Giải trình tự bộ gen một số loài nấm linh chi thu hái ở quảng nam bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới trên thiết bị illumina miseq

VŨ THỊ KIM PHƯỢNG - KHÓA 2020 – 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VŨ THỊ KIM PHƯỢNG GIẢI TRÌNH TỰ BỘ GEN MỘT SỐ LỒI NẤM LINH CHI THU HÁI Ở QUẢNG NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI TRÊN THIẾT BỊ ILLUMINA MISEQ - NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VŨ THỊ KIM PHƯỢNG GIẢI TRÌNH TỰ BỘ GEN MỘT SỐ LOÀI NẤM LINH CHI THU HÁI Ở QUẢNG NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI TRÊN THIẾT BỊ ILLUMINA MISEQ NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS NGUYỄN TÚ ANH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 Luận văn thạc sĩ – Khóa 2020 – 2022 Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất – Mã số: 8720210 Giải trình tự gen số loài nấm linh chi thu hái Quảng Nam phương pháp giải trình tự gen hệ thiết bị Illumina Miseq Học viên: Vũ Thị Kim Phượng Hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Tú Anh Từ khóa: Nấm linh chi, ITS, DNA, giải trình tự gen Đặt vấn đề mục tiêu nghiên cứu: Nấm linh chi sử dụng rộng rãi giới từ hàng ngàn năm để cải thiện sức khỏe, hỗ trợ điều trị bệnh mạn tính nhiễm khuẩn Trong năm gần đây, nghiên cứu giải trình tự gen nấm linh chi phát gen liên quan đến sinh tổng hợp triterpen chất chuyển hóa khác Những thơng tin làm sáng tỏ đường chuyển hóa chế hoạt động chất chuyển hóa thứ cấp nấm linh chi đặt móng tốt cho sản xuất quy mơ lớn thuốc tự nhiên có nguồn gốc từ nấm linh chi Trong nghiên cứu này, tiến hành: (i) Khảo sát đặc điểm hình thái số mẫu nấm linh chi thu hái Quảng Nam, (ii) Tách chiết DNA gen giải trình tự gen vùng ITS phương pháp Sanger, (iii) Giải trình tự gen phương pháp giải trình tự gen hệ thiết bị Illumina Miseq, (iv) Phân tích liệu Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: mẫu nấm linh chi thu hái tỉnh Quảng Nam (Việt Nam) Phương pháp nghiên cứu: Định danh nấm linh chi dựa vào đặc điểm hình thái thể quan sát mắt thường bào tử quan sát kính hiển vi Định danh nấm linh chi dựa vào trình tự gen vùng ITS phương pháp PCR với cặp mồi ITS1 ITS4 từ liệu giải trình tự Illumina Sử dụng phần mềm tin sinh để lắp ráp gen, dự đốn thích gen Kết quả: mẫu nấm linh chi định danh đặc điểm hình thái trình tự ITS thuộc chi Ganoderma, tương đồng cao với loài G multiplicatum, G tropicum, G flexipes, G lucidum Lắp ráp de novo gen mẫu nấm linh chi SP1 có độ dài gen 42.942.033 bp, 51.700 contig, độ dài contig lớn 21.019 bp, N50 1.578 bp, tỷ lệ GC 55,08% SP2 có độ dài gen 49.487.313 bp, 86.858 contig, độ dài contig lớn 12.727 bp, N50 709 bp, tỷ lệ GC 54,16% SP3 có độ dài gen 39.148.962 bp, 37.936 contig, độ dài contig lớn 82.794 bp, N50 2.192 bp, tỷ lệ GC 59,24% SP4 có độ dài gen 56.504.935 bp, 100.758 contig, độ dài contig lớn 15.064 bp, N50 806 bp, tỷ lệ GC 53,72% So sánh gen mẫu SP4 với liệu tham chiếu gen loài G lucidum Kết quả, so sánh với G.lucidum Ling-Jian No.2 cho gen có độ dài lớn 42,7 Mb với 56 contig Phân tích thích dự đốn gen, có 8.988 gen mã hóa protein Số lượng gen chức theo sở liệu GO, InterProscan, EggNog, Pfam, Cazyme, Merops, Busco 4.384, 6.327, 7.721, 4.979, 316, 339, 1.310 Xác định có 29 vùng gen liên quan đến trình sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp terpen, NRPS, NRPS-like, T1PKS, betalacton, có vùng gen có tỷ lệ tương đồng 100% với