(Tiểu luận) ứng dụng các kỹ thuật sắc ký để phân tích chất độc có trong muối tắm và nước biểnghb

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ KHOA DƯỢC LBM HĨA PHÂN TÍCH – KIỂM NGHIỆM – ĐỘC CHẤT - - Bài báo cáo thực tập MÔN: ĐỘC CHẤT CHỦ ĐỀ 8: ỨNG DỤNG CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ ĐỂ PHÂN TÍCH CHẤT ĐỘC CĨ TRONG “MUỐI TẮM” VÀ “NƯỚC BIỂN/GHB” GVHD: PGS.TS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ Nhóm SVTH: 12 – Dược-LT K34 Cần Thơ 2022 DANH SÁCH NHĨM Đóng STT Họ Tên MSSV góp Lê Tuấn Hùng 2033030001 100% Võ Minh Hưng 2033030002 100% Lê Kim Ngân 2033030003 100% Nguyễn Thái Sơn 2033030004 100% Phan Thị Thắm 2033030005 100% Trương Thị Ngọc Trâm 2033030007 100% Trần Huyền Trang 2033030008 100% Trần Quốc Trung 2033030009 100% Lý Hồng Vân 2033030010 100% MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH A MỞ ĐẦU B NỘI DUNG NGUỒN GỐC, TÍNH CHẤT LÝ HÓA: 1.1 Muối tắm 1.2 GHB ĐỘC TÍNH, CƠ CHẾ GÂY ĐỘC VÀ XỬ LÝ NGỘ ĐỘC 2.1 Flakka muối tắm 2.2 GHB nước biển PHÂN TÍCH SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG “ FLAKKA TRONG MUỐI TẮM “ VÀ “ GHB TRONG NƯỚC BIỂN” CÓ TRONG MẪU DỊCH SINH HỌC ( MÁU, HUYẾT TƯƠNG, NƯỚC TIỂU) BẰNG CÁC KỸ THUẬT MIỄN DỊCH VÀ SẮC KÝ HIỆN ĐẠI .8 3.1 GHB nước biển 3.1.1 Kỹ thuật xét nghiệm sắc ký đại 3.1.2 Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch 10 3.2 Flakka muối tắm 12 3.1.3 Kỹ thuật xét nghiệm sắc ký đại 12 3.1.4 Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch 18 C TÀI LIỆU THAM KHẢO GC/MS Chữ viết tắt LC α-PVDPVD LC-PVDHRMS CNS GABA GHB GHB-PVDDH LC-PVDMS LOQ MDPV MSTFA DANH MỤC VIẾT TẮT Chữ nguyên Nghĩa tiếng Việt Alpha-PVDpyrrolidinovalerophenone Central nervous system Hệ thần kinh trung ương Acid gamma-PVDaminobutyric Gamma-PVDhydroxybutyrate Gammahydroxybutyrate-PVD dehydrogenase Gas Chromatography Mass Phương pháp sắc ký khí-PVD Spectometry khối phổ Liquid chromatography Sắc kí lỏng Liquid chromatography -PVDHigh Sắc ký lỏng khối phổ Resolution Mass Spectrometry phân giải cao Liquid chromatography–mass Phương pháp sắc ký spectrometry lỏng-PVDkhối phổ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng Methylenedioxypyrovalerone N-PVDmethyl-PVDN-PVDtri-PVD methylsilyltrifluoracetamide DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1: Xét nghiệm chẩn đoán nhanh GHB với mẫu vật nước tiểu .10 Bảng 2: Tương quan mẫu vật …….12 Bảng 3: Chuyển tiếp phân mảnh lớn chất chuyển tiếp chất chuẩn nội 14 Bảng4: Các thông số Gradient sắc ký lỏng………………………………………….15 Bảng 5: Dữ liệu xác thực thu từ phương pháp “pha loãng bắn” cho tất chất phân tích có xét nghiệm 16 Bảng 6: Dữ liệu NPS dương tính từ khoảng thời gian 14 tháng thử