Đánh giá xác định bằng chỉ thị phân tử dna và hình thái kết hợp bảo tồn một số giống lan hoàng thảo dendrobium spp có giá trị

ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -oOo - TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH -oOo - CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐÁNH GIÁ, XÁC ĐỊNH BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA VÀ HÌNH THÁI KẾT HỢP BẢO TỒN MỘT SỐ GIỐNG LAN HỒNG THẢO (Dendrobium spp.) CĨ GIÁ TRỊ Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC TP HỒ CHÍ MINH Chủ nhiệm đề tài: TS HUỲNH HỮU ĐỨC TP Hồ Chí Minh, Tháng …/2021 ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -oOo - TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH -oOo - CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐÁNH GIÁ, XÁC ĐỊNH BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA VÀ HÌNH THÁI KẾT HỢP BẢO TỒN MỘT SỐ GIỐNG LAN HỒNG THẢO (Dendrobium spp.) CĨ GIÁ TRỊ Chủ nhiệm nhiệm vụ Huỳnh Hữu Đức Cơ quan chủ trì nhiệm vụ TS Nguyễn Đăng Quân TP Hồ Chí Minh, Tháng …/2021 TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc -oOo - -oOo - Tp Hồ Chí Minh, ngày…tháng…năm 2021 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN I THÔNG TIN CHUNG VỀ NHIỆM VỤ Tên nhiệm vụ: Đánh giá, xác định thị phân tử DNA hình thái kết hợp bảo tồn số giống lan Hoàng thảo (Dendrobium spp.) có giá trị Chủ nhiệm nhiệm vụ: - Họ tên: TS Huỳnh Hữu Đức - Ngày tháng năm sinh: 1982 Giới tính: Nam - Học hàm, Học vị: Tiến sỹ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Năm đạt học vị: 2014 - Chức danh khoa học: Năm phong chức danh: - Tên quan công tác: Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp HCM - Chức vụ: Phó trưởng phịng Thực Nghiệm trồng - Địa quan: 2374 quốc lộ 1, khu phố 2, phường Trung Mỹ Tây, Quận 12, Tp HCM - Điện thoại: 02837153792 Fax: 02838916997 - Địa nhà riêng: Phường Tân Phú, Quận 9, Tp Hồ Chí minh - Điện thoại nhà riêng: - Điện thoại di động: 0967 137 046 - E-mail: huuduchuynh82@gmail.com Tổ chức chủ trì nhiệm vụ - Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM - Điện thoại: 028.37153792 Fax: 028.38916997 - E-mail: ttcnsh.snn@tphcm.gov.vn Website: www.hcmbiotech.com.vn - Địa chỉ: 2374 quốc lộ 1, khu phố 2, phường Trung Mỹ Tây, Q12, Tp.HCM - Họ tên thủ trưởng tổ chức: Dương Hoa Xô - Số tài khoản: 9527.2.1007645 - Kho bạc Nhà nước/Ngân hàng: Tại kho bạc Nhà nước TP HCM II.TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng năm 2019 đến tháng năm 2021 - Thực tế thực hiện: từ tháng năm 2019 đến tháng năm 2021 - Được gia hạn (nếu có): - Lần từ tháng…năm……đến tháng năm……… Kinh phí sử dụng kinh phí a Tổng số kinh phí thực hiện: 1.424.000.000 đồng đó: - Kinh phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học: 1.424.000.000 đồng - Kinh phí từ nguồn khác: đồng b Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học Theo kế hoạch Thực tế đạt TT Thời gian Kinh phí Thời gian Kinh phí (tháng, năm) (đồng) (tháng, năm) (đồng) 05/2019 1.424.000.000 05/2020 1.424.000.000 Ghi (số đề nghị toán) c Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi Theo kế hoạch T T Nội dung khoản chi Tổng Thực tế đạt Nguồn khác NSKH Công lao động 517.288.500 517.288.500 trực tiếp Nguyên vật liệu, 807.271.580 807.271.580 lượng Thiết bị máy móc Xây dựng sửa chữa Chi khác 99.439.920 99.439.920 1.424.000.000 1.424.000.000 Tổng cộng - Lý thay đổi (nếu có): Tổng Ngu ồn khác NSKH 517.288.500 517.288.500 - 807.271.580 807.271.580 - - - - - - - - - 0 99.439.920 99.439.920 712.000.000 1.424.000.000 Các văn hành q trình thực đề tài/dự án (Liệt kê định, văn quan quản lý từ công đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực có); văn tổ chức chủ trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh…nếu có) TT Số, thời gian ban hành văn Tên văn Ghi Số 355/QĐ-SKHCN ngày Quyết định phê duyệt nhiệm vụ 26/04/2019 nghiên cứu khoa học công nghệ Số 12/2019/HĐ-QPTKHCN ngày Hợp đồng thực nhiệm vụ nghiên 09/05/2019 cứu khoa học công nghệ Các tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ Tên tổ chức Tên tổ chức đăng TT tham gia thực ký theo thuyết minh - Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ Ghi yếu đạt Lý thay đổi (nếu có): Các cá nhân tham gia thực nhiệm vụ (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp khơng q 10 người kể chủ nhiệm) T T 1 Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh TS Huỳnh Hữu Đức Tên cá nhân tham gia thực TS Huỳnh Hữu Đức Nội dung tham gia Sản phẩm chủ yếu đạt Chủ nhiệm đề tài, thực Chủ nhiệm đề tài, thực hiện theo dõi chung theo dõi chung nội nội dung dung Ghi TS Dương Hoa Xô TS Hà Thị Loan TS Dương Hoa Xô TS Hà Thị Loan ThS Nguyễn Trường Giang ThS Nguyễn Trường Giang ThS Nguyễn ThS Nguyễn Thị Thu Hằng Thị Thu Hằng KS Nguyễn KS Nguyễn Thị Xuân Hiền Thị Xuân Hiền KS Nguyễn KS Nguyễn Hoàng Cẩm Tú Hoàng Cẩm Tú ThS Nguyễn ThS Nguyễn Tấn Đức Tấn Đức ThS Võ Minh ThS Võ Minh Phát Phát - Lý thay đổi (nếu có): Thực nội dung nội dung Thực nội dung nội dung Thực số nội dung phịng thí nghiệm Thực nội dung nội dung 1, Thực nội dung nội dung 1, Thực nội dung nội dung 2,3,4 Thực nội dung nội dung Thư ký đề tài, thực số nội dung Tình hình hợp tác quốc tế Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa TT điểm, tên tổ chức hợp tác, ssoos đoàn, số lượng người tham gia…) - Tham gia thực nội dung 2,3,4,6 Tham gia thực nội dung 1,5 Tham gia thực nội dung 1,5 Tham gia thực nội dung 2,3,4 Tham gia thực nội dung Thư ký đề tài, tham gia thực nội dung 3,4,5 Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, ssoos đoàn, số lượng người tham gia…) Ghi Lý thay đổi (nếu có): Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa TT điểm,) - Tham gia thực nội dung Tham gia thực nội dung Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm …) Ghi Lý thay đổi (nếu có): Tóm tắt nội dung, công việc chủ yếu (Nêu mục 15 thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước) Thời gian (Bắt đầu, kết thức -tháng/năm) Theo kế Thực tế đạt hoạch TT Các nội dung, công việc chủ yếu cần thực (Các mốc đánh giá chủ yếu) Nội dung 1: Thu thập, đánh giá chọn lọc số giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) 5/2019 – 04/2020 5/2019 – 04/2020 Huỳnh Hữu Đức, Dương Hoa Xô, Hà Thị Loan, Nguyễn Thị Thu Hằng, Nguyễn Thị Xuân Hiền Nội dung Xây dựng sở liệu nguồn gen cho số giống lan Hoàng thảo dựa thị phân tử DNA barcode Cơng việc Xây dựng quy trình ly trích DNA tổng số thích hợp