trờng đại học nông nghiệp I viện sinh học nông nghiệp Báo cáo tổng kết dự án cấp nhà nớc hoàn thiện công nghệ xây dựng hệ thống sản xuất củ giống chất lợng cao khoai tây hà lan thông qua nuôi cấy mô thuộc chơng trình kc 04 mà số kc 04-da.03 Chủ nhiệm đề tài: gs.ts nguyễn quang thạch 6919 07/7/2008 hà nội - 2007 danh sách ngời chủ trì thực Bảng 1: Số Họ tên, TT Học hàm học vị Chức vụ, đơn vị Trách nhiệm Ghi dự án Nguyễn Quang Thạch Viện trởng, Trởng phòng Chủ nhiệm GS.TS Viện SHNN - ĐHNNI Nguyễn Thị Lý Anh Phó viện trởng, phó phòng TS Viện SHNN - ĐHNNI Nguyễn Văn Uyển Chủ tịch hội đồng KH Chủ trì dự án PGS.TS Viện SHNĐ - TP HCM nhánh Nguyễn Xuân Trờng Nghiên cứu viên Lập kế hoạch Thạc sĩ Viện SHNN - ĐHNNI sản xuất Th ký dự án triển khai địa phơng Vũ Ngọc Lan Nghiên cứu viên Kế toán dự án Thạc sĩ Viện SHNN - ĐHNNI Nguyễn Thị Hơng Nghiên cứu viên Thực Kỹ s Viện SHNN - ĐHNNI chuyên đề sản xuất in vitro Nguyễn Thị Sơn Nghiªn cøu viªn Thùc hiƯn Kü s− ViƯn SHNN - ĐHNNI chuyên đề sản xuất in vitro Trần Thị Thanh Minh Nghiên cứu viên Thực Kỹ s Viện SHNN - ĐHNNI chuyên đề sản xuất in vitro Phạm Văn Tuân Nghiên cứu viên Thực Kỹ s Viện SHNN - ĐHNNI chuyên đề sản xuất củ mini 10 Lại Đức Lu Nghiªn cøu viªn Thùc hiƯn Kü s− ViƯn SHNN - ĐHNNI chuyên đề sản xuất củ mini 11 Mai Trờng Nghiên cứu viên Thực Kỹ s Viện SHNĐ - TP HCM chuyên đề chẩn đoán bệnh virus ELISA 12 Phan T−êng Léc Nghiªn cøu viªn Thùc hiƯn Kỹ s Viện SHNĐ - TP HCM chuyên đề chẩn đoán bệnh virus PCR 13 Võ Thị Hạnh Nghiên cứu viên Thực Kỹ s Viện SHNĐ - TP HCM chuyên đề chẩn đoán bệnh vi khuẩn PCR danh sách quan phối hợp Trung tâm ứng dụng tiến khoa học công nghệ môi trờng Hải Phòng, Số 10A Đồng Tâm Lạch Tray Thành phồ Hải Phòng Trung tâm Giống Cây trồng Nam Định Sở Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Nam Định Trung tâm Giống Lâm nghiệp Quảng Ninh Trại Giống Tân Dĩnh Công ty Cổ phần Giống Cây trồng Bắc Giang Trung tâm Khuyến nông tỉnh Thái Bình Phòng Kinh tế huyện Từ Sơn tỉnh Bắc Ninh Công ty trách nhiệm hữu hạn Hùng Hà, số 27 Nhà D3 Tập thể Phơng Mai Đống Đa Hà Nội Công ty Giống Rau Hoa Quả Sapa Lào Cai Bài tóm tắt Dự án KC.04-DA.03 đợc thực nhằm mục tiêu: Xây dựng công nghệ cho sở nhân giống liên hoàn đồng (phòng thí nghiệm, vờn ơm đầu dòng, khu sản xuất giống, kho bảo quản, mô hình trình diễn) nhằm sản xuất củ giống chất lợng cao qui mô công nghiệp, với nội dung sau đây: */ Xây dựng hệ thống sản xuất giống khoai tây Hà Lan bệnh, chất lợng tốt đáp ứng nhu cầu xuất chế biến công nghiệp, giá phù hợp với quy mô 150 - 250 giống chất lợng cao/năm */ Hệ thống sản xuất giống khoai tây đợc xây dựng dựa sở bổ sung hoàn thiện quy trình công nghệ liên hoàn, đồng bộ, tiên tiến từ phòng thí nghiệm đến đồng ruộng mô hình trình diễn sản phẩm Trong trình thực hiện, dự án đà bám giát mục tiêu nội dung đề đà xây dựng đợc hệ thống bền vững sản xuất củ giống liên hoàn từ phòng thí nghiệm nhà cách ly vùng cách ly ngời nông dân Hệ thống sản xuất đợc hình thành sau đà dự án đà nghiên cứu xây dựng hoàn chỉnh quy trình (19 quy trình nhỏ) từ xác định độ bệnh (virus, nấm, khuẩn) nhanh chóng xác nguồn mẫu ban đầu; tạo củ in vitro có chất lợng nh tăng hệ số nhân, sinh trởng khỏe, số củ tạo đồng với kích thớc lớn (0,5cm); đến việc tìm thời vụ, giá thể thích hợp để đa in vitro nhà màn, tỷ lệ sống đạt >95%; đồng thời tìm đợc phơng pháp khai thác bồn mạ, phơng pháp canh tác nhà tối u nh tạo củ chủ động thu đợc số củ/cây so với trớc 200% Việc hoàn thiện phơng bảo quản củ giống thể hệ khác (củ siêu bi, củ mini, củ nguyên chủng) đà làm giảm tỷ lệ hao hụt trọng lợng xuống dới 5%, tạo củ giống trẻ sinh lý Việc lựa chọn vùng cách ly thích hợp biện pháp lọc đồng ruộng đà đợc nghiên cứu đầy đủ hoàn thiện nhằm Thử nghiệm quy trình vào sản xuất, dự án đà tạo đợc triệu củ giống siêu nguyên chủng (củ mini) 200 giống nguyên chủng 600 giống xác nhận (tính đến hết năm 2005) Số sản phẩm hoàn toàn bệnh (theo tiêu chuẩn ngành ngày 