(Luận văn) phân lập tuyển chọn các chủng của bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao làm cơ sở cho việc chế tạo chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN VĂN HIỆU Tên đề tài: lu “PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG CỦA BACILLUS SUBTILIS an CÓ KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CAO LÀM CƠ SỞ CHO VIỆC CHẾ va n TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG CHĂN NUÔI” p ie gh tn to KHÓA LUẬN THỰC TẬP TỐT NGHIỆP d oa nl w nv a lu Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : CNSH Lớp : 42 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2010 - 2014 Giảng viên hương dẫn : GS.TS Nguyễn Quang Tuyên TS Nguyễn Văn Duy an ll fu oi m at nh z z gm @ l.c om an Lu Thái nguyên - 2014 n va ac th si LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu để hồn thành khóa luận tốt nghiệp nhận hướng dẫn, giúp đỡ động viên thầy cơ, bạn bè gia đình Nhân dịp hồn thành khóa luận tốt nghiệp Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS TS Nguyễn Quang Tuyên – Viện khoa học sống – ĐH Thái Nguyên trực tiếp hướng dẫn, bảo tơi suốt q trình thực hồn thành khóa luận lu Xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Văn Duy - Khoa CNSH & CNTP - an n va Đại học Nông Lâm Thái Nguyên cán môn Vi sinh vật Khoa CNSH & CNTP Đại học Nông Lâm Thái Nguyên nhiệt tình giúp đỡ p ie gh tn to bảo Xin chân thành cảm ơn ThS Đỗ Bích Duệ tất cán phịng thí w nghiệm – Viện khoa học sống – Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện d oa nl giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô, bạn bè giúp đỡ động viên a lu suốt q trinh hồn thành khóa luận nv an Lời cảm ơn sâu sắc xin dành cho gia đình người thân yêu ll fu Em xin chân thành cảm ơn! m oi Thái Nguyên, tháng năm 2014 at nh Sinh viên z z gm @ Nguyễn Văn Hiệu l.c om an Lu n va ac th si DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Các phản ứng sinh hóa Bacillus subtilis Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 14 Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 15 Bảng 3.3: Thành phần môi trường MPA dạng thạch 16 Bảng 3.4: Mơi trường định tính khả sinh tổng hợp protease [19],[30] 16 Bảng 3.5: Môi trường thử hoạt tính enzyme protease [24] 16 lu an Bảng 3.6: Môi trường lên men đường maltose 16 n va Bảng 3.7: Môi trường Simmons Citrate Agar 17 p ie gh tn to Bảng 3.8: Môi trường khử nitrate 17 Bảng 3.9: Mơi trường lịng đỏ trứng 17 Bảng 3.10: Môi trường Clark Lubs 18 w Bảng 4.1 Kết phân lập vi khuẩn nghi ngờ Bacillus subtilis từ mẫu đất 28 d oa nl Bảng 4.2: Kết thử phản ứng sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập 33 Bảng 4.3 : Kết đo bán kính vịng phân giải casein 10 chủng vi a lu nv khuẩn phân lập (mm) 36 an Bảng 4.4 : Kết đo tốc độ sinh trưởng hoạt độ protease chủng 37 fu ll Bảng 4.5: Kết thí nghiệm ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên sinh m oi trưởng sinh tổng hợp enzyme protease vi khuẩn KTC1 38 nh at Bảng 4.6: Kết thí nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ lên khả sinh z z trưởng sinh tổng hợp protease vi khuẩn KTC1 40 @ gm Bảng 4.7: Kết thí nghiệm ảnh hưởng pH đến sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme protease KTC1 41 l.c om an Lu n va ac th si DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Vi khuẩn Bacillus subtilis Hình 4.1 : Đồ thị đường chuẩn Tyrosine 26 Hình Hình thái khuẩn lạc tế bào vi khuẩn phân lập 32 Hình 4.2 Kết phản ứng sinh hóa xác định