TP HồChíMinh–2017 BỘGIÁODỤC VÀĐÀOTẠO VIỆNHÀNLÂM KHOAHỌCVÀ CÔNGNGHỆVIỆTNAM HỌCVIỆNKHOAHỌCVÀCÔNGNGHỆ VÕĐỖMINHHOÀNG PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA MỘT SỐ TOXIN MỚITỪNỌCBÒCẠPĐENHETEROMETRUS LAOTICUS C[.]
BỘGIÁODỤC VÀĐÀOTẠO VIỆNHÀNLÂM KHOAHỌCVÀ CƠNGNGHỆVIỆTNAM HỌCVIỆNKHOAHỌCVÀCƠNGNGHỆ VÕĐỖMINHHỒNG PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA MỘT SỐ TOXIN MỚITỪNỌCBỊCẠPĐENHETEROMETRUS LAOTICUS Chun ngành: Hóa hữu cơMãsố:62.44.27.01 TĨMTẮTLUẬNÁNTIẾN SĨHỐHỮUCƠ TP.HồChíMinh–2017 BỘGIÁODỤC VÀĐÀOTẠO VIỆNHÀNLÂM KHOAHỌCVÀ CƠNGNGHỆVIỆTNAM HỌCVIỆNKHOAHỌCVÀCƠNGNGHỆ VÕĐỖMINHHỒNG PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA MỘT SỐ TOXIN MỚITỪNỌCBỊCẠPĐENHETEROMETRUS LAOTICUS Chun ngành: Hóa hữu cơMãsố:62.44.27.01 TĨMTẮTLUẬNÁNTIẾN SĨHỐHỮUCƠ NGƯỜIHƯỚNGDẪNKHOAHỌC: TSKH.Hồng NgọcAnh GS.TSKH.UtkinYuriNikolaevich MỞĐẦU Cùng với phát triển kinh tế, xã hội giới, việc nghiên cứu, tìm tịi, phát triểntìm loại dược phẩm để chữa trị bệnh cho người vấn đề ngày cấp bách xãhội khoa học Bên cạnh việc tổng hợp loại thuốc chữa bệnh có nguồn gốc từ thực vật nọcđộc độngvậtđanglànguồndượcliệuqhiếmđểbổsungcho việctổnghợpcácnguồnthuốcmới Từlâu,nọcđộccáclồiđộngvậtnhưrắn,ong,bọcạpvànhiềulồikhácđãđượcsửdụnglàmngun liệu để chữabệnh.Trongdângian,bịcạpthườngđượcdùngnguncon(tồnyết)hoặc phần (yết vĩ) để trị động kinh trẻ em, uốn ván, bán thân bất toại, quai bị, méo miệng… dướidạngthuốcbộthoặclàmviênuống.Cùngvớisựtiếnbộkhoahọc,đãcónhữngnghiêncứuđầutiêntrênthếgiớiv ềnọcbịcạpcáchđâyhơn100nămvàđãxácđịnhnọcđộcbịcạpcóhoạttínhvềthầnkinh.Tuynhiên,việcnghiêncứunọcbịcạpở ViệtNamchỉmớiởgiaiđoạnbắtđầu,chưacónhiều nghiên cứu cơng bố việc ứng dụng nọc bị cạp làm thuốc trị bênh cho người màchỉlà nhữngbàithuốcdângianđược truyền miệngchưa có nhiều kiểmchứngkhoa học Trongnọcbịcạpchứanhiềucácpolypeptidecókhảnăngtácđộnglêncácthụthểvàcáckênhioncủamàngtếbà obịkíchthích,cácloạipolypeptidenàyđãvàđangđượccácnhàkhoahọcnghiêncứunhằmtạoracácthuốcmớichữacácbệnhnhư: Parkinson, cao huyết áp, ung thư, Alzheimer Nhằmđónggópmộtnguồnngunliệumớivàcácnghiêncứukhoahọcmớichongànhdược,hướngtới làm thuốcchữabệnhvàlàmcơsởchonhữngnghiêncứutiếptheo,nhómnghiêncứuchúngtơiđã tiến hành nghiên cứu nọc bò cạpHeterometrus laoticus.Qua đề tài “Phân lập khảosát tính chất toxin số toxin từ nọc bò cạpHeterometrus laoticus”, hướngnghiên cứu nọc bò cạpHeterometrus laoticusvới hi vọng mang đến sở cho nhữngnghiêncứutiếptheo vềviệc ứngdụngcủa nọcbòcạpdùnglàmnguồn nguyên liệu cho dượcphẩm Trang1 PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU BọcạpđenHeterometruslaoticusđượcthumuaởtỉnhAnGiangthành2đợt,đợt1vàotháng5vàđợt2vàoth áng8vớitổngsố2lầnlà850cáthể.Bọcạpthumuasauđóđượcnitrongphịngthí nghiệmđể lấynọc phụcvụ cho nghiên cứu Để thu nọc bọ cạp từ phần có chứa túi nọc, bọ cạp kích thích trực tiếp vào phầnđi (đốt thứ đốt thứ 6) sử dụng