cho mẫu lan 8/20191/2021 8/20191/2021 Huỳnh Hữu Đức, Nguyễn Trường Giang, Nguyễn Hoàng Cẩm Tú Người, quan thực Công việc Khảo sát, đánh giá xây dựng marker phân tử DNA barcode cho số giống lan Hồng thảo Cơng việc Xây dựng sở liệu trình tự DNA DNA barcode để đánh giá mối quan hệ di truyền xác định số giống lan Hồng thảo thu thập Cơng việc Đánh giá nguồn gen phân tích mối quan hệ di truyền dựa trình tự DNA barcode cho giống lan Hồng thảo thu thập Nội dung Xây dựng sở liệu nguồn gen cho giống lan Hoàng thảo thu thập dựa thị phân tử SSR Công việc Khảo sát, đánh giá xây dựng marker phân tử SSR cho mẫu giống lan Hoàng thảo thu thập Công việc Xây dựng sở liệu phân tử SSR để đánh giá mối quan hệ di truyền xác định cho mẫu giống lan Hồng thảo thu thập Cơng việc Phân tích mối quan hệ di truyền dựa marker phân tử SSR cho giống lan Hoàng thảo thu thập 8/20191/2021 - Nội dung Lưu trữ in vitro số giống lan Hồng thảo có giá trị 05/202001/2021 - Nội dung Thiết lập sở liệu hình thái di truyền số giống lan Hồng thảo phục vụ công tác bảo tồn định danh 05/202001/2021 - Nội dung 6: Xử lý số liệu, viết báo cáo 11/2020 – 4/2021 - - Huỳnh Hữu Đức, Nguyễn Trường Giang, Nguyễn Hoàng Cẩm Tú, Võ Minh Phát Huỳnh Hữu Đức, Nguyễn Trường Giang, Nguyễn Hoàng Cẩm Tú, Võ Minh Phát Huỳnh Hữu Đức, , Nguyễn Thị Thu Hằng, Nguyễn Thị Xuân Hiền, Võ Minh Phát, Nguyễn Tấn Đức Huỳnh Hữu Đức, Nguyễn Trường Giang Lý thay đổi (nếu có): III TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Sản phẩm KH&CN tạo a Sản phẩm dạng I Tên sản phẩm cụ thể Đơn Số Thực tế TT Theo kế hoạch tiêu chất lượng chủ yếu vị lượng đạt Bộ giống lan hoàng thảo 20 giống lan Hoàng (Dendrobium spp.) rừng Giống 20 45 thảo hóa 5-10 giống lan Hồng Lưu trữ điều kiện in vitro Giống 5-10 10 thảo - Lý thay đổi (nếu có): b Sản phẩm dạng II TT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học cần đạt Theo kế hoạch Thực tế đạt Ghi Quy trình ly trích DNA tổng 01 quy trình 01 quy trình số Cơ sở liệu trình tự DNA Sàng lọc thị dựa thị phân tử 01 sở liệu phân tử DNA barcode để DNA barcode cho số DNA barcode xây dựng sở giống lan liệu DNA barcode Sàng lọc thị Cơ sở liệu SSR số 01 sở liệu phân tử SSR để xây dựng giống lan SSR sở liệu SSR 01 kết di truyền Kết phân tích di truyền Đã đánh giá mối quan hệ dựa marker dựa marker phân tử di truyền 45 mẫu phân tử DNA barcode DNA barcode SSR để giống lan dựa thị 01 kết di truyền phục vụ công tác lai tạo phân tử DNA barcode dựa marker bảo hộ giống thị phân tử SSR phân tử SSR - Lý thay đổi (nếu có): c Sản phẩm dạng III Yêu cầu khoa học cần đạt Số lượng, nơi công bố TT Tên sản phẩm Theo kế hoạch Thực tế đạt (Tạp chí, nhà xuất bản) 01 báo cáo tổng Báo cáo tổng kết 01 báo cáo tổng kết kết Tuyển tập báo cáo khoa 02 Bài đăng tạp Bài báo 03 báo học hội nghị cơng nghệ chí chun ngành sinh học tồn quốc 2020 - Lý thay đổi (nếu có): d Kết đào tạo Kết Tên sản phẩm Ghi TT (Thời gian kết thúc) Theo kế hoạch Thực tế đạt đăng ký 01 sinh viên Trường Đại học Cơng nghiệp thực phẩm Tp Hồ Chí Minh (Phan Nguyên Huy), 01 Cử nhân 04/2021 sinh viên trường Đại học Cơng nghệ Tp Hồ Chí Minh (Đặng Hồng Thanh Thanh) 01 học viên cao học: Nguyễn Hoàng Cẩm Tú, Thạc sỹ 04/2021 Trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh) (Dự kiến báo cáo kết vào tháng 05/2021) - Lý thay đổi (nếu có): đ Tình hình đăng ký quyền bảo hộ công nghiệp Kết Ghi TT Tên sản phẩm đăng ký Theo kế hoạch Thực tế đạt (Thời gian kết thúc) - Lý thay đổi (nếu có): e Thống kê danh mục sản phẩm KHCN ứng dụng vào thực tế TT Tên kết Thời gian ứng dụng Địa điểm (Ghi rõ tên, địa nơi ứng dụng) Kết sơ - Lý thay đổi (nếu có): Đánh giá hiệu nhiệm vụ mang lại a Hiệu khoa học công nghệ (Nêu rõ danh mục mức độ năm vững, làm chủ, so sánh với trình độ cơng nghệ so với khu vực giới…) Đề tài thu thập đánh giá 45 mẫu giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) từ nguồn khác Sự đa dạng di truyền giống phân tích dựa 58 đặc điểm hình thái hoa, lá, màu sắc, mùi thơm, cấu trúc phân tích để đánh giá mối quan hệ di truyền xây dựng phát sinh loài Đây nguồn sở liệu nguồn gen quý cho công tác khai thác lai tạo giống lan Hoàng thảo sau Ngoài ra, sở liệu di truyền phân tử dựa 02 thị DNA barcode SSR thiết lập cho 45 mẫu giống thu thập sở cho việc đánh giá nhận diện giống lan Hồng thảo nói chung phục vụ cho việc truy xuất nguồn gốc khai các tính trạng di truyền khác biệt nguồn gen Bộ sở liệu bao gồm: Bộ thị phân tử DNA barcode cho vùng rbcL, matK, psbK-psbI, ITS 45 mẫu lan; sở liệu 18 SSR với số allen phát 79 từ 18 locus với giá trị trung bình 4,39 allen/locus, tổng số alen đa hình 77 với giá trị trung bình 4,28 allen/locus Quy trình thực sở liệu hình thái di truyền phân tử (SSR, DNA barcode) cho 45 mẫu giống lan lưu trữ dạng file mềm truy xuất nhằm ứng dụng việc bảo tồn khai thác có hiệu nguồn gen b Hiệu kinh tế xã hội (Nêu rõ hiệu làm lợi tiền dự kiến nhiệm vụ tạo so với sản phẩm loại thị trường…) Trong trình thực đề tài, 10 mẫu giống lan giả hạc (D01-Giả hạc 1, D02-Giả hạc 2, D03- Giả học 3, D05-Giả hạc 5, D08-Giả hạc 8, D014-Giả hạc 14, D16-Giả hạc 16, D18-Giả hạc 18, D19 giả hạc 19, D27 giả hạc 27) lưu trữ dạng in vitro, khái thác nhân giống cách thuận tiên quy mô lớn phục vụ nhu cầu thị trường khu vực Thành phố Hồ Chí Minh nước Các giống có nguồn gốc rõ rang với hình ảnh hoa liệu di truyền phân tử SSR, DNA barcode, thuận tiện cho việc truy xuất nguồn gốc Nguồn gen giống lan rừng Hoàng thảo sở liệu hình thái thị phân tử đáng tin cậy sử dụng cho nhiều mục tiêu khác định danh giống, khai thác nguồn gen quý phục vụ lai tạo giống Tình hình thực chế độ báo cáo, kiểm tra nhiệm vụ Thời gian Ghi TT Nội dung (Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì) thực I Báo cáo tiến độ Lần 12/2019 Đang thực nội dung theo tiến độ II Báo cáo giám định 05/2020 Nhóm ngiên cứu thực đầy đủ nội dung nghiên cứu giai đoạn hợp đồng, tiến độ hạn so với thời gian ghi hợp đồng số 12/2019/HĐ-QPTKHCN ngày 09 tháng năm 2019 đựa ký kết Quỹ phát triển Khoa học Công Lần nghệ Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Tp Hồ CHí Minh Hội đồng thống đề nghị Sở KH&Cn cho tiếp tục thực nội dung giai đoạn theo hợp đồng III Nghiệm thu sở - Đề tài thực đầy đủ nội dung theo đề cương nghiên cứu đăng ký Kết quả nghiên cứu có chất lượng, sở khoa học chắc, sở lý luận khoa học, bố cục rõ ràng Kết nghiên cứu có ý nghĩa khoa học ứng dụng vào thực tiễn cao - Sản phẩm khoa học đạt yêu cầu theo đề