Bacillus subtilis 34 Hình 4.3 : Vòng phân giải casein chủng KTB2, KTB4, KTC1 36 Hình 4.4 : Đồ thị biểu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên sinh lu trưởng sinh tổng hợp enzyme protease vi khuẩn KTC1 39 an Hình 4.5: Đồ thị biểu ảnh hưởng nhiệt độ lên khả sinh va n trưởng sinh tổng hợp protease vi khuẩn KTC1 40 p ie gh tn to Hình 4.6: Đồ thị biểu ảnh hưởng pH đến sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme protease KTC1 42 d oa nl w nv a lu an ll fu oi m at nh z z gm @ l.c om an Lu n va ac th si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT THUẬT NGỮ VIẾT TẮT DIỄN GIẢI H MPA Malt-Peptone-Agar OD Optical Density VSV Vi sinh vật lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nv a lu an ll fu oi m at nh z z gm @ l.c om an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa đề tài 2.1 Sơ lược vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.1 Lịch sử phát 2.1.2 Đặc điểm phân loại phân bố vi khuẩn Bacillus subtilis lu an 2.1.3 Đặc điểm hình thái n va 2.1.4 Đặc điểm nuôi cấy p ie gh tn to 2.1.5 Đặc điểm sinh hoá 2.1.6 Bào tử khả tạo bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 2.2 Giới thiệu enzyme protease w 2.2.1 Tổng quan enzyme Protease 2.2.2 Phân loại đặc điểm protease d oa nl 2.2.3 Chức sinh học protease vi sinh vật a lu 2.2.4 Tính ưu việt ứng dụng protease vi sinh vật nv 2.2.5 Những nghiên cứu phân lập, tuyển chon, thu nhận enzyme protease an từ Bacillus nói chung Bacillus subtilis nói riêng 12 fu ll PHẦN ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP m oi NGHIÊN CỨU 14 at nh 3.1 Đối tượng khảo sát 14 z 3.2 Thời gian địa điểm thực đề tài 14 z @ 3.2.1 Thời gian : 23/12/2013 – 31/5/2014 14 gm 3.2.2 Địa điểm 14 3.3 Hóa chất thiết bị sử dụng 14 l.c om 3.3.1 Hóa chất 14 Lu 3.3.2 Thiết bị dụng cụ 14 an 3.3.3 Môi trường sử dụng 15 n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 3.4 Nội dung nghiên cứu 18 3.5 Phương pháp thực đề tài 19 3.5.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 19 3.5.2 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính protease cao 23 3.5.3 Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường lên khả sinh trưởng tạo enzyme chủng vi khuẩn 27 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 4.1 Kết phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ mẫu đất 28 4.1.1 Kết phân lập vi khuẩn nghi ngờ Bacillus subtilis từ mẫu lu đất 28 an 4.1.2 Kết khảo sát đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn nghi ngờ n va Bacillus subtilis 32 p ie gh tn to 4.2 Kết tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả tổng hợp protease 35 4.2.1 Kết khảo sát vòng phân giải 10 chủng phân lập 35 w 4.2.2 Kết khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme protease d oa nl chủng KTB2, KTB4, KTC1 37 4.3 Kết nghiên cứu điều kiện môi trường ảnh hưởng đến sinh tổng a lu hợp enzyme prorease vi khuẩn KTC1 38 nv an 4.3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh ll fu trưởng sinh tổng hợp enzyme protease chủng vi khuẩn KTC1 38 oi m 4.3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy lên khả sinh nh trưởng sinh tổng hợp enzyme protease chủng vi khuẩn KTC1 39 at 4.3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường lên khả z z sinh trưởng tạo enzyme chủng vi khuẩn KTC1 41 @ gm PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 5.1 Kết luận 43 l.c om 5.2 Kiến nghị 43 an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, kinh tế ngày phát triển