Nghiên cứu tuyển chọn và xác định ảnh hưởng của chủng vi khuẩn nội sinh đến sinh trưởng của một số loài cây thuộc chi citrus

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VÀ XÁC ĐỊNH ẢNH HƢỞNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH ĐẾN SINH TRƢỞNG CỦA MỘT SỐ LOÀI CÂY THUỘC CHI CITRUS Giáo viên hướng dẫn : TS Nguyễn Thị Thu Hằng Sinh viên thực : Kim Thị Huế Mã sinh viên : 1955020009 Lớp : K64 - CNSH Hà Nội, 2023 LỜI CẢM ƠN Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp với đề tài “Nghiên cứu tuyển chọn xác định ảnh hƣởng chủng vi khuẩn nội sinh đến sinh trƣởng số loài thuộc chi Citrus” kết q trình khơng ngừng cố gắng thân với giúp đỡ, động viên khích lệ thầy (cơ), bạn bè Với lịng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Thị Thu Hằng, giảng viên Viện Công nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp, ngƣời thầy khoa học định hƣớng tận tình bảo, giúp đỡ tơi suốt thời gian thực nghiên cứu hoàn thành đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy (cô) Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trƣờng Đại học Lâm nghiệp tận tình truyền đạt kiến thức năm học tập Với vốn kiến thức q trình học khơng tảng cho q trình nghiên cứu mà cịn hành trang quý báu để bƣớc vào đời cách vững tự tin Tôi xin chân thành cảm ơn! i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ vi CHƢƠNG TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH 1.1.1.Khái niệm vi sinh vật nội sinh 1.1.2.Sự phân bố vi sinh vật nội sinh thể thực vật 1.1.3.Vai trò vi khuẩn nội sinh thực vật 1.1.4.Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh giới 11 1.1.5.Tình hình nghiên cứu nƣớc liên quan tới vi khuẩn nội sinh 13 1.2 GIỚI THIỆU VỀ CÂY CITRUS 13 1.2.1 Đặc điểm sinh học 13 1.2.2 Nấm bệnh Citrus 14 CHƢƠNG MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 17 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17 2.3 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 17 2.3.1.Vật liệu vi sinh vật, thực vật 17 2.3.2.Hóa chất, thiết bị, dụng cụ, giá thể 19 2.4 CÁC MÔI TRƢỜNG SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 20 2.5 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.5.1 Sàng lọc chủng vi khuẩn nội sinh có khả kích thích sinh trƣởng thực vật 22 2.5.2 Xác định khả ức chế nấm Fusarium Alternaria vi khuẩn 25 2.5.3 Xác định đặc điểm hình thái vi khuẩn 26 ii 2.5.4 Xác định ảnh hƣởng chủng vi khuẩn đến sinh trƣởng, phát triển thực vật phịng thí nghiệm 27 2.5.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu thống kê 29 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH 31 3.1.1.Xác định khả sinh tổng hợp IAA vi khuẩn 31 3.1.2 Xác định khả cố định nitơ 34 3.1.3 Xác định khả phân giải phosphate khó tan 36 3.1.4.Xác định hoạt tính cellulase 38 3.2 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM BỆNH 40 3.3 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN 42 3.4 ẢNH HƢỞNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH ĐẾN SINH TRƢỞNG, PHÁT TRIỂN CỦA THỰC VẬT TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM 44 3.4.1 Ảnh hƣởng vi khuẩn nội sinh đến thực vật thí nghiệm giai đoạn nảy mầm 44 3.4.2 Ảnh hƣởng vi khuẩn nội sinh đến thực vật thí nghiệm giai đoạn 48 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 4.1 Kết luận 55 4.2 Kiến nghị 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 iii DANH MỤC VIẾT TẮT Chữ viết đầy đủ/Nghĩa STT Ký hiệu chữ viết tắt CMC Carboxyl methyl cellulose CNSH Công nghệ sinh học