TIỂU LUẬN PHƯƠNG PHÁP NGHIEN CỨU KHOA HỌC

1 Môn: Nghiên cứu khoa học ĐỀ XUẤT Ý TƯỞNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Tên đề tài: ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ HOÁ XẠ TRỊ ĐỒNG THỜI TRIỆT CĂN UNG THƯ CỔ TỬ CUNG GIAI ĐOẠN IIB – IVA TẠI BỆNH VIỆN UNG BƯỚU NGHỆ AN Họ tên học viên: Nguyễn Văn Tiến STT: 73 Mã học viên: 7052900534 Lớp: Nghệ An MỤC LỤC Contents ĐẶT VẤN ĐỀ .2 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM GIẢI PHẪU TỬ CUNG 1.1.1 Hình thể ngồi 1.1.2 Bạch huyết 1.2 YẾU TỐ NGUY CƠ MẮC UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 1.2.1 Human Papilloma Virus (HPV) 1.2.2 Các yếu tố nguy khác 1.3 GIẢI PHẪU BỆNH 1.3.1 Đại thể .4 1.3.2 Vi thể .4 1.4 TIẾN TRIỂN TỰ NHIÊN CỦA UNG THƯ CỔ TỬ CUNG .6 1.5 CHẨN ĐOÁN UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 1.5.1 Chẩn đoán xác định 1.5.2 Xét nghiệm cận lâm sàng bổ sung 1.5.3 Chẩn đoán giai đoạn .10 1.6 ĐIỀU TRỊ UNG THƯ CỔ TỬ CUNG .13 1.6.1 Điều trị ung thư cổ tử cung giai đoạn chỗ (IN SITU) 13 1.6.2 Điều trị UTCTC giai đoạn FIGO I 13 1.6.3 Điều trị UTCTC giai đoạn IIA 15 1.6.4 Điều trị UTCTC giai đoạn IIB-IVA .15 1.6.5 Điều trị UTCTC giai đoạn IVB 15 1.7 PHÁC ĐỒ HÓA XẠ TRỊ ĐỒNG THỜI TRONG UTCTC .15 1.7.1 Xạ trị .15 1.7.2 Hóa trị với Cisplatin .20 1.8 ĐIỀU TRỊ ĐÍCH 21 1.9 ĐỘC TÍNH TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ CTC BẰNG HÓA XẠ TRỊ ĐỒNG THỜI .21 1.10 MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 23 Chương 28 2.1 Đối tượng nghiêncứu 28 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnhnhân .28 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 28 2.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu 28 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 29 2.3.2 Cỡ mẫu nghiêncứu 29 2.3.3 Phương pháp thu thập sốliệu 29 2.3.4 Phương tiện nghiêncứu 29 2.3 CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH 29 Quy trình theo dõi: 35  Đánh giá kết điềutrị 35  Hướng xử trí tiếp theo: 36  Đánh giá tác dụng không mong muốn (độc tính) hóa xạ trị triệtcăn: 36 2.4 THU THẬP VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 38 2.4.1 Thu thập số liệu .38 2.4.2 Xử lý số liệu 38 2.3.5 Đạo đức nghiêncứu .38 CHƯƠNG 41 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 41 3.1 ĐẶC ĐIỂM BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU 41 3.1.1 Tuổi .41 3.1.2 Triệu chứng lâm sàng xuất thời gian đến nhập viện 41 3.1.3 Đặc điểm đại thể, vi thể 42 3.1.4 Giai đoạn bệnh di hạch vùng .43 3.1.5 Đặc điểm kỹ thuật xạ trị 44 3.2 KẾT QUẢ ĐIỀU TRỊ 45 3.2.1 Kết gần (Sau kết thúc trình điều trị) 45 3.3 ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG KHƠNG MONG MUỐN 48 3.3.1 Độc tính hệ tạo huyết gan, thận 48 3.3.2 Biến chứng muộn xạ trị 54 CHƯƠNG 55 BÀN LUẬN 