0704 nghiên cứu vai trò của một số gốc axit amin đối với tính chất của β galactosidase từ bacillus subtilis vtcc dvn 12 01 phân lập ở việt nam bằng kỹ thuậ

VIỆNHÀNLÂMKHOAHỌCVÀCƠNGNGHỆVIỆTNAM VIỆNCƠNGNGHỆSINHHỌC NGUYỄNNTHỊTHẢOTHẢOO NGHIÊNCỨUVAITRỊCỦAMỘTSỐGỐC AXITAMINĐỐIVỚITÍNHCHẤTCỦA -GALACTOSIDASEGALACTOSIDASETỪBacillussubtilis VTCC-GALACTOSIDASEDVN-GALACTOSIDASE12-GALACTOSIDASE 01PHÂNLẬPỞVIỆTNAMBẰNGKỸTHUẬTep-GALACTOSIDASE RCAVÀ ĐỘTBIẾNĐIỂMĐỊNHHƯỚNG LUẬNNÁNTIẾNSĨSINHNSĨSINHHỌCC HÀNỘII -2017 VIỆNNHÀNLÂMKHOAHỌCVÀCVÀ CÔNGNGHỆNVIỆNTNAM VIỆNNCÔNGNGHỆNSINHHỌC C NguyễnThịThảo NGHIÊN CỨU VAI TRỊ CỦA MỘT SỐGỐCAXITAMINĐỐIVỚITÍNHCHẤTCỦA -GALACTOSIDASETỪGALACTOSIDASETỪBacillussubtilisVTCC-DVN-12-GALACTOSIDASETỪ 01PHÂNLẬPỞVIỆTNAMBẰNGKỸTHUẬT ep-GALACTOSIDASETỪRCAVÀĐỘTBIẾNĐIỂMĐỊNHHƯỚNG Chunngành:Hóasinhhọc c Mãsố::62 4201 16 LUẬNNÁNTIẾNSĨSINHNSĨSINHHỌCC NGƯỜIIH ƯỚNG NG D ẪN N KHOAH ỌCVÀ C: PGS.TS.Quy ền n ĐìnhThi ViệnnCơngnghệnsinhhọcc HàNội,i,2017 LỜICẢMƠN Tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc tới cố PGS TS Quyền Đình Thi, ngunTrưởng phịngC n g n g h ệ s i n h h ọ c E n z y m e , n g u y ê n P h ó V i ệ n t r n g V i ệ n C ô n g nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hướngnghiên cứu, tận tình hướng dẫn, biên tập thảo báo tạo điều kiện hóachất,thiếtbịcũngnhưkinhphíđểhồnthànhLuậnán Tơixinchânthànhcảm ơnTS VũV ă n H n h , T r n g p h ò n g C c c h ấ t c h ứ c sinh học, Viện Công nghệ sinh học sửa thảo báo cho sửdụng số liệu khuôn khổ đề tài “Nâng cao hoạt tính xúc tác enzyme tái tổhợpβ-galactosidase bằngkỹ thuật saochépgalactosidase bằngkỹ thuật saochépl ỗ i DNA vòngvà đột b i ế n đ i ể m t r ự c tiếp” thuộc đề tài Nghiên cứu 2011-galactosidase bằngkỹ thuật saochép2012 Quỹ phát triển Khoa học vàCôngnghệQuốcgiadoTSlàmchủ nhiệm Tôi xin cảm ơn GS TS Trương Nam Hải, nguyên Trưởng phịng Kỹ thuật ditruyền, ngun Viện trưởng ViệnC n g n g h ệ s i n h h ọ c đ ã g i ú p đ ỡ h n g d ẫ n p h â n tíchcấutrúcenzyme Tơi xin cảm ơn TS Đỗ Thị Tun, phụ trách phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme,Viện Cơng nghệ sinh học giúp tơi hồn thành thủ tục để bảo vệ Luận án cáccấp Tôi xin cảm ơn tập thể Phòng CNSH Enzyme, tạo điều kiện thời gian,chiasẻchunmơnvàgiúp