dòng điện chiều có tần số kích thích 2,63kHz vàđượcduytrìtrongsuốtqtrìnhtiếtnọccủabọcạp(5–7giây).Bọcạpđượcgiữcốđịnhtrênmộtbản kim loại, kim loại nối với cực âm nguồn điện Điện cực dương sử dụngđể kích thích trực tiếp vào phần chích để bọ cạp tiết hồn tồn nọc có túi nọc ngồi.Nọc bọ cạp tiết thu lam thủy tinh mỏng dạng chất lỏng khơng màu cómàutrắngsữađục.Nọcsaukhithu đượclàmkhơtrongbìnhhútẩmcóchứaCaCl 2khan trongkhoảng Nọc sau khơ gom lại lọ thủy tinh nhỏ bảo quản tủ lạnh nhiệtđộ-20oC sử dụng Bọ cạp sau mua để ổn định ngày tiến hành lấynọc, khoảngcách hailần lấynọcliêntiếp làhaituần Nọc thô tinh chế thành phân đoạn nhỏ sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel trêngelSephadexG-50vàsắckýlỏnghiệunăngcao.Cácphânđoạnnọcthuđượctiếptụcđượcđánhgiá độc tính chuột dễ nghiên cứu cấu trúc sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân khốiphổ 3 KẾTQUẢVÀBIỆNLUẬN 3.1 Địnhdanhbọcạpđenthumẫu tạiAn Giang Bọ cạp đen tiến hành thu mẫu vùng An Giang, miền Nam, Việt Nam Sau đó, mẫuvậtbọcạpđượctiếnhànhvậnchuyểnsangPháp,gửimẫutạiphịngSinhtháimơitrườngthuộcViệnBảo tàng lịch sử QuốcgiaPhápcủaTiếnsỹkhoahọcWilsonR.Lourencođểtiếnhànhđịnhdanhbọ cạp KếtquảxácđịnhmẫubọcạpởvùngAnGiangthuộcloạiHeterometruslaoticus.(Phụlục1) 3.2 Nibọcạp trongphịng thínghiệm vàthuhoạch nọc Bọ cạp H laoticus sau thu mua vùng An Giang (2 đợt, 850 cá thể) chia vào cácthau để tiến hành thử nghiệm ni nhốt phịng thí nghiệm, thau có số lượng trung bình từ65-75cáthể,tiến hànhnivà theo dõitrong06 thángcho kếtquảnhư hình3.1 Lượngnọcthơthuđược(mg) 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 Đợt 0,93 0,7594 0,6628 0,5652 0,4864 0,3758 0,6106 0,5737 0,3942 0,3529 0,23610,21680,1996 0,489 12345678910 11 12 13 14 Số lần Hình3.1 Lượngnọcbọcạp thuđược theothờigian Lượng nọc thu từ bọ cạp nuôi phịng thí nghiệm giảm dần theo thời gian ni.Trongphịngthínghiệm,bọcạpđượcnivớimậtđộkhálớnsovớitựnhiên,khơnggianhoạtđộngít, thức ăn cungcấpđầyđủnênkhơngcótìnhtrạngcạnhtranhnguồnthứcăncũngnhưchốnglạikẻthù trongmơitrườngtự nhiên 3.3 Khảosát, đánh giávàphân tíchnọcthơ bọcạpH laoticus 3.3.1 Phântíchhàmlượngproteintổngtrong nọcthơ Lượng protein có nọc thô xác định phương pháp so màu biuret với đườngchuẩn xây dựng nồng độ dung dịch albumin khác Từ kết xây dựng đườngchuẩn phương trình hồi quy đường chuẩn tính tốn nồng độ protein có nọcH.laoticusthuđượclà1,293mg/mL vàtừđóxácđịnhđượchàmlượngcủaproteintantrongnướccủadungdịch nọc thơ lấytừbọcạp 64,65% 3.3.2 Phân tích nọc bọ cạp sắc ký lọc gel gel Sephadex G50 xác định khối lượngphân tửcác phânđoạn Thực sắc ký lọc gel gel Sephadex G – 50 với 4.500 mg nọc thơ Phịng Các chấtcó hoạt tính sinh học, Viện Sinh học Nhiệt đới, thu phân đoạn nọc với tỷ lệ khối lượng từngphân đoạn đượcthể hiệntrongbảng3.1 Bảng3.1 Khốilượng phânđoạn nọc bọcạp Phânđoạn Lượngnọc(mg) Tỉ lệ(%) 102,7 5,42 174,2 9,20 