với tiến khoa học làm cho sống người có nhiều thay đổi lớn Càng ngày đời sống vật chất cao, nhu cầu chất lượng sản phẩm tăng cao đòi hỏi nhà sản xuất phải nâng cao chất lượng sản phẩm để đáp ứng nhu cầu người tiêu dùng Với mục đích bảo vệ sức khỏe cho người sử dụng sản phẩm chăn lu nuôi, bảo vệ môi trường sống không bị ô nhiễm hoá chất độc hại, người ta an n va hạn chế cấm sử dụng số loại thuốc, đặc biệt thuốc kháng sinh thay p ie gh tn to thuốc kháng sinh chế phẩm sinh học Chế phẩm sinh học dạng thức ăn bổ sung vi sinh vật sống, có tác động có lợi đến động vật thơng qua việc cải tiến cân vi sinh vật đường ruột Tác dụng chế phẩm sinh học làm tăng w khả tiêu hoá nhờ hệ thống enzyme, tổng hợp vitamin nhóm B vitamin K manh tràng đại tràng, trung hoà độc tố ruột, khử độc phân huỷ số chất có d oa nl độc tính [11] Protease nhóm enzyme sử dụng rộng rãi chế phẩm sinh a lu học Người ta thu enzyme protease từ nhiều nguồn khác động vật, nv thực vật vi sinh vật Tuy nhiên thu enzyme từ thể động vật hay thực vật an khó khăn tốn thường phải phá bỏ tổ chức để thu enzyme trình bảo fu ll quản phức tạp Trong vi sinh vật đặc biệt vi khuẩn có chứa m oi nhiều loại enzyme có hoạt tính cao Chúng lại có khả chuyển hóa chất nh at sinh sản nhanh, nguồn nguyên liệu nuôi cấy vi khuẩn lại thường rẻ tiền, người ta có z thể dể dàng điều khiển tổng hợp enzyme từ nguồn nguyên liệu khác z gm @ [12] Vì vi sinh vật nguồn thu enzyme tiềm Trong nguồn thu l.c protease từ vi sinh vật có nhiều triển vọng việc thu protease từ vi khuẩn Bacillus om subtilis lồi vi khuẩn phổ biến dễ phân lập, thu enzyme enzyme thường có an Lu hoạt tính cao có nhiều ưu hẳn [7] n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 Từ thực tế trên, tiến hành thực đề tài : “Phân lập tuyển chọn chủng Bacillus subtilis có khả sinh protease cao làm sở cho việc chế tạo chế phẩm sinh học dùng chăn nuôi” 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Phân lập tuyển chọn chủng Bacillus subtilis có khả sinh protease làm sở cho việc chế tạo chế phẩm sinh học dùng chăn nuôi 1.3 Ý nghĩa đề tài - Ý nghĩa khoa học Phân lập loài vi khuẩn Bacilussubtilis từ đất, tuyển chọn chủng có lu an khả sinh protease Biết hiểu rõ thoa tác kĩ thuật thông n va số quy trình cơng nghệ q trình thực đề tài p ie gh tn to - Ý nghĩa thực tiễn + Làm tiền đề cho việc sản xuất chế phẩm sinh học, đáp ứng yêu cầu cao ngành chăn nuôi d oa nl w nv a lu an ll fu oi m at nh z z gm @ l.c om an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.1 Lịch sử phát Bacillus subtilis phát phân ngựa vào năm 1941 tổ chức y học Nazi Đức Lúc đầu sử dụng chủ yếu để phòng bệnh lỵ cho binh sĩ Đức chiến đấu Bắc Phi Việc điều trị phải đợi đến năm 1949 1957, Henrry cộng tách chủng khiết Bacillus subtilis Từ “subtilis therapy” có nghĩa "thuốc subtilis" đời trị chứng viêm ruột, lu viêm đại tràng, chống tiêu chảy rối loạn tiêu hoá Ngày nay, vi khuẩn an n va trở nên phổ biến, sử dụng rộng rãi y học, chăn nuôi, thực phẩm [9] p ie gh tn to 2.1.2 Đặc điểm phân loại phân bố vi khuẩn Bacillus subtilis - Đặc điểm phân loại: Theo Vũ Thị Thứ, (1996) [19] Bacillus subtilis thuộc: w Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae d oa nl Giống: Bacillus nv a lu Loài: Bacillus subtilis an ll fu oi m at nh z z gm @ l.c om Hình Vi khuẩn Bacillus subtilis an Lu http://www.isciencemag.co.uk/blog/tasty-humans/attachment/bacillus-subtilis/ n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 32 khuẩn lạc nghi ngờ Hình Hình thái khuẩn lạc tế bào vi khuẩn phân lập Kết thể bảng 4.1 cho thấy: từ mẫu đất ta thu 21 chủng vi khuẩn có đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, kết nhuộm Gram lu an giống với vi khuẩn bacillus subtilis Trong mẫu đất A (06 tháng 01) lấy cổng n va trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên có chủng KTA1, KTA2, KTA3, p ie gh tn to KTA4, mẫu đất B (20 tháng 01) lấy nhà thi đấu Đại học Thái Nguyên có chủng KTB1, KTB2, KTB3, KTB4, KTB5, mẫu đất C (10 tháng 2) lấy khoa Công nghệ sinh học- Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông lâm Thái nguyên có w chủng KTC1, KTC2, KTC3, KTC4, mẫu đất D (26 tháng 2) lấy sân bóng d oa nl trường Đại học Nơng Lâm Thái Nguyên có chủng KTD1, KTD2, KTD3, a lu KTD4, mẫu đất E (07 tháng 3) lấy đồi keo sau kí túc xá A trường Đại học Nơng nv Lâm Thái Ngun có chủng KTE1, KTE2, KTE3, KTE4 an oi m Bacillus subtilis ll fu 4.1.2 Kết khảo sát đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn nghi ngờ Các phản ứng sinh hóa đặc điểm quan trọng để nhận dạng vi khuẩn Bacillus nh at subtilis Bacillus subtilis có phản ứng sinh hóa riêng biệt để phân biệt với z z lồi vi khuẩn khác Chúng tơi tiến hành thử nghiệm phản ứng sinh hóa 21 @ gm chủng vi khuẩn nghi ngờ thu kết bảng sau: l.c om an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 33 Bảng 4.2: Kết thử phản ứng sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập Các phản ứng sinh hóa Chủng Nitrate Citrate MR – VP Maltose KTA1 + - + + + + KTA2 + - + + + + KTA3 + - + + + + KTA4 + - + + + + KTB1 + - + + + + KTB2 + - + + + + KTB3 + - + + + + KTB4 p ie gh tn to + - + + + + KTB5 + - + + + + KTC1 + - + + + + KTC2 + - + - + + KTC3 + d oa nl - + + - + KTC4 + - + + - + KTD1 + - + + - + KTD2 + fu + - + + KTD3 + - + - + + KTD4 + - + - + + KTE1 + - at - + + KTE2 + - + + - - KTE3 + - + + gm - - KTE4 + - + + - - an n va nv a lu Lecithinase w Catalase lu phân lập an - ll oi m nh z @ l.c om an Lu (-) phản ứng âm tính z Ghi chú: (+) phản ứng dương tính + n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 34 Lecithinase (-) Lecithinase (+) MR(-) VP(-) MR(+) VP(+) lu an n va Citrate (-) p ie gh tn to Citrate (+) Catalase(+) Catalase(-) d oa nl w a lu Đối chứng Nitrate (+) Nitrate (-) Maltose (+) Maltose (-) nv an ll fu Hình 4.2 Kết phản ứng sinh hóa xác định Bacillus subtilis oi m Từ bảng kết cho thấy: sau thử phản ứng sinh hóa 21 chủng nghi nh ngờ Bacillus subtilis thu kết tất chúng có phản ứng catalase dương tính, at phản ứng lecithinase âm tính, có khả phân giải nitrate, 16/21(76,2%) chủng có khả z z phân giải citrate, chủng khơng có khả phân giải citrate KTC2, KTD2, @ gm KTD3, KTD4, KTE Phản ứng MR-VP có 15/21 (71,4%) chủng cho phản ứng dương tính, chủng cho phản ứng âm tính KTC3, KTC4, KTD1, KTE2, KTE3, KTE4 Trong l.c om số 21 chủng, 18/21 (85,7%) có khả lên men đường maltose, chủng khơng có khả Lu lên men đường maltose KTE2, KTE3, KTE4 Theo Lý Kim Hữu (2005) [9] vi an khuẩn Bacillus subtilis mang đặc điểm sau: phản ứng dương tính với catalase, n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 35 nitrate, citrate, MR-VP, maltose, phản ứng âm tính với lecithinase Do số 21 chủng nghi ngờ có 10 chủng xác định Bacillus subtilis bao gồm chủng KTA1, KTA2, KTA3, KTA4 ( mẫu đất A), KTB1, KTB2, KTB3, KTB4, KTB5 (mẫu đất B), KTC1 (mẫu đất C) Theo nghiên cứu Nguyễn Thị trần Thụy (2009), số chủng Bacillus subtilis phân lập từ mẫu đất thành phố Hồ Chí minh 10 vi khuẩn mẫu