cụm gen liên quan đến chuyển hóa acid clavaric từ loài nấm Hypholoma sublateritium Kết luận kiến nghị: Đã giải trình tự gen mẫu nấm linh chi Từ liệu gen, tiếp tục phân tích gen chức liên quan tới trình sinh tổng hợp chất có tác dụng dược lý acid ganoderic,…Đề xuất đưa liệu trình tự đoạn ITS phân tích từ liệu Illumina Miseq liệu trình tự gen mẫu lên ngân hàng NCBI để làm tài liệu tham chiếu Master’s thesis – Academic course: 2020 - 2022 Specialty: Drug quality control and Toxicology – Code: 8720210 Genome sequence of the Ganoderma species from Quang Nam by the next generation sequencing method on Illumina Miseq instrument Student: Vu Thi Kim Phuong Supervisor: Assoc Prof Dr Nguyen Tu Anh Keywords: Ganoderma, ITS, DNA, genome sequence Introductions and research objectives: Ganoderma has been widely used in the world for thousands of year to improve heath and to treat the chronic and infectios diseases In recent years, several studies involving the whole-genome sequencing of Ganoderma fungi have identified some genes involved in the synthesis and regulation of triterpenes and other secondary metabolites This data helps to clarify the metabolic pathways and regulatory mechanisms of secondary metabolite synthesis in Ganoderma and lays a good foundation for the large-scale production of natural drugs from Ganoderma In this study, we conducted: (i) Survey of morphological characteristics of some Ganoderma samples collected in Quang Nam, (ii) Extraction of genomic DNA and sequencing of ITS region genes by Sanger method, (iii) Genome sequencing using next-generation sequencing on an Illumina Miseq instrument, (iv) Analysis data from Illumina Miseq Objective and research methods: Object of the study: samples of Ganoderma species collected in Quang Nam province (Viet Nam) Methods: Identification of Ganoderma species by morphological characteristics of fruiting bodies observed with the naked eye and spores observed under a microscope Identification of Ganoderma species by ITS region by PCR with special primer pairs ITS1 and ITS4 and from Illumina sequencing data Use bioinformatics software for genome assembly, gene prediction and annotation Results: samples identified by morphological characteristics and ITS sequences showed that all of them belong to Ganoderma They were most similar to the species G multiplicatum, G tropicum, G flexipes, G lucidum De novo assembly the Ganoderma species SP1 has a genome sequence of 42,942,033 bp, 51,700 contigs, the largest contig length is 21,019 bp, N50 is 1,578 bp, GC rate is 55.08% SP2 has a genome sequence of 49,487,313 bp, 86,858 contig, the largest contig length is 12,727 bp, N50 is 709 bp, GC rate is 54.16% SP3 has a genome sequence of 39,148,962 bp, 37,936 contigs, the largest contig length is 82,794 bp, N50 is 2,192 bp, GC rate is 59.24% SP4 has a genome sequence of 56,504,935 bp, 100,758 contigs, the largest contig length is 15,064 bp, N50 is 806 bp, GC rate is 53.72% Comparison of the SP4 sample genome with reference data of genomes of G lucidum The results, when compared with G.lucidum Ling-Jian No.2 gave the largest genome length of 42.7 Mb with 56 contigs Gene annotation and prediction analysis, there are 8,988 proteincoding genes The number of functional genes according to the database of GO, InterProscan, EggNog, Pfam, Cazyme, Merops, Busco is 4,384, 6,327, 7,721, 4,979, 316, 339, 1,310, respectively