55 4.1 ĐẶC ĐIỂM BỆNH NHÂN NGHIÊN CÚU .55 4.1.1 Tuổi .55 4.1.2 Triệu chứng lâm sàng xuất thời gian đến nhập viện 56 4.1.3 Đặc điểm đại thể, vi thể 56 4.1.4 Giai đoạn bệnh tình trạng di hạch vùng .57 4.1.5 Nguồn xạ liều xạ 59 4.2 KẾT QUẢ ĐIỀU TRỊ 59 4.2.1 Kết gần 60 4.3 TÁC DỤNG KHÔNG MONG MUỐN 62 4.3.1 Tác dụng không mong muốn gan, thận hệ tạo huyết 62 KẾT LUẬN 65 KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 85 PHỤ LỤC .98 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại giai đoạn bệnh theo FIGO 2009 TNM 13 Bảng 3.1: Thời gian từ có triệu chứng đến nhập viện 48 Bảng 3.2: Hình thái đại thể vi thể u nguyên phát 49 Bảng 3.3: Phân loại di hạch vùng theo giai đoạn bệnh 50 Bảng 3.4: Loại nguồn xạ xạ tiểu khung 50 Bảng 3.5: Đáp ứng theo thời gian từ có triệu chứng đến nhập viện 52 Bảng 3.6: Đáp ứng với điều trị theo thể giải phẫu bệnh 52 Bảng 3.7: Đáp ứng với điều trị theo tình trạng di hạch 53 Bảng 3.8: Đáp ứng với điều trị theo giai đoạn bệnh 53 Bảng 3.9: Sống thêm toàn 54 Bảng 3.10: Sống thêm toàn theo đáp ứng 55 Bảng 3.11: Sống thêm tồn theo tình trạng di hạch 56 Bảng 3.12: Phân loại tái phát di bệnh nhân 57 Bảng 3.13: Độc tính chung hệ tạo huyết, gan thận 58 Bảng 3.14: Mức độ hạ bạch cầu theo lần điều trị hóa chất 59 Bảng 3.15: Mức độ hạ bạch cầu trung tính theo lần điều trị hóa chất 60 Bảng 3.16: Mức độ hạ huyết sắc tố theo lần điều trị hóa chất 61 Bảng 3.17: Mức độ hạ tiểu cầu theo lần điều trị hóa chất 62 Bảng 3.18: Mức độ độc tính gan theo lần điều trị hóa chất 63 Bảng 3.19: Mức độ độc tính thận theo lần điều trị hóa chất 63 Bảng 3.20: Phân độ biến chứng muộn hệ tiêu hóa 64 Bảng 3.21: Phân độ biến chứng muộn bàng quang 65 Bảng 4.1: Giai đoạn bệnh bệnh nhân theo số nghiên cứu 68 Bảng 4.2: Tỉ lệ sống thêm toàn theo số nghiên cứu 74 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Phân bố đối tượng nghiên cứu theo nhóm tuổi 47 Biểu đồ 3.2: Phân bố đối tượng nghiên cứu theo triệu chứng lâm sàng 48 Biểu đồ 3.3: Tỉ lệ giai đoạn bệnh 49 Biểu đồ 3.4: Tỉ lệ đáp ứng với điều trị 51 Biểu đồ 3.5: Tỉ lệ bệnh nhân tử vong 54 Biểu đồ 3.6: Xác suất sống thêm tích lũy theo thời gian 55 Biểu đồ 3.7: Sống thêm toàn theo đáp ứng 56 Biểu đồ 3.8: Sống thêm tồn theo tình trạng di hạch 57 Biểu đồ 3.9: Sự thay đổi độ hạ bạch cầu theo lần điều trị hóa chất 59 Biểu đồ 3.10: Sự thay đổi độ hạ bạch cầu trung tính theo lần điều trị hóa chất 60 Biểu đồ 3.11: Sự thay đổi độ hạ huyết sắc tố theo lần điều trị hóa chất 61 Biểu đồ 3.12: Sự thay đổi độ hạ tiểu cầu theo lần điều trị hóa chất 62 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Vị trí giải phẫu nhóm hạch chậu 05 Hình 1.2: Phân loại giai đoạn ung thư cổ tử cung theo FIGO 16 Hình 1.3: Các thể tích cần tia xạ 20 Hình 1.4: Cách xác định điểm A 23 Hình 2.1: Kỹ thuật viên thiết lập tư cho bệnh nhân 38 Hình 2.2: Dụng cụ xạ áp sát vị trí đặt dụng cụ 40 Hình 2.3: Minh họa bệnh nhân xạ trị áp sát 41 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AJCC ASCO BN American Joint Committee on Cancer (Ủy ban liên Mỹ Ung thư) American Society of Clinical Oncology (Hội Ung thư học lâm sàng Mỹ) Bệnh nhân CIN Cervical Intraepithelial Neoplasia (Tân sản nội biểu mô cổ tử cung) CS Cộng CTC Cổ tử cung CTCAE Common Terminology Criteria for Adverse Events (Tiêu chuẩn thuật ngữ chung cho biến cố bất lợi) CTV Clinical Target Volume (Thể tích bia lâm sàng) CT Sim Computed Tomography Simulator (Máy CT mô phỏng) DFS Disease Free Survival (Sống thêm không bệnh) ĐƯHT Đáp ứng hoàn toàn ĐƯMP Đáp ứng phần ĐKLN Đường kính lớn FIGO Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique (Hiệp hội sản phụ khoa quốc tế) GTV Gross Tumor Volume (Thể tích khối u thơ) HDR High Dose Rate (Suất liều cao) HMMD Hóa mơ miễn dịch HPV LEEP LDR LRC LVSI Human Papilloma Virus - Virus sinh u nhú người Loop electrosurgical excision procedure (Khoét chóp vòng dao điện) Low Dose Rate (Suất liều thấp) Local Regional Control (Kiểm soát chỗ vùng) Lymphovascular Space Involvement (Xâm lấn khoang mạch bạch huyết) MRI Magnetic Resonance Imaging (Cộng hưởng từ) OS Overall Survival (Sống thêm toàn bộ) PAP PCR Papanicolaou PTV RECIST SCC UICC Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) Planning Target Volume (Thể tích bia lập kế hoạch) Response Evaluation Criteria In Solid Tumors (Tiêu chuẩn đánh giá đáp ứng cho khối u đặc) Squamous cell carcinoma (Ung thư biểu mô tế bào vảy) Union for International Cancer Control (Hiệp Hội Phòng chống Ung thư Quốc tế) UTBM Ung thư biểu mô UTCTC Ung thư cổ tử cung WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế giới) 10 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo số liệu Globocan, năm 2020 giới có 604.127 trường hợp mắc 311.365 trường hợp tử vong ung thư cổ tử cung, xếp thứ số trường hợp ung thư mắc thứ số ca tử vong liên quan đến ung thư phụ nữ Ung thư cổ tử cung đứng thứ tỉ lệ mắc tỉ lệ tử vong sau ung thư vú quốc gia có số HDI thấp (Human Development Index- Chỉ số phát triển người) Tại Việt Nam, theo ước tính năm 2018, số ca mắc ung thư cổ tử cung 4.177 trường hợp, số ca tử vong 2.420 trường hợp xếp thứ 101 Thời kì năm cuối kỷ 19 đầu kỷ 20 ung thư cổ tử cung điều trị phẫu thuật đơn Xạ trị ứng dụng điều trị phối hợp ung thư cổ tử cung Mỹ với việc sử dụng Radium 226 lần vào năm 19132 Phương pháp xạ trị cổ điển thay đổi qua nhiều năm, nhằm tăng hiệu điều trị giảm biến chứng phóng xạ điều trị, cải thiện mặt an toàn xạ Ngày kỹ thuật xạ trị áp sát suất liều cao sử dụng nguồn Iridium 192 ứng dụng rộng rãi trung tâm xạ trị giới Điều trị ung thư cổ tử