nghiệm 18 DANH MỤC HÌNH Tran g Hình 1: Cấu trúc phân tử α-PVDPVP Hình 2: Tổng hợp Flakka Hình 3: Thành phần hóa học GHB Hình 4: Quá trình sinh tổng hợp acid GHB Hình 5: Bộ xét nghiệm lạm dụng thuốc có độ nhạy cao GHB Thử nghiệm nhanh dải mm .10 Hình 6: Sắc ký đồ LC-PVDMS/MS 13 Hình 7: Sắc ký đồ phủ 10 chất phân tích xác định xét nghiệm 16 Hình 8: Sắc đồ cho thấy phân tách đồng phân etylone butylone 17 Hình 9: Kit test xét nghiệm nhanh α-PVDPVP (Nước tiểu) 20 Hình 10: Hướng dẫn sử dụng Panel 21 A • MỞ ĐẦU Thực trạng sử dụng : Muối tắm Alpha-PVDpyrrolidinovalerophenone (a-PVDPVP) chất kích thích tổng hợp bất hợp pháp có tên gọi đường phố "flaka" Mặc dù phát triển chất kích thích hệ thần kinh trung ương vào năm 1968, việc sử dụng để giải trí, trở nên phổ biến 4-PVD5 năm gần đây, nhiều trường hợp ngộ độc tử vong báo cáo chất Chúng mua trực tuyến từ cửa hàng bán lẻ thường bán dạng "muối tắm" GHB/ nước biển Gamma-PVDhydroxybutyrate (GHB) chất ức chế hệ thần kinh trung ương chủ yếu sử dụng loại thuốc bị lạm dụng để giải trí, dùng để điều trị chứng ngủ rũ với cataplexy bệnh nhân người lớn chất bổ trợ để kiểm sốt hội chứng cai rượu • Đặt vấn đề “Vì lại chọn nghiên cứu chất độc Muối tắm GHB/ nước biển” Hiện “Muối tắm” , “Nước biển” trở nên phổ biến phận giới trẻ Việt Nam, hiểm họa ma tuý nguy hiểm ẩn nắp với tên gọi tưởng chừng vô hại Việc sử dụng trái phép chất ma tuý gây nên hậu nghiêm trọng nghiện, ngộ độc cấp tính, chí dẫn đến tử vong Ngồi , sản xuất trái phép loại ma tuý đặt tên chúng trùng với sản phẩm bày bán hợp pháp “muối tắm”, “nước biển” dễ gây nhầm lẫn nghiêm trọng , khó khăn cho việc kiểm soát phát chúng Vì việc lựa chọn chủ đề nhằm cung cấp nhìn khái quát nguồn gốc, tính chất lý hố, thành phần hố học, biểu độc tính , chế gây độc ,cách xử lí ngộ độc cách sử dụng số kỹ thuật miễn dịch sắc ký định tính, định lượng “Flaka muối tắm” “ GHB nước biển” có mẫu dịch sinh học • Giải pháp để kiểm sốt việc sử dụng “ Muối tắm” “ GHB/ Nước biển” + Tuyên truyền hậu tác hại ma tuý, tránh xa chất gây nghiện + Có biện pháp chế tài nghiêm khắc người buôn bán chất gây nghiện + Quản lí bắt buộc cai nghiện đối người sử dụng nghiện B NỘI DUNG ➢ NGUỒN GỐC, TÍNH CHẤT LÝ HÓA: 1.1 Muối tắm Nguồn gốc: Muối tắm tên đặt cho nhóm ma túy có chứa nhiều hóa chất tổng hợp liên quan đến cathinone, chất kích thích tương tự amphetamine tìm thấy Khát (Catha edulis) Một loại ma túy tổng hợp biết đến đường phố “Flakka” (α-PVD pyrrolidinovalerophenone, α-PVDPVP) trở nên phổ biến Hoa Kỳ Nó tương tự mặt hóa học với MDPV, gọi muối tắm, nguyên nhân gây gia tăng trường hợp say kích động kỳ lạ Hoa Kỳ vài năm trước ➢ Tính chất lý hóa: α-PVDPVP loại bột kết tinh màu trắng