Bộ khoa học công nghệ Viện lợng nguyên tử việt nam Viện công nghệ xạ - báo cáo tổng kết đề tài khoa học công nghệ cấp năm 2005 2006 nghiên cứu chế tạo gốm xốp hydroxy apatite( HA) đáp ứng yêu cầu thử nghiệm ghép xơng thể sống Mà số ( BO / 05 / 03 – 04) c¬ quan chủ trì: viện công nghệ xạ chủ nhiệm đề tài: pgs.ts đỗ ngọc liên 7032 20/11/2008 hà nội 2007 ngời tham gia thực đề tài PGS.TS Đỗ Ngọc Liên CNĐT Viện CNXH TS Nguyễn Đức Kim TTLK KsC Nguyễn Văn Sinh TTLK Ks Đặng Ngọc Thắng TTLK CN Cao Thị Phơng Anh TTLK CN Trần Thị Thanh Hiền TTLK Ks Trần Thị Hồng Thái TTLK KTV Ngô Quang Hiển TTLK Các cán hợp tác nghiên cứu thử nghiệm GS.TS Trịnh Bình Bộ môn Mô-Phôi học, Trờng Đại học Y Hà Nội TS Ngô Duy Thìn Bộ môn Mô-Phôi học, Trờng Đại học Y Hà Nội BS Lu Đình Mùi Bộ môn Mô-Phôi học, Trờng Đại học Y Hà Nội BSCKII Nguyễn Thế Hùng Khoa Thực nghiệm-Bệnh việnTW Quân Đội 108 chữ viết tắt HA Hydroxyapatite TCP Tricanxi phốt phát TeCp Tetra canxi phèt ph¸t BCP Canxi phèt ph¸t sinh häc bao gåm: Ca5(PO4)3OH - HA , CaHPO4-monetite, Ca2P2O7- piro phèt ph¸t MAO Microarcoxidation - Oxi hóa dòng điện vi hồ quang FCS The fast calcification solution - Dung dịch vôi hóa nhanh SBF Revised simulation body fluid - Mô dịch thĨ ng−ßi FTIR Fourier transformed infrared spectroscopy - Quang phỉ hồng ngoại SEM Scaning electron microscopy - Hiển vi điện tư qut TEM Transmission electron microscopy - HiĨn vi ®iƯn tử truyền qua CD Chemical depisition - Lắng đọng hóa häc OCP Octa canxi phèt ph¸t ACP Amorphous calcium phosphate - Canxi phốt phát vô định hình DCPD Di canxi phèt ph¸t di hydrat DCPA Di canxi phèt ph¸t an hydrat CDHA Calcium deficient hydroxyapatite - Hydroxyapatite thiÕu canxi CTS Chitosan Bilirubin TP Bilirubin toàn phần HA Hydroxyapatite H.EX250 Nhuộm Hematoxylin-Eosine, phóng đại 250 lần HAI Hạt gốm hÃng Fine-Ceramica cđa Italia chÕ t¹o HAV H¹t gèm ViƯn Công nghệ xạ Việt Nam chế tạo Wbc Lợng tế bào bạch cầu đếm đợc (nghìn/mm3) Rbc Lợng tế bào hồng cầu đếm đợc (T/L) hgb Lợng hemoglobin (g/dL) hct Lợng hematocrit (%) mcv Thể tích trung bình tế bào bạch cầu đếm đợc (fL) plt: Lợng tiểu cầu đếm đợc (nghìn/mm3) mục lục mở đầu: phần I: tổng quan tài liÖu I.1 Giíi thiƯu chung .4 I.2 Mét sè vËt liƯu y sinhvµ øng dơng cđa chóng I.2.1 VËt liÖu HA I.2.2 VËt liƯu tr¬ sinh häc .5 I.2.3 Tỷ lệ pha gốm HA sinh häc I.2.4 Tạo màng gốm HA vật liệu trơ sinh häc I.2.5 Tæng quan phơng pháp sol- gel I.2.5.1 Sol- gel b»ng sù thđy ph©n c¸c muèi I.2.5.2 Sol- gel thủy phân ngng tụ alkoxide .11 I.2.5.3 Sol- gel b»ng ®−êng t¹o phøc 15 I.3 Phơng pháp điện hóa chế tạo màng HA .17 I.3.1 ChÕ t¹o màng HA theo phơng pháp anot hóa 17 I.3.2 ChÕ t¹o líp phđ sinh häc canxiphotphat (BCP) titan phơng pháp kích hoạt điện áp âm dơng 19 I.4.Xu đại ứng dụng vật liệu canxiphotphat cã ho¹t tÝnh sinh häc.22 I.5 Giíi thiƯu mét số công trình (2002- 2007) có liên quan đến công nghƯ chÕ t¹o BCP cÊp h¹t nano 25 phÇn II Kü thuËt thùc nghiÖm 30 II.1 Phơng pháp tổng hợp bột HA .30 II.2 Phơng pháp điện hóa chế tạo màng HA 30 II.3 Các phơng pháp đánh gi¸ 31 II.3.1 Phơng pháp nhiễu xạ Rơnghen (X- ray diffraction) 31 II.3.2 Phơng pháp dùng kính hiển vi điện tử quyét ( phong pháp dùng SEM) 33 II.3.3 Phơng pháp đánh giá hàm lợng tinh thể thành phần pha 34 II.3.3.1 Hàm lợng tinh thÓ 34 II.3.3.2 Thành phần pha 34 PhÇn III: kết nghiên cứu thảo luận .36 III.1 Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ tỉng hỵp bét HA 36 III.1.1 Phơng pháp tổng hợp điều chế bột HA 36 III.1.2 C¸c tham sè quan trọng