There are 29 gene regions involved in the biosynthesis of secondary metabolites terpenes, NRPS, NRPS-like, T1PKS, betalacton, of which gene region has 100% similarity with gene clusters related to the metabolism of clavaric acid from the fungus Hypholoma sublateritium Conclusions and recommendations: Genomes of Ganoderma species were sequenced Continue to analyze functional genes involved in the biosynthesis of pharmacological substances such as ganoderic acid, Deposit ITS sequence analyzed from the Illumina Miseq data and the genome sequence data to the NCBI bank for reference LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan Tác giả luận văn Vũ Thị Kim Phượng MỤC LỤC Trang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm linh chi 1.2 Định danh nấm linh chi .10 1.3 Các phương pháp giải trình tự gen 12 1.4 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 18 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .22 2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.2 Dung môi, hóa chất, mồi .22 2.3 Trang thiết bị, dụng cụ 23 2.4 Địa điểm nghiên cứu 23 2.5 Phương pháp nghiên cứu 24 Chương KẾT QUẢ .31 3.1 Đặc điểm hình thái mẫu nấm linh chi 31 3.2 Định danh mẫu nấm linh chi phương pháp giải trình tự Sanger vùng ITS 33 3.3 Giải trình tự gen nấm linh chi phương pháp giải trình tự gen hệ thiết bị Illumina miseq 34 Chương BÀN LUẬN 53 4.1 Về đặc điểm hình thái 53 4.2 Định danh mẫu nấm linh chi dựa vào trình tự DNA đoạn ITS 53 4.3 Giải trình tự gen nấm linh chi thiết bị Illumina Miseq 55 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .61 5.1 Kết luận .61 5.2 Kiến nghị .62 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh BLT Bead Linked Buffer bp Base pair ddNTP Dideoxynucleotide triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleotide triphosphate EPM Enhanced PCR Mix gDNA Genome deoxyribonucleic acid ITS Internal transcribed spacer NCBI National center for biotechnology Tiếng Việt Cặp base Vùng đệm phiên mã information NGS Next-Generation Sequencing Giải trình tự gen hệ PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase PE Pair end RSB Resuspension Buffer SE Single end SPB Sample Purification Beads TB1 Tagmentation Buffer TSB Tagment Stop Buffer TWB Tagment Wash Buffer WGS Whole genome sequencing Giải trình tự gen 61 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Sau trình thực hiện, luận văn hồn thành nội dung nghiên cứu đạt mục tiêu sau: - Phân tích đặc điểm hình thái thể đặc điểm kính hiển vi mẫu nấm linh chi thu hái Quảng Nam (Việt Nam) - Đã chiết tách DNA mẫu nấm linh chi, khuếch đại, giải trình tự đoạn ITS Sanger định danh dựa ngân hàng liệu gen NCBI mẫu có độ tương đồng cao với lồi G lucidum, mẫu có độ tương đồng cao với lồi G multiplicatum, mẫu có độ tương đồng cao với lồi G flexipes mẫu có độ tương đồng cao với loài G tropicum - Giải trình tự gen mẫu nấm linh chi phương pháp giải trình tự gen hệ thiết bị Illumina Miseq:  Phân tích liệu trình tự vùng ITS mẫu nấm linh chi dựa liệu Illumina Miseq Kết tương đồng với định danh phương pháp Sanger có tỷ lệ tương đồng cao SP1 tương đồng với G multiplicatum (99,84%), SP2 tương đồng với G tropicum (99,74%), SP3 tương đồng với G flexipes (99,85%), SP4 tương đồng với G lucidum (99,69%)  Lắp ráp de novo gen mẫu nấm linh chi SP1 có độ dài gen 42.942.033 bp, 51.700 contig, độ dài contig lớn 21.019 bp, N50 1.578 bp, tỷ lệ GC 55,08% SP2 có độ dài gen 49.487.313 bp, 86.858 contig, độ dài contig lớn 12.727 bp, N50 709 bp, tỷ lệ GC 54,16% SP3 có độ dài gen 39.148.962 bp, 37.936 contig, độ dài contig lớn 82.794 bp, N50 2.192 bp, tỷ lệ GC 59,24% SP4 có độ dài gen 56.504.935 bp, 100.758 contig, độ dài contig lớn 15.064 bp, N50 806 bp, tỷ lệ GC 53,72%  So sánh gen mẫu SP4 với liệu tham chiếu gen loài G lucidum Kết quả, so sánh với G.lucidum Ling-Jian No.2 cho gen có độ dài lớn 62 42,7 Mb với 56 contig Phân tích thích dự đốn gen, có 8.988 gen mã hóa protein Số lượng gen chức theo sở liệu GO, InterProscan, EggNog, Pfam, Cazyme, Merops, Busco 4.384, 6.327, 7.721, 4.979, 316, 339, 1.310 Xác định có 29 vùng gen liên quan đến q trình sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp terpen, NRPS, NRPS-like, T1PKS, betalacton, có vùng gen có tỷ lệ tương đồng 100% với cụm gen liên quan đến chuyển hóa acid clavaric từ lồi nấm Hypholoma sublateritium 5.2 Kiến nghị - Đưa liệu trình tự đoạn ITS phân tích từ liệu Illumina Miseq liệu trình tự gen mẫu lên ngân hàng NCBI để làm tài liệu tham chiếu - Tiếp tục phân tích gen chức liên quan tới q trình sinh tổng hợp chất có tác dụng dược lý acid ganoderic,…Hiểu rõ gen giúp ứng dụng tương lai cho ứng dụng sản xuất thuốc từ nấm linh chi Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Xuân Thám Nấm linh chi - Nguồn dược liệu quý Việt Nam Nhà xuất Mũi Cà Mau; 1996 Bishop KS, Kao CH, Xu Y, Glucina MP, Paterson RRM, Ferguson LRJP From 2000 years of Ganoderma lucidum to recent developments in nutraceuticals 2015;114:56-65 Gao Y, Tang W, Gao H, et al Antimicrobial activity of the medicinal mushroom Ganoderma 2005;21(2):211-229 Ma H-T, Hsieh J-F, Chen S-TJP Anti-diabetic effects of Ganoderma lucidum 2015;114:109-113 Zhou X, Lin J, Yin Y, Zhao J, Sun X, Tang KJTAjoCm Ganodermataceae: natural products and their related pharmacological functions 2007;35(04):559-574 Jargalmaa S, Eimes JA, Park MS, Park JY, Oh S-Y, Lim YWJP Taxonomic evaluation of selected Ganoderma species and database sequence validation 2017;5:e3596 Kües U, Nelson DR, Liu C, et al Genome analysis of medicinal Ganoderma spp with plant-pathogenic and saprotrophic life-styles 2015;114:18-37 Cong-Cong X, Bing W, Yi-Qiong P, Jian-Sheng T, Zhang TJCjonm Advances in extraction and analysis of phenolic compounds from plant materials 2017;15(10):721-731 Hội đồng Dược điển Việt Nam Dược điển Việt Nam V Tập Nhà xuất Y học; 2017:1229-1231 10 Trịnh Tam Kiệt Nấm lớn Việt Nam Tập Nhà xuất Khoa học Tự nhiên Công nghệ; 2012 11 Zhou L-W, Cao Y, Wu S-H, et al Global diversity of the Ganoderma lucidum complex (Ganodermataceae, Polyporales) inferred from morphology and multilocus phylogeny 2015;114:7-15 12 Nguyễn Lân Dũng Công nghệ nuôi trồng nấm Tập Nhà xuất nông nghiệp; 2004 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 13 Kino K, Yamashita A, Yamaoka K, et al Isolation and characterization of a new immunomodulatory protein, ling zhi-8 (LZ-8), from Ganoderma lucidium 1989;264(1):472-478 14 Xiaotong Y, Yueqin Z, Xuquan L, Huiqin F, Ke M, Qingyao YJM A comparison study of the in vitro anticancer activity and mechanism of ethanol extracts from mycella of different Ganoderma lucidum strains 2005;24(2):251-258 15 Zjawiony JKJJonp Biologically active compounds from Aphyllophorales (polypore) fungi 2004;67(2):300-310 16 Ohno N, Jinushi T, Yadomae TJIJoMM Th1-Oriented Immunomodulating Activity of Gel-Forming