253,2 13,37 688,9 36,39 674,2 35,61 Tổngkhốilượng 1.893,2 Bằng sắc ký lọc gel, nọc thơ từ lồi bọ cạpH.laoticusđã phân tách thành phân đoạnnọckhácnhautươngứngvớicáckhốilượngphântửkhácnhau.Khốilượngphântửcủa5phânđoạnnàyđượcxác địnhsơbộbằngphươngphápSDS-PAGEvàsosánhvớimẫuchuẩnkhốilượng(hình3.2) kDa M1 Sg Sg2 Sg Sg Sg5 170 130 100 70 55 40 35 25 15 10 Hình 3.2 Kếtquả điện di5phân đoạnnọcso vớimẫuchuẩn 3.3.3 Khảosátđộctínhcủa cácphânđoạn củanọcbọcạpH laoticusđốivớichuột Bảng 3.2 Kếtquảthửđộctínhtrên chuộtcủacác phân đoạnnọc Phân Biểuhiện củachuộtsau tiêmcácphân đoạn Nhậnxét đoạn Chuộtgãimõm,nằmimsauđóhoạtđộngbìnhthường Chuộtgiảmhoạtđộng,xùlơng,thởgấpnhưngphục Khơngđộc Độc nhẹ hồi sau30 phút Chuộtnằmim,chảynướcbọt,liệtchi,thởgấpnhưng phục hồisau 2giờ Độc Chuộtn ằ m i m , m ắ t n h ắ m , c o g i ậ t , l i ệ t c h i , c h ảy nước bọt,chuộttửvong sau Chuộtrun,nằmim,hoạtđộngbìnhthườngsau60phút Khơngđộc Chuộtrun, nằmim,sau đóbìnhthường Khơngđộc Nước Độc gây chết cất Phânđoạn4đượctáchratừnọcthơbọcạpH.laoticusbằngphươngphápsắckýlọcgel,thơngquathửnghiệmđộctính lênchuộtchothấyphânđoạn4cóđộctínhgâychết.Vìvậy,phânđoạn4được xác định độc tính cấp chuột đạt kết độc tính cấp phân đoạn tách từ nọc thô bọ cạpHeterometrus laoticuslà LD50= 24, 07 ± 1,09 mg/kg.Phân đoạn sau đượcxác nhận có độc tính mạnh tiếp tục phân tách HPLC để thu phân đoạn thứ cấp(hình3.3) Hình3.3.Sắcký đồkhi phân táchphânđoạn4 bằngHPLC Các phân đoạn thứ cấp phân đoạn tiếp tục đánh giá độc tính chuột cho kếtquả tóm tắt bảng 3.2 Các phân đoạn thứ cấp có độc tính (phân đoạn 4.6, 4.7, 4.11 4.15)đượctiếptụctinhchế xác định khốilượngphântử cácpeptide thành phần Bảng 3.3 Kếtquảthửđộctính phânđoạnthứcấp Phânđoạn Độc tính Phânđoạn Độc tính 4.1 Khơngđộc 4.14 Khơngđộc 4.2 Khôngđộc 4.15 Gây độc 4.3 Gây độc 4.16 Khôngđộc 4.4 Khôngđộc 4.17 Khôngđộc 4.5 Gây độc 4.18 Khôngđộc 4.6 Độcgây chết 4.19 Khôngđộc 4.7 Gây độc 4.20 Khôngđộc 4.8 Khôngđộc 4.21 Khôngđộc 4.9 Khôngđộc 4.22 Khôngđộc 4.10 Khôngđộc 4.23 Khôngđộc 4.11 Gây độc 4.24 Khôngđộc 4.12 Khôngđộc 4.25 Khôngđộc 4.13 Khôngđộc Nướcmuối sinhlý Khôngđộc 3.4 Tinhchế xác địnhkhốilượng phântử cácphânđoạn thứcấp Phân đoạn 4.6 phân tách thành phân đoạn gồm 4.6.1, 4.6.2, 4.6.3 Phân đoạn 4.6.1thuđượclượngmẫutươngđốiít,trongkhiđóởphânđoan4.6.2và4.6.3lượngmẫuthuđượcnhiềunênđượcti ếptụctinhchếđểxácđịnhkhốilượngphântử.Kếtquảchothấyphânđoạnthứcấp4.6.2có khối lượng phân tử 3.669,155 Da, cịnphânđoạnthứcấp4.6.3cókhốilượngphântử2.915,040Da Phân đoạn 4.7 tách phân đoạn Trong đó, peptide 4.7.2 tinh chế khảo sát khốilượng phân tử, kết cho thấy peptide 4.7.1 có khối lượng phân tử 3.700,2 Da peptide 4.7.2có khốilượngphântửlà 3.846,872 Da Phân đoạn 4.11 tách 01 peptide 4.11.1 xác định khối lượng phân tử là3.695,907Da Phânđoạn4.15đãtáchralàm8phânđoạnpeptide.Trongsốđó,chúngtơiđãlàmsạchvàxácđịnh khối lượng phân