trắng nhạt, khơng mùi Có dạng viên nén, viên nhộng chất lỏng ➢ Thành phần hóa học: α-PVDPVD [thường α-PVDPVP, α-PVDPVP, O-PVD2387, β xeton-PVDprolintan, prolintanone 1-PVDphenyl-PVD2-PVD (pyrrolidin-PVD1-PVDyl) pentan-PVD1-PVD one] pyrovalerone mặt hóa học liên kết với chất tương tự xeton prolintane Công thức phân tử C15H21NO (C15H22NOCl trường hợp muối clohydrid nó) Hình 1: Cấu trúc phân tử α-PVPPVP Tổng hợp Q trình tổng hợp α-PVDPVP phịng thí nghiệm theo bước + Bước 1, 1-PVDphenyl1-PVDpentanone tạo thành từ phản ứng valeronitril với phenylmagnesium bromide, với phản ứng tạo axit + Bước 2, brom hóa để tạo α-PVDbromo xeton tương ứng Chất phản ứng với pyrrolidine để tạo α-PVDPVP (hiệu suất 51%) + Bước 3, chuyển thành muối hydrochloride Hình 2: Tổng hợp Flakka 1.2 GHB ➢ Nguồn gốc Trường hợp tổng hợp GHB có từ năm 1874 báo cáo A Zaytseff Nghiên cứu tiên phong ảnh hưởng GHB người Tiến sĩ Laborit dẫn đầu vào đầu năm sáu mươi Vào năm 1964, GHB sử dụng chất gây mê, chưa phát huy tác dụng triệt để có nhiều tác dụng phụ Từ năm 1970 đến 1980, nhiều trường hợp lạm dụng GHB báo cáo số người xây dựng thể cho có khả làm tăng hormone tăng trưởng Trong suốt năm 1980 1990, tiếng chất kích thích hoạt động tình dục, đặc biệt người thường xuyên hộp đêm Từ năm 1990, GHB ý nhiều nhiều trường hợp ngộ độc cấp tính Năm 2000, Cơ quan Thực thi Ma túy Hoa Kỳ (DEA) đưa GHB vào Bảng I loại ma túy khả lạm dụng phụ thuộc thể chất tâm lý Năm 2003, liệt vào danh sách thuốc loại C Đạo luật lạm dụng thuốc Vương quốc Anh Là loại thuốc bị lạm dụng, GHB nằm tầm kiểm soát tất nước thành viên EU Tuy nhiên, ứng dụng điều trị chứng ngủ rũ thường xuyên chất bổ trợ việc kiểm soát hội chứng cai rượu nghiện rượu ➢ Tính chất lý hóa Gamma-PVDhydroxybutyrate (GHB) tiền chất nội sinh axit gamma-PVD aminobutyric (GABA) chất gây suy nhược hệ thần kinh trung ương (CNS) trở nên khét tiếng bị lạm dụng loại thuốc tiêu khiển dạng chất lỏng không màu, không mùi màu trắng bột, viên nén viên nang số tên (“Georgia Home Boy”, “Juice”, “Liquid Ecstasy”, “Mils”, “G”, “Liquid X”, “Liquid G” “Fantasy” ) ➢ Thành phần hóa học Hình 3: Cơng thức cấu tạo GHB Cơng thức phân tử: C4H8O3 PHÂN TÍCH SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG “ FLAKKA TRONG MUỐI TẮM “ VÀ “ GHB TRONG NƯỚC BIỂN” CÓ TRONG MẪU DỊCH SINH HỌC ( MÁU, HUYẾT TƯƠNG, NƯỚC TIỂU) BẰNG CÁC KỸ THUẬT MIỄN DỊCH VÀ SẮC KÝ HIỆN ĐẠI 3.1 GHB nước biển 3.1.1 Kỹ thuật xét nghiệm sắc ký đại Giới thiệu phương pháp Axit gamma-PVDhydroxybutyric (GHB) loại thuốc an thần sử dụng tội phạm ma túy Cửa sổ phát ngắn GHB trải qua q trình chuyển hóa giai đoạn I chun sâu thành axit hữu : axit glycolic, axit succinic, axit dihydroxybutyric