1058 nghiên cứu biểu hiện tinh chế và bước đầu đánh giá đặc tính sinh học của interleukin 11 người tái tổ hợp luận văn tốt nghiệp

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ QUÝ NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN,TINH CHẾ VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA INTERLEUKIN-11 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2017 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ QUÝ NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN, TINH CHẾ VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA INTERLEUKIN-11 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS TRƯƠNG NAM HẢI Viện Công nghệ sinh học TS LÊ THỊ THU HỒNG Viện Công nghệ sinh học Hà Nội – MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Interleukin-11 vai trò hệ tạo máu 1.1.1 Hệ tạo máu đường tạo tiểu cầu thể người 1.1.2 Đặc tính phân tử, cấu trúc chế hoạt động Interleukin-11 1.1.3 Những nghiên cứu vai trò IL-11 mơ hình thực nghiệm 1.2 Tình hình nghiên cứu biểu interleukin-11 tái tổ hợp 12 1.3 Hệ biểu protein tái tổ hợp 19 1.3.1 Sơ lược hệ biểu protein tái tổ hợp, ưu nhược điểm 19 1.3.2 Một số chủng biểu thông thường E coli .23 1.3.3 Vector biểu chủng E coli 25 1.3.4 Một số giải pháp cải thiện mức độ biểu protein tái tổ hợp 27 1.3.5 Tinh protein khó khăn thường gặp .29 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Vật liệu nghiên cứu 35 2.1.1 Nguyên liệu 35 2.1.2 Hóa chất vật tư dùng cho nghiên cứu 36 2.1.3 Thiết bị .40 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 40 2.2.1 Các phương pháp sinh học phân tử vi sinh 40 2.2.2 Các phương pháp hóa sinh miễn dịch 44 2.2.3 Phương pháp đánh giá tác dụng tăng sinh dòng tế bào IL-11 .49 2.2.4 Phương pháp đánh giá tính an tồn IL-11 tái tổ hợp 50 2.2.5 Phân tích, xử lý số liệu .53 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56 3.1 Biểu Interleukin-11 tế bào E coli 56 3.1.1 Biểu Interleukin-11 dạng đơn vector pET22b(+) .56 3.1.2 Biểu Interleukin-11 dạng dung hợp vector pE-SUMO3 64 3.1.3 Lựa chọn điều kiện biểu protein SUMO-IL11 67 3.2 Tinh chế tạo sản phẩm Interleukin-11 73 3.2.1 Tinh chế protein SUMO-IL11 sắc ký lực .73 3.2.2 Cắt protein SUMO-IL11 enzyme 79 3.2.3 Tạo công thức cho protein IL-11 .80 3.2.4 Loại chất gây sốt sản phẩm IL-11 82 3.2.5 Đông khô sản phẩm IL-11 85 3.3 Bƣớc đầu đánh giá đặc tính sinh học protein IL-11 tái tổ hợp 87 3.3.1 Đánh giá độ tinh protein IL-11 87 3.3.2 Đọc trình tự axit amin đầu N protein IL-11 88 3.3.3 Đánh giá tác dụng tăng sinh dòng tế bào TF-1 89 3.3.4 Đánh giá tính an toàn chung chuột .90 3.3.5 Đánh giá độc tính cấp chuột nhắt trắng 91 3.3.6 Đánh giá độc tính bán trường diễn chuột cống 92 3.3.7 Đánh giá chất gây sốt thỏ 99 CHƢƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 100 4.1 Biểu Interleukin-11 ngƣời tái tổ hợp 100 4.2 Tinh chế protein IL-11 tái tổ hợp 104 4.3 Tạo sản phẩm IL-11 có khả sử dụng đƣờng tiêm 108 4.4 Bƣớc đầu đánh giá đặc tính sinh học sản phẩm IL-11 111 4.4.1 Độ tinh trình tự axit amin đầu N IL-11 111 4.4.2 Tác dụng tăng sinh dòng tế bào IL-11 113 4.4.3 Tính an tồn IL-11 tái tổ hợp mơ hình động vật 116 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 123 NHỮNG CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 125 SUMMARY 126 TÀI LIỆU THAM KHẢO 131 PHỤ LỤC LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới GS TS Trương Nam Hải TS Lê Thị Thu Hồng, thầy tận tình hướng dẫn tạo điều kiện tốt cho suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận án Luận án thực Phòng Kỹ thuật di truyền; Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hỗ trợ Đề tài độc lập cấp Nhà nước “Nghiên cứu sản xuất Interleukin-3 Interleukin-11 tái tổ hợp chất lượng cao dùng y học (điều trị)” (2012-2016), mã số ĐT-PTNTĐ.2012-G/04 GS TS Trương Nam Hải làm chủ nhiệm Để hoàn thành luận án nghiên cứu này, nhận nhiều giúp đỡ quý báu nhiệt tình quan cá nhân, xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến: - Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Bộ phận đào tạo Viện Cơng nghệ sinh học, Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam; Bộ Khoa học Công nghệ tạo điều kiện thời gian, hỗ trợ kinh phí trang thiết bị để giúp tơi hồn thành luận án - TS Đỗ Thị Huyền tập thể cán Phòng Kỹ thuật di truyền thuộc Viện Công nghệ sinh học hỗ trợ, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận án - Bộ Mơn Sinh lý Bệnh – Miễn dịch, trường Đại học Y Hà Nội Viện KIểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế đơn vị thực nội dung đánh giá tính an toàn sản phẩm IL-11 tạo Với tất lịng biết ơn sâu sắc tơi xin dành cho gia đình bạn bè, người ln động viên tinh thần suốt thời gian thực luận án Nguyễn Thị Quý i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi thực số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần lại chưa công bố công trình khác Hà Nội, ngày tháng Tác giả năm 2017 Nguyễn Thị Quý i DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt ALT Alanine aminotransferase Alanine aminotransferase AST Aspartate aminotransferase Aspartate aminotransferase BHK Baby hamster kidney Tế bào thận chuột non BSA Bovine Serum Albumin Albumin huyết bò CFU-GM Colony-forming unitgranulocyte, monocyte Cụm bạch cầu hạt – bạch cầu mono CFU-Me Colony-forming unitmegakaryocyte Cụm mẫu tiểu cầu CFU-Mix Colony forming unit-mix Cụm hỗn hợp CHO Chinese hamster ovary Tế bào tử cung chuột bạch COS CV-1 cells in Origin, Tế bào thận khỉ xanh châu Phi carrying the SV40 genetic material dH2O De-ionized water Nước khử ion ECM Extracellular matrix Chất nhày ngoại bào EMEA European Medicines Agency Cơ quan quản lý thuốc châu Âu EPO Erythropoietin Yếu tố tạo hồng cầu erythropoietin FBS Fetal Bovine Serum Huyết bào thai bò FDA Food and Drug Administration Cục Quản lý Thuốc Thực phẩm (Mỹ) G-CFS Granulocyte colony stimulating factor Yếu tốc kích thích cụm bạch cầu hạt Gm-CSF Granulocyte macrophage colony-stimulating factor Yếu tố kích thích cụm bạch cầu hạt đại thực bào GST Glutathione S-transferase Glutathione S-transferase HEK-239 Human embryonic kidney cells 293 Tế bào thận phôi người i IL-3 Interleukin-3 Interleukin-3 IL-5 Interleukin-5 Interleukin-5 IL-6 Interleukin-6 Interleukin-6 IL-11 Interleukin-11 Interleukin-11 IPTG Isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside Chất cảm ứng IPTG Jaks Janus kinase Chất truyền tín hiệu Janus kinase LB Luria-Bertani Môi trường LB LBamp Luria-Bertani with ampicillin Môi trường LB bổ sung ampicillin tới nồng độ cuối 100 g/ml M-CSF Macrophage colonystimulating factor Yếu tố kích thích tạo cụm đại thực bào SCF Stem cell factor Yếu tố tế bào gốc STATs Signal transducer and activators of transcription Chất truyền tín hiệu chất hoạt hóa phiên mã SUMO Small Ubiquitin-like Modifier Protein cải biến có kích thước phân tử nhỏ giống ubiquitin Ub Ubiquitin Protein điều hòa ubiquitin TNF Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử khối u TPO Thrombopoietin Yếu tố kích thích mẫu tiểu cầu i DANH MỤC Trang Bảng 1.1 Trình tự kích thước số dung hợp………………… 16 Bảng 2.1 Các loại enzyme, kháng thể hóa chất dùng nghiên cứu … 36 Bảng 2.2 Môi trường dung dịch dùng cho nghiên cứu … ……………… 37 Bảng 2.3 Liều tiêm protein IL-11 cho chuột nhắt trắng … ……………… 51 Bảng 2.4 Liều tiêm protein IL-11 cho thỏ thí nghiệm … ……………… 53 Bảng 3.1 Hàm lượng endotoxin mẫu protein IL-11 tinh chế ………… 82 Bảng 3.2 Hiệu suất loại endotoxin sản phẩm IL-11 màng Ultracel 30 kDa………………………………………………………………… 84 Bảng 3.3 So sánh nồng độ protein IL-11 trước sau đông khô 86 Bảng 3.4 Trọng lượng chuột thí nghiệm ngày theo dõi 91 Bảng 3.5 Kết nghiên cứu độc tính cấp chuột nhắt trắng …………… 91 Bảng 3.6 Ảnh hưởng IL-11 đến thể trọng chuột cống……………… 92 Bảng 3.7 Ảnh hưởng IL-11 đến chức tạo máu chuột 93 Bảng 3.8 Ảnh hưởng IL-11 đến hoạt độ aspartate aminotransferase 94 alanine aminotransferase máu chuột Bảng 3.9 Ảnh hưởng IL-11 đến chức gan chuột 95 Bảng 3.10 Ảnh hưởng IL-11đến nồng độ creatinin máu chuột 97 v