tửcủabapeptidecủaphânđoạnthứcấp4.15.8là2.461,105Da;3.285,285Da 5.021,4 Da 3.5 Khảosátcấutrúcbậcmộtcủacácpolypeptidephânđoạn 4.6và tácđộng lênkênh K+ 3.5.1 Khảosátcấutrúcbậcmộtcủacácpolypeptidephânđoạn4.6 Bảng3.4.Khốilượngphântửcủacácpolypeptide táchra Phânđoạn Khốilượngphântử(Da) 4.6.2(Hetlaxin) 3.670,8 4.6.3 2.915,4 4.7.1 3.700,2 4.7.2 3.846,2 4.11 3.700,3 2.461,1 4.15 3.285,3 5.021,4 Cácpolypeptide từphân đoạn 4.6.2 (đặt tên làHetlaxin)và4.6.3 đượckhử, sau đóperidylethyl hóa phân tích khối phổ đểxác định số lượng cầu disulfide cấu trúc Kếtquả cho thấy có tín hiệu phù hợp với khối lượng 4.498 Da (cho peptide từ phân đoạn 4.6.2) tínhiệu phù hợp với khối lượng 3.538 Da (cho peptide từ phân đoạn 4.6.3) thu khối phổMALDI Sự tăng khối lượng tương ứng với với nhóm pyridylethyl phân tử Hetlaxin 6nhóm polypeptide từ phân đoạn 4.6.3 Điều cho thấy Hetlaxin chứa cầu disulfid vàpolypeptidetừphânđoạn4.6.3chứa3cầudisulfid.PhầncuốiNcủachuỗipolypeptidecủaHetlaxinđã xác định phương pháp thối hóa Edman ISXTGSXQ Trình tự amino acid củaHetlaxincũngđồngthờiđược phân tíchbằngkhốiphổMALDI(Hình 3.4) Hình3.4 Phântích trìnhtựamino acidcủaHetlaxinbằngkhốiphổ CùngmộtlúcthựchiệnvỡmảnhMS/MShồntồncủachuỗipeptidevàxácđịnhkhốilượngpeptide phương phápdấubàntaynhờtrypsin Dựatrêndữ liệucủathối hóaEdmanvàkhốiphổ hay 3.18 trình tự amino acid Hetlaxin xác định Dữ liệu khối phổMS/MS mảnh peptide thu tác động trypsin gốc cystein đầu cuối -Cđãbịamide hóa gốc lysinởvịtrí30đã đượctìmthấybằngphươngphápxácđịnhtrìnhtựamino acid MS/MS mảnh thu tác động trypsin Cấu trúc Hetlaxin xácđịnhnhưtronghình3.5 KCYDPCKKKTGC KKTGCPNAKCMNK Khối phổIS QCYDKKTGCPNAKCMNKSC CYGCISCTGSKQCYDPCKKKTGCPNAKCMN ISXTGSXQ ThốihóaEdman ISCTGSKQCYDPCKKKTGCPNAKCMNKSCKCYGC Trìnhtự Hetlaxin Hình3.5.Cấutrúcbậc1 củaHetlaxin SosánhtrìnhtựaminoacidcủaHetlaxinvớitrìnhtựaminoacidcủacácalpha-toxincótươngtác với kênh kali (Hình 3.6) cho thấy Hetlaxin đồng đẳng toxin Hetlaxin có tươngđồngcaovớitoxinAFB73769,trìnhtựaminoacidcủatoxinnàyđ ợ c suyratừsảnphẩmcủacDNA(tổng hợp) thu từ tuyến nọc bọ cạpH laoticuscủa Thái Lan, chưa có tàiliệuvềhoạttínhsinhhọccủatoxinnày.Mộttoxintươngđồngkhác(HsTX1-P59867vàtoxinVm24P0DJ31nhữngtoxin nàycótươngtác mạnh vớikênh KaliKv1.1 Kv1.3 (Hình3.6) 10 20 30 ISCTGSKQCYD P CKKKTGCPN A K CMNKSCKCYGC* HETLAXINISCTGSKQCYD P CKRKTGCPN A K CMNKSCKCYGCG AFB73769 IRCSGSRDCYSPCMKQTGCPN A K CINKSCKCYGC* P84094(KAX6D_HETSP) ASCRTPKDCADPCRKETGCPYGKCMNRKCKAAA CNRC* P59867(KAX63_HETSP) ISCVGSPECP PKCRAQ- CYYC*P0DJ31(KA211_VAEMS) GCKNGKCMNRKCKAAAISCVGSKECLPKCKAQ- CY-CPP0DJ32(KA212_VAEMS) GCKS G KCMNKKCK Hình 3.6 So sánhsựtươngđồng củahetlaxinvớicáctoxinkhác KếthợpvớiphântíchkhốiphổMSvàMS/MSvàdữliệuthuđượckhithựchiệnphươngphápthối hóa Edman, cấu trúc phân đoạn 4.6.2 xác định Sự tương tác peptide táchravớikênhKv1.3cũngđượcxemxét,từđónhậnđịnhchuỗipolypeptideđãcơlậpđượclàmộttoxinmới