Phương pháp sắc ký khí-khối phổ (GS/MC) sử dụng chiết lỏng-PVDlỏng tạo dẫn xuất với N-PVDmetyl-PVDN-PVDtri-PVDmetylsilyltrifluoracetamit phát triển cho phép phát định lượng mức độ nội sinh chất chuyển hóa mẫu sinh học (máu nước tiểu) Thuốc thử Chất chuẩn nội sinh pha loãng (GHB-PVDd6, 1,0 mg / mL metanol) pha loãng với metanol để thu dung dịch gốc 500 μg / mL.g / mL N-PVDmethyl-PVDN-PVDtri-PVDmethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) Axit clohydric 6M Axit clohydric 0,1 mol / L 2-PVDpropanol Ethyl axetat Mẫu nước tiểu: Để tránh ô nhiễm vi khuẩn mẫu nước tiểu, thêm vào hai đến ba giọt cloroform, mẫu bảo quản -PVD20°C sử dụng (Tốt đầu sau sử dụng GHB) Tiến hành Nước tiểu (1 mL) thêm vào 40 μg / mL.L GHB-PVDd6 nội chuẩn (500 μg / mL.g / mL) Một lượng 100 μg / mL.L axit clohydric 6M thêm vào để điều chỉnh độ pH đến 1– Cuối cùng, chất phân tích chiết cách sử dụng mL etyl axetat Hỗn hợp lắc kỹ phút ly tâm tốc độ 3000 vòng / phút phút Phần phía cẩn thận chuyển sang ống nghiệm thủy tinh khác Sau đó, 100 μg / mL.L HCl (0,1 mol / L 2-PVDpropanol) thêm vào, phần phía làm khơ dịng nitơ nhẹ nhiệt độ phịng Cặn khơ tạo dẫn xuất trimetylsilyl hóa cách sử dụng 500 μg / mL.L MSTFA 60 ° C 60 phút Hỗn hợp phản ứng chuyển vào lọ lấy mẫu tự động μg / mL.L tiêm vào hệ thống GC – MS Điều kiện máy sắc ký khối phổ GC/MS GC/MS thực cách sử dụng MSD 5975C (Agilent Technologies, Santa Clara, USA) trang bị 7890A GC (Agilent) lấy mẫu tự động 7683B (Agilent) Cột mao quản sử dụng TG-PVD5SILMS (30 m × 0,25 mm i.d., độ dày màng 0,25 μg / mL.m) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) GC vận hành chế độ phân chia (tỷ lệ phân chia 1/20), nhiệt độ kim phun đầu báo đặt 280 ° C 230 ° C Chương trình nhiệt độ sử dụng sau: tăng 10 ° C / phút từ 80 ° C đến 300 ° C, với nhiệt độ ban đầu trì phút nhiệt độ cuối trì phút Heli có độ tinh khiết cao sử dụng làm khí mang tốc độ dịng chảy 0,9 mL / phút Các hợp chất bị ion hóa tác động điện tử 70 eV Detector chọn lọc khối lượng sử dụng chế độ giám sát ion chọn để phân tích định lượng Các ion sau theo dõi (sử dụng thời gian dừng 20 ms) GHB: m/z 233 (target), 204; GHB-PVDd6: m/z 239 (target), 206; Glycolic acid: m/z 205 (target), 147; 2-PVDhydroxybutyrate: m/z 131 (target), 190; 3-PVDhydroxybutyrate: m/z 191 (target), 192, 204; 3-PVDhydroxyisobutyrate: m/z 177 (target), 218; Succinic acid: m/z 247 (target), 218, 262; 10 2,4-PVDdihydroxybutyrate: m/z 219 (target), 321; 3,4-PVDdihydroxybutyrate: m/z 233 (target), 321 Quy trình GC – MS xác nhận để định lượng axit hữu nói theo hướng dẫn quốc tế Kết quả: Phương pháp thiết kế đặc biệt để đánh giá định lượng GHB axit hữu nội sinh q trình chuyển hóa GHB giai