader was done in the Southeast and highland region of Vietnam - A total of 80 lines of the wild and native bitter gourd species were collected - A total of 12 lines in 80 lines were evaluated as valuable materials for improving bitter gourd yield and high homozygote ratio lines, including: 05, 09, 17, 19, 33, 37, 38, 43, 52, 62 69 and 70 - A total of 94 bitter gourd hybrid combinations were carried out successfully - The hybrid combination of 69x43 was screened as a promising hybrid for improving bitter gourd yield F1- NLU bitter gourd variety was crossed between line 69 and line 43 The yield of F1-NLU variety was evaluated about 4.65 kg per plant on the paddy-field test condition MỤC LỤC Trang Trang tựa i Lời cam đoan ii Tóm tắt nội dung nghiên cứu iii Summary iv Mục lục v Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách bảng biểu x Danh sách hình ảnh xii GIỚI THIỆU Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu tổng quát Mục tiêu cụ thể Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc phân bố khổ qua giới 1.2 Phân loại thực vật học khổ qua 1.3 Đặc điểm thực vật học khổ qua 1.4 Thành phần dinh dưỡng hóa học khổ qua 1.5 Nghiên cứu vai trò dược liệu khổ qua 10 1.6 Một số khái niệm di truyền 12 1.7 Sản xuất nghiên cứu chọn tạo giống khổ qua nước 13 1.8 Sản xuất nghiên cứu chọn tạo giống khổ qua Việt Nam 16 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 26 2.1 Nội dung thực 26 2.1.1 Nội dung 1: Điều tra, đánh giá sơ thu thập dòng/giống khổ qua địa khổ qua hoang dại 26 2.1.2 Nội dung 2: Đánh giá đặc tính nơng học mẫu 26 2.1.3 Nội dung 3: Đánh giá chọn dòng di truyền mẫu 26 2.1.4 Nội dung 4: Đánh giá khả phối hợp tổ hợp lai 26 2.1.5 Nôi dung 5: Đánh giá giống khổ qua F1 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Phương pháp tiếp cận nghiên cứu 27 2.2.2 Phương pháp thực 27 2.2.2.1 Phương pháp điều tra, đánh giá sơ thu thập dòng/giống khổ qua địa khổ qua hoang dại 27 2.2.2.2 Phương pháp đánh giá đặc tính nơng học mẫu 30 2.2.2.3 Phương pháp đánh giá chọn dòng 2.2.2.4 Phương pháp đánh giá khả tổ hợp lai 46 2.2.2.5 Phương pháp đánh giá giống khổ qua F1 47 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49 3.1 Kết điều tra, đánh giá sơ thu thập dòng/giống khổ qua địa khổ qua hoang dại 49 3.1.1 Kết điều tra nông dân trồng khổ qua khu vực Tây Nam bộ, Đông Nam 49 3.1.2 Kết điều tra nông dân trồng khổ qua khu vực Tây Nguyên 56 3.1.3 Kết điều tra thương lái tiểu thương thương mại khổ qua khu vực Tây Nam bộ, Đông Nam 60 3.1.4 Kết điều tra thương lái tiểu thương thương mại khổ qua khu vực Tây Nguyên 62 3.1.5 Kết qua thu thập mẫu dòng/giống khổ qua 65 3.2 Kết đánh giá đặc tính nơng học mẫu dịng/giống khổ qua địa khổ qua hoang dại 67 3.2.1 Kết xử lý phân nhóm trọng lượng (gram/quả) số quả/cây 80 mẫu dòng/giống khổ qua thu thập 76 3.2.2 Kết xử lý phân nhóm số lượng quả/cây 80 mẫu dòng/giống khổ qua thu thập 78 3.2.3 Kết đánh giá chất lượng 80 mẫu dòng/giống khổ qua (Momordica charantia L.) 86 3.3 Kết đánh giá chọn dòng di truyền 90 3.3.1 Kết ly trích DNA khổ qua 90 3.3.2 Kết cải biến hồn thiện quy trình nhân PCR cặp mồI SSR khổ qua 91 3.3.3 Kết đánh giá độ markers phân tử mẫu 95 3.3.4 Kết đánh giá đặc tính sinh học số dòng lựa chọn đồng ruộng 99 3.3.5 Ứng dụng triển vọng nghiên cứu cấp thiết 103 3.4 Kết đánh giá khả tổ hợp lai dòng/giống triển vọng lai tạo giống khổ qua F1 105 3.5 Kết đánh giá đặc tính giống lai F1 vừa lai tạo thành công 113 3.5.1 Kết đánh giá đặc tính giống lai F1 với quy mơ thử nghiệm 113 3.5.2 Kết trình diễn giống lai F1-NLU 116 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .120 4.1 Kết luận 120 4.2 Đề nghị 120 Tài liệu tham khảo 122 Phu lục 127 Phụ lục 2.1 Mẫu phiếu điều tra nông dân trồng khổ qua 127 Phụ lục 2.2 Mẫu phiếu điều tra thương lái/tiểu thương 133 Phụ lục 2.3 Thơng tin trình tự thiết kế 10 cặp primer SSR cho khổ qua 137 Phụ lục 3.1 Kết điều tra nông dân vùng Đông Nam Tây Nguyên 149 Phụ lục 3.2 Kết điều tra tiểu thương thương lái vùng Đông Nam Tây Nguyên 157 Phụ lục 3.3 Kết qua thu thập mẫu dịng/giống khổ qua Đơng Nam Tây Nguyên 164 Phụ lục 3.4.(1-2) Kết hình ảnh dạng 80 mẫu dòng/ giống 170 Phụ lục 3.5 Kết phân tích thành phần khống vitamine C thịt 80 mẫu dòng/giống khổ qua 172 Phụ lục 3.6 Kết đánh giá chất lượng DNA mẫu giống 175 Phụ lục 3.7 Kết điện di số sản phẩm PCR 10 cặp primer SSR 180 Phụ lục 3.8 Kết quy trình đánh giá độ 181 Phụ lục 3.9 Kết quy trình lai tạo giống khổ qua lai F1 suất 184 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism): Đa hình chiều dài đoạn nhân AVRDC (Asian Vegetable Research and Development Center): Trung tâm nghiên cứu phát triển rau Châu Á CS: Cộng CTAB: Cetyltrimethyl Ammonium Bromide DNA: Deoxyribonucleic acid ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long EB: Elution Buffer He (Heterozygote): Dị hợp tử Ho (Homozygote): Đồng hợp tử ISSR: Inter-Simple-Sequence-Repeats MAS (Marker assisted selection): Sàng lọc nhờ trợ giúp marker phân tử NLU (Nông Lâm University): Trường Đại Học Nông Lâm NST: Ngày sau trồng OD (Optical Density): Mật số hấp thu QĐ-BNN-KHCN: Quyết định-Bộ Nông nghiệp- Khoa học Công nghệ QTL (Quantative Trait Locus) RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) SSR (Simple Sequence Repeat) SD: Standard deviation TE: (Tris-EDTA) USDA: (United States Department of Agriculture DANH SÁCH BẢNG BIỂU