tạm đặttênlàHetlaxin.Hetlaxinthuộchọalpha-toxin,đâylàmộttrongnhữngtoxinđầu tiên tách từH.laoticusvà có lực mạnh với kênh kali Kv1.3 Trong Hetroscorpin -1(HS-1) toxin tách từH.laoticustại Thái Lan có trình tự amino acid khác xa so với Hetlaxin vàkhơng có báo cáo tách dụng kênh thần kinh K, HelaTx1 tách từ bọ cạp lại khơngcó tươngtác mạnh kênhKv1.3 Hetlaxin 3.5.2 Khảosáttác độngcủa Hetlaxinlên kênhK+ Sự tương tác Hetlaxin với cổng dẫn truyền ion K +của kênh kali nghiên cứutrong thí nghiệm cạnh tranh liên kết Chimeric protein KcsA-K v1.3 KcsA-Kv1.1, biểu hiệnkhác loài màng E coli, sử dụng kênh K +và R-AgTx2 sử dụng mộtphốitử.SựliênkếtcủaR-AgTx2đượcghinhậnnhờkínhhiểnviđồngtiêuqtlaser.Cóthểthấyrằng Hetlaxin cạnh tranh hiệu với R-AgTx2 liên kết với hai kênh chimeric (Hình 3.7) Các giá trị IC50được xác định 0,48 ± 0,01 μM 6,7 ± 0,4 μM tương ứng cho KM 6,7 ± 0,4 μM 6,7 ± 0,4 μM tương ứng cho KM tương ứng cho K v1.3 Kv1.1,trongkhiđógiátrịKiđư ợc tínhsửdụngphươngtrìnhCheng-Prusofflà59±6nMvà0,8±0,3M.Những số liệu cho thấy Hetlaxin tương tác hiệu với kênh kali Kv1.3, tươngtácvớikênh Kv1.1 thấp khoảngmườilần [53,87] 4000 A 900 relativeunits Signalintensity relativeunits Signalintensity 1200 600 300 -9-8-7-6-5-4-3-2 lg[C] B 3000 2000 1000 -9-8-7-6-5-4-3-2 lg[C] Hình 3.7 Sự cạnh tranh củaHetlaxinvới R-AgTx liên kết với kênh kali KcsA-Kv1.1 (A) vàKcsA-Kv1.3(B) Chođếnthờiđiểmhiệntại,từlồiH.laoticusphânbốởTháiLanchỉcóhaitoxinđãđượccơlậpvàxácđịnhtrì nhtựlàHetroscorpin-1(HS-1)vàHelaTx1.HS-1cókhốilượngphântửcủa8.293Da,chứa6gốccysteinevàthuộchọscorpinecó độc tính với trùng có hoạt tính kháng khuẩnnhưng khơng có báo cáo tương tác HS-1 với kênh kali HelaTx1 có khối lượngphântử2.763Davàchứa4gốccysteine,cókhảnăngtươngtácvớicáckênhkalikhácnhauvàtươngtác mạnh với kênhKv1.1 (EC50= 9,9 ± 1,6 μM 6,7 ± 0,4 μM tương ứng cho KM) HelaTx1 liên kết với kênh K v1.3, tuynhiên lực liên kết thấp nhiều so với kênh Kv1.1 Ở nồng độ 30 μM 6,7 ± 0,4 μM tương ứng cho KM, toxin HelaTx1 tươngtác20 %đốivớikênh kali DựatrêncáckếtquảthửnghiệmkhảnăngliênkếtvớikênhkalicủaproteintừHetlaxincơlậptừnọclồiH.lao ticusphânbốởViệtNamchothấykhảnăngliênkếtvàứcchếhoạtđộngcủakênhkali Kv1.3 Kv1.1 Đối với kênh Kv1.3, protein phát có khả ức chế nồng độ kháthấp, 0,48 ± 0,01 μM 6,7 ± 0,4 μM tương ứng cho KM 6,7 ± 0,4 μM 6,7 ± 0,4 μM tương ứng cho KM tương ứng cho K v1.3 Kv1.1 Những nghiên cứu chothấyHetlaxincókhảnăngứcchếhoạtđộngkênhK v1.3hiệuquảhơnHelaTx1đãđượccơngbốvà toxin có khả ức chế kênh K v1.3 mạnh phân lập từH laoticuscho đến (0,48µM) [90]Trước đây, đa số báo cáo cho thấy toxin nọc bọ cạpH laoticusnàyđềutácdụngtrênkênhthầnkinhKv1.1vàchưacóbáocáonàochỉrõsựliênkếtcủacácproteinnàyvới Kv1.3.HetlaxinlàtoxinđầutiêntạithờiđiểmbàiviếtđượctáchtừnọcbọcạpH.laoticuscótácđộngmạnh kênh Kv1.3 3.6 Khảosátđộctínhcủacácphân đoạncủanọc