ảnh hởng đến chất lợng sản phẩm 37 III.1.3 Nghiên cứu ảnh hởng pH đến chất lợng sản phẩm .37 III.1.4 Nghiên cứu ảnh h−ëng cđa tèc ®é bỉ xung mi canxi nitrat ®Õn chất lợng sản phẩm 39 III.1.5 Nghiên cứu ảnh hởng thời gian già hóa đến chất lợng bột HA 41 III.1.6 Quy trình tổng hợp bột HA theo phản ứng (2) .42 III.2 Thăm dò tổng hợp bột HA theo phơng pháp sol- gel .46 III.3 Chế tạo loại gốm xốp phục vụ yêu cầu thử nghiệm 50 III.3.1 Những vấn đề chung .50 III.3.2 Quy trình chế tạo gèm xèp HA 51 III.4 Nghiên cứu chế tạo màng HA đế kim loại đế gốm 54 III.4.1 Nghiên cứu phơng pháp sol- gel chế tạo màng HA 54 III.4.1.1 Phơng pháp sol- gel môi trờng metalnol hoăc etalnol chế tạo màng HA 54 III.4.1.2 Nghiên cứu chế tạo màng BCP môi trờng etylenglycol 59 III.4.1.3 Nghiên cứu hình thái học màng BCP SEM 62 III.4.1.4 Nghiên cøu chun hãa mµng BCP sang mµng HA .68 III.4.1.5 Một số kết luận đợc rút từ phơng pháp sol-gel chế tạo màng HA 69 III.4.2 Nghiên cứu chế tạo màng HA phơng pháp điện hóa 70 III.4.2.1 Hệ điện phân 70 III.4.2.2 Nghiên cứu ảnh hởng phân cực đến chất lợng màng HA 70 III.4.2.3 Nghiên cứu ảnh hởng nhiệt độ điện phân đến thành phần màng HA 75 III.4.2.4 Nghiên cứu vai trò nhiệt độ xử lý nhiệt đến thành phần màng BCP .78 III.4.2.5 Nghiên cứu kích thớc hạt tinh thể mẫu điện tổng hợp hình ảnh hình thái học cđa c¸c mÉu .80 III.4.2.6 Giả định trình xảy khu vùc catot 88 III.4.2.7 C¸c kết luận đợc đề xuất từ phơng pháp điện tổng hợp màng HA 91 III.5 Kết thử nghiệm ®éng vËt 91 III.5.1 Tỉng quan tµi liƯu 91 III.5.1.1 Vµi nÐt vỊ tình hình nghiên cứu sử dụng Hydroxy Apatite thÕ giíi vµ ë ViƯt nam 91 III.5.1.2 C¸c nhãm vËt liƯu sinh häc phæ biÕn 92 III.5.1.3 Gèm sinh häc – hydroxy apatite (HA) 92 III.5.2 Tính phù hợp mô ®èi víi vËt liƯu cÊy ghÐp .93 III.5.3 Đối tợng phơng pháp nghiên cứu 94 III.5.3.1 VËt liÖu nghiªn cøu 94 III.5.3.2 Động vật nghiên cứu 96 III.5.3.3 Phơng pháp nghiªn cøu 96 III.5.3.4 Kỹ thuật tiêu nghiên cứu 97 III.5.4 KÕt qu¶ 99 III.5.4.1.Tình trạng động vật sau phẫu thuật .99 III.5.4.2 NhËn xÐt nơi đặt vật liệu thí nghiệm .99 III.5.4.3 Hình ảnh X quang vùng khuyết xơng đùi chó đợc ghép mảnh gốm M1 M2 101 III.5.4.4 Các biến số huyết học hoá sinh .103 III.5.4.5 NhËn xÐt vi thÓ 105 III.5.5 Bµn luËn 111 III.5.5.1 T×nh trạng toàn thân 111 III.5.5.2 Các biến số sinh hoá huyÕt häc 111 III.5.5.3 Tình trạng vùng mô tiếp xúc với vật liệu .112 III.5.5.4 Tình trạng vùng mô x−¬ng tiÕp xóc víi vËt liƯu 112 III.5.5.5 X quang .112 III.5.6 KÕt luËn phÇn thư nghiƯm 113 PhÇn IV: kÕt luËn chung 114 Tài liệu tham khảo 116 Mở đầu Thực tế cho thấy phẫu thuật ghép xơng, chỉnh hình cần thiết Có nhiều ngời không may gặp tai nạn, bị chấn thơng bị tàn tật suốt đời nh−ng nhê kü tht nµy cïng víi sư dơng vËt liệu gốm y sinh dạng HA mà họ đà đợc phục hồi, trở lại sống bình thờng Sự đời gốm y sinh đợc loài ngời ghi nhận nh cách mạng lĩnh vực khoa học vật liệu Nhờ ứng dụng loại chi tiết ghép gốm y sinh dạng HA, phẫu thuật ghép xơng, chỉnh hình xơng đà đạt đến giới hạn hoàn thiện Có thể nói đợc điều gốm HA loại vật liệu có hoạt tính sinh häc, cã tÝnh t−¬ng thÝch sinh häc tèt nhÊt so với tất vật liệu y sinh mà nhà y học đà sử dụng cho ghép xơng chữa xơng Chúng đà nói đến bột HA gốm HA loại vật liệu y sinh tuyệt vời nh vậy, thiếu sót không giới thiệu chất loại vật liệu HA viết tắt hợp chất hoá học, có công thức Ca5(PO4)3(OH) đợc gọi hydroxyapatite Đây hợp chất bền vững canxi photphat Gốm HA gốm đợc thiêu kết từ bột HA nhiệt độ dới 11000C Tại nhiệt