cs Cộng ĐC Đối chứng et al Và tác giả khác g Gram IAA Indole – – Acetic Acid KHV Kính hiển vi l Lít LB Lysogeny Broth 10 mg Milligram 11 ml Milliliter 12 nm Nanometer 13 OD Optical Density 14 TB Trung bình 15 VKNS Vi khuẩn nội sinh 16 VSV Vi sinh vật 17 µg Microgram 18 µl Microliter 19 µm Micrometres iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các nhóm vi sinh vật tổng hợp IAA chất dẫn xuất [5] Bảng 2.1 Thông tin chủng vi khuẩn nội sinh sử dụng 18 Bảng 2.2 Môi trƣờng xác định khả sinh IAA chủng vi khuẩn 20 Bảng 2.3 Môi trƣờng xác định Norris glucose lỏng để xác định khả cố định nitơ vi khuẩn 20 Bảng 2.4 Môi trƣờng Pikovskaya (PVK) dùng để xác định khả phân giải phosphate khó tan vi khuẩn 21 Bảng 2.5 Môi trƣờng xác định hoạt tính cellulose chủng vi khuẩn 21 Bảng 2.6 Nồng độ IAA xây dựng đồ thị chuẩn 23 Bảng 3.1 Trị số OD530nm đo đƣợc nồng độ IAA khác 31 Bảng 3.2 Khả sinh tổng hợp IAA chủng vi khuẩn nội sinh 32 Bảng 3.3 Khả cố định nitơ chủng vi khuẩn nội sinh 34 Bảng 3.4: Khả phân giải phosphate khó tan chủng vi khuẩn nội sinh 36 Bảng 3.5 Khả phân giải cellulose chủng vi khuẩn nội sinh 39 Bảng 3.6 Khả ức chế nấm Fusarium Alternaria chủng vi khuẩn nội sinh 41 Bảng 3.7 Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn nội sinh 43 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng chủng vi khuẩn nội sinh đến thời gian nảy mầm khối lƣợng mầm 45 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 3.1 Phản ứng màu IAA nồng độ khác với thuốc thử Salkowski 31 Hình 3.2 Đồ thị chuẩn mối tƣơng quan tuyến tính trị số OD530nm nồng độ IAA (µg/ml) 32 Hình 3.3 Chỉ số hòa tan phosphate chủng vi khuẩn nội sinh 37 Hình 3.4 Khả phân giải phosphate khó tan chủng vi khuẩn 38 Hình 3.5 Hoạt tính cellulase chủng vi khuẩn nội sinh 39 Hình 3.6 Khả phân giải CMC 1% chủng vi khuẩn nội sinh 40 Hình 3.7 Khả ức chế nấm Fusarium Alternaria vi khuẩn 41 Hình 3.8 Hình thái khuẩn lạc số chủng vi khuẩn môi trƣờng LB agar 43 Hình 3.19 Hình dạng tế bào chủng vi khuẩn nội sinh 44 Hình 3.10 Ảnh hƣởng chủng vi khuẩn nội sinh có khả sinh chất kích thích sinh trƣởng thực vật đến Bƣởi giai đoạn nảy mầm sau 15 ngày thí nghiệm 46 Hình 3.11 Ảnh hƣởng chủng vi khuẩn nội sinh có khả sinh chất kích thích sinh trƣởng thực vật đến Quất giai đoạn nảy mầm sau 15 ngày thí nghiệm 48 Hình 3.12 Ảnh hƣởng chủng vi khuẩn nội sinh đến sinh trƣởng Bƣởi trồng giá thể đất sau tuần thí nghiệm 52 Hình 3.13 Ảnh hƣởng chủng vi khuẩn nội sinh đến sinh trƣởng Bƣởi trồng giá thể đất sau tuần thí nghiệm 53 Hình 3.14 Ảnh hƣởng chủng vi khuẩn nội sinh đến sinh trƣởng Quất trồng giá thể đất sau tuần thí nghiệm 53 (Xử lý hạt Quất với chủng VKNS: A-K26; B-K1; C-K33; D-K32; E-K17; F-K9; G-ĐC 53 Hình 3.15 Ảnh hƣởng chủng vi khuẩn nội sinh đến sinh trƣởng Quất giá thể đất sau tuần thí nghiệm 54 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Các hoạt động nông nghiệp kỷ 20 đƣợc thực nhiều cách sử dụng thiết bị nông nghiệp, giống trồng suất cao, làm đất thâm canh, tƣới tiêu, phân bón, thuốc trừ sâu đầu vào sản xuất khác Những ứng dụng ảnh hƣởng tiêu cực đến chất lƣợng đất góp phần gây ô nhiễm môi trƣờng Để giảm thiểu tác động tiêu cực kỹ thuật canh tác thông thƣờng gây ra, việc cấy vi sinh vật nhƣ phân bón sinh học đƣợc ý nhiều Một liên kết cộng sinh đƣợc hình thành vi sinh vật thực vật, hữu ích cho hai Vi sinh vật nội sinh vi sinh vật liên kết với thực vật, sống mô sống chủ mà không gây tác hại cho chủ (Ahmed et al., 2012; Hallmann et al., 1997) Các vi