bọcạpH.laoticuslêndế 3.6.1 Kếtquảkhảo sátđộctínhcủacác phânđoạnnọc thuđược trêndế Các phân đoạn nọc bọ cạpH laoticusđược thử nghiệm xác định độc tính cơntrùng phương pháp tiêm bên bụng dế, lô gồm tiêm đối chứng sử dụng nước cấtcho kếtquảnhư bảng3.5 Bảng3.5 Kếtquảthửđộctính trêndế củacácphân đoạn nọc PĐ Các biểu hiệncủa dế Nhậnxét Dếnằmim, sauđó hoạtđộngbình thường Khơngđộc Dếnằmim, sauđó hoạtđộngbình thường Khơngđộc Dếnằmim, sauđó hoạtđộngbình thường Khơngđộc Dếnằmim, sauđó hoạtđộngbình thường Khơngđộc Dế hoạt động mạnh, nhảy liên tục trongbồnquansát,sauđónằmim,26phútsaudế n g n g h o t đ ộ n g , tức hi r ụ n g r a , t vong Nướccất Độc gâychế t Dếrun, nằmim, sauđó bìnhthường Khơngđộc Đối với phân đoạn 5, sau tiêm năm phút đầu tiên, dế hoạt động mạnh, chạynhảy liên tục Đến phút thứ 10, dế bắt đầu nằm yên đến phút thứ 26, dế có biểu tử vong, tứchirụngra Phân đoạn xácđịnh phân đoạncó độc tínhđối vớicơntrùng 3.6.2 Xácđịnhđộctínhcấpcủa phân đoạnđộclêncơn trùng theođườngtiêm bụng bêndế Saukhitiếnhànhtiêmbênbụngdếcủacáclơthửnghiệmvàcáclơđốichứngchúngtơixácđịnh đượcnhưsau: XácđịnhđượcliềutốiđakhơnggâychếtLD0=20,3µg/g Xácđịnh đượcliềutốithiểu gâychết 100%LD100=393,75 µg/g Xácđịnh liềuchếttrungbình LD50theo phương phápKarber– Behrenstheo bảng3.7 tacó: ∑ab=1.600,52 𝐿𝐷50= 𝐿 𝐷 n= 60/8 = 7,50 ∑𝑎𝑏 1600,52 =3 , =180,35 − 7,50 𝑛 100 − VậyLD50= 180,35 µg/g Bảng3.6 Tỷlệtửvong củadế ởcác liềukhác nhautrong khoảng LD0và LD 100sau 24 tiêm Liềutiêm 20,30 73,65 127,00 180,35 233,70 287,05 340,40 393,75 Sốdế/lô 8 8 8 Sốdếchết 3 4 Sốdếsống 5 4 0,00 37,50 37,50 50,00 50,00 75,00 87,50 100,00 Tỷlệchết (%) Bảng3.7 BảngtínhtheophươngphápKarber–Behrens 1,50 3,00 3,50 4,00 5,00 6,50 6,50 b 53,35 53,35 53,35 53,35 53,35 53,35 53,35 a.b 80.03 160,05 186,73 213,40 266,75 346,78 346,78 200 % Dế chết 300 a a:Sốtrungbình dếchếtởhailiều kếtiếp Liềutiêm(µg/g) b:hiệusốgiữahai lầnkếtiếp 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 100 400 Hình 3.8.Đồthịtỷlệ%dếchếttheo liềudùng Dựavàođồthịtỷlệ%chuộtchếttheoliềudùngtaxácđịnhliềuLD 16vàliềuLD 84nhưsau:LD16= 43,85 µg/ gvà LD84= 3 , µg/g Từđótính phân phốichuẩns= 143,40, vớibướcnhảyliềud=53,40.Hằngsố Karber–Behrensk= 0,564 Sai sốchuẩn củaliều LD50đ ợ c tínhtheo cơngthức: 𝑘× 𝑠×𝑑 𝐸𝑠= √ 𝑛 Eslà 23,99 Vậy độc tính cấp phân đoạn tách từ nọc thơ bọ cạp H laoticuslà LD50=180,35± 23,99 µg/g NhưvậybằngphươngphápKarber–Behrenschúngtơiđãxácđịnhđượcđộctínhcấpcủaphânđoạn độc vớicơntrùnglà LD50= 180,35± 23,99µg/g 3.6.3 Phântách phânđoạn 5bằng sắcký lỏnghiệunăngcao Phânđoạn5saukhiđượcxácđịnhcóđộctínhgâychếtđốivớicơntrùng(dế),tiếptụcđượcphân tách để thu toxin nhằm xác định cấu trúc toxin có độc tính xác định khả năngtươngtácđốivớikênhkali.Phânđoạn5đượcphântáchsửdụngsắckýlỏnghiệunăngcaophađảo,cột Eclipse XDB C18,sắckýđồthuđượcnhưhình3.23.Cácphânđoạnsaukhiđượctáchrariêngđượcđánhsố từ 5.1 