độ thiêu kết hạt bột đợc liên kết lại với nh hạt rắn đợc kết khối pha lỏng giáp ranh hạt bột, rắn pha lỏng để nguội đà làm cho khối vật liệu đợc giữ cấu hình định Sự nghiên cứu thành phần xơng động vật đà xác định rằng, HA khoáng vô quan trọng chiếm tới 70% thành phần xơng, răng, lại nớc 10% mô sợi có chất chất hữu chiếm gần 20% Ngời ta gọi phần hữu có cấu tạo phức tạp collagien Vật liệu y sinh đợc sử dụng phẫu thuật xơng chỉnh hình gồm loại sau: - Các vật liệu trơ với phản ứng thể đợc sử dụng nh chi tiết cố định xơng bao gồm: Thép không gỉ 316L, hợp kim Co Cr, sợi cacbon, gốm oxit nhôm, hợp kim titan Ti6A14V - Vật liệu có tính tơng thích sinh học chừng mực định nh: polime y sinh PMMA, PU, thuû tinh y sinh, gèm thuû tinh y sinh - Các loại vật liệu có hoạt tính sinh học cao, có thành phần hình thái cấu trúc gần với thành phần khoáng xơng vi cấu trúc xơng Các loại vật liệu nµy lµ gèm HA vµ gèm dÉn xt cđa HA nh gốm sở TCP sử dụng cho mục đích tái sinh xơng Các loại vật liệu thuộc hai nhóm đầu đà đợc nhà y học ViƯt nam sư dơng phÉu tht x−¬ng tõ nhiỊu năm Các vật liệu nhóm chung sống thể có ăn mòn vật liệu ghép, ăn mòn tạo sản phẩm gây độc hại với thể mặt khác làm lỏng lẻo liên kết xơng tự nhiên phần ghép Lo¹i vËt liƯu y sinh thø ba cã tÝnh chÊt u việt đặc biệt lẽ loại vật liƯu cã tÝnh t−¬ng thÝch sinh häc tut vêi nhÊt, có lẽ giá vật liệu cao nên vật liệu tốt nhng cha đợc nhà phẫu thuật Việt nam sử dụng điều trị Trên giới, nớc phát triển với tảng khoa học kỹ thuật tiên tiến cộng với trang thiết bị đại, loại vật liƯu y sinh cã tÝnh t−¬ng thÝch sinh häc cao đà đợc nhà y học sử dụng từ cuối năm 80 kỷ trớc Với nhu cầu không ngừng nâng cao chất lợng sống, đà đến lúc xà hội yêu cầu nhà y học, nhà khoa học phải nhanh chóng đa loại vật liệu y häc gèm HA vµo sư dơng ë n−íc ta Trong phạm vi nghiên cứu vật liệu sinh học dạng HA có hai hớng đợc triển khai là: Gèm HA d¹ng khèi, d¹ng h¹t Gèm HA dạng màng vật liệu trơ hai nhóm vật liệu y sinh với mục đích tạo cho vật liệu tính tơng thích sinh học cao so với vật liệu ban đầu Tuy nhiên, gốm HA có nhợc điểm độ bền nén, độ bền uốn thấp không sử dụng đợc gốm HA dạng khối để ghép vào chi tiết đòi hỏi chịu lực lớn Liên quan đến chế tạo øng dơng vËt liƯu y sinh, chóng ta cã thĨ nêu số tập thể nhà khoa học nớc đà có công trình nghiên cứu theo hớng sau: - Tập thể nhà khoa học Trờng Đại học Bách khoa đà có công trình nghiên cứu chế tạo số vật liệu thủy tinh sinh häc, gèm thđy tinh sinh häc KÕt qu¶ nghiên cứu đà đợc thử nghiệm động vật bớc đầu nghiên cứu lâm sàng - Tập thể nhà khoa học Viẹn Công nghệ ứng dụng đà chế tạo số chi tiết ghép động vật tiến hành thử nghiệm lâm sàng vật liệu sợi cacbon Cả hớng đà nghiên cứu thử nghiệm hàng chục năm đà đạt đợc số kết đa vào áp dụng - Theo hớng nghiên cứu chế tạo loại vật liƯu y sinh cã tÝnh chÊt t−¬ng thÝch sinh häc cao nhÊt nh− bét HA, gèm HA vµ mµng HA đợc nghiên cứu từ năm 2003 với đề tài "Nghiên cứu tổng hợp bột HA chế thử gốm xốp HA" Đề tài đợc thực Viện Công nghệ Xạ Hiếm Tập thể nhà khoa học Viên Công nghệ Xạ Hiếm đà hoàn thành đề tài với tên nh đà có số thử nghiệm chi tiét ghép gốm xốp HA động vật Từ kết nghiên cứu năm 2003 - 2004, Bộ Khoa học Công nghệ đà cho phép Viện Công nghệ Xạ Hiếm mở đề tài cấp Bộ năm 2005 - 2006 có tên nh sau: "Nghiên cứu chế tạo gốm xốp hydroxypatite đáp ứng yêu cầu thử nghiệm ghép xơng thể sống" Để đạt mục tiêu đề tài, đà xây dựng nội dung nghiên cứu gồm vấn đề sau: Hoàn thiện phơng pháp tổng hợp bột HA Chế tạo dạng gốm