cương đăng ký số lượng chất lượng sản phẩm Các nội dung cần bổ sung: - Cần bổ sung, cập nhật tài liệu tham khảo, thông tin Lần 04/2021 nghiên cứu - Phần kết luận cần viết ngắn gọn lại, nêu cụ thể kết đạt - Hoàn chỉnh lại báo cáo theo góp ý thành viên Hội đồng - Đồng ý nghiệm thu cấp sở nhiệm vụ Đánh giá, xác định thị phân tử DNA hình thái kết hợp bảo tồn số giống lan Hoàng thảo (Dendrobium spp.)” Chủ nhiệm đề tài Thủ trưởng tổ chức chủ trì GIÁM ĐỐC TS Huỳnh Hữu Đức TS Nguyễn Đăng Quân MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu phong lan 1.2 Một số marker phân tử DNA dùng nghiên cứu đa dạng di truyền 1.2 Tổng quan số thị phân tử DNA 1.2.1 Giới thiệu chung thị phân tử DNA 1.2.2 Chỉ thị phân tử DNA barcode 10 1.2.3 Chỉ thị phân tử SSR 12 1.3 Ứng dụng thị phân tử nghiên cứu lan nói chung Lan Dendrobium nói riêng 12 1.4 Một số nghiên cứu ứng dụng thị phân tử DNA trồng nước 17 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu 22 2.2 Nội dung nghiên cứu 22 2.2.1 Nội dung 1: Thu thập, đánh giá chọn lọc số giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) 22 2.2.2 Nội dung Xây dựng sở liệu nguồn gen cho số giống lan Hoàng thảo dựa thị phân tử DNA barcode 23 2.2.3 Nội dung Xây dựng sở liệu nguồn gen cho giống lan Hoàng thảo thu thập dựa thị phân tử SSR 23 2.2.4 Nội dung Lưu trữ in vitro số giống lan Hồng thảo có giá trị 24 2.2.5 Nội dung Thiết lập sở liệu hình thái di truyền số giống lan Hồng thảo phục vụ công tác bảo tồn định danh 24 2.2.6 Nội dung 6: Xử lý số liệu, viết báo cáo tổng kết, nghiệm thu đề tài 24 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Nội dung 1: Thu thập, đánh giá số mẫu giống lan Hồng thảo (Dendrobium) hình thái 24 2.3.2 Nội dung 2: Xây dựng sở liệu nguồn gen cho số mẫu giống lan Hoàng thảo dựa thị phân tử DNA barcode 26 2.3.3 Nội dung Xây dựng sở liệu nguồn gen cho mẫu giống lan Hoàng thảo thu thập dựa thị phân tử SSR 31 2.3.4 Nội dung Lưu trữ in vitro số mẫu giống lan Hồng thảo có giá trị 33 2.3.5 Nội dung Thiết lập sở liệu hình thái di truyền số giống lan Hồng thảo phục vụ công tác bảo tồn 34 2.3.6 Nội dung 6: Xử lý số liệu, viết báo cáo tổng kết, nghiệm thu đề tài 34 i Chương KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 35 3.1 Nội dung 1: Thu thập, đánh giá số mẫu giống lan Hồng thảo (Dendrobium) hình thái 35 3.2 Nội dung Xây dựng sở liệu nguồn gen cho số giống lan Hoàng thảo dựa thị phân tử DNA barcode 38 3.3 Nội dung Xây dựng sở liệu nguồn gen cho giống lan Hoàng thảo thu thập dựa thị phân tử SSR 86 3.4 Nội dung Lưu trữ in vitro số mẫu giống lan Hồng thảo có giá trị 91 3.5 Nội dung Thiết lập sở liệu hình thái di truyền số giống lan Hồng thảo phục vụ cơng tác bảo tồn 93 3.6 Nội dung 6: Xử lý số liệu, viết báo cáo tổng kết, nghiệm thu đề tài 94 Chương KẾT LUẬN 95 4.1 Kết luận 95 4.2 Kiến nghị 97 TÀI LIỆU THAM KHẢO 98 PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC 10 PHỤ LỤC 13 PHỤ LỤC 25 PHỤ LỤC 39 PHỤ LỤC 51 PHỤ LỤC 60 PHỤ LỤC 64 PHỤ LỤC 10 66 PHỤ LỤC 11 69 PHỤ LỤC 12 70 PHỤ LỤC 13 64 PHỤ LỤC 14 80 PHỤ LỤC 15 85 ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT BOLD: CBOL: COI: cpDNA: CTAB: DNA: iBOL: ITS: PCR: nrDNA: AFLP: UBND: SSR: STRs: PCR: RFLP: RAPD: ISSR: The Barcode of Life Data System Consortium for the Barcode of Life Cytochrome oxidase I Chloroplast DNA Cetyltrimethylammonium bromide Deoxyribonucleic acid The International Barcode of Life Internal transcribed spacer Polymerase chain reaction Nuclear DNA Amplified Fragment Length Polymorphism Ủy ban nhân dân Simple Sequence Repeats Short Tandem RepeatsPolymerase chain reaction Restriction Fragment Length Polymorphism Randomly Amplified Polymorphic DNA Inter-simple sequence repeat iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các kỹ thuật thị DNA Bảng 1.2 Thống kê số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng để đánh giá mối quan hệ di truyền lan Dendrobium 16 Bảng 2.1 Một số mẫu giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) dự kiến thực nghiên cứu 25 Bảng 2.2 Một số trình tự primer dự kiến sử dụng nghiên cứu 27 Bảng 2.3.Thành phần phản ứng PCR (20 µL/phản ứng) 29 Bảng 2.4.Chu kỳ nhiệt 29 Bảng 2.5 Một số primer SSR dự kiến thực nghiên cứu 31 Bảng 3.1 Danh sách giống lan Hoàng thảo thu thập 35 Bảng 3.2 Kết đo OD mẫu DNA tổng số mẫu giống lan ly trích phương pháp CTAB cải tiến điều kiện nghiền mẫu tủa DNA khác 39 Bảng 3.3 Kết khuếch đại 12 vùng thị phân tử DNA barcode với 38 cặp primer đặc hiệu cho marker 43 Bảng 3.4 Kết giải trình tự thành công vùng gen rbcL, matK, psbK-psbI, ITS 47 Bảng 3.5 Kết so sánh trình tự rbcL 45 mẫu lan với trình tự NCBI 49 Bảng 3.6 Vị trí sai khác 45 mẫu giống lan Dendrobium dựa vùng gen rbcL 54 Bảng 3.7 Kết so sánh trình tự matK 45 mẫu lan với trình tự NCBI 58 Bảng 3.8 Vị trí sai khác 45 mẫu giống lan Dendrobium dựa vùng gen matK 61 Bảng 3.9 Kết so sánh trình tự psbK-psbI 45 mẫu lan với trình tự NCBI 65 Bảng 3.10 Vị trí sai khác 45 mẫu giống lan Dendrobium dựa vùng gen psbK-psbI 68 Bảng 3.11 Kết so sánh trình tự ITS 45 mẫu lan với trình tự NCBI 72 Bảng 3.12 Vị trí sai khác 45 mẫu giống lan Dendrobium dựa vùng gen ITS 75 Bảng 3.13 Kết sàng lọc primer SSR cho 45 mẫu lan nghiên cứu 86 Bảng 3.14 Kết phân tích 45 mẫu giống lan dựa 18 thị phân tử SSR 88 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Hình ảnh số mẫu giống lan Dendrobium thu thập 36 Hình 3.2 Cây phân nhóm di truyền 41 mẫu giống lan dựa đặc điểm hình thái 38 Hình 3.3 Kết điện di DNA tổng số gel agarose 0,8% 40 Hình 3.4 Kết điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại vùng thị phân tử DNA barcode rbcL với cặp primer đặc hiệu cho marker A/ primer rbcL1-F rbcL724-R; B/ primer matK-KIM3-F matK-KIM1-R; C/ primer psbK-psbI-F psbK-psbI-R; D/ primer ITS-F ITS-R 45 Hình 3.5 Cây phân loại mẫu giống lan dựa trình tự DNA vùng rbcL A/ Phân pát sinh loại trình tự nghiên cứu, B/ Cây phát sinh lồi trình tự nghiên cứu kết hợp với trình tự nghiên cứu trước 57 Hình 3.6 Cây phân loại mẫu giống lan dựa trình tự DNA vùng matK A/ Phân pát sinh loại trình tự nghiên cứu, B/ Cây phát sinh lồi trình tự nghiên cứu kết hợp với trình tự nghiên cứu trước 64 Hình 3.7 Cây phân loại mẫu giống lan dựa trình tự DNA vùng psbK-psbI A/ Phân pát sinh loại trình tự nghiên cứu, B/ Cây phát sinh lồi trình tự nghiên cứu kết hợp với trình tự nghiên cứu trước 70 Hình 3.8 Cây phân loại mẫu giống lan dựa trình tự DNA vùng ITS A/ Phân pát