đến 5.25 sau đượcsử dụngđể đánh giáđộctínhtrêndế 3.6.4 Khảosátđộctínhlên dếđốivớicác phânđoạn thứcấp Dựa vào kết khảo sát độc tính phân đoạn thứ cấp lên côn trùng bảng 3.8, 13phân đoạn xác định có độc tính dế thử nghiệm phân đoạn 5.3; 5.7; 5.8; 5.9; 5.10;5.12;5.13;5.15;5.17;5.18;5.21;5.24.Cácphânđoạnđộcnhẹtỷlệtửvongmỗilơlà50%(3/6)sau4 giờ, phân đoạnđộcmạnhcótỷkệtửvongmỗilơlà5/6sau4giờ.4phânđoạnđượcxácđịnhcóđộctính mạnh (độc gâychết,tỷlệ 5/6) làcác phân đoạn:5.7,5.12,5.15, 5.21 Bảng 3.8 Kết thử độc tính phân đoạn sau tách sắc ký lỏng hiệu cao lên côntrùng Phân đoạn 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 Kếtquả Khôngđộc (0/6) Khôngđộc (0/6) Độc nhẹ(3/6) Khôngđộc (0/6) Khôngđộc (0/6) Phân đoạn 5.9 Phân đoạn Kếtquả Độc nhẹ (3/6) 5.17 Kết Quả Độc nhẹ (3/6) 5.10 Độc nhẹ (3/6) 5.18 Độc nhẹ (3/6) 5.11 5.19 Khôngđộc(0/6) 5.12 Khôngđộc (0/6) Độc mạnh(5/6) 5.20 Khôngđộc(0/6) 5.13 Độc nhẹ (3/6) 5.21 Độc mạnh(5/6) 5.6 5.7 5.8 Khôngđộc (0/6) Độc mạnh(5/6) Độc nhẹ(3/6) 5.14 5.15 5.16 Khôngđộc (0/6) Độc mạnh(5/6) Khôngđộc (0/6) 5.22 Độc nhẹ (3/6) 5.23 5.24 Khôngđộc(0/6) Độc nhẹ (3/6) Từ kết sơ trên, phân đoạn độc côn trùng tiến hành tinh chế để thuđược mẫu toxinsạchnhằmtiến hànhxácđịnh khốilượngphân tửcủa cáctoxin Hình3.9 Sắc ký đồ củaphân đoạn 3.7 Cơlậpvà xácđịnhkhốilượngphântửcácphân đoạn thứcấp có độctính 3.7.1 Cơlập cácpolypeptidetừphânđoạnthứcấp Các phân đoạn thứ cấp xác định có độc tính phân tách sắc ký lỏng hiệu năngcao nhằm thu chuỗi polypeptide để phân tích xác định cấu trúc khả năngtươngtác đốikênh kali.Kếtquảtómtắtcủa trìnhcơ lập đượcthểhiệntrongbảngbảng3.8 3.7.2 Xácđịnhcấutrúc chuỗi polypeptidecủaphân đoạn 5.21 Phânđoạn5.21đượcchọnđểtiếptụctiếnhànhsắckýđểcơlậphaichuỗipolypetidecótrongthànhphầntừđóxác địnhcácđặctínhcủahaichuỗipolypeptidenày.Khốilượngphântửcủahaichuỗi polypeptide xác định phương pháp khối phổ MALDI-TOF cho kết khối lượngphântửcủahaiphânđoạn5.21.1và5.21.2lầnlượtlà317,974Davà 832,600 Da Đây toxinngắn, khác với toxin xác định có độc tính trùng nọc bọ cạpH laoticusphân bốtạiTháiLanlàtoxin dàicó khốilượngphân tửlớn8.293,07 Da.[90] Phân đoạn 5.21.1 xác định cấu trúc sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân Nhiệt độvàđộpHcủamẫuthayđổitrongkhoảng10–45oCvà5–7,5.Đầutiênxácđịnhhệspincủapeptide bằngphổD QF C OS Y, t i ế p t he o, b ằ n g phổ NO ES Y đểx c đị nh trìnhtựa m i n o acidtrong chuổipeptide.Thu kếtquảphổ NMR nhưhình 3.38.