sinh vật nội sinh phổ biến bao gồm loài nấm, vi khuẩn xạ khuẩn, đƣợc phân lập từ trồng nông nghiệp hay cỏ hoang dại, từ mầm hai mầm Một số vi khuẩn nội sinh có khả thúc đẩy tăng trƣởng thực vật kiểm soát sinh học với tác nhân gây bệnh Khả thúc đẩy tăng trƣởng thực vật thơng qua việc cung cấp chất dinh dƣỡng cho cây, điều hòa phytohormone, hay làm tăng tính khả dụng ngun tố khống Vi khuẩn nội sinh sở hữu khả quan trọng để hịa tan phosphate khơng hịa tan cung cấp nitơ cho chủ Bên cạnh đó, vi khuẩn nội sinh có khả ức chế sinh học với loại nấm, vi khuẩn tuyến trùng gây bệnh thực vật Do đó, cƣ trú mơ thực vật, vi sinh vật nội sinh đem lại cho trồng nhiều điều kiện thuận lợi giúp trồng phát triển tốt (Dhanya Padmavathy, 2014) Các loài ăn quả, có múi thuộc chi Citrus (họ Rutaceae, Aurantioideae Citrus) ăn chính, đƣợc sử dụng nhiều Việt Nam giới Các loài thuộc chi Citrus dƣợc liệu giá trị: có thịt chứa nhiều thành phần dinh dƣỡng nhƣ carbohidrate, beta carotene, vitamin, chất khoáng; vỏ quả, hoa chứa nhiều tinh dầu, pectin, hợp chất thuộc nhóm flavonoid nhƣ naringin, hesperidin, Do vậy, việc nghiên cứu ứng dụng biện pháp canh tác, chăm sóc nhằm nâng cao suất thu hoạch lồi thuộc chi Citrus ln đƣợc quan tâm Bên cạnh đó, sinh trƣởng Citrus bị kìm hãm loại bệnh nấm gây ra, phổ biến bệnh vàng thối rễ nấm Fusarium sp., bệnh mốc xanh nấm Alternaria sp Bệnh nấm gây thƣờng khó phịng trừ nấm có khả tồn lâu đất Hiện nay, hƣớng ứng dụng vi sinh vật nội sinh vừa có khả sinh chất kích thích sinh trƣởng thực vật, vừa có khả kháng nấm nônglâm nghiệp đƣợc quan tâm nghiên cứu Xuất phát từ thực tế đó, tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn xác định ảnh hƣởng chủng vi khuẩn nội sinh đến sinh trƣởng số loài thuộc chi Citrus” CHƢƠNG TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan vi sinh vật nội sinh 1.1.1 Khái niệm vi sinh vật nội sinh Vi khuẩn nội sinh thực vật ("Endophytic bacteria") hiểu theo nghĩa đen vi khuẩn cƣ trú bên ("endo" = bên trong; "phyton" = cây) Vi sinh vật nội sinh vi khuẩn có lợi thực vật phát triển mạnh bên thực vật cải thiện phát triển thực vật điều kiện bình thƣờng khắc nghiệt Vi sinh vật nội sinh đƣợc truyền từ bố mẹ sang hệ (hệ sợi nấm ăn sâu vào phôi hạt mẹ) lan truyền quần thể chủ thông qua bào tử vi sinh vật nội sinh (Suryanarayana, 2013; Tadych et al., 2014) Vi khuẩn nội sinh thực vật diện phổ biến hầu hết tất loài thực vật, chúng sống tiềm ẩn tích cực xâm chiếm nội mô thực vật cách cục hệ thống (Hallmann et al., 1997) [26] Vi khuẩn nội sinh bắt nguồn từ cộng đồng vi khuẩn biểu sinh vùng rễ lá, nhƣ từ hạt vật liệu nhân giống vơ tính 1.1.2 Sự phân bố vi sinh vật nội sinh thể thực vật Nhiều nghiên cứu cho vùng rễ nguồn vi khuẩn nội sinh chính, từ chúng xâm chiếm vào bên mô tế bào thực vật (Verma et al., 2001 [37]; Bressan Borges, 2004 [19]) Vì vậy, vi khuẩn nội sinh thƣờng đƣợc phát rễ với mật độ cao từ giai đoạn đầu phát triển (McInroy Kloepper, 1995) [30] Rễ đƣợc xem vị trí ƣa thích cho vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào cây, từ vi khuẩn tiếp tục xâm nhập vào bên thể thực vật Vi khuẩn nội sinh xâm chiếm tế bào nội mơ từ vị trí nhƣ bề mặt rễ, lơng hút, chóp rễ điểm phát sinh rễ bên (Verma et al., 2001) [37] Ngồi ra, vi khuẩn xâm nhập vào thông qua khe hở tự nhiên nhƣ: khí khổng, thủy Bảng 3.8 Ảnh hƣởng chủng vi khuẩn nội sinh đến thời gian nảy mầm khối lƣợng mầm Loại hạt thí Chủng nghiệm VKNS Hạt Bƣởi Hạt Quất Thời gian hạt Khối lƣợng mầm sau 30 ngày