sinh loại trình tự nghiên cứu, B/ Cây phát sinh lồi trình tự nghiên cứu kết hợp với trình tự nghiên cứu trước 84 Hình 3.9 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại thị SSR OA15 với cặp mồi OA15F OA15-R 45 mẫu lan 87 Hình 3.10 Cây phát sinh chủng loài 45 mẫu lan dựa thị phân tử SSR 90 Hình 3.11 Hình ảnh 10 giống lan giả hạc lưu trữ điều kiện in vitro Trung tâm Công nghệ Sinh học 93 v MỞ ĐẦU Việt Nam nước có mức độ đa dạng sinh học cao với nhiều lồi đặc hữu, lan rừng Việt Nam đánh giá đa dạng phong phú, với nhiều loài đẹp có giá trị kinh tế Đây nguồn gen quý phục vụ công tác lai tạo để tạo nhiều giống lan đặc sắc Lan Hoàng thảo (Dendrobium) lồi hoa quanh năm, thích hợp cho vùng có khí hậu nhiệt đới, có giá trị kinh tế cao thị trường ưa chuộng Đặc biệt, nhiều lồi lan Hồng thảo có sức sống mạnh, dễ thích nghi với điều kiện khí hậu TP HCM, đồng thời có khả kháng bệnh cao Tuy nhiên, đa số giống lan Dendrobium nuôi trồng TP HCM giống nhập nội từ Thái Lan Trong nhà vườn trồng lan sở hữu giống lan Hoàng thảo rừng hóa có giá trị, nhập nội hay tự lai tạo mà chưa đánh giá khai thác hiệu Trong đó, giống lan rừng hóa có giá trị Giả hạc, Long tu, Đại ý thảo, Trầm nhiều giống lai tạo chọn lọc với chất lượng tốt, mang nhiều đặc tính trội Tuy nhiên, giống lan rừng Việt Nam bị khai thác bừa bãi chưa có sách bảo tồn triệt để nhà nước ta nên phần lớn loài lan có nguy bị tiêu diệt nguồn gen quý Các nhà vườn trồng lan thường xuyên chọn lọc, lai tạo giống lan chưa biết xác nguồn gốc giống, chưa phân tích đánh giá thiếu đánh giá phân tích mặt di truyền Dó đó, việc sưu tập, lai tạo, chọn lọc giống lan rừng, bảo tồn nguồn gen nhằm phục vụ công tác nghiên cứu lai tạo giống hoa lan phù hợp với điều kiện khí hậu thị hiếu người tiêu dùng yêu cầu thiết yếu nhằm góp phần thúc đẩy việc phát triển hoa lan địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh tỉnh phía Nam Việc xác định nguồn gốc giống bố mẹ đánh giá giống cách đầy đủ mặt hình thái di truyền yêu cầu bắt buộc quan trọng công tác lai tạo giống sản xuất giống trồng Trong đó, việc phân loại truyền thống dựa đặc tính hình thái sử dụng mang lại hiệu chưa cao, chưa đảm bảo tính xác tốn nhiều thời gian cơng sức Các marker phân tử DNA barcode, SSR sử dụng công tác đánh giá nguồn gen, xác định mối quan hệ di truyền, nguồn gốc bố mẹ đánh giá giống mang lại kết khả quan đầy triển vọng rút ngắn thời gian lai tạo đồng thời đánh giá xác định cách xác nguồn gốc giống lai tạo bảo hộ giống Ngoài ra, việc đảm bảo lưu trữ bảo tồn nguồn gen giống lan bố mẹ chọn lọc song song với phân tích hình thái di truyền yêu cầu bắt buộc công tác lai tạo nghiên cứu phát triển giống lan giống lan quý, có giá trị kinh tế Trên sở đó, đề tài “Đánh giá, xác định thị phân tử DNA hình thái kết hợp bảo tồn số giống lan Hồng thảo (Dendrobium spp.) có giá trị” thực với mục tiêu xây dựng sở liệu phân tử DNA kết hợp hình thái để đánh giá mối quan hệ di truyền, lưu trữ bảo tồn nguồn gen giống lan Hoàng thảo nhằm phục vụ công tác nghiên cứu, lai tạo giống khai thác cách có hiệu số giống lan có giá trị Chương TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu phong lan Họ lan hay họ Phong lan (danh pháp khoa học: Orchidaceae) họ thực vật có hoa, thuộc Măng tây (Asparagales), lớp thực vật mầm Đây họ lớn thực vật, phân bổ nhiều nơi giới, tập trung chủ yếu vùng nhiệt đới (Atwood 1986);(Dressler 1993) Theo thống kê vườn thực vật hoàng gia Kew, họ lan gồm 880 chi gần 22.000 loài chấp nhận, số lượng xác chưa xác định rõ, nhiều tới 25.000 loài Số lượng loài lan cao gấp lần số lượng lồi động vật có vú hay lần số lượng loài chim Lan chiếm khoảng 6–11% số lượng lồi thực vật có hoa (Chase 2005)) Bên cạnh đó, khoảng 800 lồi lan bổ sung thêm năm Trong họ lan, chi lớn Bulbophyllum (khoảng 2.000 loài), Epidendrum (khoảng 1.500 loài), Dendrobium (khoảng 1.400 loài) Pleurothallis (khoảng 1.000 loài) Orchidaceae phân bố rộng khắp giới, chung có mặt mơi trường sống ngoại trừ sa mạc sơng băng Các lồi phần lớn tìm thấy khu vực nhiệt đới, chủ yêu Châu A, Nam Mỹ Trung Mỹ Ở vĩ độ cao vùng Bắc cực, miền nam Patagonia …cũng tìm thấy chúng Orchidaceae phân bố rộng khắp như: châu Đại Dương 50-70 chi, Châu Âu ôn đới Châu Á 40 – 60 chi, Bắc Mỹ 20- 25 chi, Châu Âu ôn đới châu Á 40 - 60 chi, Bắc Mỹ 20 - 25 chi (De Hert, Jacquemyn et al 2011) Châu Á nói chung vùng Đơng Nam Á nói riêng hai khu vực tập trung nhiều lan nhất, Việt Nam nằm khu vực mà lan Việt Nam vô phong phú đa dạng chủng loại màu sắc Có thể nói lan rừng Việt Nam không thu hút người yêu vẻ đẹp hoa lan nước mà thu hút người yêu Lan toàn giới với nét đặc trưng riêng biệt chúng Theo Phạm Hoàng Hộ (1993), lan rừng Việt Nam có khoảng 750 loài với nét đặc trưng khác Với phong phú chủng loại màu sắc thế, khó lột tả hết đặc điểm riêng chúng Mỗi loài lan rừng có yêu cầu điều kiện sinh thái định, ngoại trừ số loại lan thích nghi với điều kiện sống khác loại thường sinh sống nơi thích hợp Theo Trần Hợp (2000) điều kiện địa lý sinh thái Việt Nam đa dạng trải dài từ Bắc tới Nam với nhiều kiểu khí hậu đặc trưng khác nhau, lan rừng Việt Nam có nhiều loại lan đặc hữu, quý Lan rừng Việt Nam có nhiều màu sắc khác cam (Ascocentrum minitaum), màu đỏ loài Huyết Nhung, hồng Hồng lan hay sắc màu trắng xanh loài Mỹ Dung Dạ Hương… Có thể nói lan rừng Việt Nam với sắc màu đa dạng thế, lai tạo Việt Nam có tổ hợp lan phong phú sắc màu Đó chưa kể đến sắc màu có sẵn tự nhiên lồi Đi cáo (Aerides multiflora), Ngọc điểm (Rhyncholius parishii), Long nhãn kim điệp (Dendrobium annamensis), v.v Không riêng sắc đẹp, xét độ bền lồi lan rừng Việt Nam có nhiều giống nở lâu với khoảng thời gian khác Có lồi nở tháng (Mỹ Dung Dạ Hương, Huyết Nhung, Hoàng lan, Hồng lan) có loại nở trung bình từ – tuần (Long tu, Kim điệp, Đuôi cáo, Ngọc điểm) có lồi có thời gian nở ngày Thạch hộc…Xét kích thước Phong lan rừng Việt Nam có kích thước khác tỳ theo lồi Một số lồi có kích thướt bé giống Eria Các lồi có kích thước trung bình có số có kích thước lớn 10 cm Hạc Đĩnh, Huyết Nhung, Mỹ Dung hay Dạ Hương…Ngoài ra, lan rừng Việt Nam có ưu mạnh hương thơm, so với lồi lan lai lan rừng có kích thướt bé lại có hương thơm vơ hấp dẫn Một số lồi có hương thơm kể đến Mỹ Dung Dạ Hương, Hạc Đỉnh, Đi Cáo, Ngọc Điểm… Theo Nguyễn Thiện Tịch (2001), phần lớn lan rừng việt Nam phong lan Chúng sống bám cao phụ sin Vì rễ chúng bám vào bề mặt vỏ không lấy thức ăn mô gỗ Do tách lan khỏi thân cây, cành mà chúng bám trồng chúng sống Rễ phong lan bám bề mặt gỗ phát triển tốt nhờ cấu tạo đặc biệt chúng việc giữ nước hấp thu nước hòa tan chất khác Dựa vào đặc điểm rễ chia lan phụ sinh hai nhóm: phong lan bán phong lan Lan Hoàng thảo (Dendrobium) phân bố khắp nơi gới, chi phong phú đa dạng, theo ước tính có 1400 lồi nhiều Bullbopllyllum Ở nước nhiệt đới Châu Á đặc biệt khu vực Đông Nam Á tập trung nhiều đa dạng chi Dendrobium Vì họ lan có nhiều chi nhỏ nên khơng có thống hình thức hoa, Đồng thời giống hoa lan có điều kiện sinh trưởng đa dạng Có loại phù hợp vơi khí hậu Nhiệt đới, lại có hoa ưa Hàn đới, Ôn đới…Tuy nhiên, Dendrobium sinh trưởng phát triển tốt với điều kiện tự nhiên khó khăn Hoa nhóm lan tươi lâu đồng thời dễ dàng lai tạo tất loài lan Dendrobium chia làm hai nhóm dựa điều kiện inh trưởng nhóm ưa nóng nhóm ưa lạnh Ở Việt Nam chủ yếu nhóm ưa nóng, vài nhóm ưa lạnh thường sinh trưởng vùng núi cao nguyên Với đặc điểm thấy lan rừng Việt Nam nguồn lợi nhuận mang đến hiệu kinh tế cao khai thác hợp lý lai giống Không mang vẻ đẹp mà cịn thu ngoại tệ từ giống lan Có thể nói lan rừng Việt Nam tặng phẩm vô thiên nhiên ban tặng cho vùng núi rừng Tuy nhiên, nguồn gen chưa khai thác quản lý khai thác hợp lý Một ví dụ điển hình nhận thấy lồi lan hài Paphiopedilum delenatii, khơng có kế hoạch khai thác, bảo tồn không hợp lý nên Việt Nam chưa thể khai thác thương mại hóa lồi hoa 1.2 Một số marker phân tử DNA dùng nghiên cứu đa dạng di truyền Trong nơng nghiệp nói chung ngành hoa kiểng nói riêng, mục tiêu nhà chọn tạo giống trồng cải tiến giống trồng bị thiếu nhiều tính trạng cách chọn lọc lai chéo giống với giống mang tính trạng mong muốn Trong lai tạo giống truyền thống, việc chọn tạo giống bao gồm việc lai gen cá thể với nhau, lựa chọn tổ hợp lai số sản phẩm phân ly Như vậy, trình nhiều thời gian tốn kém, trải qua nhiều lần lai, nhiều hệ, lựa chọn kiểu hình cẩn thận, liên kết gen mục tiêu gen mong muốn gây khó khăn cho q trình chọn tạo giống Sự đời cơng nghệ đánh dấu DNA (công nghệ thị phân tử)dựa DNA gen với phát triển loại thị phân tử kết hợp với mục tiêu chọn tạo giống phân tử mở hội cho nhà chọn tạo giống trồng di truyền học vượt qua thách thức trở ngại lai tạo giống truyền thống Hiện nay, thị phân tử sử dụng rộng rãi để đánh dấu vị trí vùng gen số chương trình chọn giống lai tạo giống trồng Các thị phân tử liên kết chặt chẽ với nhiều tính trạng nơng học tính trạng kháng bệnh loại trồng (Jain, Brar et al 2002, Gupta and Rustgi 2004, Phillips and Vasil 2013) Một số thị phân tử như: (i) đa hình chiều dài giới hạn (RFLP), (ii) đa hình đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD), đa hình chiều dài đoạn khuyếch đại (AFLP) microsatellite đoạn trình tự lặp lại đơn giản (SSR), (iii) đa hình nucleotide đơn (SNP) Những thị phân tử tạo với số lượng lớn chứng minh hữu ích cho nhiều mục đích khác việc cải thiện giống trồng Chẳng hạn, chúng sử dụng rộng rãi để xây dựng đồ di truyền phân tử, liên quan thị với gen/tính trạng di truyền số lượng có vai trị việc kiểm sốt tính trạng quan trọng sử dụng số trường hợp để lựa chọn gián tiếp marker (MAS) Một số ứng dụng khác thị phân tử bao gồm giới thiệu gen mục tiêu thông qua lai chéo, mơ tả đặc tính nguồn giống bố mẹ, chẩn đốn di truyền, mơ tả đặc tính giống chuyển gen, nghiên cứu cấu trúc gen phân tích phát sinh lồi (Jain, Brar et al 2002) Đối với ứng dụng lai tạo giống, thị phân tử SSR chứng minh khuyến khích sử dụng chọn giống trồng khả liên kết tính trạng cao (Gupta and Varshney 2000) Chỉ thị phân tử SSR cho thấy ưu tính đa hình cao, tính ổn định, độ tinh cậy, khả tự động hoá so sánh với thị phân tử khác (Shariflou, Hassani et al 2001) Trong đó, thị phân tử DNA barcode cho thấy tính xác đánh giá xác định nhiều trồng khác với nhanh chóng tin cậy định DNA barcode phương pháp để xác định nhanh chóng lồi dựa trình tự DNA tách chiết từ mẫu mô nhỏ sinh vật 1.2 Tổng quan số thị phân tử DNA 1.2.1 Giới thiệu chung thị phân tử DNA Các thị di truyền thị thể khác biệt thể loài khác Các thị cho gen mục tiêu mà dấu hiệu “cờ đánh dấu” Chỉ thị di truyền bao gồm thị hình thái thị phân tử (isozyme, protein, DNA) Tất thị di truyền chiếm vị trí đặc biệt nhiễm sắc thể (NST) gọi locus Các thị di truyền thường liên kết với gen di truyền theo quy luật di truyền Chỉ thị phân tử thường hiểu thị DNA, thị nằm gần hay liên kết với gen khơng có ảnh hưởng đến kiểu hình (Thành 2015) Chỉ thị di truyền chia thành hai loại: thị truyền thống thị DNA Chỉ thị truyền thống gồm thị hình thái (đây tính trạng đặc điểm hình thái màu hoa, kiểu hình hạt, đặc điểm sinh trưởng, biến đổi sắc tố v.v.), thị tế bào (đặc trưng cấu trúc nhiễm sắc thể) thị sinh hóa (các isozyme, protein chất trao đổi chất) Chỉ thị DNA thay đổi phân tử DNA chia thành nhiều loại dựa khác phương pháp kỹ thuật xác định đa hình Các thị DNA sử dụng rộng rãi số lượng thị không hạn chế Chỉ thị DNA hình thành từ loại đột biến DNA khác thay (đột biến điểm), xếp lại (thêm vào bớt nucleotide) sai sót chép đoạn DNA lặp lại liền kề Các thị DNA thường nằm vùng không phiên mã Khác với thị hình thái sinh hóa, thị DNA khơng giới hạn số lượng, không ảnh hưởng yếu tố môi trường giai đoạn phát triển Chỉ thị DNA sử dụng nhiều nghiên cứu quan hệ di truyền, phát sinh chủng loại phân loại phân tử; lập đồ liên kết di truyền, nhận biết gen chọn giống bao gồm đánh giá đa dạng di truyền, nhận biết giống, chọn lọc tính trạng kháng bệnh, chống chịu điều kiện bất lợi môi trường, suất phẩm chất giống (Thành 2014) Theo thống kê từ khảo sát cơng trình ứng dụng kỹ thuật phân tử vào nghiên cứu sinh học quần thể, từ năm 1979 đến có hàng ngàn nghiêncứu di truyền quần thể nhiều đối tượng khác nhau, có 300 nghiên cứu sử dụng marker phân tử RFLP, RAPD, DAF,SSR, ISSR, AFLP… làm công cụ nghiên cứu Sự gia tăng sử dụng kỹ thuật vào đầu thập niên 90 chứng minh vai trò to lớn chúng việc cung cấp thơng tin hữu ích cấu trúc di truyền quần thể Bảng 1.1 Các kỹ thuật thị DNA Kí hiệu Tên Tiếng Anh Kỹ thuật khơng sử dụng PCR Restriction Fragment Length RFLP Polymorphism Restriction Endonuclease REF Fingerprinting Kỹ thuật sử dụng PCR Amplified Fragment Length AFLP Polymorphism Randomly Amplified Polymorphic RAPD DNA AP-PCR Arbitrarily primed PCR Amplification Refractory Mutation ARMS System Arbitrary Signatures from ASAP Amplification SPAR Single Primer Amplification Reaction SPLAT Single Polymorphic Amplification Test Sequence-Specific Amplification S-SAP Polymorphisms Amplified Sequence Length ASLP Polymorphism Cleaved Amplification Polymorphic CAPS Sequence CAS Coupled Amplification and Sequencing DAF DNA Amplification Fingerprint Selective Amplification of SAMPL Polymorphic Loci Kỹ thuật thị dựa tiểu vệ tinh ISSR Inter-Simple Sequence Repeats ISTR Inverse Sequence-Tagged Repeats MP-PCR Microsatellite-Primed PCR Randomly Amplified Hybridizing RAHM Microsatellites RAMPs Randomly Amplified Microsatellite Polymorphisms VNTR Variable Number Tandem Repeats Các kỹ thuật thị PCR chuỗi đặc trưng STS Sequence-Tagged-Site Sequence Characterised Amplification SCAR Regions SSLP Single Sequence Length Polymorphism Tên Tiếng Việt Đa hình độ dài đoạn cắt hạn chế Lấy dấu cắt hạn chế Đa hình độ dài nhân chọn lọc DNA đa hình nhân ngẫu nhiên PCR với mồi ngẫu nhiên Hệ thống đột biến chịu nhiệt nhân Các dấu hiệu ngẫu nhiên từ nhân Phản ứng nhân với mồi đơn Phép thử nhân đa hình đơn Đa hình nhân chuỗi đặc trưng Đa hình độ dài chuỗi nhân Chuỗi đa hình nhân cắt hạn chế Giải trình tự nhân kết hợp Dấu nhân DNA Nhân chọn lọc locus đa hình Chuỗi lặp lại đơn giản Chuỗi lặp lại ngược đánh dấu PCR với mồi tiểu vệ tinh Tiểu vệ tinh lai nhân ngẫu nhiên Đa hình tiểu vệ tinh nhân ngẫu nhiên Số lượng thay đổi chuỗi lặp lại liền kề Vị trí chuỗi đánh dấu Vùng nhân chuỗi mô tả Đa hình độ dài chuỗi đơn giản SSR Simple Sequence Repeats STMS Sequence-Tagged Microsatellite Site Các kỹ thuật thị gen nhảy REMAP Retrotrasposon-Microsatellite Amplified Polymorphism Retrotrasposon-Based Insertion RBIP Polymorphism Inter- Retrotrasposon Amplified IRAP Polymorphism TD Transposable Display Các kỹ thuật thị nhân khác ITS Internal Transcribed Spacer SNP Single Nucleotide Polymorphism OLA Oligonucleotide Ligation Assay Single Stranded Conformation SSCP Polymorphism ASO Allele Specific Oligonucleotide ASH Allele-Specific Hybridization Các kỹ thuật thị lục lạp cpSSR Chloroplast Simple Sequence Repeats RFLPA Restriction Fragment Length cpDNA Polymorphism Analysis cpDNA trnAs Chloroplast Transfer RNAs Công nghệ hỗ trợ đại DarT Diversity array Technology NGS Next-geneation sequencing Các chuỗi lặp lại đơn giản Vị trí chuỗi tiểu vệ tinh đánh dấu Đa hình tiểu vệ tinh gen nhảy ngược nhân Đa hình gắn dựa gen nhảy ngược Đa hình gen nhảy ngược nhân Biểu lộ gen nhảy Vùng đệm mã Đa hình nucleotide đơn Phân tích gắn Oligonucleotide Đa hình cấu tạo sợi đơn Oligonucleotide đặc trưng allen Lai allen đặc trưng Chuỗi lặp lại đơn giản lục lạp Phân tích đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn Các RNA vận chuyển lục lạp Công nghệ xếp đa dạng Giải trình tự hệ thứ hai (Nguồn: Thành (2014)) Trong số marker phân tử, marker RFLP sử dụng việc lập đồ gen người, sau cải biến để ứng dụng cho việc lập đồ(mapping) trồng RFLP thể đa hình đáng tin cậy nhất, dùng cho phân tích xác kiểu gen Marker RFLP có khả sử dụng phong phú, marker có đặc tính đồng trội cho phép phân biệt cá thể đồng hợp dị hợp, quy trình thực phức tạp, nguy hiểm đến sức khỏe người thực hiện, đắt tiền, yêu cầu DNA có số lượng chất lượng cao Do đó, người ta có xu hướng sử dụng marker đơn giản sở phản ứng PCR Kỹ thuật RAPD đời sau kỹ thuật RFLP, khả tạo đa hình tương đương với kỹ thuật RFLP quy trình thực đơn giản hơn, chi phí thấp hơn,thu kết nhanh hơn, giúp nhà khoa học thu đa hình DNA nhiều locus Vì mồi sử dụng kỹ thuật RAPD ngắn nên dễ dàng tìm trình tự tương đồng DNA gen Do đó, tính đa hình thu từ RAPD cao có thay đổi base nitơ sẽ ngăn cản bắt cặp mồi DNA mạch khn Do tính hiệu nên RAPD nhanhchóng có vị trí xứng đáng nghiên cứu đa dạng di truyền số giống trồng hai mầm lúa, chuối, dứa, cà chua, cacao…Khái niệm chọn tạo giống phân tử (molecular breeding) hình thành sở chức chẩn đốn kỹ thuật sinh học phân tử, có kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD sử dụng rộng rãi để phân tích tính đa hình DNA.RAPD fingerprinting sử dụng vấn đề liên quan đến sinh sản huyết thống.Gần đây, việc sử dụng kỹ thuật minisatellite microsatellite tăng lên Tuy nhiên, chi phí xây dựng thư viện DNA nhân tố giới hạn nhiều phịng thí nghiệm muốn sử dụng hai kỹ thuật Các kỹ thuật DNA sử dụngcác marker phân tử SSCP, DAF, áp dụng vào nghiên cứu quần thể cung cấp lựa chọn 1.2.2 Chỉ thị phân tử DNA barcode Từ năm 1990, với phát triển mạnh mẽ sinh học phân tử, phương pháp nghiên cứu lĩnh vực phân loại học hình thành gọi phương pháp phân loại học phân tử Phương pháp dựa liệu thông tin hệ gen (ADN) nhân sản phẩm chúng (protein) Tùy mục đích đối tượng nghiên cứu, người ta lựa chọn gen (đoạn ADN) khác sản phẩm khác hệ gen (Schindel and Miller (2005); Park (2007); Kress and Erickson (2012); Paula (2013); Schindel and Miller (2005)) Năm 2003, Paul Hebert nhà nghiên cứu Đại học Guelph Ontario, Canada, đề nghị "DNA barcode" cách để xác định loài DNA barcode sử dụng chuỗi gen ngắn từ phần gen mang ý nghĩa nhận dạng mã vạch sản phẩm hàng hóa với sọc màu đen sử dụng rộng rãi siêu thị Về nguyên tắc, hai mặt hàng trơng giống nguồn gốc xuất xứ hay có thành phần khác mang mã vạch khác biệt Phương pháp DNA barcode nhằm đại hóa việc phân loại theo truyền thống dùng tính đa dạng phân tử DNA phương tiện để nhận biết xác định sinh vật 10 Theo Pires Marinoni (2010) chuỗi DNA cho lồi, chúng xem di truyền "mã vạch" có tiềm để giải vấn đề cố hữu loại phân loại thực hành Với biến thể bốn nucleotide (A, T, C, G) điểm, có đến 4n (trong "n" tương ứng với số lượng nucleotide khảo sát) mã cho đoạn trình tự DNA định Ví dụ, với việc khảo sát 15 vị trí nucleotide khác cho đoạn DNA xác định tỷ (415) loài Việc nhận dạng bước đầu (đánh giá sơ ban đầu) thực cách nhanh chóng với chi phí thấp mà khơng cần chuyên gia phân loại nhóm nghiên cứu (mặc dù việc xác định sau cần đánh giá chuyên gia) Ngoài ra, lợi phương pháp khả nhận dạng cá thể giai đoạn phát triển khả phân biệt lồi có hình thái giống hệt DNA barcode phương pháp phổ biến để xác định lồi sử dụng mẫu có vùng DNA đáng tin cậy mẫu có DNA suy thoái cao ,đang ứng dụng rộng rãi giới nhằm phục vụ công tác phân loại, đánh giá đa dạng sinh học bảo tồn nguồn gen Kỹ thuật dựa chất di truyền tiến hóa sinh vật (trình tự DNA gen sinh vật) giúp xác định nhanh sinh vật hệ thống phân loại đồng thời xác định mối quan hệ nguồn gốc sinh vật khảo sát phục vụ công tác bảo tồn lai tạo giống DNA barcode sử dụng để giải câu hỏi sinh thái tiến hóa từ động vật nấm nguyên sinh vật, tảo thực vật Các kết