29/12/2003), suất đời xác nhận đạt 18 tấn/ha tơng đợc với giống nhập nội nhng với giá thành hạ 30% Trong trình thực hiện, dự án đà đào tạo đợc đội ngũ cán bộ, công nhân, nông dân có hiểu biết trình độ chuyên môn cao lĩnh vực khoai tây, bao gồm: Sinh viên (15 ngời); Cao học viên (04 ngời); Công nhân trại giống (50 ngời); Nông dân (500 lợt ngời) Ngoài đăng 04 báo tạp chí chuyên ngành 01 sách ứng dụng công nghệ cao sản xuất khoai tây giống bệnh Trung tâm Khuyến Nông Quốc gia Trung tâm Thông tin Bộ NN&PTNT phát hành đợc Cục Nông nghiệp cho phép lu hành toàn quốc lời mở đầu Khoai tây trồng vụ đông lý tởng cho Đồng Bắc nhng cha đợc phát triển với tiềm cđa nã DiƯn tÝch trång khoai t©y ë ViƯt Nam khiêm tốn, dao động quanh 33000 (2003) Năng suất bình quân thấp 12,5 tấn/ha suất khoai tây nớc nh Pháp, Đức, Hà Lan xấp xỉ 40 Nguyên nhân tợng việc sử dụng củ giống đà thoái hoá chất lợng làm giảm suất, giảm hiệu sản xuất khoai tây Thực tiễn sản xuất khoai tây Việt Nam cho thấy sư dơng cđ gièng nhËp néi cã chÊt l−ỵng nh Mariella, Diamant suất đạt 25 30 tấn/ha Tuy nhiên, dựa vào nguån gièng nhËp néi chi phÝ rÊt cao (12000 đồng/kg) không chủ động Việc nghiên cứu xây dựng hệ thống sản xuất củ giống khoai tây chất lợng cao chỗ yêu cầu thiết Nghiên cứu để hình thành hệ thống sản xuất giống khoai tây phức tạp mặt công nghệ lẫn thiết bị, nên đà đợc nhiều quan tập trung nghiên cứu ròng rà hàng chục năm Cho đến nghiên cứu đà thu đợc kết có ý nghĩa, bớc đầu vận dụng thành công số địa phơng, khẳng định tổ chức hình thành hệ thống sản xuất củ giống có chất lợng cao chỗ chơng tổng quan tình hình nghiên cứu nớc nớc 1.1 Kết nghiên cứu nớc: Theo báo cáo Dự án khoai tây Việt - Đức Bộ NN&PTNT diện tích khoai tây nớc dao động dới 30.000ha giai đoạn 1996 - 2002 với suất bình quân 10,6 tấn/ha - 12,1 tấn/ha So với giới st khoai t©y cđa ViƯt Nam thÊp chØ b»ng 1/3 - 1/4 (năng suất giới đạt 40 tấn/ha) Theo Ngô Văn Hải, (1997) cho biết sản xuất khoai tây có lÃi suất đạt 10 tấn/ha, dới /ha bị lỗ Với suất đạt 10 tấn/ha so với mức đầu t− chi phÝ cao cđa trång trät khoai t©y nh− hiệu kinh tế sản xuất khoai tây thấp so với nhiều trồng vụ đông khác nh ngô, khoai lang, đỗ Vì ngời nông dân thu hẹp diện tích trồng khoai tây Theo Trơng Văn Hộ, Lê Thị Tuyết CTV, 1987 cho biết: nguyên nhân dẫn đến suất khoai tây thấp có nhiều nguyên nhân song yếu tố quan trọng ảnh hởng đến suất khoai tây Việt Nam chất lợng củ giống Nếu chất lợng củ giống tốt mật độ trồng 60.000 cây/ha mức độ thâm canh Việt Nam cho thu hoạch 20 tấn/ha có giá trị kinh tế cao Tuy nhiên, thực tế lại không đợc nh thế, Việt Nam cha có hệ thống sản xuất giống khoai tây nh nớc sản xuất khoai tây Cách sử dụng củ giống không nông dân nh tự sản xuất trì củ giống từ đời sang đời khác đà dẫn đến tình trạng thoái hoá giống làm suất thấp Theo báo cáo kết Dự án khoai tây Việt - Đức Bộ NN&PTNT (5/2002) cấu giống khoai tây cho thấy: tập đoàn trồng giống khoai tây đợc trồng Việt Nam đa dạng phong phú, bao gồm giống đợc lai tạo chọn lọc nh KT3, P3, HH2, HH7 giống Thờng Tín đà bị thoái hoá chiếm khoảng 15% Các giống nhập nội gồm loại: Giống nhập từ Châu âu gồm Diamant, Nicola, RedStar, Hà Lan, Mariella, Rasant, Solara giống sinh trởng phát triển tốt suất cao, chất lợng tốt, có đầu khả xuất nhng giá giống cao (nhập khẩu: 10.000đ/kg, giống đà qua nhân vụ giá 5000đ/kg), đợc nông dân a chuộng nhng khả triển khai rộng có khó khăn Mặt khác qua vụ trồng đà có tợng thoái hoá Các giống nhập từ Trung Quốc đa số không rõ tên nhng giá giống rẻ (từ 2000 - 30000đ/kg) nên chiếm tỷ lệ diện tÝch trång cao nhÊt (65 - 70%) Tuy nhiªn chÊt lợng củ giống không cao, suất chất lợng củ thu hoạch cha đạt mong muốn nên đầu gặp khó khăn Nh vấn đề xúc phải tự sản xuất đợc củ giống chất lợng tốt, có đầu (đáng ý giống khoai tây nguồn Châu âu) nhng giá thành phù hợp với điều kiện nông dân Trớc tình hình giống chất lợng từ năm 1980 Bộ NN&PTNT đà có chủ trơng xây dựng hệ thống sản