Fungal (1® 3)-Beta-Glucans 2002;4(2) 17 Loyd A, Barnes C, Held B, et al Elucidating" lucidum": Distinguishing the diverse laccate Ganoderma species of the United States 2018;13(7):e0199738 18 Smith BJ, Sivasithamparam KJASB Morphological studies of Ganoderma (Ganodermataceae) from the Australasian and Pacific regions 2003;16(4):487-503 19 Poczai P, Hyvönen JJMbr Nuclear ribosomal spacer regions in plant phylogenetics: problems and prospects 2010;37(4):1897-1912 20 Nazir R, Rehman S, Nisa M, ali Baba U Exploring bacterial diversity: from cell to sequence Freshwater Microbiology Elsevier; 2019:263-306 21 Zhou X, Ren L, Li Y, Zhang M, Yu Y, Yu JJSCLS The next-generation sequencing technology: a technology review and future perspective 2010;53(1):4457 22 Van Dijk EL, Auger H, Jaszczyszyn Y, Thermes CJTig Ten years of next- generation sequencing technology 2014;30(9):418-426 23 Goodwin S, McPherson JD, McCombie WRJNRG Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies 2016;17(6):333-351 24 Mardis ERJARAC Next-generation sequencing platforms 2013;6(1):287- 303 25 Ryvarden L Can we trust morphology in Ganoderma? 1994:19-24 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 26 Moncalvo J-M, Wang H-H, Hseu R-SJM Phylogenetic relationships in Ganoderma inferred from the internal transcribed spacers and 25S ribosomal DNA sequences 1995;87(2):223-238 27 Smith B, Sivasithamparam KJMR Internal transcribed spacer ribosomal DNA sequence of five species of Ganoderma from Australia 2000;104(8):943-951 28 Liao B, Chen X, Han J, et al Identification of commercial Ganoderma (Lingzhi) species by ITS2 sequences 2015;10(1):1-9 29 Chen S, Xu J, Liu C, et al Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum 2012;3(1):1-9 30 Liu D, Gong J, Dai W, et al The genome of Ganderma lucidum provide insights into triterpense biosynthesis and wood degradation 2012;7(5):e36146 31 Tian Y-Z, Wang Z-F, Liu Y-D, Zhang G-Z, Li GJG The whole-genome sequencing and analysis of a Ganoderma lucidum strain provide insights into the genetic basis of its high triterpene content 2021;113(1):840-849 32 Zhu Y, Xu J, Sun C, et al Chromosome-level genome map provides insights into diverse defense mechanisms in the medicinal fungus Ganoderma sinense 2015;5(1):1-14 33 Agudelo-Valencia D, Uribe-Echeverry PT, Betancur-Pérez JFJG De novo assembly and annotation of the Ganoderma australe genome 2020;112(1):930-933 34 Utomo C, Tanjung ZA, Aditama R, et al Complete Mitochondrial Genome Sequence of the Phytopathogenic Basidiomycete Ganoderma b oninense Strain G3 2019;8(5):e00968-18 35 Binder M, Justo A, Riley R, et al Phylogenetic and phylogenomic overview of the Polyporales 2013;105(6):1350-1373 36 Phạm Thị Minh Tâm, Lê Thị Thu Cúc, Trần Thị Quỳnh Chi, Trần Việt Hùng, Nguyễn Ngọc Vinh Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào nghiên cứu số loài nấm linh chi Việt Nam Tạp chí dược học 2016;56(9):21-26 37 Illumina Miseq System Guide 2019 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 38 British Pharmacopoeia Commission Deoxyribonucleic acid (DNA) based identification techniques for herbal drugs British Pharmacopoeia Appendix XI vol V Stationery Office, London; 2022 39 Voo CL, Yeo DE, Chong K-P, Rodrigues KFJMra Draft Genome Sequence of a Phytopathogenic Ganoderma sp Strain That Causes Basal Stem Rot Disease on Oil Palm in Sabah, Malaysia 2020;9(1):e01240-19 40 