đoạn I mẫu huyết nước tiểu Các nồng độ chất nội sinh axit glycolic, GHB, axit succinic, axit 2,4-PVP dihydroxybutyric, axit 3,4-PVPdihydroxybutyric sở kết luận có sử dụng GHB hay không 3.1.2 Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch Hình 5: Bộ xét nghiệm lạm dụng thuốc có độ nhạy cao GHB Thử nghiệm nhanh dải mm Bảng 1: Xét nghiệm chẩn đoán nhanh GHB với mẫu vật nước tiểu Bộ dụng cụ Thể loại TESGTING lạm Định dạng STRIP GHB dụng ma túy Mẫu vật Nước tiểu Thời gian thử nghiệm – 15 phút Thời hạn sử dụng 24 tháng Ứng dụng Xét nghiệm GHB Cắt 10 gg Điểm bật Self testing kits, strip drug drug test 11 Mơ tả Axit-PVDHydroxybutyric (GHB), cịn gọi axit 4-PVDhydroxybutanoic, chất dẫn truyền thần kinh tự nhiên loại thuốc thần kinh Nó sử dụng mơi trường y tế loại thuốc gây mê nói chung phương pháp điều trị bệnh cataplexy, chứng ngủ rũ nghiện rượu Nó sử dụng bất hợp pháp chất gây say, để cố gắng tăng hiệu suất thể thao, loại thuốc hiếp dâm ngày Nó thường sử dụng dạng muối, chẳng hạn natri-PVDhydroxybutyrate (Na.GHB, natri oxybate) kali-PVDhydroxybutyrate (K.GHB, kali oxybate) Nước tiểu thường mẫu vật thường dùng cho mục đích theo dõi lạm dụng thuốc Cả-PVDbutyrolactone (GBL) 1,4-PVDbutanediol chuyển đổi thành GHB thể Nguyên tắc kiểm tra GHB-PVDDH (gammahydroxybutyrate dehydrogenase) xúc tác phản ứng GHB NAD+ để tạo NADH, phản ứng nhuộm tetrazoliym cặp diaphorase dẫn đến việc tạo phức hợp thuốc nhuộm màu tím Các thuốc thử ổn định sử dụng để tạo xét nghiệm sàng lọc GHB nước tiểu mức 10 μg / mL.g / mL Hạn chế Băng thử nghiệm nhanh cung cấp kết phân tích sơ bộ, định tính Một phương pháp phân tích thứ cấp phải sử dụng để có kết xác nhận Phương pháp sắc ký khí / quang phổ khối (GC/MS) phương pháp xác nhận Có thể có lỗi kỹ thuật, chất gây nhiễu khác mẫu nước tiểu gây kết sai Chất pha trộn, chẳng hạn thuốc tẩy phèn, mẫu nước tiểu tạo kết sai lệch phương pháp phân tích sử dụng Nếu nghi ngờ, xét nghiệm nên lặp lại với mẫu nước tiểu khác Một kết dương tính cho thấy diện thuốc chất chuyển hóa khơng cho thấy mức độ nhiễm độc, đường dùng nồng độ nước tiểu 12 Một kết âm tính khơng thiết nước tiểu khơng có thuốc Kết âm tính thu có thuốc mức giới hạn xét nghiệm * So sánh băng thử nghiệm nhanh GHB (Nước tiểu) GC/MS Các kết sau lập bảng: Bảng 2: Tương quan mẫu vật Phương pháp GC/MS Tổng kết Kiểm tra nhanh GHB Các kết Tích Tích cực Tiêu cực 46 50 136 140 50 140 190 97,1% 95,8% Cassette cực (nước tiểu) Tiêu cực Tổng kết Thỏa thuận% 92,0% Giải thích; Tích cực (+) Tiêu cực (-PVD) Khảo sát 50 người sử dụng GHB thử nghiệm nhanh GHB có 46 người cho kết dương tính => sai số người (âm tính) => độ nhạy pp 92% Khảo sát 140 người không sử dụng GHB pp GC/MS