xuất giống khoai tây bệnh, tiêu chuẩn khoai tây giống nh nớc giới Tuy nhiên nhiều năm thử nghiệm, nhiều nguyên nhân, cha hình thành đợc hệ thống sản xuất, bảo quản giống khoai tây bệnh, ổn định suất nh đà chủ trơng xây dựng Nh đà trình bày, nguyên nhân giảm diện tích trồng suất thấp, nguyên nhân suất thấp củ giống chất lợng Các nghiên cứu khoai tây tác giả nh: Vũ Triệu Mân (1986), Trơng Văn Hộ, Lê Thị Tuyết(1987), Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Minh Tấn (1989, 1992) khẳng định chất lợng củ giống khoai tây Việt Nam giảm sút giống đà bị thoái hoá Có nguyên nhân gây thoái hoá giống khoai tây Việt Nam: thoái hoá nhiễm bệnh virus, củ giống sản xuất nhiễm bệnh từ 76 - 100% sè khãm ®iỊu tra, khoai gièng míi nhập nội tỷ lệ nhiễm virus tự nhiên hàng năm chiếm 4,7 - 22% (Hà Minh Trung, Nguyễn Phơng Đại, Nguyễn Văn Viết ) (nguyên nhân chính) thoái hoá già hoá củ giống bảo quản củ giống điều kiện nóng ẩm Hệ thống sản xuất khoai tây giống có chất lợng phải khắc phục đợc hai vấn đề Đà có hàng loạt nghiên cứu xây dựng hệ thống sản xuất khoai tây giống bệnh Trớc hết phải kể đến Nguyễn Văn Uyển, Vander Zaag cộng đà hình thành hệ thống nhân giống khoai tây bắt nguồn từ nuôi cấy mô bao gồm khâu: nhân nhanh invitro, giâm nhân bồn mạ, tạo bầu đem trồng sản xuất khoai giống khoai thơng phẩm Biện pháp đà nâng cao suất khoai tây từ - 18 tấn/ha đợc áp dụng rộng rÃi Đà Lạt tạo tập quán trồng khoai tây cấy mô vùng Tuy nhiên biện pháp áp dụng thành công Đà Lạt, nơi có điều kiện thời tiết khí hậu quanh năm thích hợp cho việc nhân trồng khoai tây Tại khu vực đồng sông Hồng, việc nhân nhanh cây, tạo củ (microtuber) khoai tây bệnh in vitro đà đợc tiến hành hàng loạt phòng thí nghiệm (Viện công nghệ sinh học, Viện KHKTNN, Trờng ĐHNNI, Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh ) Tuy nhiên, với điều kiện thời tiết khí hậu đồng sông Hồng (nơi trồng khoai tây chính) việc in vitro, nhân bồn mạ nh Đà Lạt không thành công Do cần phải có nhiều nghiên cứu cải tiến Hệ thống sản xuất khoai tây giống gốc hoàn toàn bệnh đà đợc Trờng ĐHNNI xây dựng đề xuất vào năm đầu 1990 Hệ thống bao gồm khâu: nhân nhanh in vitro, tạo củ siêu bi in vitro, nhân nhanh lồng cách ly, trồng nhà màn, tạo củ giống gốc hoàn toàn virus, nhân tiếp tục củ giống gốc vùng cách ly với môi giới truyền bệnh (rệp), cung cấp giống thơng mại cho nơi sản xuất Mô hình đà đợc thử nghiệm thành công: tạo đợc củ giống khoai Ackersegen hoàn toàn bệnh cho suất tơng đơng khoai nhập nội (20,9/20,6 tấn/ha) Tân Hoà - Vũ Th Thái Bình quy mô thử nghiệm đạt 24,3 tấn/ha Tuy nhiên, mô hình năm qua cha đợc triển khai rộng không khâu phải cải tiến (đặc biệt khâu sản xuất lợng lớn cây, củ gốc), nh việc xây dựng thiết bị nh nhà cách ly, kho lạnh dễ dàng thực đợc điều kiện không cho phép Cho đến mô hình đà đợc Viện Sinh học NN Trờng ĐHNNI cải tiến, mặt khác điều kiện kinh tế xà hội đà cho phép đầu t xây dựng thiết bị cần thiết để thực mô hình Bên cạnh việc nghiên cứu xây dựng mô hình hệ thống sản xuất giống có nhiều nghiên cứu tập trung vào việc xây dựng giải pháp chọn lọc vệ sinh quần thể nhằm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh virus đồng ruộng (Vũ Triệu Mân, Đinh Văn Cự, Nguyễn Văn Viết), biện pháp đà làm giảm tợng thoái hoá giống tăng suất từ tấn/ha Giải pháp trồng khoai tây hạt hớng nhằm tháo gỡ khó khăn giống khoai tây Giải pháp đà đợc Viện CLT - CTP Việt Nam nghiên cứu từ năm 1978 đà thu đợc nhiều thành tựu đáng kể: Đà chủ động sản xuất hạt giống khoai tây số tổ hợp Việt Nam thay cho nhập nội (Phạm Xuân Tùng, Vũ Tuyên Hoàng, Phạm Xuân Liêm, Đào Mạnh Hùng, Trịnh Xử lý mầm đỉnh củ giống sau bảo quản lạnh Củ giống đạt tiêu chuẩn đem trồng 2.15 Quy trình chẩn đoán bệnh virus direct ELISA 2.15.1 Đặt vấn đề: Khoai tây trồng dễ bị nhiễm bệnh virus Thống kê cho thấy có tới 30 loài virus gây bệnh cho khoai tây ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) đợc dùng phổ biến giới để chuẩn đoán