[12,29,30,46,52,75] Hình3.10 Phổ NMRcủatoxin 5.21.1 Qua hình 3.10, cho thấy H gốc amin cuối bị ion hóa Dựa vào kết phổNMR phổ MS đãdự đoánđược cấu trúc toxin 5.21.1 dipeptideLeu-Trp (hình 3.11) Nhưvậy,ởphânđoạn5củanọcbọcạpH.laoticuscó độc tính trùng, làm toxincủaphân đoạn 5.21.1là Leu-Trp làtoxin ngắncó khốilượngphân từ 317,974Da A B C Hình3.11 Cấutrúccủa toxin5.21.1 (Leu-Trp) A:Cấu trúc phẳng củaLeu– Trp ;B:VịtrícácnhómHtrênphổ NMR C:Mơhìnhcấutrúckhơnggiancủa Leu-Trp Sốlượngcácdipeptidecóhoạttínhsinhhọcđượcpháthiệntừthiênnhiêntínhtớithờiđiểmcủabàiviếtnàycịnrất hạnchế.Mộtvàidipeptidecóhoạttínhsinhhọcđượcpháthiệnsớmlàcarnosine(β-alanyl-L-histidine)vàanserine(β-alanyl-Nmethyl-Lhistidine)đượctìmthấytrongmơcơvàmơnãocủađộngvật.Cùngvớihomocarnosinevàophidine,cácdipeptidenàyđ ãvàđangđượcnghiên cứu khả kháng oxy hố tiềm ứng dụng dược phẩm Có cơng bốvề hoạt tính carnosine anserine khả điều trị số bệnh người đái tháođường,xơvữađộngmạch,Alzheimernhờkhảnăngngăncảnsựhìnhthànhcácsảnphẩmglycathố(các sản phẩm glycosyl hố protein hay lipid mà khơng có tham gia enzyme điều hồ).Gần đây, từ mô cá hồi Chum (Oncorhynchus keta), số dipeptide, điển hình Phe–Leu,Ala–Trp, Val–Trp, Met–Trp, Ile–Trp, Leu–Trp, tìm thấy cho kết thử nghiệm ứcchế enzyme ACE (angiotensinconverting enzyme), từ mang tới tiềm sử dụng làm thuốcđiềutrịbệnh tănghuyếtáp [42,50,68,79,95,100,105] KẾTLUẬN Quaqu t r ì n h k h ả o s t v n g h i ê n c ứ u n ọ c từb ọ c p Heterometrusl aot i c u s p h â n b ố A n Giang, mộtsố kếtquả sau ghinhận tómtắtnhưsau Bọ cạpHeterometrus laoticustrong tự nhiên bị ảnh hưởng môi trường xung quanh, cạnhtranh nguồn thức ăn, chống lại kẻ thù nên lượng nọc thô bọ cạp tương đối nhiều Trong điều kiệnnuôi phịng thí nghiệm, bọ cạp vận động, thức ăn nước cung cấp đầy đủ nên trọnglượng bọ cạp tăng nhiều, lượng nọc thu giảm đáng kể theo thời gian ni Điều kiện ni thửnghiệmtrongphịngthínghiệmnhư sau: Số lượngbọ cạptrungbìnhdưới50 1thauni Cho ăn1tuần1lần, trungbình 2,00gdế/bọcạp Lượngnọcthuđượccủa850conbọcạptrong6thángnilà6,9653gnọc,trungbình8,19mg/con BằngphươngphápsắckýlọcgeltrêngelSephadexG-50vớidungmơilàđệmammoniumacetate(pH=4,7),nọcthơcủa bọ cạpH laoticusđã tách thành phân đoạn nọc có ba phânđoạncóđộctínhđólàphânđoạn2,3và4.Trongbaphânđoạnđộcchỉcóphânđoạn4làphânđoạnđộc gây chết đối vớichuột,cịnphânđoạn2và3gâyđộcđốivớichuộtnhưngsauđóphụchồi.Khikhảosátđộctínhcủacácphânđoạntáchrađốivớicơntrùngchothấyphânđoạn 5cóđộctínhgâychết dế So sánh kết điện di cho thấy phân đoạn chứa protein có khối lượng phântử nằm vùng từ đến 10 kDa khoảng 65 kDa Phân đoạn chứa protein có khốilượngphântửtrongkhoảng3 kDa kDa Khảosát phân đoạn4 cóđộc tínhgâychết đốivớichuột Độc tính cấp phân đoạn theo tiêm tĩnh mạch chuột, liều chết trung bình LD50là24,07 ± 1,09 mg/kg, xếp vào độc loại II (loại có độc tính cao) so sánh với độctínhcấpcủanọcthơ,thìphânđoạn4lạicóđộctínhyếuhơnnọcthơ,điềuđócóthểxácđịnhrằngtrongnọcthơ,ng ồicácpeptidecókhốilượngphântửthấpđộcđốivớiđộngvậtcịncácpeptidecó khối lượng phân tử lớn enzyme phospholipasecũngcótácdụngđộcđốivớiđộngvật,chúngtươngtác vớinhaulàmcho độc tính nọcthô mạnh so vớiphân đoạn Bằng phương pháp HPLC, phân đoạn tách thành 25 phân đoạn thứ cấp khác nhau.Trongđócómộtphânđoạncóđộc tínhgây chếtđốivớiđộngvậtđólàphânđoạn4.6và5phân