phân lập Như kết phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis nơi cho thấy số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis đất nơi tương đương Tiếp tục tiến hành thí nghiệm khảo sát khả sinh protease lu an 10 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập va 4.2 Kết tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả tổng hợp protease n p ie gh tn to 4.2.1 Kết khảo sát vòng phân giải 10 chủng phân lập Khảo sát vòng phân giải dùng để xác định khả thủy phân protein chủng vi khuẩn phân lập Khả sinh Protease ngoại bào Bacillus w subtilis xác định đường kính vịng phân giải dịch nuôi cấy vi khuẩn tren môi d oa nl trường ni cấy có chứa casein (D-d) Tiến hành ni chủng Mơi trường thử hoạt tính enzyme a lu protease lỏng máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút sau 40h kể từ lúc bắt đầu cấy vi nv an khuẩn, ủ nhiệt độ phòng Ly tâm dịch mơi trường 5000 vịng/ phút 20 phút ll fu để thu dịch chiết protease ngoại bào (loại bỏ cặn dưới) Nhỏ 0.2 ml dịch ly tâm m oi lên bề mặt thạch (Môi trường thử hoạt tính enzyme protease đặc) khoang lỗ Ta at nh thu kết đo bán kính vịng phân giải 10 chủng vi khuẩn sau: z z gm @ l.c om an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 36 Bảng 4.3 : Kết đo bán kính vịng phân giải casein 10 chủng vi khuẩn phân lập (mm) Chủngvi khuẩn Vòng phân giải (D-d (mm)) KTA1 13 KTA2 11 KTA3 KTA4 19 KTB1 14 KTB2 20 KTB3 14 KTB4 20 KTB5 15 p ie gh tn to KTC1 22 lu STT an n va 10 KTB2 KTB4 d oa nl w nv a lu KTC1 an ll fu oi m nh at Hình 4.3 : Vịng phân giải casein chủng KTB2, KTB4, KTC1 z Qua bảng 4.3 ta nhận thấy : Cả 10 chủng vi khuẩn có khả tổng hợp z gm @ enzyme protease ngoại bào mức độ khác Trong chủng KTC1 có khả tổng hợp protease cao (đường kính phân giải 22mm), sau l.c chủng KTB2 KTB4 (20mm), KTA4 (19mm), KTB5 (15mm), KTB1 om KTB3 (14mm), KTA1 (13mm), KTA2 (11mm), KTA3 (8mm) có bán kính vịng Lu an phân giải lớn so với chủng cịn lại Qua đó, sơ đánh giá khả n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 37 sinh tổng hợp protease 10 chủng vi khuẩn Từ chọn chủng KTB2, KTB4, KTC1 để tiếp tục nghiên cứu khả sinh protease cách xác Theo nghiên cứu Nguyễn Thị trần Thụy (2009), chủng Bacillus subtilis phân lập từ đất vườn thành phố Hồ Chí Minh có đường kính vịng phân giải casein đo cao 20,05mm Như chủng bacillus subtilis phân lập trường Đại học Nơng Lâm Thái Ngun có đường kính vịng phân giải casein lớn có khả sinh enzyme protease cao 4.2.2 Kết khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme protease chủng KTB2, KTB4, KTC1 lu Để đánh giá xác khả tổng hợp protease chúng tơi tiến an n va hành lên men chủng vi khuẩn mơi trường thử hoạt tính protease lỏng p ie gh tn to tiến hành đo hoạt độ chủng theo phương pháp Anson [8] Tiến hành ni chủng mơi trường có casein 1% điều kiện 37oC máy lắc với tốc độ 200 vịng/ phút 48 tiếng Sau ly tâm lấy w dịch tiến hành đo hoạt độ protease theo phương pháp Anson thu kết sau: Bảng 4.4 : Kết đo tốc độ sinh trưởng hoạt độ protease chủng d oa nl OD sinh trưởng HĐP (UI/ml) KTB2 0,513 ± 0,06 1,764 ± 0,017 0,460 ± 0,06 1,496 ± 0,017 nv KTB4 a lu Chủng an 0,556 ± 0,006 1,907 ± 0,017 ll fu KTC1 m oi Theo bảng 4.4 ta thấy hoạt độ enzyme protease chủng KTC1, KTB2, nh at KTB4 1,907 (UI/ml), 1,764 (UI/ml), 1,496 (UI/ml) Chủng KTC1có hoạt z tính protease tốc độ sinh trưởng cao Nên ta lưu giữ giống KTC1 để tiếp tục z hợp enzyme protease gm @ tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường đến khả tổng l.c Theo nghiên cứu Phan Trương Hương Thảo (2009) hoạt độ enzyme om protease cao chủng Bacillus subtilis phân lập từ đất vườn thành phố Lu an Hồ Chí Minh 1,73 (UI/ml) thấp chủng KTC1, từ cho thấy chủng KTC1 có n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 38 khả tổng hợp enzyme protease cao chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ đất vườn thành phố Hồ Chí Minh 4.3 Kết nghiên cứu điều kiện môi trường ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme prorease vi khuẩn KTC1 4.3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme protease chủng vi khuẩn KTC1 Nhằm xác định thời gian thích hợp dùng để ni cấy thu sinh lượng enzyme tối đa, tiến hành nuôi vi khuẩn mơi trường cảm ứng sinh enzyme có lu chất đậu nành 4%, bổ sung CaCO3 với nồng độ 0.5 % Ni bình an máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút Sau khoảng thời gian xác định 20h, 30h, n va 36h, 40h, 44h, 48h, 52h Xác định hoạt tính protease môi trường p ie gh tn to phương pháp Anson [12] đo OD sinh trưởng bước sóng 620nm Kết thu thể bảng sau: Bảng 4.5: Kết thí nghiệm ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên sinh w trưởng sinh tổng hợp enzyme protease vi khuẩn KTC1 d oa nl Thời gian nuôi cấy nv an HĐP (UI/ml) 0,584 ± 0,002 0,836 ± 0,016 1,367 ± 0,002 1,774 ± 0,016 ll fu 30h a lu 20h OD sinh trưởng 2,026 ± 0,016 1,988 ± 0,002 oi m 36h 1,968 ± 0,002 44h 1,955 ± 0,002 48h 1,505 ± 0,002 52h 1,241 ± 0,002 2,126 ± 0,016 at nh 40h z 1,893 ± 0,016 z @ gm 1,712 ± 0,016 1,369 ± 0,016 l.c om an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 39 lu an n va p ie gh tn to Hình 4.4 : Biểu đồ biểu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme protease vi khuẩn KTC1 Sau tiến hành ly tâm thu dịch enzyme thô tiến hành khảo sát theo w phương pháp Anson thu kết bảng 4.5 hình 4.4 ta thấy sinh trưởng d oa nl hoạt độ enzyme sinh vi khuẩn KTC1 tăng dần từ 20h – 40h sau giảm dần Hoạt độ enzyme đạt cao khoảng thời gian 40h (2,126UI/ml) Vì vậy, a lu thí nghiệm sau ta chọn thời gian thích hợp để thu enzyme 40h nv an Kết hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu trước Nguyễn Thị ll fu Trần Thụy (2009) nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên sinh oi m trưởng sinh tổng hợp enzyme protease vi khuẩn Bacillus subtilis Hoạt độ at nh enzyme protease thu cao khoảng thời gian 40h z 4.3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy lên khả sinh z @ trưởng sinh tổng hợp enzyme protease chủng vi khuẩn KTC1 gm Nhiều nghiên cứu cho thấy nhờ khả sinh bào tử mà vi khuẩn Bacillus subtilis có khả sinh trưởng giới hạn nhiệt độ rộng, hầu hết l.c om vi khuẩn nhóm lồi ưa ấm với nhiệt độ dao động từ 20 – 45oC [21,22] Vì an Lu chúng tơi tiến hành thí nghiệm nhằm tìm nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng sinh enzyme vi khuẩn KTC1 khoảng nhiệt độ từ 20 – 45oC n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 40 Chủng giống nuôi 37oC, sau cấy - 2% vào mơi trường cảm ứng sinh enzyme có chất đậu nành 4%, bổ sung CaCO3 với nồng độ 0.5 % bình trụ miệng nhỏ Ni bình máy lắc nhiệt độ 27, 32, 37, 42, 47 với tốc độ 200 vòng/ phút thời gian 40h Ta thu kết bảng sau: Bảng 4.6: Kết thí nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ lên khả sinh trưởng sinh tổng hợp protease vi khuẩn KTC1 lu an n va p ie gh tn to Nhiệt độ OD sinh trưởng HĐP (UI/ml) 27oC 1,180 ± 0,002 1,643 ± 0,009 32oC 1,894 ± 0,002 2,039 ± 0,009 37oC 1,985 ± 0,002 2,206 ± 0,009 42oC 