bệnh virus khoai tâycũng nh nhiều loại trồng khác Đà có nhiều phơng pháp chuẩn đoán khác dựa nguyên tắc phản ứng kết kháng nguyên kháng thể nhng mang tên gọi khác Mỗi phơng pháp thích hợp với mục đích điều kiện cụ thể tác giả đặt tiến hành hoàn thiện phơng pháp Trong thực tế sản xuất, virus không gây hại giống Khi khoai tây bị nhiễm lúc hai loai virus PVY PLRV (gây xoăn lá) mức độ giảm suất nghiêm trọng, 80% Ngợc lại, PVX đợc ghi nhận giảm dới 10% suất.Vì báo cáo này, nghiên cứu công nghệ chuẩn đoán virus gây hại điển hình cho khoai tây Việt Nam, PVY, sau gọi tắt virus Y Phản ứng kháng nguyên kháng thể phản ứng màu, kháng thể đợc gắn sẵn với chất tạo màu, thông qua cầu nối avidin, biotin lectin khác 50 Sơ đồ: ảnh hởng nhiễm loại virus khác đến suất khoai tây % giảm suất PVY + PRLV PVY PVX + PVS % nhiƠm bƯnh 2.15.2 Quy tr×nh chẩn đoán virus Y 2.15.2.1 Nguồn kháng thể đặc hiệu Khó khăn cho việc đa vào sử dụng phơng pháp ELISA nguồn kháng thể cho loại virus Kháng thể thờng đợc sản suất qua hệ thống miễn dịch thể động vật (thỏ), cách tiêm cho chúng loại kháng nguyên sạch, khiết Do việc tinh khối lợng lớn virus dùng làm kháng nguyên đòi hỏi thiết bị hóa chất đặc biệt, nớc trồng khoai tây tự sản xuất đợc nguồn kháng thể đặc hiệu chất lợng cao Trung tâm khoai tây quốc tế CIP đà đầu t xây dựng mạng lới có khả sản xuất đủ kháng thể đặc hiệu cho vùng trồng khoai tây giới, nhng kết hạn chế Đối với nớc phát triển, đờng nhanh cho bớc pháp triển ban đầu mua kháng thể đặc hiệu từ công ty chuyên ngành nớc phát triển Đó biện pháp sử dụng Viện, Trờng quan kiểm định giống Việt Nam 15.2.2 Thiết bị làm chuẩn đoán ELISA Hiện direct ALISA đà đợc chuẩn đoán thực chủ yếu thiết bị chuiyên dùng, có độ nhạy lớn phần lớn gắn với máy tính kết đáng tin cậy Phản 51 ứng kháng nguyên dịch chiết lấph loÃng kháng thể đợc cho sảy đồng thời phản ứng nhiều lỗ(thờng 90 lỗ) tơng ng với 90 mẫu khác Tùy loại virus, phản ứng đợc ®Ỉt cÊc ®iỊu kiƯn nhiƯt ®é tèi thÝch cho trình phản ứng thời gian thích hợp cho phản ứng màu sảy mức tối đa Việc đọc kết so màu không thực mắt thờng mà thiết bị quang học tự động gọi máy đọc kết ELISA (ELISA Reader) Các sai lệch chủ quan ngời đọc kết ELISA đợc hoàn toàn loại bỏ 2.15.2.3 Thao tác chuẩn đoán ELISA (direct) - Vật liệu: Lá non từ khoai tây cần chuẩn đoán virus - Hóa chất, thiết bị: + Kháng huyết đặc hiệu cho virus cần chuẩn đoán + Dung dịch đệm để hòa loÃng huyết dịch ép từ + Thiết bị ELISA Reader phản ứng 90 lỗ + Micropipet nhiều đầu hút, từ 20-50 àl + Tủ bảo ôn - Thao t¸c víi virus Y: + NghiỊn 50 mg với 500àl đệm ống Eppendorf 1,5 ml + Li tâm ống Eppendorf 10 phút với vi li tâm lạnh(microfuge) nhiều lỗ + Chuẩn bị sẵn dung dịch kháng thể (kháng huyết thanh) + Cho vào giếng 5àl dịch (supernatans) từ ống Eppendorf, 20àl đệm 5àl dich kháng thể + Đặt phản ứng 30 0C 30 phút + Đọc kết máy ELISA Reader 2.16 Quy trình chẩn đoán bệnh virus indirect ELISA 2.16.1 Cơ sở khoa häc vµ thùc tiƠn: ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay) ngµy đà trở nên phơng pháp chẩn đoán virus bệnh khác trồng có độ xác cao đợc dùng rộng rÃi Trên thực tế sử dụng, nhà khoa học thuộc nhiều nớc khác đà có cải tiến, hoàn thiện xây dựng thành công phơng pháp ELISA biến thể cho 52 phù hợp với đòi hỏi độ nhạy, yêu cầu chẩn đoán nhanh, hàng loạt, hạ giá thành chẩn đoán, tiện dụngMột biện pháp phổ biến ELISA indirect ELISA 2.16.2 Nguyên tắc: Theo Lommel vµ ctv(1982, Hammond and Chastagner, 1989), indirect ELISA đợc hiểu phơng pháp ELISA với thử đợc tráng phủ lớp kháng nguyên(dịch ép từ bị bệnh virus hòa loÃng nớc cất hay dung dịch đệm thích hợp) Sau giọt huyết chứa kháng thể đợc nhỏ lên thử Phản ứng kết tủa kháng nguyên- kháng thể xảy Thờng kháng thể đà đợc nối sẵn với chất tạo màu Sau rửa chất d phản ứng, quan sát mắt thờng có mặt hay vắng mặt kháng nguyên (virus) mẫu thử Ưu điểm lớn indirect ELISA cïng mét tÊm thư cã thĨ cã kÕt qu¶ chÈn đoán nhiều loại virus khác nhau, thay