nghiên cứu gần đây, cho thấy marker DNA barcode thực vật lựa chọn vùng rbcL matK cộng với hai khu vực bổ sung trnH - psbA vùng ITS cho thấy mức độ phù hợp cho phân biệt loài thực vật (Jalil, Annuar et al 2015, Kress, García-Robledo et al 2015, Paula 2013) Một số vùng kiểm tra cho việc sử dụng vùng mã vạch: vùng lạp thể không mã hóa trnH-psbA, trnL intron, trnL-F, atpF-atpH, psbK-psbI, vùng rps4; vùng lạp thể mã hóa accD, ndhJ, rpoB, rpoC1 ycf5, ribulose-bisphosphate carboxylase (rbcL), maturase K (matK), ndhF, 23S rDNA atpB, vùng nhân không mã hóa Internal Transcribed Spacer (ITS bao gồm ITS1 ITS2) 11 1.2.3 Chỉ thị phân tử SSR SSR khám phá sử dụng làm marker phân tử vào năm 1984 Từ đó, SSR phát triển sử dụng làm marker việc đánh giá loài trồng hoang dại hóa chọn lọc SSR thị phân tử dựa trình tự lặp lại diện phổ biến gen loài thực vật Thông thường SSR phát sinh đột biến enzyme DNA polymerase hoạt động bị lỗi trình nhân DNA, đơn vị lặp lại bổ sung thêm loại bỏ bớt trình tự SSR, trình tái tổ hợp trình giảm phân có vai trị tăng giảm tỷ lệ trình tự SSR Các chế làm tăng tỷ lệ đột biến trình tự SSR khoảng 10-2 – 10-3 locus trêm nhiễm sắc hệ (Tautz, 1989), tăng tỷ lệ đột biến khoảng 106 lần so với trình tự DNA thông thường không lặp lại (Wolfe cộng sự, 1987) SSR diện vùng gen mã hóa khơng mã hóa gen (Batley 2015) Như vậy, tính đa hình cao SSR sử dụng để phát alen biến đổi mức độ quần thể khả liên kết tính trạng mục tiêu để phát triển marker phân tử nghiên cứu chọn tạo giống Các alen marker SSR có độ tin cậy cao, quy trình thực tương đối đơn giản chuẩn hóa dễ thực (Mason 2015) Trên sở đó, SSR sử dụng nghiên cứu tiến hóa quần thể gen nghiên cứu vai trò tiến hóa gen, đáp ứng stress gen, chọn lọc marker liên kết tính trạng xây dựng đồ di truyền Hiện nay, SSR ứng dụng nghiên cứu nhiều loại trồng khác lúa mì, lúa đậu nành gần - dưa chuột, hoa hướng dương, đậu phộng (Collard Mackill, 2008) Ngoài ra, việc ứng dụng SSR việc đánh giá chọn lọc giống hoa thực 1.3 Ứng dụng thị phân tử nghiên cứu lan nói chung Lan Dendrobium nói riêng Họ Lan họ lớn bao gồm nhiều lồi, lên đến 25.000 lồi (Chase 2005) Do đó, để đánh giá nghiên cứu toàn diện loài họ lan, nhà nghiên cứu phát triển mã vạch DNA (DNA barcode) quy mô quốc gia, khu vực bước đầu hướng tới việc xây dựng hệ thống mã vạch toàn cầu cho loài lan Mã vạch DNA họ lan quy mô quốc gia khu vực hữu 12 ích, chúng cung cấp cơng cụ hiệu để xác định loài địa phương nhằm bảo tồn, kiểm sốt thương mại địa phương góp phần hỗ trợ cho ngành công nghiệp hoa lan Ở Hàn Quốc, 94 loài (103 loài) 42 chi đại diện cho tất lồi họ lan, nhiều lồi số có giá trị cao dùng làm cảnh hay dược liệu (Lee NS (2007); Lee (2011)) Hiện nay, hệ thống mã vạch cho lan nghiên cứu chuyên sâu nhằm phát triển ứng dụng phục vụ ngành công nghiệp hoa lan Hàn Quốc (Kim, Oh et al 2014) Nhiều đoạn trình tự DNA dùng cho mã vạch nghiên cứu như: rbcL, matK, atpF-atpH, psbK-psbI trnHpsbA nhằm kiểm tra tính phổ quát đoạn DNA barcode họ lan đánh giá tiềm chúng việc phân biệt loài Phong lan Trên giới nhiều nước nghiên cứu, ứng dụng DNA barcode việc đánh giá mối quan hệ di truyền, xác định loài lan Úc, Thái Lan, Trung Quốc, Indonesia, Malaisia Ở Hàn Quốc, 94 loài (103 loài) 42 chi đại diện cho tất lồi họ lan, nhiều lồi số có giá trị cao dùng làm cảnh hay dược liệu (Lee NS (2007); Lee (2011)) Hiện nay, hệ thống mã vạch cho lan nghiên cứu chuyên sâu nhằm phát triển ứng dụng phục vụ ngành công nghiệp hoa lan Hàn Quốc (Kim, Oh et al 2014) Các mối quan hệ phát sinh lồi lồi họ lan phân tích dựa marker phân tử DNA barcode khác rbcL (Cameron, Chase et al 1999), psaB (Cameron 2004), atpB (Cameron 2006) matK (Freudenstein and Chase 2015) Tuy nhiên, phát triển DNA mã vạch cho họ lan riêng lẻ theo định hướng khác Ở Việt Nam nghiên cứu ứng dụng DNA barcode việc đánh giá mối quan hệ di truyền, xác định loài lan để phục vụ công tác sưu tập, bảo tồn lai tạo giống Đối với lan Dendrobium, có nghiên cứu mối quan hệ 12 loài lan Dendrobium dựa phân tích trình tự vùng ITS DNA ribosom (Tsai C.C et al, 2003) Vào năm 2009, Hui Yao cộng xác định loài lan Dendrobium dựa locus trnH - psbA gen lục lạp Singh H.K cộng (2012), đánh giá mối quan hệ họ hàng 36 loài Dendrobium dựa locus matK, rbcL, rpoB, rpoC1, trnH - psbA gen lục lạp vùng ITS nhân 13 Năm 2010, Asahina cộng sử dụng trình tự gene matK rbcL để phân định loài Dendrobium, đồng thời nghiên cứu phát sinh chủng lồi nhóm Dendrobium dùng y học: Dendrobium fimbriatum, D moniliforme, D nobile, D pulchellum, D tosaense Theo LI Guo-liang cộng (2013) mô tả loài Dendrobium officinale, D.moniliforme, D.huoshanense D.tosaense bốn loài độc lập Tuy nhiên, Flora China (xuất 2009), D.officinale, D.huoshanense D.Tosaense tương đồng với D.catenatum Nhóm tác giả sử dụng vùng trình tự ITS, Nad intron2 psbAtrnH để phân tích bốn lồi Dendrobium trên, kết cho thấy có biến đổi nhỏ trình tự D.officinale D.tosaense vùng ITS, Nad intron2 psbA-trnH Có khác biệt D.huoshanense D.officinale D.tosaense vùng ITS, Nad intron2 psbA-trnH, có khác biệt D.huoshanense and D.moniliforme Khoảng cách di truyền D.moniliforme D.huoshanense nhỏ khoảng cahs di truyền D.huoshanense D.tosaense Kết cho thấy D.huoshanens tương đồng với D.moniliforme Songzhi Xu cộng (2015), đánh giá 11 mã vạch dựa giống Dendrobium thu từ lục địa Châu Á Kết cho thấy mã vạch ITS, ITS2, matK, rbcL trnH-psbA dễ dàng khuếch đại trình tự với primer có Bốn mã vạch ITS, ITS2, ITS+matK, ITS2+matK có vùng mã vạch gaps ITS+matK mã vạch tối ưu phát triển phương pháp Hơn nữa, hiệu ITS+matK đánh giá bốn chi lớn bao gồm Ficus, Lysimachia, Paphiopedilum, Pedicularis Nhóm tác giả khuyến cáo sử dụng kết hợp ITS+matK sử dụng làm mã vạch DNA cho nhóm thực vật có hoa Năm 2019, Liu cộng sử dụng vùng gen ITS để phân tích, định danh lồi lan Dendrobium Nhóm nghiên cứu phân tích 13 mẫu lan Dendrobium dựa thị phân tử DNA barcode với vùng gen ITS Cây phát sinh loài xây dựng dựa trình tự DNA vùng gen ITS cho 13 mẫu giống lan cho thấy chia làm nhóm Nghiên cứu cho thấy vùng gen ITS có hiệu việc định danh số giống lan Dendrobium 14 Năm 2019, Duan cộng sàng lọc xác định trình tự vùng gen dựa thị phân tử DNA barcode để định danh Rehmannia Nhóm tác giả sàng lọc vùng gen rbcL, matK, psbA-trnH, ITS2, ITS loài Rehmannia với tỷ lệ khuếch đại giải trình tự thành cơng Kết cho thấy vùng gen ITS2 có tiềm việc xác định loài Năm 2020, Srivastava cộng ứng dụng thị phân tử việc xác định lồi lan đặc hữu có nguy tuyệt chủng Ấn Độ Nhóm tác giả đánh giá xác định 62 mẫu 35 loài thuộc 07 chi dựa thị phân tử DNA barcode Vùng gen rbcL, matK, trnH-psbK, ITS sử dụng để phân tích giải trình tự Kết cho thấy vùng gen ITS có hiệu việc xác định lồi đánh giá mối quan hệ di truyền Mức độ xác định đạt 94,64% vùng gen rbcL (78,69%), matK (51,61%) Năm 2021, Li cộng sử dụng vùng gen lục lạp để xác định số loài lan dựa thị phân tử DNA barcode Nhóm tác giả sử dụng vùng gen lục lạp rbcL, matK, ndhF ycf1 riêng lẻ kết hợp để xác định loài Kết cho thấy vùng gen ndhF ycf1 xác định mức độ lồi, kết hợp trình tự vùng gen cho thấy khả xác định mức độ chi loài, nghiên cứu ndhF, cf1, matK+ycf1 ndhF+ycf1 có tiềm việc xác định loài lan Năm 2006, Yue cộng phát triển marker SSR sử dụng để xác định Dendrobium biến đổi Nhóm tác giả sử dụng 14 marker SSR để xác định cho quần thể gồm 42 Dendrobium lai Kết cho thấy 42 giống kiểm tra xác định marker sử dụng để kiểm tra cho thấy gốing lai nằm nhánh bố mẹ nằm nhánh Năm 2008, Boonsrangsom cộng phát triển marker SSR loài lan Dendrobium Và sử dụng phần mềm NTSYS-pc 2.1 để phân tích mối quan hệ di truyền 49 giống lan Dendrobium lai Kết cho thấy tất mẫu Dendrobium xác định khơng rõ ràng phân nhóm Tuy nhiên nhiều SSR Dendrobium chứa thông tin để phát triển marker sử dụng để phân tích đánh giá đa dạng di truyền phân biệt giống 15 Năm 2012, Chattopadhyay cộng ứng dụng marker phân tử để đánh giá đặc điểm di truyền để chọn lọc loài Dendrobium dược liệu marker SSR, RAPD Kết cho thấy marker phân tử SSR hiệu marker RAPD việc đánh giá mối quan hệ di truyền loài chuyên biệt mức độ đa hình lồi Dendrobium Nhóm tác giả cho thấy việc sử dụng marker SSR để đánh giá mối quan hệ di truyền loài lan Ấn Độ Năm 2014, Liu cộng sử dụng 53 cặp primer SSR để đánh giá mối quan hệ di truyền xác định loài Dendrobium Kết cho thấy 07 cặp primer cho kết đa hình với band chuyên biệt, chứng tỏ 07 cặp primer SSR có tiềm việc sử dụng để xác định loài Dendrobium hệ Năm 2019, Zhao cộng sử dụng thị phân tử SSR để phân nhóm di truyền lồi Dendrobium khác lồi Nhóm tác giả sử dụng 100 locus khác để đánh giá số giống lan Dendrobium Kết cho thấy có 73 locus đa hình phân tích 37 lồi lan Dendrobium với số PIC 9,68 Từ kết tren cho thấy thị phân tử SSR có giá trị việc nghiên cứu di truyền lai tạo giống lan Dendrobium Năm 2020, Basavaraj cộng sử dụng thị phân tử SSR để phân tích đánh giá lồi lan Dendrobium khu vực phía Tây Ấn Độ Nhóm tác giả sử dụng 11 locus để đánh giá mối quan hệ di truyền số loài lan Dendrobium kết cho thấy có locus có tính đa hình cao với 12 band cho lồi, band đồng hình band đa hình Hệ số tương đồng từ 0,37 – 0,60 Kết cho thấy thị phân tử SSR sử dụng tốt cho loài đặc hữu tương lai Bảng 1.2 Thống kê số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng để đánh giá mối quan hệ di truyền lan Dendrobium TT Marker phân tử RAPD RAPD RAPD RAPD RAPD RFLP RFLP Đối tượng 15 loài Dendrobium Dendrobium oficinale D nobile, D monliforme Dendrobium nobie loài Dendrobium D chrysanthum, D fimbriatum 25 loài Dendrobium 16 Tham khảo Peng et al., 2004 Ding et al., 2005 Feng et al., 2013 Bhattacharry et al., 2014 Zhang et al., 2014 Zhang et al., 2005 Peyachoknagul et al., 2014 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 AFLP AFLP AFLP ISSR ISSR ISSR ISSR SSR SSR SSR SSR SSR SSR SSR SSR DNA barcode DNA barcode DNA barcode DNA barcode DNA barcode DNA barcode DNA barcode DNA barcode DNA barcode loài Dendrobium 38 loài Dendrobium 13 loài Dendrobium loài Dendrobium Dendrobium oficinale D Chrysanthum 15 loài Dendrobium Dendrobium oficinale loài Dendrobium Dendrobium loddigessi 31 loài Dendrobium D nobile, D monliforme giống Dendrobium lai 31 loài Dendrobium Trung Quốc Dendrobium nobie 10 loài Dendrobium 05 loài Dendrobium dược liệu 32 loài Dendrobium 11 loài Dendrobium 13 loài Dendrobium loài Dendrobium giống lai 112 loài Dendrobium 07 loài Dendrobium 12 loài Dendrobium Yu et al., 2004 Bai et al., 2007 Wang et al., 2007 Shen et al., 2005 Shen et al., 2006a Bao et al., 2008 Lu et al., 2013 Xie et al., 2010 Xu et al., 2011 Cai et al., 2012 Lu et al., 2012 Feng et al., 2013 Juejun et al., 2013 Lu et al., 2013 Liu et al., 2014 Yuan et al., 2009 Asahina et al., 2010 Huang et al., 2009 Ding et al., 2011 Takamiya et al., 2011 Yao et al., 2012 Xiang et al., 2013 Zhang et al., 2013 Liu et al., 2014 Từ nghiên cứu lan rừng lan Dendrobium thị phân tử DNA barcode SSR cho thấy cần thiết phải xây dựng sở liệu cghir thị phân tử cho giống lan rừng Việt nam đặc biệt giống lan thuộc chi Dendrobium 1.4 Một số nghiên cứu ứng dụng thị phân tử DNA trồng nước Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh thực hoàn thành đề tài “Sưu tập, nhập nội, chọn tạo nhân nhanh giống hoa lan phục vụ nội tiêu xuất khẩu” (Dương Hoa Xô cộng sự, 2011) Nhóm nghiên cứu sưu tập 371 dịng lan loại, có 102 giống lan rừng Việt nam Đồng thời, dựa kết ban đầu đề tài sở “Xây dựng sở liệu trình tự DNA cho số lồi Lan rừng Việt Nam dựa marker phân tử DNA barcode” để xác định giống lan rừng thương mại phục vụ việc bảo tồn nhân giống in vitro 17 thực từ năm 2015 – 2017 (Huỳnh Hữu Đức cộng sự, 2017) Kết cho thấy 10/12 vùng DNA barcode cho sản phẩm khuếch đại với 13 cặp primer đặc hiệu cho marker với tỷ lệ khuếch đại cho vùng rbcL 97,56%, matK 95,12%, atpF-atpH 97,56%, psbK-psbI 97,56%, trnH-psbA 95,12%, ITS1 85,37%, rpoB 82,93%, rpoC 82,93% Trên sở trình tự DNA vùng rbcL, matK, ITS 41 mẫu giống lan nghiên cứu xác thực phân tích di truyền Như vậy, từ lựa chọn vùng DNA barcode để xây dựng sở liệu cho loài lan rừng Việt Nam để phân loại, đánh giá xác định loài Ngoài ra, Trung tâm sưu tập, bảo tồn nhiều chủng loại lan rừng khác lan thương mại để phục vụ công tác bảo tồn lai tạo giống, nhân giống in vitro Việc ứng dụng kỹ thuật DNA barcode việc định danh phân biệt lồi có mối quan hệ họ hang gần dễ nhầm lẫm mặt hình thái bước đàu thực Trung tâm cơng nghệ sinh học Tp Hồ CHí Minh Đánh giá hai loài Dendrobium officinale Dendrobium nobile phân biệt định danh xác dựa vùng DNA barcode rbcL, matK ITS Kết phân tích cho thấy mẫu DNA ly trích từ mẫu lan cho tỷ lệ PCR thành công cặp mồi tương ứng cho DNA barcode 100% Dựa trình tự DNA 03 vùng rbcL, matK ITS 07 mẫu lan nghiên cứu phân biệt hai lồi Dendrobium officinale Dendrobium nobile Bên cạnh kết so sánh khác 03 vùng trình tự 07 mẫu lan có mức độ khác từ thấp tới cao rbcL