HA phục vụ yêu cầu thử nghiệm: a- Chế tạo gốm xốp dạng khối theo yêu cầu thử nghiệm b- Chế tạo gốm xốp dạng mô yêu cầu thử nghiƯm c- ChÕ t¹o gèm xèp d¹ng h¹t víi cÊp hạt d 500 - 700àm Nghiên cứu chế tạo màng HA đế kim loại đế gốm alumina Thử nghiệm cấy ghép xơng động vật Phần I: tổng quan tài liệu I.1 Giới thiệu chung Vật liệu y sinh dạng tự nhiên từ xơng động vật từ xơng đồng loại đà đợc nhà y học giới sử dụng từ lâu Năm 1265 nhà phẫu thuật ngời Ai Cập đà dùng xơng cá để ghép vào chỗ khuyết tật xơng ngời Năm 1668 nhà phẫu thuật Châu Âu có tên Myth Meekeren đà dùng xơng chó để ghép cho chỗ khuyết tật xơng tín đồ thiên chúa giáo Ca phẫu thuật thành công tốt đẹp, vết thơng đà lành nhng tín đồ đà bị cấm vào nhà thờ đà mang thể dị vật xơng chó Vì không muốn đoạn tuyệt với tín ngỡng mình, bệnh nhân đà làm phẫu thuật ngợc trở lại chấn thơng, vứt bỏ dị vật đà giúp lành lặn Năm 1887 Bircher dùng ngà voi, năm 1955 S.Peer dùng sừng bò năm 1988, Auchincloss dùng xơng bò làm chi tiết ghép cho xơng ngời Đó ca ghép xơng ngời xơng động vật, nhiều ca ghép xơng đợc thực nhờ dùng xơng đồng loại đà đợc thực Các vật liệu y sinh khác nh hợp kim, kim loại, polyme y sinh, thuỷ tinh sinh học đợc nhà y học giới sử dụng từ lâu phong phú, nhiên chúng hạn chế định Gốm HA loại vật liệu y sinh có đặc tính hoạt hoá sinh học tơng thích sinh học cao nhất, loại vật liệu đà đợc nớc nh Mỹ, Nhật, Trung Quốc, Hàn Quốc nớc Châu Âu nghiên cứu đa vào sử dụng cách rộng rÃi rầm rộ từ cuối thËp kû 80 cđa thÕ kû tr−íc T¹i n−íc ta loại vật liệu đợc tổng hợp, mong đợc đa vào sử dụng lâm sàng thời gian tới I.2 Một số vËt liƯu y sinh vµ øng dơng cđa chóng I.2.1 VËt liƯu HA VËt liƯu HA cã tÝnh t−¬ng thÝch sinh học tuyệt vời có khả tạo cho tái sinh xơng nhanh, vật liệu tạo liên kết trực tiếp với xơng Từ bảng (5) nhận xét điện áp phân cực yếu tố quan trọng Nếu khống chế đợc điện áp phân cực giá trị tối u chẳng hạn trờng hợp 1,45 von hÃy quan sát biến đổi thành phần lớp BCP theo nhiệt độ khoảng từ 450C đến 850C Tõ b¶ng (6) chóng ta cã thĨ cã nhËn xÐt điều kiện màng BCP với 100% HA đợc tạo vùng nhiệt độ từ 550C đến 850C Tuy nhiên phổ đồ Rơnghen ứng với mẫu điện phân 750C 850C (mẫu M9 M10) có pic đặc trng cho HA rõ ràng hơn, độ cao píc tơng ứng cao so với giá trị mẫu khác Điều có nghĩa phần trăm tinh thể mẫu HA màng mẫu M9, M10 cao III.4.2.4 Nghiên cứu vai trò nhiệt độ xử lý nhiệt đến thành phần màng BCP Bảng (7) số liệu thành phần mẫu đợc điện tổng hợp điều kiện nh nhng đợc xử lý nhiệt nhiệt độ khác Bảng (7) ảnh hởng nhiệt độ xử lý nhiệt đến thành phần màng BCP T10 = 650, điện áp phân cực1,45V M11 Nhiệt độ xử lý nhiệt (t20) 5000C M12 6000C 100,00 0 M3 7000C 100,00 0 M8 8000C 53,50 46,5 MÉu 80,00 TCP (%) Canxihydrogen photphat(%) 20,00 HA(%) Ghi chó Tõ b¶ng (7) thấy điện phân điều kiện đợc xem tối u (t1 = 65oC, Vc = -1,45V) giai đoạn xử lý nhiệt để gốm hoá màng HA thực vùng nhiệt độ từ 500oC đến 700oC III.4.2.5 Nghiên cứu kích thớc hạt tinh thể mẫu điện tổng hợp hình ảnh hình thái học số mẫu Từ phổ đồ Rơnghen mẫu M1ữ M12 tính gần kích thớc tinh thể tinh thể HA mẫu 16 Bảng (8): Kích thớc tinh thể HA mẫu điện tổng hợp Mẫu M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 KÝch th−íc (nm) 40 45 30 37 33 40 50 25 40 55 57 47 Quan sát hình ảnh SEM cđa mÉu M10 chóng ta thÊy mét bỊ mỈt tuyệt vời hạt có kích thớc đồng đợc phân bố toàn điện tích với ranh giới hạt đợc tách biệt Hình minh hoạ vi cấu trúc bề mặt mẫu M10 Hình ảnh SEM-1 mẫu 10 (điện phân 85oC, 1,45V, nhiệt độ xử lý 700oC III.4.2.6 Giả định trình xảy khu vực catot Khi điện phân, trờng hợp hệ nghiên cứu, trình xảy catot theo phản ứng sau: 2H2O + 2e H2 + OH- , E0 = - 0,8277 von Quá trình làm tăng nồng độ OH- lân cận catốt Do pH lân cận catốt tăng lên theo tốc độ trình catot Nh đặt điện áp âm vào điện cực thép không gỉ có 17 thể chờ đợi tợng xẩy khu vực nh sau: - Sự tăng nồng dộ HPO42- PO43- tăng pH - Sự tăng nồng độ ion canxi điện trờng cực âm đủ mạnh để kéo cation phía nó, làm cho nồng độ cation canxi khu vực catot tăng đáng kể so với nồng độ cation dung dịch Hai tợng xảy đồng thời làm tăng khả vợt qua trạng thái bÃo hoà hợp chất canxi vµ photphat ë khu vùc catèt Theo Lu [tµi liƯu 36 báo cáo chính] hệ có tồn phân tử ion nh H3PO4, H2PO42-, HPO42-, PO43- tăng pH đến giá trị hệ tồn chủ yếu dạng HPO42- PO43- Trong trờng hợp nghiên cứu trình điện hoá đà đồng thời làm tăng yếu tố ®Ĩ thóc ®Èy thêi ®iĨm ë ®ã xÈy hiƯn tợng bÃo hoà octa canxi photphat hydroxyapatite III.4.2.7 Các kết luận đợc đề xuất từ phơng pháp điện tổng hợp màng HA a Đà xác định đợc vùng điện áp phân cực tối u để tổng hợp màng BCP với thành phần HA 80% b Có thể điện kích hoạt để tạo màng HA vùng nhiệt độ từ 55oC đến 85oC Tuy nhiên nhiệt ®é tèi −u ®Ĩ cho mµng HA kÕt tđa ®ång ®Ịu , xèp, h¹t tinh thĨ cã kÝch th−íc ®ång đợc chọn từ 80 ữ 85oC c Bằng phơng pháp kích hoạt điện hoá đà tạo đợc màng HA có kích thớc tinh thể khoảng từ 25 ữ 60 nm d Đà đa giải thích hình thành màng HA trờng hợp nghiên cứu điện tổng hợp cách trực tiếp mà theo chế kích hoạt điều kiện hình thành gel hydroxyapatite III.5 Kết thử nghiệm động vật III.5.1 Đối tợng phơng pháp nghiên cứu III.5.1.1 Vật liệu nghiên cứu III.5.1.1.1 Hạt gốm Hạt gốm HA Viện Công nghệ xạ Việt Nam chế tạo (ký hiệu HAV) tơng đơng kích thớc hạt gốm HA h·ng Fine - Ceramica 18 cđa Italia chÕ t¹o (ký hiệu HAI) có Viện Công nghệ xạ Hai loại vật liệu đợc thử nghiệm song song mô để so sánh Quy cách cụ thể: đờng kính hạt 450-900àm 06 mẫu HAV, 06 mẫu HAI Các hạt gốm nghiên cứu (HAV) hạt gốm đối chứng (HAI) đợc nhồi vào ống silicon mở hai đầu, chiều dài 5mm, đờng kính 2mm Mỗi ống chứa khoảng 60 hạt III.5.1.1.2 Mảnh gốm Mảnh gốm xốp hình máng Viện Công nghệ xạ Việt Nam chế tạo có quy cách cụ thể nh sau: - Loại thứ (ký hiệu M1): Chiều dài: 25mm, đờng kính trong: 4mm, đờng kính ngoài: 1012mm, độ xốp trung bình 50%, đờng kính mao quản hở 150àm - Loại thứ hai (ký hiệu M2): Chiều dài: 25mm, đờng kính trong: 4mm, đờng kính ngoài: 1012mm, độ xốp 20%, đờng kính lỗ xốp 150àm III.5.1.2 Động vật nghiên cứu III.5.1.2.1 Thỏ ta, giống đực Thể trọng thỏ nghiên cứu: 1,8 kg đến 2,2 kg Tổng số thỏ nghiên cứu: 12 III.5.1.2.2 Chã ta, gièng ®ùc ThĨ träng chã nghiên cứu: 10 kg đến 12 kg Tổng số chó nghiên cứu: 09 III.5.1.3 Phơng pháp nghiên cứu III.5.1.3.1 Chia nhóm thí nghiệm - 12 thỏ đợc chia thành nhóm: R1 R2, nhóm đợc chia thành phân nhóm: nuôi tới mức thời gian: tuần 12 tuần sau cấy ghép Theo mô hình Viện nghiên cứu vật liệu sinh học Hàn Quốc (KBRI) 19 - 09 chó đợc chia thành nhóm: D3, D6 D9, nuôi tới mức thời gian 3, tháng sau cấy ghép III.5.1.3.2 Mô hình nghiên cứu - 12 thỏ: 06 thỏ đợc cấy ghép hạt HA loại HAV (chứa ống silicon) vào mông bên phải 03 thỏ đợc nuôi tới tuần 03 thỏ đợc nuôi tới 12 tuần - 06 thỏ đợc cấy ghép hạt HA loại HAI (chứa ống silicon) vào mông bên phải 03 thỏ đợc nuôi tới tuần 03 thỏ đợc nuôi tới 12 tuần - 09 chó: Xơng đùi phải: cấy ghép mảnh gốm M1 Xơng đùi trái: cấy ghép mảnh gốm M2 III.5.1.4 Kỹ thuật tiêu nghiên cứu III.5.1.4.1 Nghiên cứu tính phù hợp mô vật liệu gốm HA cấy vào mô động vật thí nghiệm (thỏ) III.5.1.4.2 Nghiên cứu phát triển xơng vùng khuyết xơng sau đa mảnh ghép gốm HAV vào xơng đùi chó * Kỹ thuật cấy ghép ã Chó đợc gây mê tĩnh mạch pentobarbital natri ã Tạo khuyết xơng mặt trớc xơng đùi theo kích thớc mảnh ghép Đặt mảnh ghép (chân phải: vật liệu M1, chân trái: vật liệu M2), buộc chặt mảnh ghép vào xơng lin ã Đóng vết thơng * Các tiêu nghiên cứu - Theo dõi tình trạng toàn thân chỗ chó sau đặt mảnh ghép - Theo thời hạn 3, tháng, giết chó lấy bệnh phẩm - Nhận xét đại thể chỗ - Chụp X quang Đánh giá tình trạng xơng mảnh ghép - Lấy mô xơng nơi cấy ghép làm tiêu mô học theo phơng pháp khử canxi, nhuộm H.E, quan sát dới kính hiĨn vi quang häc vỊ: + Sù x©m nhËp cđa mô xơng vào mảnh ghép; tạo xơng 20 + Phản ứng mô xơng mảnh ghép + Sự tiêu mảnh ghép + So sánh hình ảnh vi thể mô xơng động vật thí nghiệm nơi ghép mảnh M1 mảnh M2 Các biến số huyết học máu thỏ qua giai đoạn nghiên cứu đợc thực máy Screen master hÃng Hospitex Diagnostics (Italy) Các biến số hoá sinh đợc thực máy Vet abcTM Animal Blood Counter Định lợng tế bào mô đợc thực kính hiển vi đa trang bị phần mềm KS400 của hÃng Carl Zeiss (CHLB Đức) Công trình đợc thực Lab bảo quản xơng vật liệu sinh học, Bộ môn Mô-Phôi học (Trờng Đại học Y Hà Nội), Khoa thực nghiệm (Bệnh viện TW Quân đội 108) Bộ môn Dợc lý (Trờng Đại học Y Hà Nội) III.5.2 Kết thử nghiệm III.5.2.1 Tình trạng động vật sau phẫu thuật Cả hai loại động vật thí nghiệm không sốt, ăn uống, hoạt động bình thờng sau phẫu thuật III.5.2.2 Nhận xét nơi đặt vật liệu thí nghiệm - Trên loại động vật thí nghiệm: vết mổ liền sẹo, không bị nhiễm khuẩn - Mô mềm bình thờng: không phù nề, không nhiễm khuẩn, màu sắc bình thờng, dấu hiệu thải loại ống silicon (ë thá) hay m¶nh ghÐp HA (ë chã) - M¶nh ghép bám vào nơi cấy ghép đợc che phủ mô mềm - Mô xơng có màu sắc tự nhiên, dấu hiệu biến đổi III.5.2.3 Hình ảnh X quang vùng khuyết xơng đùi chó đợc ghép mảnh gốm M1 M2 - Tại nơi cấy ghép mảnh gốm, theo thời gian xơng đà phát triển lấp kín khe xơng với mảnh gốm - giai đoạn tháng sau ghép, mảnh ghép không bị tiêu biến - Quanh nơi cấy ghép dấu hiệu huỷ mô xơng mảnh ghép - Không có biểu khác biệt hình ảnh X quang nơi ghép hai loại mảnh ghép M1 M2 21 III.5.2.4 Các biến số huyết học hoá sinh Bảng So s¸nh c¸c chØ sè hut häc cđa thá sau cấy hạt gốm HAI tuần 12 tuần wbc rbc hgb hct mcv plt Tr−íc cÊy ghÐp 11,6 4,33 9,1 27,6 64 272 tuÇn 9,7 4,79 10,1 30,2 63 218 12 tuÇn 12,7 4,91 12,1 32,2 66 296 Bảng 10 So sánh số huyết học thỏ sau cấy hạt gốm HAV tuần 12 tuÇn wbc rbc hgb hct mcv plt 11,2 9,9 10,7 4,36 4,29 4,71 9,8 9,5 11,3 28,9 28,2 29,8 66 66 64 249 270 326 Tr−íc cÊy ghÐp tn 12 tuần Bảng 11 So sánh số huyết học thỏ sau cấy hạt gốm HAI HAV tuÇn HAI HAV wbc rbc hgb hct mcv plt 9,7 9,9 4,79 4,29 10,1 9,5 30,2 28,2 63 66 218 270 Bảng 12 So sánh số huyết học thỏ sau cấy hạt gốm HAI HAV 12 tuÇn HAI HAV wbc rbc hgb hct mcv plt 12,7 10,7 4,91 4,71 12,1 11,3 32,2 29,8 66 64 296 326 Bảng 13 So sánh công thức bạch cầu thỏ sau cấy hạt gốm HAI tuần 12 tn Tr−íc cÊy ghÐp tn 12 tn lympho Trung tÝnh (%) (%) 72 76 73 28 24 27 22 Acid (%) Mono (%) 0 0 0 Bảng 14 So sánh công thức bạch cầu thỏ sau cấy hạt gốm HAV tuần 12 tuÇn lympho (%) Trung tÝnh (%) Acid (%) Mono (%) Tr−íc cÊy ghÐp 77 23 0 tn 79 21 0 12 tuần 75 25 0 Bảng 15 So sánh công thức bạch cầu thỏ sau cấy hạt gốm HAI HAV tuần lympho (%) Trung tÝnh (%) Acid (%) Mono (%) HAI 76 24 0 HAV 79 21 0 B¶ng 16 So