phải tiến hành chẩn đoán lần lợt loại virus Đặc biệt trờng hợp khoai tây, loại bị nhiễm lúc nhiều loại virus, phơng pháp indirect ELISA đợc coi trọng 2.16.3 Các bớc tiến hành qua trình công nghệ hoàn thiện Bớc 1: Chuẩn bị dung dịch kháng nguyên từ bị nhiễm bệnh virus + Lấy 1-2 khoai tây, chọn trung bình không non già + Cho từ mẫu vào túi nilon nhỏ, đánh số cất vào tủ lạnh 5-100C để lu giữ Khi chẩn đoán, dùng hai ngón tay miết bên túi cho nát bên trong, dịch chảy xuống đáy túi đợc lấy pipette Pasteur, khoảng 0,1 ml + Hòa loÃng trăm lần dung dịch đệm 0,1 M phosphat pH6,8, thu khoảng 10 ml dịch kháng nguyên, giữ lạnh 4-50C Dung dịch đợc dùng để xử lý thử + Tấm thử thờng dùng loại màng nitrocellulose, ngâm màng nitrocellulose dịch kháng nguyên nhiệt độ 0C, lắc nhẹ cho kháng nguyên hút bám bề mặt thử Các thử sau đợc lấy ra, kẹp giấy lọc cho thấm hết dịch d thừa tiếp tục treo cho khô nhiệt độ phòng Sau khô, thử đợc bảo quản lạnh đến sử dụng Bớc 2: Chuẩn bị dung dịch kháng thể 53 Dung dịch kháng thể đặc hiệu cho loại virus đợc hòa loÃng theo dẫn nhà sản xuất Mỗi nhà sản xuất có công nghệ riêng để gắn enzym vào kháng thể Phơng pháp gắn tơng đối phức tạp cần nhiều loại hóa chất đặc dụng Vì vậy, thông thờng loại kháng thể có gắn enzym chất phụ gia thờng có bán sẵn Tuy vậy, tự làm cần thiết Hai loại enzym thông dụng dùng để gắn vào kháng thể photphatase kiỊm vµ peroxidase, cã protein trung gian lµ protein A Photphatase kiềm có chất là: 4- methoxy-4-(3 phosphoryl)-phenyl-1,2 dioxetan, peroxidase sử dụng chất luminol Cả hai phản ứng tạo huỳnh quang tạo cặn có màu nâu màu xanh da trời Bớc 3:Tạo phản ứng kháng nguyên- kháng thể + Trên thử có đánh số chia sẵn ô, dùng micropipette nhỏ giọt kháng thể (50-100àl giọt) + Để phản ứng xảy ë 300C giê + Rưa s¹ch b»ng đệm Tris_NaCl + Thấm khô phơi khô Bớc 4: Đánh giá kết chẩn đoán Căn màu đặc trng xuất hiên vùng phản ứng đánh giá mức độ nhiễm bệnh virus, cờng độ màu phản ánh tình trạng bệnh Phơng pháp trình phơng pháp đà đơn giản hóa để thực điều kiện nớc ta Ưu điểm thu mẫu gắn dịch kháng nguyên làm nhiều ngày liên tiếp nhiều địa phơng sau thực lần phản ứng với kháng thể đọc kết phòng thí nghiệm 2.17 Quy trình chẩn đoán bệnh virus PCR 2.17.1 Cơ sơ lý luận thực tiễn PCR (Polymerase Chain Reaction) phản ứng dây chuyền sinh tổng hợp DNA víi sù xóc t¸c cđa enzym DNA polymerase theo mét khuôn mẫu DNA có sẵn, sử dụng deoxynucleotides làm nguyên liệu cho trình tổng hợp DÃy mà DNA virus khoai tây có chất DNA đà đợc nghiên cứu công bố đầy đủ Từ t− t−ëng nµy cã thĨ dƠ dµng thiÕt kÕ đoạn mồi thích hợp loại virus Việc chuẩn đoán bệnh virus xác đơn giản nhờ máy PCR thiết bị điện di, phổ biến 54 nớc ta Tuy nhiên khó khăn chuẩn đoán virus PCR chỗ hầu hết chúng có lõi RNA Phơng pháp thích hợp để xác định có mặt virus RNA RT-PCR (Reveres transcript-PCR) Trong phơng pháp này, việc thực phản ứng tổng hợp ngợc sợi cDNA từ RNA virus với xúc tác cđa enzym reverse transcriptase, sau ®ã míi dïng kütht PCR để nhân sợi cDNA lên nhiều Dới phơng pháp RT- PCR để chuẩn đoán có mặt virus Y khoai tây 2.17.2 Quy tr×nh : Qui tr×nh gåm b−íc: B−íc 1: Chiết suất RNA tổng số từ bệnh Bớc 2: Tỉng hỵp sỵi cDNA thø nhÊt nhê reverse transcriptase Bớc 3: Nhân sợi cDNA thứ lên nhiều nhê kü tht PCR B−íc vµ lµ hai b−íc khã nhÊt qui tr×nh v× RNA virus cã số lợng nhỏ lại mẫn cảm với enzym RNAse bền có mặt khắp nơi trình làm việc: thành ống nghiệm, mồ hôi tay thí nghiệm viên, vi sinh vật rơi vào ống nghiệm Vì đòi hỏi thí nghiệm viên lành nghề rÊt cÈn thËn thao t¸c *VËt liƯu, hãa chÊt, dụng cụ thao tác bớc -Vật liệu: 500 mg cố định nitơ lỏng -Hóa chất : +§Ưm chiÕt RNA: 4M guanidin thicyante, 25 mM Na citrate, 0,5% sarkosyl, 0,1 M – mercapthoethanol +Phenol b·o hßa +Dung dịch 8M LiCl: Cân đủ lợng LiCl, hòa tan 90ml nớc cất lên thể tích 100ml Vô trùng 120 0C, để nguội qua đêm Lọc qua giấy lọc vô trùng, giữ 0C + Dung dịch DEPC- H2O: Thêm 100àl diethypirocarbonate (chất