Trang Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng có 100g thịt khổ qua tươi Bảng 1.2 Thành phần dinh dưỡng có 100g thịt khổ qua tươi Bảng 1.3 Đặc tính giống khổ qua thương mại 17 Bảng 2.1 Thông tin 10 cặp primer sử dụng đánh giá di truyền 44 Bảng 2.2 Chu trình nhiệt phản ứng nhân DNA khổ qua 45 Bảng 3.1 Kết điều tra số đặc tính nơng học khổ qua nơng dân khu vực Đông Nam 50 Bảng 3.2 Kết điều tra số đặc tính nơng học khổ qua nông dân khu vực Tây Nguyên 57 Bảng 3.3 Kết điều tra thương lái/tiểu thương thương mại khổ qua khu vực Đông Nam 61 Bảng 3.4 Kết điều tra thương lái/tiểu thương thương mại khổ qua khu vực Tây Nguyên 63 Bảng 3.5 (1-8) Đánh giá số tính trạng nơng học 80 dịng 68-75 Bảng 3.6 Mô tả khái quát đặc điểm dạng 80 mẫu 79 Bảng 3.7 Một số thành phần dinh dưỡng thịt tươi 80 mẫu dòng/giống khổ qua 87 Bảng 3.8 Đánh giá cảm quan độ đắng thịt 80 mẫu khổ qua 88 Bảng 3.9 Kết ly trích DNA tổng số mẫu khổ qua tươi 91 Bảng 3.10 Chu trình nhiệt phản ứng nhân DNA khổ qua kỹ thuật PCR theo Kole, 2012 cải biến 93 Bảng 3.11 (1-2) Kết đánh giá di truyền 80 mẫu dòng/giống khổ qua sử dụng 10 cặp primers SSR 97-98 Bảng 3.12 Đặc tính sinh học số dòng khổ qua triển vọng 100 Bảng 3.13 Đánh giá độ đồng tính trạng tổng số 101 10 Phụ lục 3.5 Kết phân tích thành phần khống vitamine C thịt 80 mẫu dòng/giống khổ qua Phụ lục định lượng Vitamine C thịt khổ qua Nghiệm mg Vitamine C (100 gram mẫu) thức R1 R2 R3 Aver SD Chanh HCl 2% 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 90.89 2.58 36.47 40.13 37.20 43.07 44.53 46.73 37.93 37.20 45.27 38.67 40.87 47.47 44.53 48.20 46.73 45.27 46.00 46.00 47.47 46.00 43.80 39.40 46.00 21.80 43.80 47.47 43.80 32.80 35.73 24.73 89.50 2.55 35.73 37.20 35.73 40.87 43.80 46.00 40.87 37.93 40.87 37.93 37.93 46.00 37.93 47.47 44.53 45.27 45.27 45.27 46.00 45.27 43.80 37.20 44.53 21.80 39.40 46.00 44.53 30.60 32.80 26.20 88.00 2.50 37.20 39.40 35.00 42.33 44.53 47.47 37.20 38.67 46.00 37.20 37.93 46.00 35.73 46.73 42.33 46.00 43.80 46.00 47.47 46.00 42.33 36.47 45.27 21.07 38.67 46.00 43.80 35.00 32.07 23.27 185 89.46 2.54 36.47 38.91 35.98 42.09 44.29 46.73 38.67 37.93 44.04 37.93 38.91 46.49 39.40 47.47 44.53 45.51 45.02 45.76 46.98 45.76 43.31 37.69 45.27 21.56 40.62 46.49 44.04 32.80 33.53 24.73 1.45 0.04 0.73 1.53 1.12 1.12 0.42 0.73 1.94 0.73 2.78 0.73 1.69 0.85 4.58 0.73 2.20 0.42 1.12 0.42 0.85 0.42 0.85 1.53 0.73 0.42 2.78 0.85 0.42 2.20 1.94 1.47 Phụ lục định lượng Vitamine C thịt khổ qua Nghiệm mg Vitamine C (100 gram mẫu) thức R1 R2 R3 Aver 31 46.00 46.73 43.80 45.51 32 35.00 37.20 35.00 35.73 33 46.00 45.27 46.00 45.76 34 48.20 46.73 47.47 47.47 35 30.00 32.20 35.00 32.40 36 36.47 35.73 37.20 36.47 37 33.13 37.20 39.40 