1,826 ± 0,002 2,183 ± 0,009 47oC 1,508 ± 0,002 1,797 ± 0,009 d oa nl w nv a lu an ll fu oi m at nh z z gm @ Hình 4.5: Biểu đồ biểu ảnh hưởng nhiệt độ lên khả sinh l.c trưởng sinh tổng hợp protease vi khuẩn KTC1 om Theo kết bảng 4.6 hình 4.5 ta thấy sinh trưởng hoạt độ protease Lu an vi khuẩn KTC1 đạt tối đa điều kiện nhiệt độ 37oC (2,206 UI/ml) Vì vậy, n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 41 thí nghiệm ta chọn điều kiện nhiệt độ nuôi cấy thích hợp để thu enzyme 37oC Kết hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu trước Nguyễn Thị Trần Thụy (2009) nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme protease vi khuẩn Bacillus subtilis Hoạt độ protease đạt tối đa nhiệt độ 37oC 4.3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường lên khả sinh trưởng tạo enzyme chủng vi khuẩn KTC1 lu Để đánh giá phát triển khả sinh enzyme KTC1 an n va pH khác nhau, tiến hành nuôi chủng giống môi trường MPA lỏng 24h, sau cấy sang mơi trường cảm ứng sinh enzyme có chất đậu p ie gh tn to nành 4%, bổ sung CaCO3 với nồng độ 0.5%, pH môi trường khác nhau: 6,5; 7; 7,5; 8; 8.5 40h nhiệt độ 37oC, ly tâm dịch enzyme thô Đo OD sinh trưởng hoạt độ protease ta kết sau: w Bảng 4.7: Kết thí nghiệm ảnh hưởng pH đến sinh trưởng sinh tổng d oa nl HĐP (UI/ml) 1,780 ± 0,002 1,931 ± 0,008 2,035 ± 0,002 2,225 ± 0,008 an ll fu OD sinh trưởng nv 6,5 a lu pH hợp enzyme protease KTC1 m 2,022 ± 0,002 2,099 ± 0,008 oi 7,5 1,926 ± 0,002 nh 2,014 ± 0,008 8,5 1,908 ± 0,002 1,933 ± 0,008 at z z gm @ l.c om an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 42 lu an n va Hình 4.6: Biểu đồ biểu ảnh hưởng pH đến sinh trưởng sinh p ie gh tn to tổng hợp enzyme protease KTC1 Qua bảng 4.7 ta thấy pH 6.5 vi khuẩn phát triển yếu, Khi pH tăng từ 7- 8.5 vi khuẩn sinh trưởng phát triển tốt Ở pH vi khuẩn KTC1 cho hoạt tính w enzyme cao (2,225 UI/ml) Kết hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu trước Nguyễn Thị d oa nl Trần Thụy (2009) nghiên cứu ảnh hưởng pH lên sinh trưởng sinh tổng nv a lu hợp enzyme protease vi khuẩn Bacillus subtilis pH thu hoạt độ protease cao an fu Như qua kết nghiên cứu điều kiện môi trường ảnh hưởng đến sinh ll tổng hợp enzyme prorease vi khuẩn KTC1 ta có kết luận sau: m oi Hoạt độ enzyme vi khuẩn KTC1 đạt cao khoảng thời gian 40h, at nh nhiệt độ 37oC pH = z z gm @ l.c om an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 43 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết thu trên, rút kết luận sau đây: - Từ mẫu đất trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên phân lập 10 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis - Đã nghiên cứu khả sinh protease ngoại bào chủng Bacillus subtilis phân lập được, 10 chủng có khả sinh protease ngoại bào, lu chủng KTC1 có hoạt độ enzyme protease cao đạt 1,907 UI/ml an n va - Đã nghiên cứu điều kiện môi trường ảnh hưởng đến sinh tổng hợp p ie gh tn to enzyme prorease ngoại bào Kết xác định hoạt độ enzyme đạt cao sau 40h nuôi cấy, nhiệt độ 37oC pH 7,0 5.2 Kiến nghị w Do điều kiện thời gian có hạn nên nghiên cứu sâu Nếu có điều kiện, chúng tơi tiếp tục đề tài với nghiên cứu: d oa nl - Khảo sát sâu điều kiện tối ưu cho khả sinh tổng hợp enzyme a lu protease quy mô lớn nv - Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease thực tiễn sản xuất an chế phẩm dùng chăn nuôi, bảo vệ môi trường v.v… ll fu oi m at nh z z gm @ l.c om an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng Việt Tơ Minh