kháng RNAse mạnh) vµo 100ml n−íc cÊt Khy 10 - 16 giê Sau đem đun nóng lên 60 80oC 10 phút để làm bay lợng DEPC d, giữ tủ lạnh -Dụng cụ: + Vô trùng khô dơng thđy tinh ë 180o C giê 55 + Dơng nhùa v« trïng −ít ë 120oC 20 phút Dùng găng tay thao tác da ngời có nhiều RNAse + Máy li tâm lạnh siêu tốc + Tủ lạnh sâu 20o C -80oC -Thao tác: - Nghiền nhanh 500 mg nitơ lỏng, bột thu đợc cho vào ống nghiệm 0,6ml - Thêm 500àl đệm chiết đà làm nóng lên 65oC, Thêm 167àl phenol bÃo hòa đệm TEL, lắc rung 30 giây, thêm 167àl hỗn hợp chlororm:isoamyl alcohol(24:1), lắc rung 30 gi©y - Ly t©m ë 10 000xg, oC , - Hót cÈn thËn 400µl dịch cho vào ống Eppendorf khác, thêm 100àl 8M LiCl, ñ ë 0C giê, RNA bị kết tủa Ly tâm 10 000xg, 4oC, 15 - 20 phút, rửa cặn với 1ml LiCl, ly tâm làm khô cặn - Hòa cặn 50àl DEPC- H2O, thêm 0,1 thể tích 3M Na- acetate thể tích 100% ethanol, để -80oC qua đêm - Ly t©m ë 10 000xg, 0C, 20 - 30 phút, rửa cặn 70% ethanol lạnh - Ly tâm ë 10 000xg, oC, phót, bá hÕt ethanol, làm khô chân không - Hôa cặn 25àl DEPC- H2O lạnh, bảo quản RNA -80oC *Vật liệu hóa chất thao tác bớc -Vật liệu: Dịch RNA thu đợc bớc -Hóa chất: Mồi tơng thích: 5TTCCAAAGTGTCCTTTGAG3 , enzym reverse transcriptase, RNAsin (chất bảo vệ RNA) -Thao tác: - Cho vào ống Eppendorf loại 0,6 ml: 4àl dịch RNA thu đợc bớc 1, 1àl mồi đặc trng, 7àl DEPC- H2O - ủ 65 0C phút để mồi gắn với RNA - Thêm vào ống: 4àl đệm RT, 2àl DEPC- H2O, 0,5àl RNAsin, 0,5àl hỗn hợp loại dNTP, 1àl enzym RT - Trộn hỗn hợp ống l¾c rung nhĐ, đ ë 42oC giê 56 - Kết thúc phản ứng cách thêm: 60àl đệm 0,1M TE, 80àl phenol bÃo hòa, 80àl hỗn hợp chloform: isoamyl alcohol (24:1) Tất trộn lắc rung nhĐ - Ly t©m ë 10 000xg , 4oC, phút -Lấy cẩn thận 50 - 60 ul dịch cho vào ống nghiệm Thêm: 0,1 thể tích M Na acetat, thĨ tÝch ethanol 100% l¹nh - Đặt ống nghiệm 80oC qua đêm - Ly tâm ë 10 000xg, 4oC , Rưa cỈn (th−êng không nhìn thấy số lợng nhỏ) 300àl ethanol 70%, làm khô cặn chân không - Thêm 40àl H2O cất, lắc cho tan cặn DNA - Bảo quản 80oC tiến hành chạy PCR bớc *Vật liệu, hóa chất thao tác bớc -Vật liệu: Dịch cDNA thu đợc bớc -Hóa chất: mồi đặc trng cho virus : 5CTTCATCAAACAAACTCTTT3 , Enzym TaqDNA polymerase (một loại polymerase chịu nhiệt), loại dNPT -Thao tác: - Cho vào ống Eppendorf loại 1,5 ml: H2O cất vô trùng 30àl, 10x ampli buffer 10àl, hỗn hợp loại dNPT 16àl, mồi tới mồi lui loại 5àl, dịch cDNA (chứa khoảng 2àg DNA) 2àl, Taq polymerase (5 unit/àl) 0,5àl, thêm H2O cất cho tổng thể tích đạt100àl - Đặt 100àl dầu khoáng lên bề mặt, để tránh bay nớc - Đặt ống Eppendorf vào thiết bị Thermocycler, chạy 30-35 chu kỳ, chu kỳ 94 0C (1 phút) 72oC (3 phót), ë chu kú cuèi 72oC (10 phót) - Kết thúc chu kỳ cuối, đặt ống Eppendorf ë –20oC cho ®Õn ®iƯn di ®Ĩ ®äc kÕt qua PCR - Nếu gen đà nhuộm Ethidium Bromide xuất băng tơng ứng với kích thớc cđa virus (tÝnh b»ng Kb) ë ®èi chøng không bệnh không có, kết chẩn đoán dơng tính 2.17.3 Đánh giá phơng pháp chẩn đoán virus PCR 57 Phơng pháp chẩn đoán virus khoai tây thông qua RT-PCR phức tạp nh mô tả Do thực tế, hầu nh PCR không đợc sử dụng để chẩn đoán virus Y virus có chất RNA khoai tây 2.18 Quy trình chẩn đoán bệnh nấm PCR 2.18.1 Cơ sở khoa học thực tiễn Việc sử dụng PCR chẩn đoán bệnh nấm, có độ xác cao, nhng đợc sử dụng hạn chế sau: + Đầu t cho xây dựng đơn vị chẩn đoán bệnh nớc ta b»ng PCR kh¸ tèn kÐm Hãa chÊt tinh khiÕt phải mua nớc ngoài, thời gian đặt hàng lâu + Đối tựơng trồng cần chẩn đoán bệnh hầu hết có giá trị kinh tế thấp + Đối tợng nấm bệnh đa dạng mẫu tồn nhiều dạng nấm khác nhau, trớc chẩn đoán PCR đòi hỏi phải phân lập nấm nhân lên số lợng lớn môi trờng thích hợp + PCR phản ứng nhạy việc lẫn tạp loại nấm hay vi khuẩn khác làm rối loại kết chẩn đoán Vì thực phản ứng PCR phải làm điều kiện vô trùng Vì lý trên, PCR dùng vào chẩn đoán bệnh nấm thực vật công tác nghiên cứu, cần thiết phải sâu xác định quan hệ nấm- ký chủ với nòi nấm loài nhng có khả lây nhiễm khác 2.18.2 Nguyên tắc