Utomo C, Tanjung ZA, Aditama R, et al Draft genome sequence of the phytopathogenic fungus Ganoderma boninense, the causal agent of basal stem rot disease on oil palm 2018;6(17):e00122-18 41 Godio RP, Fouces R, Martín JFJC, biology A squalene epoxidase is involved in biosynthesis of both the antitumor compound clavaric acid and sterols in the basidiomycete H sublateritium 2007;14(12):1334-1346 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - PHỤ LỤC Phụ lục 1: Hình ảnh thể quan sát mắt thường mẫu nấm linh STT Mẫu SP1 SP2 SP3 SP4 SP5 Mặt trước Mặt sau Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - STT Mẫu SP6 SP7 SP8 Mặt trước Mặt sau Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - Phụ lục 2: Trình tự ITS mẫu nấm linh chi phương pháp PCR với cặp mồi ITS1 ITS4 SP1-SG ATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAGTCCTACCTGATTTGAGGTCAGA GGTCATAAAGCTGTCTTCAACTGAGACGGTTAGGAGCTTGCCAAACGCT TCACGGTCGCGGCGCAGACATTATCACACCGACAGCCGATCCGCAAGGA ACCAAGCTAATGCATTTGAGAGAAGCCGACCAAGAACGGCCAGCAAGC CTCCAAGACAAAGCCTACAAACCGCAAAAGCTTGTAGGTTGAAGATTTC ATGACACTCAAACAGGCATGCTCCTCGGAATACCAAGGAGCGCAAGGT GCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTAT CGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGCT GAAAGTTGTATATAGATGCGTTACATCGCGATACACATTCTGATACTTTA TAGGGTTTGTGATAGACGCAGGCGCAGACACGCTTCCGCAAAGCCCGGT AAAGAGCCAGATTCACGCATTTATATATTTCGCGGCTCACACAAGGGGA TCAGGTGTAGAGTGGATGAGCAGGGCGTGCACATGCCCCGGAAGGCCA GCTACAACCCAGTCAAGACTCTATAATGATCCTTCCGCAGG SP2-SG CTTTTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAGTCCTACCTGATTTGAGG TCAGAGGTCATACCACAGCTGTCTCCAACTGAGACTGTTAGAAGCTTGC CAAACGCTTCACGGTCGCGGCGTAAACATTATCACACCGAGAGCCGATC CGCAAGGAACCAAGCTAATGCATTTAAGAGGAGCCGACCAAGAACGGC CGACAAGCCTCCAAGTCCAAGCCTACAAAACCGCAAAGGCTTGTAGGTT GATGATTTCATGACACTCAAACAGGCATGCTCCTCGGAATACCAAGGAG CGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCAC ATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGA TCCGTTGCTGAAAGTTGTATATAGATGCGTTACATCGCAATACACATTCT GATACTTTATAGAGTTTGTGATAAACGCAGGCACAGACACGTCCTGCAA AGCCCGGTGAAGGGCCCTGCTTTACGATCTGAAGCCCACAGTAAGTGCA CAGGTGTAGAGTGGATGAGTCAGGGCGCGCACATGCCTGCGGAAGGCC Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - AGCTACAACCCGGTCAAGACTCGATAATGATCCTTCCGCAGGTCACCCT AC SP3-SG GCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAGTCCTACCTGATTTGA GGTCAGAGGTCATAAAGCTGTCTCCAACCAGAGACCGTTAGAACCTCGC CCAAACGCTTCACGGTCGCGGCGTAGACATTATCACACCGAGAGCCGAT CCGCAAGGAACCAAGCTAATGCATTTGAGAGGAGCCGACCAGTAACGG CCGACAAGCCTCCAAGTCCAAGCCTACGAACCGCAAAAGCTCGTAGGTT GAAGATTTCATGACACTCAAACAGGCATGCTCCTCGGAATACCAAGGAG CGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCAC ATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGA TCCGTTGCTGAAAGTTGTATATAGATGCGTTACATCGCAATACACATTAT GATACTTTATTGGGTTTGTGATAAACGCAGGCGCAGACACGCTTCACGA GCCCCGTAAAGAGCCCGCTTCACGATCTGAAGCCACACAGTGTGCGCAC ACGCGTAGAGGGAAGACTTTTCTCGCACATAGATACGGAAGGCCAGCTA CAACCCGTTCAAAACTCGATAATGATCCTTCCGCAGGTTCACC SP4-SG TTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAGTCCTACCTGATTTGAGGTCA GAGGTCATAAAGCTGTCTTATAGGAGACGGTTAGAAGCCCGCCAAACGC TTCACGCACGCGGCTGAAAAAAGTTATCACACCGAGAGCCGATCAGCA GAGGAACCAAGCTAACGCATTTAAGAGGAGCCGACCGATATGGGACGG CGGACAAGCCTCCAAGTCCAAGCCTACAAACCACAAAAGATTGTAAGTT GAAGATTTCATGACACTCAAACCGGCATGCTCCTCGGAATACCAAGGAG CGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCAGAGGATTCACAGAATTCTGCATTTCA CATTACCTATCGCAATTCGATGCGTTCTTCATCGATGCAAGAGCCAAGA