Châu, (2000), Giáo trình thực tập vi sinh vật học Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM Nguyễn Trọng Cẩn (chủ biên), Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ enzyme, NXB Nông Nghiệp – Tp Hổ Chí Minh Nguyễn Lân Dũng, Hoàng Đức Nhuận, 1976 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập I, II, III NXB khoa học kỹ thuật lu Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi Sinh vật an học NXB Giáo dục n va Nguyễn Lân Dũng (dịch) (1983), Thực Hành Vi Sinh Vật Học, NXB Đại Học p ie gh tn to Trung học chuyên nghiệp Hà Nội Nguyễn Thành Đạt (1990), Thực hành vi sinh vật, NXB Nông nghiệp Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Đức Lượng, (2004), Cơng nghệ sản xuất mì w sản phẩm lên men cổ truyền NXB khoa học kỹ thuật Phạm Thị Ánh Hồng (2003), kỹ thuật sinh hóa, NXB Đại học quốc gia TP d oa nl HồChí Minh a lu Lý Kim Hữu, 2005 Khảo sát đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis tìm nv an hiểu điều kiện ni cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm Probiotic fu ll LVTN, khoa Chăn nuôi thú y Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM m oi 10 Trần Ngọc Hùng, Lê Phi Nga, “nghiên cứu thu Protease từ Bacillus subtilis z Thủ Dầu Một, S 11 (2013) at nh sử dụng chế phẩm sinh học chăn ni”, Tạp chí khoa học Đại học z @ 11 Lã Văn Kính, (1998), Những tiến khoa học kỹ thuật công nghệ sản l.c Nông nghiệp Kỹ thuật Miền Nam gm xuất thức ăn gia súc vai trò probiotic động vật Viện Khoa học om 12 Nguyễn Đức Lượng (Chủ biên) Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy an Lu Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hương, Phan Thị Huyền (2004), Công Nghệ Enzym, NXB Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 45 13 Nguyễn Đức Lượng (Chủ biên) Nguyễn Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2003), Thí nghiệm vi sinh vật học,NXB Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh 14 Lê Đức Mạnh, Ngô Tiến Hiển, Lê Đức Ngọc, Nghiên cứu thu nhận bảo quản protease từ chế phẩm lên men bề mặt vi khuẩn Bacillus subtilis, Các cơng trình nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học công nghệ thực phẩm (Giai đoạn 1986-1995), NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, 1995 15 Lê Minh Cẩm Ngọc, (2005), Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ chế phẩm probiotic, tìm hiểu mơi trường ni cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm LVTN, Khoa Chăn nuôi thú y Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM lu 16 Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông Nghiệp an n va 17 Lương Đức Phẩm (2007), Chế phẩm sinh học dùng chăn nuôi nuôi p ie gh tn to trồng thủy sản, NXB Nông Nghiệp 18 Nguyễn Vĩnh Phước, (1977), Vi sinh vật thú y tập I, NXB đại học trung học chuyên nghiệp, NXB Nông nghiệp Hà Nội w 19 Vũ Thị Thứ, (1996), Nghiên cứu đặc điểm sinh học khả ứng dụng số chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus subtilis Luận án phó tiến sĩ khoa d oa nl học, Viện sinh học nhiệt đới a lu 20 Đỗ Thị Bích Thủy, Trần Thị Xơ, “Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố nv lên khả sinh protease Bacillus subtilis”, Tạp chí Nơng nghiệp an phát triển nông thôn, 49, (2004), 1667-1668 fu ll 21 Đỗ Thị Bích Thủy, “Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố lên khả sinh m oi protease Bacillus subtilis”, tạp chí khoa học Đại học Huế, T 71, S (2012) at nh z z gm @ l.c om an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99