có 136 người cho kết âm tính => sai số người (dương tính) => độ đặc hiệu pp 97.1% 3.2 Flakka muối tắm 3.1.3 Kỹ thuật xét nghiệm sắc ký đại 13 Mẫu huyết nước tiểu giữ tủ lạnh đem phân tích thường thực vào hôm sau Bảo quản mẫu thời gian dài thực -PVD 80 ° C Phép đo chất tác động thần kinh thực phương pháp sắc ký lỏng-PVDkhối phổ (LC-PVD MS) đa thành phần LC-PVDđộ phân giải cao (LC-PVDHRMS / MS), dựa tín hiệu ghi hai ion sản phẩm cho chất phân tích chế độ theo dõi phản ứng tích cực chọn (SRM) Phương pháp LC-PVDHRMS thường xuyên cập nhật chất mới, chúng xuất thị trường thuốc Hình 6: Sắc ký đồ LC-PVPMS/MS Vật liệu phương pháp phân tích Thuốc thử Tất hợp chất chuẩn đối chứng Dung môi, bao gồm metanol, axetonitril axit fomic Nước tiểu bình thường khơng chứa thuốc 14 Chuẩn bị tiêu chuẩn hiệu chuẩn Nước tiểu bình thường không chứa ma túy bổ sung chất chuẩn đối chiếu nồng độ 25 ng / mL, 250 ng / mL 1000 ng / mL làm chất chuẩn Tất mẫu, mẫu chuẩn mẫu chứng pha loãng lần với dung dịch nội chuẩn (0,5 µg / mL metylone D3 alpha-PVDPVP D8) cách thêm 400 µL chất chuẩn nội vào 100 µL mẫu Bảng 3: Chuyển tiếp phân mảnh lớn chất chuyển tiếp chất chuẩn nội Thiết bị đo đạc Tất phân tích thực thơng qua LC – MS / MS hệ thống Acquity TQD UPLC / MS / MS (Waters) Cột phân tích UPLC BEH C18 (Waters) 2,1 ì 50 mm, 1,7 àm c sử dụng để tách sắc ký Thời gian chạy cho phương pháp 2,0 phút với tổng thời gian chu kỳ 2,5 phút Không cần chiết làm mẫu trước phân tích LC – MS / MS Hai trình chuyển đổi theo dõi cho 10 chất phân tích (alpha-PVDPVP, butylone, ethylone, MDPV, mephedrone, d, l-PVD methcathinone, methedrone, methylone, mitragynine naphyrone), cộng với hai chất chuẩn nội (methylone D3 alpha-PVDPVP D8 ), thể Bảng I Các dung môi rửa giải sử dụng gradient 0,1% axit fomic 10% metanol (pha động A) 0,1% axit fomic 50:50 metanol– axetonitril (pha động B), với tốc độ dòng 0,4 mL / phút (Bảng II) 15 Bảng 4: Các thông số Gradient sắc ký lỏng Phương pháp xác nhận Phương pháp xác nhận cách kiểm tra thông số khác giới hạn, độ tuyến tính, độ chụm độ xác (P&A: Mười lần lặp lại ba nồng độ ngày ba ngày với hệ số phương sai [% CV] điểm P&A lặp lại ngày tất ngày P&A giảm khoảng +/-PVD 15%), ảnh hưởng hiệu ứng ma trận Lạm dụng ma túy (benzoylecgonine, THC-PVDA, amphetamine, methamphetamine, MDMA, MDEA, MDA phentermine) thuốc điều trị (oxazepam, morphine, imipramine, buprenorphine, fentanyl, meprobamate, methadone, tramadol, gabapentin, pregentabalin) kiểm tra nguồn gây nhiễu có Các mẫu bệnh phẩm đánh giá cách so sánh kết định lượng phương pháp với kết phương pháp mô tả Phương pháp trước phát triển xác nhận mô tả thiếu chất phân tích quan trọng, ví dụ, mitragynine alpha-PVDPVP