sánh công thức bạch cầu thỏ sau cấy hạt gốm HAI HAV 12 tuần lympho (%) Trung tính(%) Acid (%) Mono (%) HAI 73 27 0 HAV 75 25 0 Bảng 17 So sánh số hoá sinh thỏ sau cấy hạt gốm HAI tuần 12 tuần GOT (UI/L) GPT (UI/L) Cholesterol Creatinin Bilirubin TP Albumin Protein (mmol/l) (mg/dl) (mmol/l) (g/l) (g/l) Tr−íc cÊy ghÐp 42,3 62,6 1,5 1,0 12,4 5,1 67,8 tuÇn 47,3 70,8 2,4 1,1 12,5 5,0 68,4 12 tuần 60,7 75,6 2,3 1,1 12,3 5,0 67,1 23 Bảng 18 So s¸nh c¸c chØ sè ho¸ sinh cđa thá sau cấy hạt gốm HAV tuần 12 tuần GOT (UI/L) GPT (UI/L) Cholesterol Creatinin Bilirubin TP Albumin Protein (mmol/l) (mg/dl) (mmol/l) (g/l) (g/l) Tr−íc 41,9 cÊy ghÐp 63,9 1,4 1,0 12,4 5,1 68,7 tuÇn 45,6 61,1 2,2 1,1 12,8 5,1 68,3 12 tuÇn 67,2 84,7 2,1 1,0 12,3 5,1 64,6 Bảng 19 So sánh số hoá sinh thỏ sau cấy hạt gốm HAI HAV tuÇn GOT GPT (UI/L) (UI/L) Cholesterol Creatinin Bilirubin TP Albumin Protein (mmol/l) (mg/dl) (mmol/l) (g/l) (g/l) HAI 47,3 70,8 2,4 1,1 12,5 5,0 68,4 HAV 45,6 61,1 2,2 1,1 12,8 5,1 68,3 Bảng 20 So sánh số hoá sinh thỏ sau cấy hạt gốm HAI HAV 12 tuần GOT GPT Cholesterol Creatinin Bilirubin TP Albumin Protein (UI/L) (UI/L) (mmol/l) (mg/dl) (mmol/l) (g/l) (g/l) HAI 60,7 75,6 2,3 1,1 12,3 5,0 67,1 HAV 67,2 84,7 2,1 1,0 12,3 5,1 64,6 NhËn xÐt chung: Qua c¸c bảng trên, nhận thấy hầu nh thay đổi đáng kể số huyết học hoá sinh, đặc biệt biến số lympho bào bạch cầu đa nhân trung tính động vật thí nghiệm so với lô chứng, nh lô đợc cấy HAV so với lô đợc cấy HAI 24 III.5.2.5 Nhận xét vi thĨ III.5.2.5.1 T¹i vïng cÊy èng silicon chøa h¹t gốm - Trên hình ảnh vi thể không nhận thấy khác biệt vùng cấy ghép hạt gốm HAI với vùng cấy ghép hạt gốm HAV Bảng 21 So sánh sốvề mô liên kết lym bào thỏ sau cấy hạt gốm HAI HAV 12 tuần Mô liên kết (tỷ lệ %) Lympho bào (tb/mm2) tuÇn 12 tuÇn tuÇn 12 tuÇn HAV 19,2 29,1 27,5 17,9 HAI 21,2 28,0 25,8 18,1 Lo¹i hạt gốm Hình Mô liên kết hạt gốm HAV lòng ống silicon đợc cấy vào thỏ sau 12 tuÇn H.E X 125 25 NhËn xÐt chung: - Theo thời gian, mô liên kết xâm nhập vào lòng ống, bao quanh hạt gốm tăng lên - Song song với hình ảnh tăng mô liên kết lòng ống silicon giảm kích thớc hạt gốm, tạo khoảng trống mô liên kết hạt gốm - Số lợng tế bào viêm giảm giai đoạn 12 tuần sau cấy hạt gốm - Không thấy khác biệt phản ứng mô quanh hạt gốm hạt HAV HAI III.5.2.5.2 Tại vùng cấy ghép mảnh gốm - Trên hình ảnh vi thể không nhận thấy khác biệt vùng cÊy ghÐp m¶nh gèm M1 víi vïng cÊy ghÐp m¶nh gốm M2 - Mô xơng chủ quanh mảnh ghép có màu sắc cấu trúc bình thờng, không thấy hình ảnh tế bào viêm Không có hình ảnh tiêu xơng hay hoại tử nơi cấy ghép - Mô xơng phát triển vào vùng khuyết xơng rõ rệt: giai đoạn tháng tháng, mảnh xơng tha Có thể nhận thấy vùng mô xơng khác nhau: Vùng xơng chủ quanh mảnh ghép màu đậm hơn, vùng xơng sinh quanh mảnh ghép màu nhạt Trên mặt bè xơng hình thành, có nhiều tạo cốt bào tham gia tạo xơng giai đoạn tháng, có nhiều mảnh xơng hơn, tuỷ xơng phát triển nhiều lên xen bè xơng Màu sắc cấu trúc bè xơng hoàn toàn bình thờng, không khác biệt với mô xơng chủ quanh mảnh ghép 26 Hình Vùng cấy ghép mảnh gốm vào xơng chó (sau tháng) HE X 125 - Vùng xơng chủ; Xơng sinh III.5.3 Bàn luận III.5.3.1 Tình trạng toàn thân Qua theo dõi tuần sau cấy ghép, hai loại động vật thí nghiệm không sốt, ăn uống, hoạt động bình thờng Vết mổ liền sẹo, không bị nhiễm khuẩn, không thấy tợng đùn vật liệu Quan sát vùng mô tiếp xúc với vật liệu không thấy khác biệt so với vùng xung quanh Điều chứng tỏ thể động vật đợc cấy ghép vật liệu phản ứng toàn