Nguyên tắc phải tách đợc sợi DNA nấm có dÃy mà đặc trng, thực vật ký chủ loài nấm khác giải mà sợi DNA đặc trng Khi đà có dÃy mà việc thiết kế mồi việc máy tính với phần mềm chuyên dụng Các cặp mồi có chiều dài 20-30 nucleotid sau tổng hợp máy DNA Synthetizer theo đơn đặt hàng Nhiều hÃng có bán sẵn cặp mồi chuyên dùng cho việc chẩn đoán loại khác ViƯc thay ®ỉi nhiƯt ®é mét chu kú PCR phải đợc thực xác nhanh phải dùng thiết bị Thermocycler có khả đặt chơng trình cho chế độ nhiệt tự động máy nh số chu kỳ phải thực 58 18.3 Thao tác chẩn đoán bệnh nấm PCR công nghệ hoàn thiện 2.18.3.1 Phân lập nuôi cấy nấm bệnh Khác với vi khuẩn, việc chẩn đoán nấm bệnh PCR yêu cầu lợng sợi nấm lớn, dựa vào vết nấm mẫu để có đợc Vì cần dùng phơng pháp phân lập nấm thờng dùng ngành Bảo vệ thực vật để phân lập Nấm sau đợc nuôi môi trờng lỏng, máy lắc, với môi trờng thích hợp đạt khối lợng nấm thích hợp, thờng là: g 2.18.3.2 Chiết suất DNA từ sợi nấm + Sợi nấm đợc tách riêng ly tâm lọc để khối lợng 1g + Rửa (qua lọc đệm Tris-HCl, pH8) + Thêm Sarcosyl SDS để chiết DNA, đặt 60 0C 60 phút, lắc nhẹ + Thêm thể tích đệm kết tủa chứa 30% PEG 6000 1,5M NaCl, để đá 60 phút + Ly tâm lấy cặn chứa DNA, bỏ dịch + Hòa tan DNA ml ®Ưm Tris 50 mM, pH8 + Chiết protein chất tạp khác cách thêm thể tích phenol, lắc tách lấy pha nớc + Kết tủa DNA cách thêm vào1/10 thể tích 3M sodium acetate(pH6,5) thể tích ethanol tuyệt đối lạnh + Thu kết tủa ly tâm + Rửa kÕt tđa DNA b»ng ethanol l¹nh 70% + Ci cïng hòa tan DNA 0,5 ml đệm TE 2.18.3.3 Chạy PCR Quy trình chạy PCR với cặp mồi đặc trng cho để chẩn đoán bệnh sơng mai nấm Phytophtora Infestans VMSP1 (5'-CAT AAA AGA CTG CCT ACG CCG-3') and VMSP2 (5'-AAG GGT ACT CAA = ACG GTCAG-3') 2.18.3.4 X¸c định kết chẩn đoán Kết chẩn đoán đợc xác định qua băng DNA bảng gel ®iƯn di sau nhm, so víi ®èi chøng V× có DNA tơng ứng với cặp mồi đặc trng đợc 59 khuếch đại, kết âm tính có nghĩa loại nấm đà đợc phân lập loại nấm dự kiến 2.19 Quy trình chẩn đoán bệnh khuẩn PCR 2.19.1 Cơ sở khoa học thực tiễn: PCR(Polymorphism Chain Reaction) đợc ứng dụng rộng rÃi nớc ta trở thành phơng pháp chẩn đoán bệnh quen thuộc ngành y tế, thủy sản nhiều ngành khác Tuy nhiên việc sử dụng PCR để chẩn đoán bệnh trồng tơng đối hạn chế Nguyên nhân là: - Đầu t sở chẩn đoán PCR tơng đối cao, không phù hợp với trồng nông lâm nghiệp có giá trị tơng đối thấp - Các triệu chứng bệnh vi khuẩn khoai tây(thí dụ bệnh héo tơi vi khuẩn Pseudomonas solanaceae) tơng đối rõ, tơng đối đặc trng, chẩn đoán thông qua phơng pháp đơn giản nh quan sát bệnh, quan sát dòng dịch vi khuẩn chảy từ thân bệnh nhúng vào nớc sạch, quan sát hình thành vòng có màu cắt củ bị bệnh Trên thực tế, đến dùng PCR để chẩn đoán bệnh vi khuẩn cần thiết phải phân biệt phản ứng loài vi khuẩn khác Một phơng pháp sinh học phòng chống bệnh héo tơi sử dụng phơng pháp bón vào đất lợng lớn vi khuẩn đối kháng Pseudomonas flurescens Trong trờng hợp xác định bệnh phơng pháp vi sinh vật phức tạp, dùng PCR để có kết xác 2.19.2 Nguyên tắc Trên DNA loại vi khuẩn gây bệnh, ngời ta phải tìm đoạn có trình tự nucleotid đặc trng cho loài vi khuẩn Việc thờng đợc sử dụng dùng phơng pháp RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) nhiều chủng, loài vi khuẩn với hệ thống mồi ngẫu nhiên Khi đà có dÃy mồi đặc trng cho vi khuẩn, ta thiết kế hai đoạn mồi đặc trng, loại chừng 20 - 30 nucleotid Hai đoạn mồi nhân tạo này, phản ứng PCR gắn với hai đầu đoạn DNA đặc trng cho vi khuẩn Giả thiết ta có phản ứng, với dung dịch đệm thích hợp: đoạn mồi đặc trng 60 Vi khuÈn (DNA template) Enzym DNA polymerase 4 deoxynucleotide mức d Mg++ Điều kiện đủ để enzym DNA polymerase bắt đầu hoạt động sinh tổng hợp nên đoạn DNA đặc trng cho vi khuẩn Quá trình sinh tổng hợp qua bớc: a/ Tách sợi (95 C); b/ Gắn mồi (32 0C); c/ Sinh tổng hợp DNA (72 0C) Bằng cách điều khiển nhiệt độ theo chu kỳ ta nhân đoạn DNA đặc trng cho vi khuẩn lên hàng triệu qua 30 40 chu kỳ Số lợng