36.58 38 37.20 35.73 39.00 37.31 39 41.07 40.87 41.33 41.09 40 44.53 43.80 40.53 42.96 41 42.73 46.00 42.47 43.73 42 37.93 35.87 37.20 37.00 43 37.20 37.93 33.67 36.27 44 45.27 40.87 41.00 42.38 45 38.67 32.93 37.20 36.27 46 33.87 37.93 37.93 36.58 47 47.47 46.00 42.00 45.16 48 34.53 37.93 35.73 36.07 49 44.20 47.47 46.73 46.13 50 46.73 41.53 42.33 43.53 51 45.27 45.27 43.00 44.51 52 38.00 45.27 43.80 42.36 53 42.00 45.27 46.00 44.42 54 42.47 46.00 41.47 43.31 55 40.00 45.27 46.00 43.76 56 43.80 40.80 42.33 42.31 57 33.40 37.20 36.47 35.69 58 40.00 44.53 45.27 43.27 59 20.80 21.80 21.07 21.22 60 43.80 39.40 39.67 40.96 186 SD 1.53 1.27 0.42 0.73 2.51 0.73 3.18 1.64 0.23 2.13 1.97 1.05 2.28 2.50 2.98 2.35 2.83 1.72 1.71 2.80 1.31 3.84 2.13 2.38 3.27 1.50 2.02 2.85 0.52 2.47 Nghiệm thức 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 mg Vitamine C (100 gram mẫu) R1 47.47 41.80 32.80 30.73 21.73 42.00 35.00 40.00 48.20 33.50 36.47 40.13 32.20 43.07 40.53 42.73 37.93 32.20 40.27 34.67 R2 44.00 44.53 30.60 32.80 26.20 42.73 34.20 45.27 46.73 32.00 35.73 41.20 32.73 42.87 43.80 46.00 34.87 35.93 40.87 32.93 R3 43.00 40.80 30.00 32.07 23.27 43.80 35.00 46.00 47.47 30.50 32.20 39.40 35.00 42.33 40.53 45.47 36.20 36.67 39.00 30.20 187 Aver 44.82 42.38 31.13 31.87 23.73 42.84 34.73 43.76 47.47 32.00 34.80 40.24 33.31 42.76 41.62 44.73 36.33 34.93 40.04 32.60 SD 2.34 1.93 1.47 1.05 2.27 0.91 0.46 3.27 0.73 1.50 2.28 0.91 1.49 0.38 1.89 1.75 1.54 2.40 0.95 2.25 Phụ lục 3.6 Kết đánh giá chất lượng DNA mẫu giống Sample ID 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 Date 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 Time 18:51 18:52 18:53 18:54 18:55 18:58 18:59 19:01 19:02 19:02 19:03 19:04 19:06 19:11 19:15 19:18 19:19 19:19 19:21 19:23 19:24 19:25 19:26 19:27 19:28 19:33 19:37 19:39 19:40 19:41 19:42 19:43 19:44 19:45 19:46 19:47 19:47 19:48 19:53 ng/ul 1,737.45 74.31 2,116.80 1,674.81 1,075.29 969.46 4,496.74 2,351.08 1,195.60 3,418.69 1,261.43 3,211.01 2,524.03 3,127.33 751.51 1,371.94 1,366.47 3,440.23 1,177.49 1,303.27 911.77 873.09 1,723.54 1,086.69 998.55 1,878.85 1,217.89 1,412.40 190.25 2,685.19 2,365.49 1,308.99 2,074.50 1,562.18 758.65 1,115.05 1,124.65 1,361.53 2,589.67 188 A260 34.75 1.49 42.34 33.50 21.51 19.39 89.94 47.02 23.91 68.37 25.23 64.22 50.48 62.55 15.03 27.44 27.33 68.81 23.55 26.07 18.24 17.46 34.47 21.73 19.97 37.58 24.36 28.25 3.81 53.70 47.31 26.18 41.49 31.24 15.17 22.30 22.49 27.23 51.79 A280 17.55 7.33 22.97 18.70 11.83 10.33 51.15 24.98 12.13 34.51 12.48 31.61 24.69 32.42 7.88 13.73 14.09 34.41 12.37 15.16 9.56 10.08 18.81 12.34 12.22 19.48 12.75 16.22 8.18 28.86 23.03 14.05 22.49 17.53 