nảy mầm Khối lƣợng tƣơi Khối lƣợng khô (ngày) (mg) (mg) K1 5-6 3787,90 ± 4,86 186,53 ± 2,72 K9 6-7 3595,83 ± 1,62 178,71 ± 1,41 K17 6-7 3012,63 ± 1,17 182,51 ± 1,02 K26 5-6 3934,15 ± 2,04 199,02 ± 1,70 K32 6-7 3419,90 ± 1,94 176,94 ± 1,62 K33 7-8 2849,10 ± 2,01 176,13 ± 1,96 ĐC - 10 2435,19 ± 1,43 170,17 ± 2,05 K1 7-8 363,1 ± 1,16 55,8 ± 1,71 K9 7-8 264,1 ± 1,36 41,3 ± 1,55 K17 10 - 11 163,7 ± 3,12 19,6 ± 1,20 K26 7-8 303,8 ± 1,79 50,8 ± 0,37 K32 12 - 13 231,0 ± 2,41 40,6 ± 0,40 K33 10 - 11 211,4 ± 2,22 33,6 ± 1,82 ĐC 14 - 15 111,8 ± 1,29 15,0 ± 0,94 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn nội sinh đến Bưởi giai đoạn mầm: Thời gian nảy mầm cơng thức thí nghiệm xử lý hạt với chủng VKNS ngắn so với công thức ĐC: nảy mầm nhanh công thức xử lý hạt với chủng K1, K26 (5 - ngày), công thức xử lý hạt với chủng K9, K17, K32 (6 - ngày), thời gian nảy mầm lâu công thức xử lý hạt với chủng vi khuẩn K33 (7 - ngày) 45 Kết xác định khối lƣợng tƣơi mầm sau 30 ngày kích thích hạt Bƣởi nảy mầm tiêu nghiên cứu khác biệt đáng kể so với đối chứng Trong đó, cơng thức ngâm hạt với chủng vi khuẩn K1, K9, K17, K26 K32 cho khối lƣợng tƣơi mầm sau 30 ngày đạt 3000 mg: Chủng K26 có khối lƣợng tƣơi cao (3934,15 ± 2,04 mg); chủng lại có khối lƣợng lần lƣợt K1 (3787,90 ± 4,86 mg), K9 (3595,83 ± 1,62 mg), K32 (3419,90 ± 1,94 mg), K17 (3012,63 ± 1,17 mg) Công thức ủ chủng K33 với hạt Bƣởi cho mầm có khối lƣợng tƣơi thấp cơng thức thí nghiệm (2849,10 ± 2,01 mg), nhƣng so với công thức đối chứng (2435,19 ± 1,43 mg) cao Hình ảnh thí nghiệm thu thập sau 15 ngày tính từ bắt đầu ủ hạt với vi khuẩn ngâm hạt tối đƣợc trình bày Hình 3.11 Hình 3.10 Ảnh hƣởng chủng vi khuẩn nội sinh có khả sinh chất kích thích sinh trƣởng thực vật đến Bƣởi giai đoạn nảy mầm sau 15 ngày thí nghiệm (Ảnh hưởng chủng vi khuẩn nội sinh: A – chủng K26; B – chủng K9; C – chủng K1; D – Chủng K32; E – chủng K17; F – chủng K33; G – đối chứng) Kết xác định khối lƣợng khô mầm ủ hạt Bƣởi với chủng vi khuẩn khác khác nhau: có chủng ủ với hạt Bƣởi cho khối lƣợng khô mầm đạt 180 - 200 mg chủng K26 (199,2 mg), chủng K1 (186,53 mg), K17 (182,51 mg) Các chủng ủ với hạt Bƣởi cho mầm có khối lƣợng khơ thấp chủng K9 (178,71 mg), K32 (176,94 mg), K33 (176,13 mg) 46 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn nội sinh đến Quất giai đoạn mầm: Thời gian nảy mầm hạt đƣợc lây nhiễm chủng VKNS ngắn so với công thức ĐC không lây nhiễm vi khuẩn: Công thức lây nhiễm hạt với chủng vi khuẩn K1, K9 K26 có thời gian nảy mầm - ngày, công thức lây nhiễm chủng K17 K33 (10 - 11 ngày), thời gian nảy mầm lâu hạt lây nhiễm chủng vi khuẩn K32 (12 - 13 ngày) Sau 30 ngày thí nghiệm, khối lƣợng tƣơi mầm Quất cơng thức thí nghiệm có chênh lệch kết cao công thức đối chứng Có cơng thức nhiễm vi khuẩn vào hạt có khối lƣợng tƣơi mầm cao 300 mg K26 K1; công thức nhiễm hạt với chủng K32, K33 K9 có khối lƣợng tƣơi cao 200 mg Công thức nhiễm hạt với chủng K17 cơng thức ĐC có khối lƣợng 100 mg Hạt Quất xử lý vi khuẩn K1 cho mầm có trọng lƣợng tƣơi cao (363,1± 1,16 mg), chủng K26 (303,8 ± 1,79 mg), K9 (264,1 ± 1,36 mg), K32 (231 ± 2,41 mg), K33 (211,4 ± 2,22 mg) cuối K17 có khối lƣợng thấp 163,7 ± 3,12mg Hình ảnh thí nghiệm thu thập sau 15 ngày tính từ bắt đầu ủ hạt Quất với vi khuẩn ngâm hạt tối đƣợc trình bày Hình 3.12 Dựa vào kết thấy chủng vi khuẩn có khả cố định đạm, phân giải lân, phân giải cellulose tổng hợp IAA nhiễm với hạt Bƣởi Quất làm gia tăng số sinh trƣởng (cao so với công thức