cung giai đoạn sớm (IA1, IA2, IB1 IIA1) chủ yếu phẫu thuật lẽ tỉ lệ kiểm soát bệnh cao tác dụng không mong muốn thấp Phẫu thuật ưu việt xạ trị chủ yếu phẫu thuật giúp bảo tồn buồng trứng chức tình dục phụ nữ trẻ tuổi, yếu tố giúp cải thiện chất lượng sống bệnh nhân tránh mãn kinh sớm Đối với ung thư cổ tử cung giai đoạn tiến triển chỗ vùng (IB2, IIA2, IIB – IVA) phác đồ điều trị chuẩn hóa xạ trị đồng thời, vai trị hóa chất đồng thời với xạ trị nhằm mục đích làm tăng độ nhạy cảm u với xạ trị, đồng thời có tác dụng tiêu diệt tổn thương vi di căn4,5 Ung thư cổ tử cung giai đoạn IIB - IVA có đặc điểm khối u có kích thước lớn, xâm lấn rộng, xâm lấn hạch quan lân cận Tại Nghệ An đến chưa có nghiên cứu kết điều trị nhóm bệnh 14  Hạch chậu nhận bạch huyết dẫn lưu từ hạch bẹn, phần lớn bạch huyết tử cung bàng quang, bạch huyết phần thành bụng tương ứng với vùng cấp máu mạch thượng vị mạch mũ chậu sâu, bạch huyết phần đùi tương ứng với vùng cấp máu mạch bịt  Hạch chậu trong: Có từ tới 10 hạch, nằm dọc động mạch chậu trong, vị trí mà động mạch chia nhánh Những hạch phía sau nằm dọc theo động mạch bên Hình 1.1: Vị trí giải phẫu nhóm hạch chậu  Hạch chậu nhận bạch huyết từ tạng chậu, mông đùi sau  Hạch chậu dẫn lưu bạch huyết chủ yếu tới hạch chậu chung, phần tới hạch chậu  Hạch chậu chung: Hạch chậu chung chia làm nhóm: - Nhóm ngồi: nằm ngồi động mạch, nằm động mạch chậu chung thắt lưng, có hạch - Nhóm giữa: nằm sau tĩnh mạch, có hạch 15 - Nhóm trong: nằm động mạch, vị trí chia đơi động mạch chủ, phía trước tĩnh mạch chậu chung trái, nhóm cịn gọi nhóm ụ nhơ  Hạch chậu chung nhận bạch huyết từ hạch chậu hạch chậu trong, từ ụ nhô, tử cung âm đạo  Hạch chậu chung dẫn lưu bạch huyết hạch cạnh động mạch chủ 1.2 YẾU TỐ NGUY CƠ MẮC UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 1.2.1 Human Papilloma Virus (HPV) Có nhiều chứng cho thấy có liên quan UTCTC nhiễm HPV Nhiễm HPV coi nguyên nhân gây 95% trường hợp UTCTC Các virus liên quan đến ung thư bao gồm bốn phân típ nguy cao (16, 18, 31 45), chín phân típ nguy trung bình (33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 59 68) 75% ung thư cổ tử cung nhiễm HPV-16, 18, 31 45 Nhiễm HPV bắt đầu virus xâm nhập vào tế bào đáy biểu mô vảy bề mặt thông qua chấn thương nhỏ hay trình sinh hoạt tình dục7 Những tổn thương nhìn thấy lâm sàng thường gặp HPV hệ thống sinh dục nữ mụn cơm sinh dục mụn cơm hoa liễu (condylomata acuminata) Điển hình, tổn thương phát triển dạng u nhú, nhiều ổ, giới hạn rõ âm hộ, miệng âm đạo, tầng sinh mơn, hậu mơn thấy cổ tử cung Hầu hết nhiễm HPV cổ tử cung chẩn đoán PCR phương pháp chẩn đoán phát axit nucleic thoáng qua Tỉ lệ phụ nữ virus tăng nhóm tuổi trẻ khoảng cách lần lấy mẫu kéo dài, nhiễm HPV nhóm nguy thấp8 Vac-xin phịng ung thư cổ tử cung Hiện nay, có số vac-xin bào chế để tiêm chủng, phòng số typ HPV, đặc biệt typ 16 18 typ đóng vai trị quan trọng bệnh sinh 70% UTCTC Gardasil, Cervarix9 16 1.2.2 Các yếu tố nguy khác Ung thư CTC ung thư gây nhiều yếu tố phức hợp, yếu tố chủ yếu nhiễm HPV, người ta kể đến yếu tố nguy khác như: hành vi tình dục (sinh hoạt sớm, nhiều bạn tình), nhiễm trùng, nhiễm herpes virus, trạng thái suy giảm nhiễm dịch, hút thuốc lá, dinh dưỡng10 1.3 GIẢI PHẪU BỆNH Trên đại thể phát tổn thương ung thư CTC xâm lấn, ung thư CTC chỗ vi xâm lấn phát vi thể 1.3.1 Đại thể Ung thư CTC xâm lấn, có hình thái sau11: - Thể sùi - Thể loét - Thể loét - sùi 1.3.2 Vi thể Áp dụng theo phân loại mô bệnh học ung thư cổ tử cung WHO năm 2003 kèm theo mã bệnh ICD-O (International Code of Disease for Oncology) 12 Trong có số type gặp nghiên cứu: Típ mơ bệnh học Mã Các u tế bào vẩy Ung thư tế bào vẩy nói chung 8070/3 Ung thư tế bào vẩy sừng hố 8071/3 Ung thư tế bào vẩy khơng sừng hố 8072/3 Các u tuyến Ung thư biểu mơ tuyến 8140/3 17 Các u biểu mô khác Ung thư biểu mô tuyến vảy 8560/3 Ung thư biểu mô không biệt hoá 8020/3 1.4 TIẾN TRIỂN TỰ NHIÊN CỦA UNG THƯ CỔ TỬ CUNG * Quá trình tiến triển Với phát triển nghiên cứu tế bào học mô bệnh học, tiến triển tự nhiên ung thư CTC hiểu rõ Diễn biến loại tổn thương thường tổn thương lộ tuyến CTC Các biểu mô tuyến xuất lỗ CTC bị dị sản, tác dụng pH axít âm đạo, tác dụng khác như: virus, vi khuẩn, dị sản biệt hố thành biểu mơ vẩy thành tổn thương loạn sản13 Sự phát triển xâm nhập ung thư CTC từ giai đoạn vi xâm nhập tới xâm nhập vùng tiểu khung xâm nhập ngồi tiểu khung nhanh chậm tuỳ trường hợp q trình nặng dần có quy luật theo giai đoạn Trong thực tế lâm sàng người ta không gặp bệnh ung thư CTC lan tràn toàn thân lập tức14,15 Ung thư CTC sau thời gian dài đến tiến triển vùng tiểu khung sau tiến triển vượt ngồi vùng tiểu khung coi giai đoạn muộn Tại vùng tiểu khung ung thư tiến triển theo hình thức nặng dần Tổ chức ung thư lúc đầu xâm nhập mạch bạch huyết, tĩnh mạch sau lan tổ chức xung quanh16,17 * Xâm lấn Xâm lấn theo chiều sâu Xâm lấn cấu trúc CTC, chiếm 1/3 trong, đến 1/3 giữa, 1/3 ngồi Tuy nhiên, ung thư có kích thước đến cm mà xâm lấn giới hạn CTC 18 Xâm lấn âm đạo Ung thư từ cổ tử cung xâm lấn đồ, xâm lấn âm đạo đến 1/3 âm đạo tổ chức xung quanh Sự xâm lấn trực tiếp (hay gặp nhất) qua đường bạch huyết Xâm lấn trước sau Xâm lấn trước vào bàng quang, niệu đạo Đây xâm lấn xảy tương đối sớm cho dù giải phẫu học bàng quang CTC có mạc bàng quang - âm đạo ngăn cách Xâm lấn sau vào trực tràng, niệu quản thường xảy muộn hơn18 Xâm lấn bàng quang thường xâm lấn trực tiếp xâm lấn trực tràng niệu quản thường xâm lấn qua đường bạch huyết Xâm lấn thân tử cung Xâm lấn thân tử cung vòi trứng gặp Xâm lấn tổ chức