7.27 10.64 11.05 13.34 31.36 260/280 1.98 0.20 1.84 1.79 1.82 1.88 1.76 1.88 1.97 1.98 2.02 2.03 2.04 1.93 1.91 2.00 1.94 2.00 1.90 1.72 1.91 1.73 1.83 1.76 1.63 1.93 1.91 1.74 0.46 1.86 2.05 1.86 1.84 1.78 2.09 2.10 2.03 2.04 1.65 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 19:54 19:55 19:55 19:56 19:57 19:58 20:07 20:08 20:09 20:10 20:11 20:13 20:14 20:18 20:19 20:20 20:21 20:21 20:22 20:23 20:23 20:24 20:25 20:26 20:27 20:27 20:28 20:28 20:29 20:30 20:30 20:31 20:31 20:32 20:41 20:42 20:43 20:45 20:46 20:47 20:47 1,338.15 1,091.70 1,089.50 444.31 529.19 171.02 390.82 511.52 806.54 1,878.43 2,387.02 2,669.50 2,982.17 2,988.78 574.85 1,216.19 2,727.78 2,246.14 3,392.09 2,158.01 658.46 1,432.55 293.32 1,795.29 1,346.52 2,734.87 880.08 1,051.24 934.25 1,348.88 1,677.58 1,564.65 3,608.55 2,175.26 650.56 737.14 801.57 603.39 702.53 518.58 441.74 189 26.76 21.83 21.79 8.89 10.58 3.42 7.82 10.23 16.13 37.57 47.74 53.39 59.64 59.78 11.50 24.32 54.56 44.92 67.84 43.16 13.17 28.65 5.87 35.91 26.93 54.70 17.60 21.03 18.69 26.98 33.55 31.29 72.17 43.51 13.01 14.74 16.03 12.07 14.05 10.37 8.84 12.68 10.57 11.37 4.48 5.53 1.96 4.26 5.69 9.45 19.84 24.22 26.92 29.67 29.74 6.19 13.28 28.57 22.31 35.00 24.00 6.50 15.29 9.15 17.90 13.83 28.85 10.79 11.05 11.27 12.83 16.86 15.80 38.86 23.09 11.21 8.46 10.65 2.21 6.99 5.09 4.42 2.11 2.07 1.92 1.98 1.91 1.74 1.83 1.80 1.71 1.89 1.97 1.98 2.01 2.01 1.86 1.83 1.91 2.01 1.94 1.80 2.03 1.87 0.64 2.01 1.95 1.90 1.63 1.90 1.66 2.10 1.99 1.98 1.86 1.88 1.16 1.74 1.51 5.47 2.01 2.04 2.00 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 20:47 20:48 20:48 20:49 20:50 20:50 20:51 20:51 20:52 20:53 20:54 20:54 20:55 20:56 20:56 20:57 20:58 20:59 20:59 21:00 21:00 21:01 21:01 21:02 21:03 21:04 21:04 21:05 21:06 21:10 21:11 21:12 21:12 21:13 21:14 21:14 21:15 21:16 21:17 21:18 21:18 177.24 218.86 187.63 138.92 53.94 90.36 209.26 127.26 490.75 1,280.39 1,660.47 1,649.62 1,211.66 2,173.37 1,649.95 4,523.41 3,170.01 1,388.13 2,115.93 2,862.04 2,020.77 1,167.69 1,321.45 323.60 2,700.52 1,498.80 2,534.48 2,381.96 2,298.58 65.48 2,424.92 3,101.04 2,125.17 3,450.84 2,857.35 2,181.63 90.54 1,903.20 1,022.19 3,785.48 2,309.21 190 3.55 4.38 3.75 2.78 1.08 1.81 4.19 2.55 9.82 25.61 33.21 32.99 24.23 43.47 33.00 90.47 63.40 27.76 42.32 57.24 40.42 23.35 26.43 6.47 54.01 29.98 50.69 47.64 45.97 1.31 48.50 62.02 42.50 69.02 57.15 43.63 1.81 38.06 20.44 75.71 46.18 1.70 2.44 2.03 1.37 0.67 1.06 2.09 1.40 4.92 13.44 18.27 16.28 13.50 21.86 16.49 50.97 33.94 13.25 23.81 29.74 21.03 12.37 14.30 9.94 28.97 15.80 26.74 25.09 22.90 5.83 25.24 32.00 22.18 34.78 29.35 21.96 8.68 20.52 10.08 39.03 22.62 2.09 1.79 1.85 