đối chứng) Nhƣ vậy, chủng vi khuẩn nội sinh tuyển chọn bƣớc đầu cho thấy có tiềm việc nghiên cứu sản xuất phân sinh học ứng dụng canh tác ăn có múi bền vững 47 Hình 3.11 Ảnh hƣởng chủng vi khuẩn nội sinh có khả sinh chất kích thích sinh trƣởng thực vật đến Quất giai đoạn nảy mầm sau 15 ngày thí nghiệm 3.4.2 Ảnh hưởng vi khuẩn nội sinh đến thực vật thí nghiệm giai đoạn 3.4.2.1 Ảnh hưởng vi khuẩn nội sinh đến chiều cao chiều dài rễ Thí nghiệm gồm cơng thức, cơng thức thí nghiệm tƣơng ứng với cơng thức xử lý với chủng vi khuẩn bao gồm: K1, K9, K17, K26, K32, K33; công thức đối chứng Bố trí lặp lại thí nghiệm lần Kết xác định chiều cao chiều dài rễ trung bình (Bảng 3.9) Bƣởi, Quất thí nghiệm cho thấy: chiều cao chiều dài rễ đƣợc xử lý với vi khuẩn nội sinh tăng đáng kể so với đối chứng Bên cạnh thu thập số liệu, hình ảnh q trình thí nghiệm đƣợc trình bày Hình 3,13, 3.14, 3.15 3.16 48 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng chủng vi khuẩn nội sinh đến chiều cao chiều dài rễ trung bình Cây Bƣởi Chủng VKNS Cây Quất Chiều cao (cm) Chiều dài Chiều cao (cm) Chiều dài sau thời gian rễ sau sau thời gian rễ sau tuần tuần tuần (cm) K1 8,0 ± 1,2 8,8 ± 0,4 9,6 ± 0,7 5,1 ± 1,8 7,2 ± 0,3 15,5 ± 1,3 K9 7,9 ± 0,6 8,3 ± 0,6 8,9 ± 1,1 3,9 ± 0,9 4,7 ± 0,6 7,9 ± 0,5 K17 8,9 ± 1,2 10,4 ± 0,2 12,3 ± 0,9 3,3 ± 0,4 4,4 ± 0,2 7,4 ± 0,7 K26 6,6 ± 0,8 7,1 ± 0,7 7,4 ± 0,4 4,2 ± 1,2 5,1 ± 0,7 9,6 ± 1,2 K32 7,2 ± 0,3 7,9 ± 0,2 7,7 ± 0,4 3,1 ± 0,2 4,1 ± 1,1 5,1 ± 0,4 K33 8,4 ± 1,9 9,2 ± 0,8 11,7 ± 1,3 4,7 ± 1,1 5,8 ± 0,2 11,2 ± 1,6 ĐC 6,5 ± 1,6 6,8 ± 0,3 6,4 ± 0,6 2,2 ± 0,1 3,7 ± 0,4 4,4 ± 0,2 tuần tuần tuần (cm) Ảnh hưởng chủng vi khuẩn nội sinh đến chiều cao chiều dài rễ trung bình Bưởi giai đoạn con: Kết trình bày Bảng 3.9 cho thấy, sau tuần nuôi trồng Bƣởi giá thể đất, có cơng thức xử lý với vi khuẩn có chiều cao trung bình cm chiều dài rễ 11 cm công thức xử lý hạt Bƣởi với chủng K17 (chiều cao TB 10,4 cm; chiều dài rễ TB 12,3 cm), K33 (chiều cao TB 9,2 cm; chiều dài rễ TB 11,7 cm); cơng thức có chiều cao chiều dài rễ cm xử lý hạt với chủng K1 (chiều cao chiều dài rễ TB tƣơng ứng 8,8 cm 9,6 cm), K9 (chiều cao TB 8,3 cm; chiều dài rễ TB 8,9 cm) Công thức xử lý hạt với chủng K26, K32 có chiều cao chiều dài rễ TB thấp so với cơng thức thí nghiệm khác nhƣng nhỉnh so với công thức đối chứng (chiều cao TB chiều dài rễ TB tƣơng ứng 6,8 cm 6,4 cm) Ảnh hưởng chủng vi khuẩn nội sinh đến đến chiều cao chiều dài rễ trung bình Quất giai đoạn con: Sau tuần ni Quất giá thể 49 đất, có cơng thức xử lý vi khuẩn có chiều cao trung bình cm chiều dài rễ 15 cm công thức xử lý hạt với chủng K1: chiều cao chiều dài rễ TB tƣơng ứng 7,2 cm 15,5 cm; công thức có chiều cao trung bình cm chiều dài rễ cm K26 (chiều cao TB 5,1 cm, chiều dài rễ TB 9,6 cm), K33 (chiều cao TB 5,8 cm, chiều dài rễ TB 11,2 cm); có cơng thức chiều cao – cm chiều dài rễ từ 5,1 - 7,9 cm K9, K17, K32; cịn lại cơng thức đối chứng có chiều cao chiều dài rễ TB thấp cả, tƣơng ứng 3,7 cm 4,4 cm Nhƣ vậy, kết cơng thức thí nghiệm (nhiễm hạt với vi khuẩn nội sinh) cho chiều cao chiều dài rễ TB gia tăng so với công thức đối chứng 3.4.2.2 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn nội sinh đến khối lượng Mức độ ảnh hƣởng chủng vi khuẩn đến sinh trƣởng Bƣởi Quất giai đoạn đƣợc đánh giá thơng qua tiêu chí khối lƣợng thu đƣợc kết thống kê Bảng 3.10 Bảng 3.10 Ảnh hƣởng chủng vi khuẩn nội sinh đến khối lƣợng sau tuần thí nghiệm Chủng VKNS Cây Bƣởi Cây Quất Khối lƣợng Khối lƣợng Khối lƣợng Khối lƣợng tƣơi (mg) khô (mg) tƣơi (mg) khô (mg) K1 388,2 ± 2,4 41,7 ± 0,2 286 ± 1,4 37,7 ± 0,5 K9 351,9 ± 0,8 39,2 ± 0,7 174 ± 0,6 24,3 ± 0,9 K17 464,7 ± 2,7 56,3 ± 0,1 152 ± 0,6 18,5 ± 0,4 K26 221,4 ± 1,1 29,5 ± 0,9 221 ± 0,8 29,4 ± 0,5 K32 235,1 ± 0,9 33,8 ± 0,4 136 ± 1,7 16,8 ± 0,7 K33 392,5 ± 1,3 44,2 ± 0,5 254 ± 1,4 36,2 ± 0,9 ĐC 197,3 ± 1,6 26,4 ± 0,3 117 ± 0,9 14,6 ± 0,6 50 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn nội sinh đến khối lượng Bưởi giai đoạn con: Kết xác định khối lƣợng tƣơi khô sau tuần trồng giá thể có khác biệt đáng kể cơng thức thí nghiệm so với cơng thức đối chứng Trong đó, cơng thức ngâm hạt với chủng K17 cho tuần tuổi có khối lƣợng tƣơi 400 mg; chủng nhiễm với hạt cho có khối lƣợng tƣơi 300 mg K1, K9 K33; công thức nhiễm chủng K26 K32 cho có khối lƣợng tƣơi cao 200 mg K26, K32; thấp cơng thức đối chứng cho có khối lƣợng tƣơi 197,3 ± 1,6 mg Nhƣ vậy, chủng K17 có ảnh hƣởng tích cực đến khối lƣợng tƣơi (464,7 ± 2,7 mg); chủng cịn lại nhiễm với hạt Bƣởi cho có khối lƣợng lần lƣợt K33 (392,5 ± 1,3 mg), K1 (388,2 ± 2,4 mg), K9 (351,9 ± 0,8 mg), K32 (235,1 ± 0,9 mg) Công thức ủ chủng vi khuẩn K26 với hạt Bƣởi cho tuần tuổi có khối lƣợng tƣơi thấp cơng thức thí nghiệm (221,4 ± 1,1 mg), nhƣng so với cơng thức đối chứng (197,3 ± 1,6 mg) cao Kết xác định trọng lƣợng khô tuần tuổi ủ hạt Bƣởi với chủng vi khuẩn khác khác nhau: có chủng ủ với hạt Bƣởi cho trọng lƣợng khô đạt 41-57 mg chủng K17 (56,3 ± 0,1 mg), chủng K33 (44,2 ± 0,5 mg), K1 (41,7 ± 0,2 mg) Các chủng nhiễm với hạt cho có khối lƣợng khơ thấp chủng K9 (39,2 ± 0,7 mg), K32 (33,8 ± 0,4 mg) K26 (29,5 ± 0,9 mg) Ảnh hưởng chủng vi khuẩn nội sinh đến khối lượng Quất giai đoạn con: Sau tuần thí nghiệm, khối lƣợng tƣơi Quất thí nghiệm có chênh lệch kết cao công thức đối chứng Có cơng thức nhiễm vi khuẩn vào hạt có khối lƣợng tƣơi cao 200 mg K1; K26 K33; công thức có khối lƣợng tƣơi cao 100 mg cơng thức nhiễm hạt Quất với chủng K9, K17, K32 công thức ĐC 51 Nhƣ vậy, hạt Quất xử lý vi khuẩn K1 cho có khối lƣợng tƣơi cao (286 ± 1,4 mg), chủng K33 (254 ± 1,4 mg), K26 (221 ± 0,8 mg), K9 (174 ± 0,6 mg), K17 (152 ± 0,6 mg) cuối K32 có khối lƣợng thấp 136 ± 1,7 mg Hình 3.12 Ảnh hƣởng chủng vi khuẩn nội sinh đến sinh trƣởng Bƣởi trồng giá thể đất sau tuần thí nghiệm (Xử lý hạt với chủng VKNS: A-K17; B-K9; C-K33; D-K1; E-K32; F-K26; G-ĐC) 52 A B C D E F G Hình 3.13 Ảnh hƣởng chủng vi khuẩn nội sinh đến sinh trƣởng Bƣởi trồng giá thể đất sau tuần thí nghiệm (Xử lý hạt Bưởi với chủng VKNS: A-K17; B-K33; C-K1; D-K9; E-K32; F-K26; G-ĐC) Hình 3.14 Ảnh hƣởng chủng vi khuẩn nội sinh đến sinh trƣởng Quất trồng giá thể đất sau tuần thí nghiệm (Xử lý hạt Quất với chủng VKNS: A-K26; B-K1; C-K33; D-K32; E-K17; F-K9; GĐC 53 A B D C E F G Hình 3.15 Ảnh hƣởng chủng vi khuẩn nội sinh đến sinh trƣởng Quất giá thể đất sau tuần thí nghiệm (Xử lý hạt Quất với chủng VKNS: A-K1; B-K33; C-K26; D-K9; E-K17; F-K32; G-ĐC) 54 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã xác định đƣợc khả sinh IAA, sinh trƣởng môi trƣờng không chứa nitơ 36 chủng vi khuẩn nội sinh Trên sở đó, tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn nội sinh (K1, K9, K17, K26, K32 K33) có khả sinh - µg/ml IAA; mật độ vi khuẩn môi trƣờng không chứa nitơ OD600nm = 0,25 - 0,4 - Đã xác định đƣợc khả phân giải phosphate, cellulose đặc điểm hình thái, đặc tính Gram chủng vi khuẩn tuyển chọn: 6/6 chủng vi khuẩn có khả phân giải phosphate khó tan (SI = 2,454 - 3,389); 5/6 chủng sinh cellulase ngoại bào (D/d = 2,30 - 4,75); 6/6 chủng vi khuẩn trực khuẩn, Gram dƣơng - Đã xác định đƣợc 3/6 chủng vi khuẩn tuyển chọn có khả kháng nấm Fusarium Alternaria (đƣờng kính vùng ức chế nấm - 18 mm) - Bƣớc đầu xác định đƣợc ảnh hƣởng chủng vi khuẩn nội sinh tuyển chọn đến sinh trƣởng Bƣởi, Quất giai đoạn hạt nảy mầm giai đoạn con: Cả 6/6 chủng vi khuẩn có khả làm gia tăng trọng lƣợng tƣơi, trọng lƣợng khô mầm; thúc đẩy sinh trƣởng giai đoạn trồng bầu đất 4.2 Kiến nghị Đề nghị thực công việc nghiên cứu nhƣ sau: - Định danh đến loài chủng vi khuẩn nội sinh có khả sinh chất kích thích sinh trƣởng thực vật (K1, K9, K17, K26, K32 K33) - Tiếp tục xác định ảnh hƣởng chủng vi khuẩn nội sinh quan tâm đến sinh trƣởng loài Citrus giai đoạn trồng vƣờn ƣơm đồng ruộng 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Cao Ngọc Điệp (2010) Vi khuẩn nội sinh thực vật NXB Đại học Cần Thơ, Cần Thơ Lê Gia Huy, Khuất Hữu Thanh (2004) Cơ sở công nghệ vi sinh vật ứng dụng NXB giáo dục Lê Xuân Phƣơng (2009), Vi sinh vật học môi trường, NXB Đà Nẵng Lê Văn Tri (1998) Chất điều hòa sinh trƣởng suất trồng, NXB Nông nghiệp Nguyễn Lân Dũng (1984) Vi sinh vật đất chuyển hóa hợp chất carbon, nitơ NXB Khoa học kỹ thuật Nguyễn Minh Hƣng (2007) Phân bón vi sinh vật NXB Nơng nghiệp Nguyễn Thị Thủy (2015) Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Azotobacter có khả cố định nitơ sinh tổng hợp IAA Khóa luận tốt nghiệp trường Đại học Lâm nghiệp Nguyễn Thu Hà, Nguyễn Ngọc Quyên, Vũ Thị Minh Đức (2001) Phân lập, tuyển chọn chủng Azotobacter cho sản xuất phân bón vi sinh vật Hội thảo Quốc tế sinh học, tập 2, trang 144 - 148 Ngô Tự Thành, Vũ Thị Minh Đức, Nguyễn Ngọc Quyên, Nguyễn Thu Hà (2003) Đặc tính sinh học số chủng Azotobacter Tạp chí Di truyền học ứng dụng, tập 4, trang 31 - 37 10 Ngô Xn Bình (2015) Luận án tiến sĩ nơng nghiệp Nghiên cứu đặc điểm sinh học số biện pháp kỹ thuật nguồn thực liệu tạo không hạt có múi 11 Nguyễn Thị Thu Hà, Hà Thanh Toàn Cao Ngọc Điệp (2009) Phân lập đặc tính dịng vi khuẩn nội sinh số cỏ chăn ni Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 7(2), trang 241 - 250 12 Nguyễn Hữu Hiệp (2007) Cố định đạm sinh học Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, Cần Thơ 56 13 Nguyễn Văn Giang (2015) Vi sinh vật nội sinh thực vật, Trƣờng Đại học Nông Nghiệp Hà Nội 14 Phạm Văn Toản (2003) Khả sử dụng hỗn hợp vi sinh vật làm phân bón chức cho số trồng nông nghiệp, công nghiệp lâm nghiệp Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, trang 127 - 131 15 Văn Thị Phƣơng Nhƣ (2015) Phân lập khảo sát đặc tính vi khuẩn nội sinh lúa trồng đất tỉnh Phú Yên Luận án Tiến sĩ Vi sinh vật, Trường Đại học Cần Thơ Tài liệu tiếng Anh 16 Audi G.; Wapstra A H.; Thibault C.; Blachot J Bersillon O (2003) The NUBASE evaluation of nuclear decay properties Nuclear Physics A 17 Aquilanti L., Favilli F., Clemanti F (2004) Comperison of different strategies for isolation preliminaru identification of Azotobacter from soil sampes Soil Biology Biochemistry, 36, 1475 - 1483 18 Berg G., Hallmann J (2006) Control of plant pathogenic fungi with bacterial endophytes In: Microbial root endophytes Schulz B, Boyle C, Sieber TN (Eeds.) Springer, Berlin, 53-67 19 Bressan, Wellington, Borges, Marcela T (2004) Delivery methods forintroducing endophytic bacteria into maize", Biocontrol, 49(3): 315-322 20 Chen Y.P., Rekha P.D., Arun A.B., Shen F.T., Lai W.A., Young C.C (2006) Phosphate solubilizing bacteria from subtropical soil their tricalcium phosphate solubilizing abilities, Appl Soil Ecol., 34: 33-41 21 Dey B.K (1988) Phosphate solubilizing organisms in improving fertility status of soil Plant Physiology Forum, Naya Prokash, Calcutta: 237 – 248 22 Domsch K.H.; Gams W.; Vàerson Traute-Heidi (1980) Fusarium Compendium of Soil Fungi London: Academic Press 333–337 23 Dong, Yuemei, Iniguez, A Leonardo, Triplett, Eric W (2003) Quantitative assessments of the host range strain specificity of 57 endophytic colonization by Klebsiella pneumoniae 342 Plant Soil, 257(1): 49-59 24 Fouda, A., Eid, AM., Elsaied, A., El-Belely, EF, Barghath, MG, Azab, E., Gobouri, AA, Hassan, SE-D (2021) Plant growth promoting endophytic bacterial community inhabiting the leaves of Pulicaria incisa (Lam.) Plants 10: 76 25 Greenwood, Norman N., Earnshaw, A (1997) Chemistry of the Elements Oxford: Butterworth-Heinemann 26 Gupta, Garima, Panwar, Jitendra, Akhtar, Mohd Sayeed, Jha, Prabhat N (2012) Endophytic nitrogen-fixing bacteria as biofertilizer in Lichtfouse, Eric (Editor), Sustainable Agriculture Reviews, Springer Netherl: 183-221 27 Hallmann, Quadt-Hallmann A., Mahafee W F., Kloepper J W (1997) Bacterial endophytes in agricultural crops Can J Microbiol., 43: 895-914 28 H Fankem, et al (2006) Occurrence functioning of phosphate solubilizing microorganisms from oil palm tree (Elaeis guineensis) rhizosphere in Cameroon African Journal of Biotechnology, 5, 2450-2460 29 Khan A., Jilani G., Akhtar M.S., Naqvi S.M.S., Rasheed M (2009) Phosphorus solubilizing bacteria: occurrence, mechanisms their role in crop production J Agric Biol Sci., 1(1): 48-58 30 McInroy, John A., Kloepper, Joseph W (1995) Population dynamics ofnendophytic bacteria in field-grown sweet corn cotton Canadian Journal of Microbiology, 41(10): 895-901 31 Oliveira, Marcelo N V., Santos, Thiago M A., Vale, Helson M M., Delvaux, Júlio C., Cordero, Alexvàer P., Ferreira, Alessvàra B., Miguel, Paulo S.B., Tótola, Marcos R., Costa, Maurício D., Moraes, Célia A Borges, Arnaldo C (2013) Endophytic microbial diversity in coffee cherries of Coffea arabica from Southeastern Brazil Canadian Journal of Microbiology, 59(4): 221-230 58 32 Rodr guez, Hilda, Fraga, Reynaldo (1999) Phosphate solubilizing bacteria their role in plant growth promotion Biotechnol 17(4): 319-339 33 Sarwar K., Macrac I.C (1992) Determination of bacterially derived auxins using a microplate method Lett Appl Microbiol 20: 282 - 286 34 Singh, Pratap D., Singh, Bahadur H., Prabha, Ratna (2016) Microbial inoculants in sustainable agricultural productivity Research Perspectives, Springer India: New Delhi, New Delhi 35 Summerll, Brett A Laurence, matthew H, Liew, Edward C.Y, Leslie, John F (2010) Biogeography phylogeography of Fusarium: a review Fungal Diversity 36 Summerbell, Richard (2003) Ascomycetes: Aspergillus, Fusarium, Sporothrix, Piedraia, and Their Relatives In Howard, Dexter H Pathogenic Fungi in Human and Animals 37 T Baliah, et al (2016) Isolation, identification characterization of phosphate solubilizing bacteria from different crop soils of Srivilliputtur Taluk, Virudhunagar District, Tamil Nadu Tropical Ecology 57(3): 465-474 38 Wilson, D.B (2011) Microbial diversity of cellulose hydrolysis Current opinion in microbiology 14: 259-263 39 Wilson, D.B (2008) Three microbial strategies for plant cell wall degradation Annals of the New York Academy of Sciences 1125: 289-297 59