xung quanh Xâm lấn tổ chức xung quanh (parametre) thường theo đường bạch huyết, gặp xâm lấn trực tiếp qua đường sợi thần kinh Tổ chức ung thư thường nằm tổ chức đệm (40%) mạch máu (40%) Từ parametre ung thư tiến triển xâm lấn thành xương tiểu khung 19 * Di ung thư cổ tử cung Di hạch Di hạch ung thư CTC thường theo thân bạch huyết19: - Thân bạch huyết chậu - Thân bạch huyết chậu hay hạ vị - Thân sau Di xa - Di phổi - Di xương: xương chậu, cột sống lưng, chi Di cột sống lưng thường theo đường bạch huyết - Di ổ bụng: di gan, di phúc mạc, ống tiêu hoá - Di thận, tuyến nội tiết, tuỵ, túi mật, tim, da, não * Tử vong Tử vong chủ yếu urê huyết cao nguyên nhân chèn ép niệu quản Cũng tử vong di phổi, viêm phúc mạc thủng ruột, chảy máu 1.5 CHẨN ĐOÁN UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 1.5.1 Chẩn đoán xác định  Cơ Ra máu âm đạo bất thường triệu chứng hay gặp nhất, thường máu sau giao hợp, sau thụt rửa âm đạo, máu tự nhiên kì kinh, hay máu sau mãn kinh Triệu chứng thứ hai dịch nhầy âm đạo màu vàng nhạt nhầy máu, đặc biệt bệnh nhân có tổn thương hoại tử nhiều Một số bệnh nhân có biểu đau vùng thắt lưng vùng mơng, triệu chứng liên quan tới hạch chậu hạch cạnh động mạch chủ chèn ép vào rễ thần kinh Đau triệu chứng gặp ung thư cổ tử cung giai 20 đoạn sớm, tồn bệnh lý khác Ngồi ra, cịn số triệu chứng tiết niệu, tiêu hóa đái máu, ngồi máu xuất ung thư xâm lấn vào bàng quang trực tràng, bệnh giai đoạn muộn  Toàn thân Bệnh nhân có thiếu máu, mệt mỏi máu dai dẳng kéo dài có nguyên nhân khác phối hợp Gầy sút cân gặp bệnh tiến triển muộn Lưu ý khám hạch ngoại vi: hạch bẹn, hạch thượng đòn  Khám thực thể sinh thiết cổ tử cung Trường hợp u rõ, thấy khối sùi loét, thâm nhiễm cổ tử cung, chảy máu tự nhiên chạm vào U thể exophytic phát triển ngoài, lồi vào âm đạo, dễ thấy dễ nhận định kích thước u, đánh giá u xâm lấn âm đạo hay chưa Những u thể endophytic phát triển chủ yếu vào trong, số trường hợp thấy u lấp ló lỗ ngồi, số khác biểu cổ vết loét sần Song cổ ngồi hồn tồn nhẵn, quan sát khơng thấy tổn thương, u to thấy cổ tử cung to bình thường, thăm âm đạo thấy cổ tử cung cứng Những trường hợp khơng nhận định kích thước u mà nhận định kích thước cổ tử cung Lưu ý trường hợp u có biểu cổ vết loét sần, phần u chìm bên có kích thước lớn nhiều so với kích thước vết loét Sinh thiết u để có chứng giải phẫu bệnh Trường hợp nghĩ tới u thể endophytic mà không quan sát thấy tổn thương cổ cần nạo ống cổ tử cung để lấy bệnh phẩm Thăm trực tràng đánh giá parametre thành trực tràng Càng có chương trình tầm sốt tốt, khả phát ung thư cổ tử cung giai đoạn sớm cao Với kết xét nghiệm tế bào bất thường, ung thư cổ tử cung cần tiếp tục tìm kiếm Có tổn thương nghi ngờ quan sát mắt thường hay soi cổ tử cung, sau test acid acetic test lugol