DNA đủ lớn để quan sát thấy điện di DNA mắt thờng với thuốc nhuộm DNA thích hợp Tất nhiên, vi khuẩn (DNA templat) phản ứng không xảy kết chẩn đoán âm tính 2.19.3 Các bớc tiến hành quy trình công nghệ hoàn thiện *Bớc 1: chuẩn bị nguyên liệu từ khoai tâybị nhiễm bệnh - Lấy 1-2 khoai tây đoạn thân, cđ cã vÕt bƯnh râ nhÊt, cho mÉu vµo mét túi nilon nhỏ Đánh số cất vào tủ lạnh 10 0C - Dùng cối chày sứ đà hấp vô trùng nghiền mẫu với 2ml ®Ưm chiÕt CTAB - Ly t©m ë 1000xg, 0C để bỏ cặn - Thêm 2ml hỗn hợp chloroform/isoamyl alcohol (24/1,v/v) Vortex tạo nhũ phút - Ly tâm 10 000xg, 0C Tách riêng pha nớc vào ống nghiệm khác - Thêm 0.2ml 10% CTAB 1,5ml isopropanol Để yên lạnh để kêt tđa DNA - Ly t©m ë 1000xg, 0C Bá dịch - Rửa lần ethanol 70% - Hòa cặn 0,5 ml đệm TE Trong dung dịch chứa phần lớn DNA thực vật lẫn với DNA vi khuẩn Có thể dùng mồi đặc hiệu vi khuẩn để khuếch đại DNA vi khuẩn PCR *Bớc : Ch¹y PCR: Cocktail gåm cã (trong èng Eppendorf 1,5ml): - Nớc cất vô trùng 30àl - Buffer 10àl - Hỗn hợp dNTP 1,25mM 16àl 61 - Mồi đặc hiệu (100pmol) 5àl - Mồi đặc hiệu (100pmol) 5àl - Dịch DNA vi khuẩn 20àl - Taq Polymerase 5àl - Thêm nớc cất cho cocktail đủ 100 àl - Thêm 100àl dầu khoáng lên mặt dịch để chống bốc Các ống Eppendorf sau đợc đặt vào máy Thermocycler chạy theo chơng trình sau: Chu kỳ Thời gian (phút) Tách DNA (95o C) Gắn mồi (32o C) Sinh tổng hợp DNA Chu kú C¸c chu kú sau Chu kú cuèi 10 Sè chu kỳ: 35 40 *Bớc 3: Đánh giá kết chẩn đoán Sau chạy PCR, hỗn hợp DNA đợc chạy điện di gel agarose (0.8%) đệm TBE Bản gel, sau kết thúc điện di (thờng giờ) đợc nhuộm dung dịch EtBr 30 phút Các DNA đợc quan sát, chụp ảnh dới ánh sáng tử ngoại 302nm Do mồi mang tính đặc trng cao nên có đoạn DNA đặc trng cho vi khuẩn đợc nhân Trên gel tạo băng thẫm màu hoàn toàn mẫu đối chứng sản xuất thử nghiệm 3.I Danh mục sản phẩm : Cây in vitro: Cao - 7cm, - l¸, - rƠ, mập, khỏe, virus 100% Củ in vitro: đờng kính củ 5mm, khối lợng củ 0,5g, virus 100% Cây bồn mạ: cao - 10cm, - lá, mập, khoẻ, không vỡ bầu, virus 100% Củ giống siêu nguyên chủng: khối lợng trung bình 5g/củ, virus 100% Củ giống nguyên chủng: khối lợng trung bình: 30 - 40g/củ, virus 99% 62 3.2 Số lợng sản phẩm sản xt: 2.000.000 cđ gièng siªu nguyªn chđng (2003 – 2004) 600 tÊn gièng nguyªn chđng (2005) đào tạo nhân lực - Tp hun cho 500 nụng dân (thuyết minh dự án đăng ký: 300-500 người) - Đào tạo cán kỹ thuật 30 người (thuyết minh dự án không đăng ký) - Đào tạo sinh viên: 17 sinh viên (thuyết minh dự án đăng ký:10 người) - Đào tạo thạc sỹ: 04 thạc sĩ (thuyết minh dự án đăng ký:2 người) c«ng bè khoa häc hợp tác quốc tế - ó cụng b 04 báo 01 sách (số báo đăng ký - bài) - Có 03 báo cáo khoa học Hội nghị khoai tây Bộ NN-PTNT - Trao đổi khoa học với đoàn cán nuôi cấy mô Banglades, tham gia báo cáo hội nghị khoai tây Châu Á – Thái Bình Dương, hợp tác phát triển khoa học cơng nghệ với Triều Tiên Italia - Có 05 lượt cán dự án thăm quan, học tập ti nc ngoi (Trung quc, H Lan, Canada) *Các báo Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Xuân Trờng, Nguyễn Thị Lý Anh, Đỗ Thị Ngân (2004) Nghiên cứu biện pháp làm tăng số lợng củ giống hệ thống sản xuất giống khoai tây Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Xuân Trờng, Nguyễn Thị Lý Anh, Phạm Văn Tuân, Lại Đức Lu (2004) Nghiên cứu sản xuất củ giống gốc khoai tây minituber từ in vitro Trần Thị Thanh Minh, Nguyễn Thị Hơng, Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2005) Một số nghiên cứu góp phần hoàn thiện quy trình tạo củ khoai tây in vitro biện pháp bảo quản chúng Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Hơng, Trần Thị Thanh Minh, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2005) Nghiên cứu ảnh hởng bình nuôi, hệ thiosulfat bạc đến sinh trởng, hệ số nhân chất lợng khoai tây in vitro 63 *Sách đà xuất Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Xuân Trờng, Nguyễn Thị Lý Anh (2004) ứng dụng công cao sản xuất khoai tây giống bÖnh 64