GATCCGGTGCTGAAAGTTGTAGATAGATGGGTTACATCGCAATACACAT TATGGCAACCTTATAGAGCAGGTGATAAACGCAGGCACAGATATGCTCC GCAACCCCGGTAAAGGAAGCGTGCCTCACAATCTGAAGCCCACAGTAA GGGCACAGGTGTACCGCAGTGGATGAGCAACGACGTGCAAATGCCTCG Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - GAAGGCCAGCTACAACCCGGTCAAAACTCGATAATGATCCTTCCGCAAG TTCACCTAC SP5-SG GCTGCGGAGTATGACCGCTTGTACCTGGCCTTCCGAGGCATGTGC ACGCCCTGAGTCATCCACTCTACACCTGTGCACTTACTGTGGGCTTCAGA TTGCAAGGCACGCTCTTTACCGGGCTTGCGGAGCATATCTGTGCCTGCGT TTATCACAAACTCTATAAAGTAACATAATGTGTATTGCGATGTAACACA TCTATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAG AACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATC ATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGC CTGTTTGAGTGTCATGAAATCTTCAACCTACAAGCTTTTGTGGTTTGTAG GCTTGGACTTGGAGGCTTGTCGGCCGTTATCGGTCGGCTCCTCTTAAATG CATTAGCTTGGTTCCTTGCGGATCGGCTCTCGGTGTGATAACGTCTACGC CGCGACCGTGAAGCGTTTGGCGAGCTTCTAACCGTCTTATAAGACAGCT TTATGACCTCTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGC ATATCAATAAGCGGAGGAA SP6-SG GTCGCGGAGATGATCCGCTTGTAGGAGGTCTTCCCAGGCATGTGC ACGCCCTGGTCATCCTCTCTACACCTGTGCACTTACTGTGGGCTTCATAT TGAAAGGCACGCTCTTTACCGGGCTTGCGGAGCATATCTGTGCCTGCGT TTATCACAAACTCTATAAAGTAACAGAATGTGTATTGCGATGTAACACA TCTATATACAACTTTCATCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAC AACGCACCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCACTGAATC ATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGC CTGTTTGAGTGTCATGAAATCTTCAACCTACAAGCTTTTGTGGTTTGTAT GCTTGGACTTGGAGGCTTGTCGGCCGTTATCGGTCGGCTCCTCTTAAATG CATTACCTTGGTTCCTTGCGGATCGGCTCTCGGTGTGATAACGTCTACGC CGCGACCGTGAAGCGTTTGGCGAGCTTCTAACCATCTTATAAGACAGCT Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - TTATGACCTCTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGC ATATCAATAA SP7-SG CGGGGAGTATGCATCTGTGTGTGTGTGGCCGTGCCATGTATGTGC ACGCGGGGAGTCATCCCCTCTACGCCTGTGCACACACTGTGGGCTTCAG ATCGTGAAGCGGGCTCTTTACGGGGCTCGTGAAGCGTGTCTGTGCCTGC GTTTATCACAAACTCAATAAAGTATCAGAATGTGTATTGCGATGTAACG CATCTATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGA AGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGA ATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCA TGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATCTTCAACCTACGAGCTTTTGCGGTTTG TAGGCTTGGACTTGGAGGCTTGTCGGCCGTTGCTGGTCGGCTCCTCTCAA ATGCATTAGCTTGGTTCCTTGCGGATCGGCTCTCGGTGTGATAATGTCTA CGCCGCGACCGTGAAGCGTTTGGGCGAGCTTCTAACGGTCTCTGTTGGA GACAGCTTTATGACCTCTGACCTCAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAAC TTAAGCATATCATAGCCGGGAAGGAAGAA SP8-SG TCGGGATCCAGATCCCCCTGTGTGAGGGCTTGCGGTCTCTGATCC GCAGAGGTCATCCCTCGATGCCTGTGCACTTACTGTGGGCTTCGATCGTG AAGCGGGCTCTTTACCGGGCTTTGCGGAAGCGTGTCTGCGCCTGCGTCT ATCACAAACCCTATAAAGTATCAGAATGTGTATCGCGATGTAACGCATC TATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGA ACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCA TCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCC TGTTTGAGTGTCATGAAATCTTCAACCTACAAGCTTTTGCGGTTTGTAGG CTTGGACCTGGAGGCTTGCTGGCCGTTCTTGGTCGGCTCCTCTCAAATGC ATTAGCTTGGTTCCTTGCGGATCGGCTGTCGGTGTGATAATGTCTGCGCC GCGACCGTGAAGCGTTTGGCAAGCTCCTAACCGTCTCAGTTGAAGACAG Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - CTTTATGACCTCTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAA GCATATCAAAAATAG Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - Phụ lục 3: Hình ảnh trình tự ITS mẫu nấm linh chi từ liệu Illumina phần mềm Geneious Prime SP1: SP2: Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - SP3: SP4: