Tách chiết tinh dầu và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa của cây cúc tần

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM KHOA CNSH - CNTP ĐẶNG VĂN CƯỜNG Đề tài: TÁCH CHIẾT TINH DẦU VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ CHỐNG OXY HĨA CỦA TINH DẦU CÚC TẦN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Khoa : CNSH - CNTP Ngành : Cơng nghệ thực phẩm Khóa học : 2018 – 2022 THÁI NGUYÊN - 2022 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM KHOA CNSH - CNTP ĐẶNG VĂN CƯỜNG Đề tài: TÁCH CHIẾT TINH DẦU VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ CHỐNG OXY HÓA CỦA TINH DẦU CÚC TẦN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Khoa : CNSH - CNTP Ngành : Cơng nghệ thực phẩm Khóa học : 2018 – 2022 Giáo viên hướng dẫn: Th.S Lưu Hồng Sơn Th.S Đinh Thị Kim Hoa THÁI NGUYÊN - 2022 i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC HÌNH iv DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT .v PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài PHẦN TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 2.1 Tổng quan cúc tần 2.1.1 Phân loại đặc điểm thực vật học cúc tần 2.1.2 Thành phần hóa học cơng dụng cúc tần 2.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu 2.2.1 Trên giới 2.2.2 Trong nước 2.3 Tổng quan tinh dầu 2.3.1 Khái niệm 2.3.2 Trạng thái tự nhiên phân bố tinh dầu 2.3.3 Tính chất lý, hóa tinh dầu 2.3.4 Thành phần hóa học 2.3.5 Ứng dụng tinh dầu 2.4 Tổng quan phương pháp tách chiết 2.4.1 Khái niệm mục đích chiết 2.4.2 Các phương pháp tách chiết 2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết 12 PHẦN ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Đối tượng nghiên cứu phạm vi nghiên cứu 17 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu: 17 ii 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu: 17 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 17 3.3 Nội dung nghiên cứu 17 3.4 Nguyên vật liệu, thiết bị dụng cụ hóa chất nghiên cứu 17 3.4.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 17 3.4.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất phục vụ nghiên cứu 18 3.5 Phương pháp nghiên cứu 19 3.5.1 Khảo sát điều kiện tách chiết tinh dầu cúc tần 19 3.5.2 Tối ưu hóa điều kiện tách chiết tinh dầu từ cúc tần 22 3.5.3 Phân tích thành phần cấu tử tinh dầu cúc tần phương pháp GC–MS 24 3.5.4 Đánh giá hoạt tính sinh học tinh dầu cúc tần 24 3.5.5 Các phương pháp xử lý số liệu 26 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .27 4.1 Kết khảo sát điều kiện tách chiết tinh dầu cúc tần 27 4.1.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng tinh dầu 27 4.1.2 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu 28 4.1.3 Ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng tinh dầu 29 4.2 Tối ưu hóa quy trình tách chiết tinh dầu cúc tần 29 4.3 Kết phân tích thành phần cấu tử tinh dầu cúc tần 32 4.4 Kết đánh giá hoạt tính sinh học tinh dầu cúc tần 34 4.4.1 Kết nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu Cúc tần 34 4.4.2 Kết nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa tinh dầu Cúc tần 35 4.5 Tính tốn giá thành sản phẩm 36 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 5.1 Kết luận 37 5.2 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Phân loại khoa học cúc tần Bảng 2.2: Thành phần chất có 100g cúc tần tươi Bảng 2.3: Thành phần hóa học tinh dầu cúc tần Nghệ An .7 Bảng 3.1: Thiết bị, dụng cụ hóa chất phục vụ nghiên cứu 18 Bảng 3.2: Bảng mã hóa điều kiện tối ưu 23 Bảng 3.3: Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố hàm lượng tinh dầu từ cúc tần 23 Bảng 4.1: Kết nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng tinh dầu cúc tần .27 Bảng 4.2: Kết nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu 28 Bảng 4.3: Kết ảnh hưởng yếu tố thời gian chiết dến hàm lượng tinh dầu 29 Bảng 4.4: Kết ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố chiết tinh dầu từ Cúc tần .30 Bảng 4.5: Thành phần hóa học tinh dầu cúc tần 33 Bảng 4.5: Kết xác định khả ức chế gốc tự 35 Bảng 4.6: Sơ giá thành lọ tinh dầu cúc tần 10mL .36 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Cây cúc tần Hình 4.1: Kết phân tích phương sai ANOVA mơ hình chiết tinh dầu từ Cúc tần 31 Hình 4.2: Bề mặt đáp ứng hàm lượng tinh dầu Cúc tần 31 Hình 4.3: Hàm kỳ vọng điều kiện tối ưu hàm lượng tinh dầu Cúc tần .32 Hình 4.4: Ảnh kháng khuẩn tinh dầu cúc tần 34 Hình 4.5: Sự tương quan hoạt tính ức chế gốc tự nồng độ tinh dầu .35 Hình 4.6: Đánh giá hoạt tính chống oxy hố tinh dầu cúc tần 36 v DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Từ, thuật ngữ viết tắt Nghĩa từ, thuật ngữ CT Công thức DM Dung môi DPPH 2,2-Diphenyl-l-picrylhydrazyl HLTD Hàm lượng tinh dầu NL Nguyên liệu PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây cúc tần loại mọc hoang nông thơn biết dược tính tốt cây, vị thuốc dân gian, loại thảo dược q Đơng y có tác dụng chữa bệnh trĩ, sỏi thận, ho, cảm, sốt nhiều công dụng khác Cúc tần hay cịn có nhiều tên gọi nhân gian khác như: rau cúc tần, từ bi, đại ngải, hoa mai não, đại bi Tên khoa học Pluchea Indica (L) Less, thuộc chi cúc tần – Pluchea, thuộc họ Cúc Có nguồn gốc từ Malaysia Ấn Độ, du nhập vào Việt Nam từ nhiều năm trước Cúc tần Việt Nam chủ yếu dùng làm rau thuốc, số loại cúc tần dây leo khác cúc tần Ấn Độ, cúc tần Nhật Bản chủ yếu trồng làm cảnh Cây cúc tần mọc hoang dại nhiều nơi, người ta thường sử dụng cúc cần để làm nguyên liệu nấu ăn Tuy nhiên biết cịn có cơng dụng chữa trị bệnh như: hỗ trợ tiêu hóa, tán phong hàn, tiêu độc, sát trùng, tiêu ứ, lợi tiểu Trong Đơng y, cúc tần có vị đắng, cay, tính ấm có mùi thơm Có công dụng điều trị bệnh phong thấp, phong hàn, sát trùng, tiêu đờm, hạ áp, kháng viêm, khu phong, trừ thấp, tiêu thũng lợi tiểu, minh mục, bồi bổ thể, tiêu độc, tiêu ứ, hoạt huyết, cường tim, kích thích hệ tiêu hố, tán uất hỏa Theo y học đại nhiều nghiên cứu chứng minh cúc tần có hoạt tính chống oxy hố, chống viêm, chống lt, hạ nhiệt, hạ đường huyết, lợi tiểu chống khuẩn nhiều cơng dụng, tác dụng hưu ích Vì vậy, em hình thành ý tưởng định thực đề tài “Tách chiết tinh dầu đánh giá hoạt tính kháng khuẩn chống oxy hóa cúc tần” Để tối ưu hố quy trình tách chiết, đánh giá hoạt tính sinh học tinh dầu cúc tần 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát - Tách chiết tinh dầu cúc tần - Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật chống oxy hóa tinh dầu cúc tần - Tính tốn giá thành sản phẩm 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Khảo sát điều kiện tách chiết tinh dầu cúc tần: Khảo sát thông số nhiệt độ, tỉ lệ dung môi, thời gian - Tối ưu hóa tách chiết tinh dầu: đánh giá tương tác nhân tố, hỗ trợ phần mềm tối ưu hóa - Phân tích thành phần cấu tử tinh dầu - Đánh giá hoạt tính sinh học tinh dầu: kháng khuẩn, chống oxy hóa 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài - Sinh viên có hội áp dụng kiến thức học vào thực tế tạo điều kiện cho sinh viên tích lũy kiến thức, kinh nghiệm thực hành, thí nghiệm, kinh nghiệm thực tiễn sản xuất Giúp sinh viên bước đầu làm quen tự tiến hành với phương pháp nghiên cứu khoa học - Dùng làm tài liệu tham khảo tài liệu chuyển giao lĩnh vực liên quan 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Các kết nghiên cứu từ đề tài cung cấp thông tin khoa học đáng tin cậy thành phần hoá học đánh giá tác dụng, hoạt tính kháng vi sinh vật chống oxy hóa cúc tần Góp phần xây dựng sở khoa học cho việc khai thác sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên thực vật đất nước phục vụ cho nhu cầu nghiên cứu mới, làm tiền đề vững cho nghiên cứu có liên quan thành phần hố học xác định giá trị cúc tần PHẦN TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 2.1 Tổng quan cúc tần 2.1.1 Phân loại đặc điểm thực vật học cúc tần 2.1.1.1 Vị trí phân loại thực vật: Cúc tần có tên gọi khác rau cúc tần, từ bi, đại ngải, hoa mai não, đại bi , [15], [16], [17] Bảng 2.1: Phân loại khoa học cúc tần Giới Plante Tên khoa học Pluchea indica Bộ Asterales Họ Asteraceae Chi Pluchea Loài P indicia 2.1.1.2 Đặc điểm thực vật học Hình 2.1: Cây cúc tần 34 Từ kết cho thấy thành phần hóa học tinh dầu cúc tần thu có 25 hợp chất Trong chất có hàm lượng cao Caryophyllene Oxyde(6.55%), Caryophyllene(5.47%), Silphiperfol-5-ene(5.22%), Humulene(5.13%) Kết có khác biệt với kết nghiên cứu thành phần tinh dầu cúc tần Nghệ An theo nghiên cứu Nguyễn Thị Chung.(1999) Cụ thể nghiên cứu công bố tìm 34 hợp chất xác định 22 hợp chất Với thành phần là: -selinen, -copaen, 7-H-Silphiperfol-5-en Sở dĩ có sai khác khác điều kiện, khí hậu, thổ nhưỡng điều kiện thực nghiệm nên thành phần chất tinh dầu khác 4.4 Kết đánh giá hoạt tính sinh học tinh dầu cúc tần 4.4.1 Kết nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu Cúc tần Để biết tinh dầu cúc tần có hoạt tính kháng khuẩn hay không: Chúng sử phương pháp khuếch tán giếng thạch cách đo đường kính vùng ức chế tăng trưởng vi khuẩn (mm) tinh dầu đĩa thạch Kết nghiên cứu ảnh hưởng tinh dầu cúc tần ảnh hưởng đến khả kháng khuẩn thể hiện: Tinh dầu từ cúc tần có khả kháng chuẩn chống lại vi khuẩn thử nghiệm E.coli với kích thước vịng kháng khuẩn đo là: 1,5 mm Từ ta khẳng định tinh dầu chiết suất từ cúc tần có khả kháng khuẩn khả kháng khuẩn yếu Hình 4.4: Ảnh kháng khuẩn tinh dầu cúc tần 35 4.4.2 Kết nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa tinh dầu Cúc tần Qua q trình thí nghiệm với chất thử DPPH, tơi xác định tương quan hoạt tính ức chế gốc tự nồng độ tinh dầu thể qua hình 4.4 Bảng 4.5: Kết xác định khả ức chế gốc tự Lần Độ hấp thụ Mẫu đối chứng %DPPH 0,287 0,286 0,286 0,524 45,41 0,247 0,246 0,248 0,247 0,524 52,86 30 0,198 0.197 0,198 0,198 0,524 62,21 40 0,146 0.147 0,147 0,147 0,524 71,94 50 0,081 0,081 0,082 0,081 0,524 84,54 Nồng độ (µg/mL) Lần Lần 10 0,286 20 Hình 4.5: Sự tương quan hoạt tính ức chế gốc tự nồng độ tinh dầu Từ phương trình ta suy giá trị IC50 tinh dầu cúc tần là: IC50 = 16,24 (µg/mL) 36 Hình 4.6: Đánh giá hoạt tính chống oxy hố tinh dầu cúc tần 4.5 Tính tốn giá thành sản phẩm Để đánh giá hiệu kinh tế tinh dầu Cúc tần tiến hành khảo sát sơ giá thành sản phẩm 68.600 đồng/lọ 10mL, qua tham khảo giá thành sản phẩm loại thị trường thấy tiềm cạnh tranh thương mại hoá sản phẩm Kết tính tốn sơ giá thành sản phẩm tinh dầu hồi trình bày bảng 4.7 Bảng 4.6: Sơ giá thành lọ tinh dầu cúc tần 10mL STT Chỉ tiêu tính tốn Đơn vị Kg Số lượng 12 Đơn giá (đồng)/kg 5.000 Giá thành sản phẩm (đồng) 60.000 Cúc tần Điện Kwh 0,20 3.000 600 Nước m3 0,40 9.000 3.500 Nhân cơng Cơng 0,01 200.000 1.000 Nhãn mác, bao bì Bộ 2.500 2.500 Chi phí khác 1.000 1.000 Tổng 68.600 Qua bảng ta nhận thấy chi phí lớn cho nguyên liệu 60.000 đồng để sản suất 10mL tinh dầu cúc tần quy mơ phịng thí nghiệm, chi phí giảm xuống đưa vào thực tiễn sản suất sử dụng trang thiết bị đại, cơng suất lớn, tối ưu lại quy trình tách chiết tìm vùng nguyên liệu trồng cúc tần phù hợp 37 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Sau trình nghiên cứu thực đề tài khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, nắm được: - Tôi khảo sát điều kiện tách chiết tinh dầu: Thông số nhiệt độ tốt 100oC; Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu tốt 3/2 (mL/g); Thông số thời gian tốt 60 phút - Thông số tối ưu hóa điều kiện tách chiết sau: Thông số nhiệt độ tối ưu là: 100.41oC; Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu tối ưu là: 1.65 (mL/g); Thông số thời gian tối ưu là: 58.65 phút - Qua q trình làm nghiên cứu làm thí nghiệm, xác định tinh dầu cúc tần trồng Thái Nguyên có 25 hợp chất, chất có hàm lượng cao là: Caryophyllene, Oxyde (6,55%), Caryophyllene (5.47%), Silphiperfol-5 ene (5,22%), Humulene (5,13%) - Tinh dầu cúc tần có khả kháng khuẩn chống oxy hóa khơng cao - Giá thành sản xuất tinh dầu cúc tần (10mL) 68.600 đồng nhận thấy mức giá tốt cạnh tranh thị trường 5.2 Kiến nghị Do thời gian tiến hành thí nghiệm ngắn sở vật chất phục vụ cho nghiên cứu q trình thí nghiệm nên em xin có số kiến nghị với khoa nhà trường sau: Sử dụng phương pháp tách chiết khác để tiếp tục khảo sát điều kiện tối ưu cho phương pháp Nghiên cứu đánh giá thêm yếu tố ảnh hưởng đến trình tách chiết tinh dầu khác như: chất xúc tác, trạng thái nguyên liệu 38 Sử dụng đa dạng vi sinh vật thuộc nhiều chủng khác để đánh giá khách quan, chi tiết khả kháng khuẩn tinh dầu cúc tần Tiếp tục nghiên cứu đánh giá thêm hoạt tính sinh học khác tinh dầu cúc tần để từ có nhìn nhận tổng quan hoạt tính sinh học tinh dầu cúc tần Làm nguồn tài liệu cho nghiên cứu có liên quan sau 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thị Chung, Nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu cúc tần Pluchea indica (L.) less Nghệ An Luận văn thạc sỹ khoa hóa học Đại học Vinh 1999 Võ Văn Chí (1999), Từ điển thuốc Việt Nam.Nxb y học Đinh Thị Kim Hoa , Nguyễn Thị Tình , Tạ Thị Lượng, Nguyễn Văn Duy, Nguyễn Thị Trà My, Lê Thị Hồng Ngọc, Nông Thị Hồng Ngọc, Vi Đại Lâm, Lưu Hồng Sơn, “Nghiên cứu quy trình tách chiết carotenoid tổng số từ cúc tần (pluchea indica less.) thu hái thái nguyên”.2021 Phạm Đình Hùng, cộng sự, “nghiên cứu tách chiết, xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ thuộc họ cúc, cà phê, ô rô, bứa số họ khác mọc phổ biến miền nam việt nam”,2005 Lê Mai Hương Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả tách chiết tinh dầu từ trầu khơng đánh giá hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành công nghệ thực phẩm Đại học Nông Lâm Thái Nguyên 2020 Phạm Thanh Kỳ Bài giảng dược liệu Đại học dược Hà Nội 1998 Đỗ Tất Lợi (1997), Cây thuốc bắc nam Nxb y học Đỗ Tất Lợi (2004) “Những thuốc vị thuốc Việt Nam”, tr 668- 669 Nxb y học Lã Đình Mới Tài nguyên thực vật có tinh dầu Việt Nam Nxb Nông nghiệp Hà Nội 2001 10 Nguyễn Duy Phước Nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu cúc tần(Pluchea indica(L.) Less) Hà Tĩnh Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành hóa hữu Đại học Vinh 2003 11 Lê Văn Hạc, Nguyễn Thị Chung, Nguyễn Xuân Dũng, Hồ Quang Trung, and Piet.A.Leclerq constituents of leaf and root essentianal oil of Pluchea indica(L.) Less from Viet Nam,J.of essential oil- Brearing Plant.2000, Vol 3, No.1, pp 21-29 40 12 Tiêu chuẩn Việt Nam 10495 : 2015 13 Tiêu chuẩn quốc gia 11939 : 2017 Tiếng Anh 14 Cho et al (2012) Crude aqueous extracts of Pluchea indica (L.) Less inhibit proliferation and migration of cancer cells through induction of p53-dependent cell death BMC complementary and alternative medicine, 12, 265 Trang web 15 https://omega3.vn/cay-cuc-tan.htmL 16 https://vi.wikipedia.org/wiki/C%C3%BAc_t%E1%BA%A7n 17 https://dty.vn/thuoc-nam/tong-quan-ve-cay-cuc-tan PHỤ LỤC Phụ lục 1: Một số hình ảnh q trình tách chiết đánh giá hoạt tính tinh dầu cúc tần Hình 1: Lá tần tươi Hình 2: Thiết bị khảo sát điều kiện tách chiết tinh dầu Hình 3: Hệ thống chiết tinh dầu cúc tần Hình 4: Tách chiết tinh dầu cúc tần Hình 5: Tinh dầu cúc tần Phụ lục 2: Hình ảnh chạy quang phổ tinh dầu hồi Phụ lục 3: Xử lý số liệu Xử lý kết khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình tách chiết tinh dầu 1.1 Xử lý kết kháo sát nhiệt độ ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu ANOVA hamLuongtinhdau Sum of Mean Squares Between df ,482 Square Sig ,241 24,11 Groups Within ,060 ,542 ,010 Groups Total hamLuongtinhdau Subset for alpha = CT 0.05 N Dunca na 3 Sig ,267 ,533 ,833 1,000 1,000 1,000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 F ,001 1.2 Xử lý kết khảo sát thời gian chiết ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu ANOVA hamLuongtinhdau Sum of Mean Squares Between df Square ,482 ,241 ,060 ,010 ,542 F Sig 24,111 Groups Within Groups Total hamLuongtinhdau CT Subset for alpha = 0.05 N Duncana 3 3 Sig ,267 ,533 ,833 1,000 1,000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 1,000 ,001 1.3 Xử lý kết khảo sát tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu ANOVA hamLuongtinhdau Sum of Squares Between Mean df Square ,482 ,241 ,060 ,010 ,542 F Sig 24,111 ,001 Groups Within Groups Total hamLuongtinhdau CT Subset for alpha = 0.05 N Duncana 3 3 Sig ,267 ,533 ,833 1,000 1,000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 1,000 1.4 Tối ưu hóa q trình tách chiết tinh dầu Cúc tần