đỡtận tìnhtrongsuốtqtrìnhthựchiệnLuận án Tơi xincảm ơnP h ị n g quảnlý tổnghợp, Phịngthí nghiệm t r ọ n g đ i ể m C ô n g nghệ gen,các cán bộtại cơsở đàotạoViệnCôngnghệ sinh học,V i ệ n H n l â m Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất, máymócvàgiúpđỡtơihồnthànhmọithủtụccầnthiếttrongqtrìnhlàmnghiêncứu Cuối xin cảm ơn người thân gia đình bạn bè giúp đỡ,tạođiềukiệnvàđộngviêntơitrongsuốtthờigianhọc tập Hà Nội, ngày 20 tháng 08 năm 2017Tácgiả NguyễnThịThảo LỜICAMĐOAN Tôixincamđoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cáccộngsự khác; Các số liệu kết trình bày luận văn án trung thực, phần đãđược công bố trênc c t p c h í k h o a h ọ c c h u y ê n n g n h v i s ự đ n g ý v c h o p h é p củacácđồngtácgiả; Phầncịnlạichưađượcaicơngbốtrongbấtkỳcơngtrìnhnàokhác Hà Nội, ngày20tháng 2017Tácgiả NguyễnThịThảo 08 năm CÁCTỪVIẾTTẮT bp BOD Basepair(cặpbazơ) Biochemicaloxygendemand(Nhucầuoxysinhhóa)BSA Bovineserumalbumin(Albuminhuyếtthanhbị) cfu Colonyf or mi ng u n i t ( Đ n v ị x c đ ị n h s ố l ợ n g t ế b o r i ê n g r ẽ củavi khuẩnhoặc nấm) COD Chemicaloxygendemand(Nhucầuoxyhóahọc)CS Cộng DNA Deoxyribonucleicacid(Axitdeoxyribonucleic) ep-RCA Errorpronerollingcircleamplification(Saochépvòngtạolỗi)Gal (đườnggalactozơ) Glc Glucose(đườngglucozơ) GHF Galactose Glycosideh y d r o l a s e f a m i l y ( H ọ c c e n z y m t h ủ y p h â n l i ê n k ế t glycozit) GOS Galactose-oligossacharide IPTG Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside kb Kilobase(ĐơnvịđokíchthướccủaphântửADN)kDa KiloDalton(Đơnvịđokhối lượngcủa phântửprotein)M Marker (Thangchuẩn) PCR Polymerasechainreaction(Phảnứngchuỗitrùnghợp)oNP Nitrophenyl oNPG Ortho-Nitrophenyl--D- Ortho- galactopyranosidepNPG/pNP-gal para-Nitrophenyl--DgalactopyranosidepNP-fuc para-Nitrophenyl--Dfucopyranosiderpm Roundperminute(Vòng/phút) SDS-PAGE Sodiumdodecyl s u l f a t e p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o CÁCTỪVIẾTTẮT p h o r e s i s (Điệndigelpolyacrylamitcó bổsungsodiumdodecylsulfate) SOC Superoptimalbroth(Môitrườnggiàudinhdưỡngchovikhuẩn)TIM Triosephosphateisomerase TLC Thin-layerchromatography (Sắckýbảnmỏng) TE TrisEDTA TBE TrisboricacidEDTA TEMED N,N,N’,N’Tetramethylethylendiaminev/v Volume/volume(Thểtích/thểtích) w/v Weight/volume(Trọnglượng/thểtích) WT Wildtype(Dạng banđầu) MỤCLỤC LỜICẢMƠN .i LỜICAMĐOAN ii CÁCTỪVIẾTTẮT iii MỤCLỤC .iv DANHMỤCHÌNH vii DANHMỤCBẢNG ix DANHMỤCPHỤLỤC xi MỞ ĐẦU CHƯƠNG1.TỔNGQUANTÀILIỆU .4 1.1 Thôngtinchungvề-GALACTOSIDASETỪgalactosidase .4 1.1.1 Địnhnghĩa 1.1.2 Nguồngốcvàphânloại .4 1.1.3 Cấutrúc 1.1.4 Cơchếphảnứng .15 1.2 Ứngdụng 18 1.2.1 Trongcôngnghiệpchếbiếnsữa .19 1.2.2 Trongxửlýwhey 20 1.2.3 Trongydược 23 1.2.4 Mộtsốứngdụngkhác .24 1.3 Tìnhhìnhnghiêncứuβ-GALACTOSIDASETỪgalactosidasetrongvàngồinước .25 1.3.1 Cáchướngnghiêncứutrênthếgiới 25 1.3.2 Cácnghiêncứutrongnước .31 1.3.3 Hướngnghiêncứucủađềtài 32 CHƯƠNG2.VẬTLIỆUVÀPHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 35 2.1 Vậtliệuvàhóachất .35 2.1.1 Vậtliệu 35 2.1.2 Hóachấtvàdungdịch .36 2.1.3 Thiếtbịthínghiệm 38 2.2 Phươngphápnghiêncứu .38 2.2.1 TạođộtbiếnngẫunhiêntrêngenlacA 38 2.2.2 XâydựngthưviệncácdòngmanggenlacAđộtbiến .41 MỤCLỤC 2.2.3 Tạođộtbiếnđiểmvàđộtbiếnđiểms u y biến 42 2.2.4 Xâydựngvàphântíchcấutrúcenzyme 43 2.2.5 Sànglọchoạttính-galactosidasetừcácdịngmang genlacAđộtbiến 43 2.2.6 TáchDNAplasmid 44 2.2.7 Cắtplasmidbằngenzymegiớihạn 45 2.2.8 Điệndiagarose .45 2.2.9 Xác địnhtrìnhtựDNA 45 2.2.10 BiểuhiệnvàtinhsạchLacAtáitổhợp 45 2.2.11 ĐiệndiSDS-PAGE 46 2.2.12 Xác địnhhàmlượngprotein 47 2.2.13 Xácđịnhhoạttínhthủyphâncủa-galactosidase 48 2.2.14 Xácđịnhkhảnăngchuyểnhóa glycosidecủa-galactosidase .49 2.2.15 Đặcđiểm củaLacAtựnhiênvàđộtbiến 50 2.2.16 Xửlýsốliệu 52 CHƯƠNG3.KẾTQUẢNGHIÊNCỨU 53 3.1 Tạođộtbiếnngẫunhiên .54 3.1.1 TạođộtbiếnngẫunhiêntrêngenlacA 54 3.1.2 TạothưviệncácdịngmanggenlacAđộtbiếnvàsànglọchoạttính 57 3.1.3 Phântíchtrìnhtựcácdịngđộtbiến 59 3.1.4 XácđịnhđiểmđộtbiếnlàmthayđổihoạttínhLacA .60 3.2 Tạođộtbiếnđiểmsuybiến 66 3.2.1 XácđịnhvùngliênkếtcơchấtcủaLacA 67 3.2.2 Tạothưviệnđộtbiếnđiểmsuybiến .68 3.2.3 Sànglọc hoạt tínhvàchọndịng 69 3.2.4 Phântíchtrìnhtựcácdịngđộtbiến 69 3.2.5 TinhsạchvàxácđịnhhoạttínhriêngcủaLacAđộtbiếnđiểmsuybiến 72 3.3 ĐánhgiátínhchấtlýhóacủacácLacA độtbiến 77 3.3.1 Nhiệtđộhoạtđộngtốiưu 78 3.3.2 pHhoạtđộngtốiưu 79 3.3.3 ẢnhhưởngcủapH đếnđộbềnLacAtựnhiênvàđộtbiến .80 3.3.4 ẢnhhưởngcủanhiệtđộđếnđộbềnLacAtựnhiênvàđộtbiến 81 3.3.5 Động họccủaLacAtựnhiên vàđột biến 85 MỤCLỤC 3.3.6 Ảnhhưởngcủađộtbiếnđếnkhảnăngtạooligosaccharide 86 3.4 Phântíchsựảnhhưởngcủacác độtbiếnđếncấutrúccủaLacA .88 3.4.1 ẢnhhưởngcủavịtríAla301đếncấutrúccủaLacA .88 3.4.2 ẢnhhưởngcủavịtríPhe361đếncấutrúccủaLacA .91 3.4.3 ẢnhhưởngcủavịtríLeu373đếncấu trúccủaLacA 93 CHƯƠNG4.THẢOLUẬN 97 4.1 TạođộtbiếnngẫunhiêntrêngenlacA 97 4.2 Đánhgiáảnhhưởngcủacácvịtríđộtbiếntìmđượctrên LacA 98 4.2.1 ẢnhhưởngcủaaxitaminAla301 .99 4.2.2 Ảnhhưởngcủacácaxitamindựđoánliênkếtvớicơchất .103 KẾTLUẬNVÀKIẾNNGHỊ 112 CÁCCÔNGBỐLIÊNQUANĐẾN LUẬNÁN 113 THESISABSTRACT 114 TÀILỆUTHAMKHẢO 121 PHỤLỤC DANHMỤCHÌNH Hình1.1 Cấutrúc-galactosidasecủaE.colithuộchọGHF-2 10 Hình1.2 Cấutrúccủa-galactosidasetừK.lactis 10 Hình1.3 Sosánhcấutrúc-galactosidasetừngườivớimộtsốvisinhvậtkhác 11 Hình1.4 Cấutrúccủa-galactosidasetừB.circulansATCC31382 12 Hình1.5 Cấutrúckhơnggian3chiềuvàvùngtrungtâmhoạtđộngcủaLacA 14 Hình1.6 Độnghọcphảnứngthủyphânlactosecủa-galactosidase 16 Hình1.7 Động học phản ứng thủy phân lactose của-galactosidasevới hai axit glutamictrongtrungtâmhoạtđộng 17 Hình1.8 Sựtổnghợpoligosaccharide 22 Hình1.9 Sơ đồ so sánh phương pháp error prone-RCA với cácphương pháp đột biếnngẫunhiênkhác 33 Hình2.1 CơchếtạođộtbiếnngẫunhiênbằngsaochéplỗivịngDNA 40 Hình2.2 Cácbướctrongqtrìnhtạođộtbiếnđịnhhướng 42 Hình2.3 ĐườngchuẩnhàmlượngalbuminhuyếtthanhbịtheoBradford .48 Hình2.4 SựthủyphâncủaoNPGbởi-galactosidase 49 Hình2.5 ĐồthịLineawever-Burk 51 Hình3.1 ĐiệndiđồsảnphẩmplasmidpELacAsauphảnứngep-RCA 55 Hình3.2 ĐiệndiđồsảnphẩmcắtplasmidpELacAtừcácdòngtrongthưviệnđộtbiếnngẫunhiênbằn gBamHIvàNotI 57 Hình3.3 ĐiệndiđồsảnphẩmPCRkhnpELacAvớicáccặpmồiđộtbiến .60 Hình3.4A TrìnhtựbộbanucleotidetạivịtrímãhóachoaxitaminGlu62trênLacA 61 Hình3.4B TrìnhtựbộbanucleotidetạivịtrímãhóachoaxitaminArg77trênLacA 61 Hình3.4C TrìnhtựbộbanucleotidetạivịtrímãhóachoaxitaminAla191trênLacA 62 Hình3.4D TrìnhtựbộbanucleotidetạivịtrímãhóachoaxitaminA301trênLacA .62 Hình3.4E TrìnhtựbộbanucleotidetạivịtrímãhóachoaxitaminPhe361trênLacA 62 Hình3.4F TrìnhtựbộbanucleotidetạivịtrímãhóachoaxitaminAla429trênLacA 63 Hình3.4G TrìnhtựbộbanucleotidetạivịtrímãhóachoaxitaminAla524trênLacA 63