2.03 1.61 1.71 2.01 1.82 1.99 1.91 1.82 2.03 1.80 1.99 2.00 1.78 1.87 2.10 1.78 1.92 1.92 1.89 1.85 0.65 1.86 1.90 1.90 1.90 2.01 0.22 1.92 1.94 1.92 1.98 1.95 1.99 0.21 1.86 2.03 1.94 2.04 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 21:19 21:19 21:20 21:20 21:21 21:21 21:22 21:22 21:23 21:24 21:28 21:28 21:29 21:30 21:30 21:31 21:32 21:33 21:33 21:34 21:34 21:36 21:37 21:38 21:39 21:39 21:40 21:40 21:41 21:41 22:08 22:09 22:09 22:10 22:11 22:12 22:12 22:13 22:14 22:14 22:15 1,445.66 1,826.62 2,535.56 2,880.70 2,395.03 1,886.69 2,056.30 1,819.14 1,802.51 1,852.37 2,275.11 2,710.77 2,905.99 2,443.73 3,042.74 3,187.39 1,877.98 1,499.14 3,217.64 1,514.80 1,829.38 263.44 2,578.70 4,434.32 150.98 3,095.52 2,637.88 1,805.76 2,540.81 2,664.91 1,676.05 1,858.22 2,764.72 141.59 2,235.89 92.57 2,243.88 2,922.05 3,046.62 2,744.16 2,815.09 191 28.91 36.53 50.71 57.61 47.90 37.73 41.13 36.38 36.05 37.05 45.50 54.22 58.12 48.88 60.86 63.75 37.56 29.98 64.35 30.30 36.59 5.27 51.57 88.69 3.02 61.91 52.76 36.12 50.82 53.30 33.52 37.16 55.29 2.83 44.72 1.85 44.88 58.44 60.93 54.88 56.30 14.01 18.30 24.89 28.03 23.28 18.17 19.50 17.46 17.51 18.70 23.13 27.90 29.87 25.29 30.85 33.20 18.84 15.30 32.41 15.10 18.93 3.17 25.97 50.14 5.51 31.53 26.48 18.68 25.69 26.37 17.07 18.23 27.84 4.87 22.63 5.50 23.38 30.19 31.59 27.71 29.71 2.06 2.00 2.04 2.06 2.06 2.08 2.11 2.08 2.06 1.98 1.97 1.94 1.95 1.93 1.97 1.92 1.99 1.96 1.99 2.01 1.93 1.66 1.99 1.77 0.55 1.96 1.99 1.93 1.98 2.02 1.96 2.04 1.99 0.58 1.98 0.34 1.92 1.94 1.93 1.98 1.90 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 5/16/15 22:15 22:22 22:22 22:23 22:24 22:24 22:25 22:26 22:26 22:27 22:27 22:28 22:29 22:29 22:30 22:31 22:31 22:32 22:32 22:33 22:33 22:34 22:34 22:35 22:35 22:37 22:37 22:38 22:38 22:39 22:39 22:40 22:40 22:41 22:41 22:42 22:43 22:43 22:44 22:44 3,508.11 1,920.78 2,548.21 2,059.33 2,515.93 2,357.85 2,406.05 867.27 2,075.30 2,366.55 2,560.43 3,059.09 2,356.90 2,121.14 1,784.44 2,662.72 1,573.32 2,932.17 2,939.81 1,698.39 2,229.08 1,607.59 1,919.53 1,231.65 2,316.97 7.48 298.74 185.22 170.32 402.84 278.16 499.38 488.13 334.39 294.89 307.05 262.92 104.82 100.84 28.28 192 70.16 38.42 50.96 41.19 50.32 47.16 48.12 17.35 41.51 47.33 51.21 61.18 47.14 42.42 35.69 53.25 31.47 58.64 58.80 33.97 44.58 32.15 38.39 24.63 46.34 0.15 5.98 3.70 3.41 8.06 5.56 9.99 9.76 6.69 5.90 6.14 5.26 2.10 2.02 0.57 36.89 19.18 25.78 20.90 25.24 23.18 24.35 9.81 20.84 24.18 25.05 31.35 23.92 21.10 18.75 27.09 15.64 30.70 29.87 18.03 21.94 15.60 19.60 11.97 22.47 0.07 3.71 1.89 1.86 3.95 2.85 5.02 5.24 3.26 3.12 2.90 2.47 1.09 1.03 0.29 1.90 2.00 1.98 1.97 1.99 2.03 1.98 1.77 1.99 1.96 2.04 1.95 1.97 2.01 1.90 1.97 2.01 1.91 1.97 1.88 2.03 2.06 1.96 2.06 2.06 2.10 1.61 1.96 1.83 2.04 1.95 1.99 1.86 2.05 1.89 2.12 2.13 1.93 1.96 1.98 Phụ lục 3.7 Kết điện di số sản phẩm PCR 10 cặp primer SSR đánh giá di truyền mẫu dịng/giống khổ qua 193 Phụ lục 3.8 Quy trình đánh giá dòng marker phân tử Bước 1: Ly trích vật liệu di truyền DNA dịng /giống khổ qua Công việc 1: Chọn mẫu tốt nghiền nitơ lỏng (chú ý bảo quản không để mẫu bột tan chảy) Công việc 2: Thêm vào mẫu bột khổ qua 1ml dung dịch EB trộn ủ 650C để đồng hoá phá vỡ Công việc 3: Ly tâm 13000 rpm cho 10 phút, hút 800 ml dịch phần hoà 800 ml Isopropanol vào ủ -200C/30 phút để kết tủa DNA ly tâm thu hồi DNA hồ tan 800 ml TE Cơng việc 4: Thêm 800 ml Isopropanol vào dung dịch DNA-TE làm công việc (công việc cải biến Công việc 5: Ly tâm 13000 rpm thu hồi DNA tạo phức với 400ml CTAB ủ 600C 15 phút (trộn Công việc 6: Thêm 800ml Chloroform/Isoamylalcohol vào hỗn hợp lắc ly tâm 13000rpm phút Công việc 7: Hút 500 ml dịch bên thêm vào 1ml Ethanol 96%, ly tâm 13000 rpm/ 10 phút thu Công việc 8: Rửa 3-4 lần DNA Ethanol 70% (công việc cải biến thêm) Cơng việc 9: Làm khơ DNA hồ tan 50 ml TE 1X, bảo quản -200C 194 Bước 2: Nhân DNA mẫu khổ qua với cặp mồi đồng trội SSR (Simple Sequence Repeat) phương pháp PCR Quy trình tiến hành nhân DNA thực thực qua bước cải biến yếu bao gồm: sàng lọc cặp primer SSR đồng trội, cải biến thành phần phản ứng PCR, cải biến quy trình nhân PCR nhân DNA tối ưu Cơng việc1: Thay đổi sàng lọc cặp primers phân biệt di truyền cho cá thể Thông tin cặp mồi primer đặc hiệu cho khổ qua thực dựa theo thông tin tham khảo Da-Long Guo, 2012 [22] website: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore Công việc 2: Thay đổi hồn thành thành phần hóa chất phản ứng PCR Tổng thể tích phản ứng 20 µl gồm có DNA genomic mẫu khổ qua 20 ng, 0.3 mM dNTPs, 0.4 mM of each primer, 1X Taq buffer, 2.5 mM Mg2+, and U Taq polymerase (TaKaRa Biotechnology Co.) Cơng việc 3: Thay đổi hồn thành thành phần nhiệt độ phản ứng PCR Chu trình nhiệt phản ứng nhân DNA khổ qua kỹ thuật PCR Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Tiền biến tính 94 phút Biến tính 94 phút Bắt cặp theo primer 45 giây Kéo dài 72 phút Hoàn tất 72 phút Giữ mẫu Chu kỳ 35 Bước 3: Xác định cá thể có kiểu gene đồng hợp dựa kết đánh giá di truyền DNA thị SSR 195 Cá thể đồng hợp (Ho) cá thể có band nhân DNA ngược lại cá thể dị hợp (He) cá thể có band nhân DNA điện di gel agarose Bước 4: Đánh giá mức độ đồng số tiêu liên quan đến tính trạng suất dịng khổ qua có độ triển vọng đồng ruộng Gieo hạt giống khổ qua ruộng có mật độ gieo hạt (80x80) cm, tổng số gieo 20 cây/dịng Chăm sóc quan sát theo dõi đến giai đoạn