thân vật liệu cấy ghép III.5.3.2 Các biến số sinh hoá huyết học Kết nghiên cứu số sinh hoá, huyết học cho thấy hầu nh thay đổi đáng kể tiêu động vật thí nghiệm Vì số mẫu nên dùng thuật toán thống kê để so sánh đợc, song từ kết cho thấy vật liệu HA không làm thay đổi tiêu sinh học, không gây độc cho động vật đợc cấy ghép Có tăng 27 loại men gan (GOT & GPT) cholesterol máu, nhng biểu hai nhóm vật liệu cấy ghép: HAI HAV III.5.3.3 Tình trạng vùng mô tiếp xúc với vật liệu Diện tích mô liên kết xâm nhập vào vật liệu tăng lên theo thời gian cấy ghép: giai đoạn tuần 19,2%, giai đoạn 12 tuần 29,1% Điều cho thấy khả năng: - Mô chủ phát triển bình thờng bên cạnh vật liệu - Mô chủ phát triển đến đâu, vật liệu phân huỷ đến Tuy nhiên, để đánh giá xác kết trên, cần tạo khoảng cách hạt gốm thực nghiệm (khi nhồi hạt vào ống silicon) nh»m t¹o diƯn tÝch gièng cho tỉ chøc liên kết xâm nhập III.5.3 Tình trạng vùng mô xơng tiếp xúc với vật liệu Tại vùng cấy ghép mảnh HA vào xơng đùi chó sau ba mốc thời gian khác cho thấy HA không làm thay đổi cấu trúc mô xơng chủ mà mô xơng chủ phát triển vào bên mảnh ghép HA Thời gian lâu, mật độ xơng phát triển nhiều Kết phù hợp với nhiều thông báo đà nghiên cứu trớc loại HA nớc sản xuất (Holmes 1988, Martin cộng 1993, Natholi Pompili 1988) Điều chứng tỏ HAV (gốm HA Viện công nghệ xạ hiếm) đà đáp ứng đợc đặc tính sinh học cần thiết cho phát triển xơng (tính dẫn xơng) III.5.3.5 X quang Hình ảnh đậm độ cản quang đồng vùng ghép xơng cho thấy quanh nơi cấy ghép dấu hiệu huỷ mô xơng, loÃng xơng Cũng không thấy tợng can xù, u xơng Các biểu chứng tỏ mô xơng chủ biểu thải loại mảnh ghép 28 Phần IV: kết luận Hoàn thiện đợc phơng pháp kết tủa hóa học ớt tổng hợp HA theo phản ứng chất phản ứng canxi nitrat amoni hydro photphat Các điều kiện trình tổng hợp bột là: - t0C = 20 - 300C - pH cña hai dung dịch tiền chất (pH = 10) - Tốc độ bæ xung canxinitrat 5ml/ph - ω = 200 v/ph - Nồng độ Ca (NO3)2: 0,1M - Thời gian giá hóa 60 - Chế độ rửa: Rửa lần nớc + lần rợu - Xử lý nhiệt t¹i 4000C giê - NghiỊn −ít etanol Thành phần HA TCP đợc điều khiển thông qua khống chế giá trị pH tốc độ cấp canxinitrat Đà thăm dò tổng hợp bột HA phơng pháp sol-gel môi trờng etanol môi tr−êng axit citric etylen glycol Bét HA tỉng hỵp phơng pháp sol-gol có kích thớc 30nm điều chế môi trờng etanol 20nm điều chế môi trờng etylenglycol với axít citric Đà chế tạo đợc loại gốm HA phục vụ yêu cầu thư nghiƯm - Gèm xèp ®ång ®Ịu - Gèm xèp modul - Gèm h¹t HA xèp, cÊp h¹t 500 - 700 àm Kích thớc khối lợng theo yêu cầu thử nghiệm Đà chế tạo đợc màng HA phơng pháp sol-gel đế alumina thực giai đoạn chuyển hóa môi trờng kiềm 600 50 Đà chế tạo đợc màng HA phơng pháp điện hóa thép không gỉ Màng chế tạo đợc theo phơng pháp điện hóa có thành phần HA 80%, có kích thớc tinh thể từ 25 - 60nm H¹t gèm hydroxy apatite cÊy vào mô sau 12 tuần có biểu 29 dung nạp thể thỏ thí nghiệm: không làm thay đổi số huyết học hoá sinh, nơi cấy không thấy biểu phản ứng loại bỏ vật liệu Hạt gốm đợc bao phủ mô liên kết- mạch, kích thớc hạt gốm nhỏ dần; số lợng tế bào viêm giảm dần mô xung quanh hạt gốm Tại ổ khuyết xơng đùi chó, mảnh ghép HA không làm biến đổi cấu trúc bình thờng mô xơng chủ, tồn gắn kết chặt chẽ với mô xơng chủ theo thời gian thí nghiệm Tính dẫn xơng HA đà thể rõ hình ảnh xơng sinh từ mô xơng chủ phát triển dần vào mảnh ghép Không thấy khác biệt kết nghiên cứu hạt gốm HAV Viện CNXH chế tạo mẫu thơng phẩm hạt gốm HA h·ng Fine Ceramica cđa Italia chÕ t¹o (ký hiƯu lµ HAI) 30