bắt đầu hoa, tiến hành đo đếm tính trạng liên quan đến suất cá thể chọn ruộng 196 Phụ lục 3.9 Kết quy trình lai tạo giống khổ qua lai F1 suất Quy trình lai giống khổ qua F1 từ nguồn vật liệu giống khổ qua địa Bước 1: Thực lựa chọn dòng bố dòng mẹ triển vọng Việc lựa chọn bố mẹ đầu dòng dựa tính trạng kiểu hình chất di truyền mong đợi: suất, tính chống chịu, chất lượng v.v Bước 2: Thực xác định thời vụ gieo thích hợp Chọn thời vụ thời tiết tốt, mưa khí hậu ấm áp phù hợp với điều kiện nhiệt độ ẩm độ thích hợp để tung phấn nhận phấn Bước 3: Thực cơng việc gieo hạt, trồng chăm sóc Trước gieo hạt giống khổ qua cần có nắm thông tin khoảng thời điểm hoa (hoa đực hoa cái) dòng bố mẹ để xử lý điều chỉnh thời gian nở hoa phù hợp Tiến hành gieo hạt dòng bố dòng mẹ vào khay bầu, lựa chọn đất trồng chuẩn bị làm đất để trồng dòng triển vọng bố mẹ Đất trồng khổ qua thích hợp loại đất thơng thống có khả giữ nước Trong q trình trồng cần ý đến thời đểm bón phân loại phân bón cần cho giai đoạn khác để tiến hành bón phân cho thích hợp Ngồi ra, việc tưới nước cần thiết cho khổ qua giai đoạn bắt đầu có hoa, cần ý khổ qua ưa nước không để bị ngập úng Về việc phòng trừ sâu bệnh hại cần tập trung ý đến số tác nhân gây hại quan trọng khổ qua như: bệnh xoăn virut, bệnh đốm lá, rầy mềm, ruồi đục sâu đục Bước 4: Thực công việc kiểm tra đồng ruộng thải loại Ruộng sản xuất hạt giống khổ qua lai tiến hành kiểm tra khử lẫn thời kỳ sau: + Lần 1: Trước hoa 197 + Lần 2: Khi hoa đậu + Lần 3: Trước thu hoạch Bước 5: Thực công việc bao hoa thụ phấn Việc lai tạo thụ phấn trực tiếp tay điều kiện nhà lưới bảo vệ gồm công đoạn sau: Lựa chọn loại vật liệu dùng để bao hoa + Túi giấy nhỏ kích thước x cm để bao hoa (có thể dùng vật liệu bao hoa tuỳ điều kiện nơi lai tạo, ý tạo điều kiện phù hợp ẩm độ nhiệt độ xung quanh tiểu không gian xung quanh hoa sau thụ phấn) + Kim ghim nhựa kim loại để kẹp hoa Bao hoa dòng mẹ Tiến hành bao hoa trước hoa nở 1-2 ngày nhằm tránh nhận phấn từ hoa đực không mong muốn Đánh dấu ghi để chuẩn bị lai tạo Thu thập hoa đực dòng bố Thu thập hoa đực dòng bố dùng làm nguồn cho phấn, cần chọn hoa đực có sức sống hạt phấn khỏe Thụ phấn cho dòng mẹ Hoa dòng mẹ bao bọc để cách ly Quá trình thụ phấn tiến hành ngày với điều kiện thời tiết tốt Bước 6: Thực việc chăm sóc thụ phấn Chăm sóc cây, giữ cho sinh truởng khoẻ để nuôi Phải loại bỏ hết thụ phấn tự nhiên từ non Bước 7: Thu hoạch bảo quản hạt giống 198 Khi chuyển sang màu vàng tiến hành thu hoạch chín bổ đôi, cạo hết ruột quả, cho vào thùng rửa hết phần vỏ hạt nước sạch, mang hạt phơi khô nắng tự nhiên kiểm tra ẩm độ hạt khoảng từ 15-20% tiến hành mang hạt bảo quản túi hút ẩm, đậy kín giữ tủ mát 40C 199