BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ KIT CHẨN ĐỐN VI KHUẨN LAO KHƠNG ĐIỂN HÌNH (NONTUBERCULOSIS MYCOBACTERIA - NTM) BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR NGUYỄN THỊ LAN CHUYÊN NGÀNH MÃ NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC : 60420201 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS TRẦN MỸ LINH HÀ NỘI, 03/2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, cơng trình nghiên cứu khoa học riêng dƣới hƣớng dẫn Tiến sĩ Trần Mỹ Linh Các số liệu, kết luận văn trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Học viên Nguyễn Thị Lan ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến Tiến Sĩ Trần Mỹ Linh tận tình hƣớng dẫn, quan tâm giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo Phịng đào tạo Khoa sau đại học Viện Đại học Mở Hà Nội, Labo Lao chuẩn Quốc gia Bệnh viện phổi Trung ưong, tạo điều kiện, giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Tơi xin tỏ lịng biết ơn chân thành đến Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm Khoa Sau đại học- Viện Đại học Mở Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, ngƣời thân bạn bè, đồng nghiệp động viên, khích lệ tơi nhiều để tơi có thêm nhiệt tình say mê nghiên cứu khoa học Hà Nội, ngày 16 tháng 03 năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Lan iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ii LỜI CẢM ƠN iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi ĐẶT VẤN ĐỀ Error! Bookmark not defined CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .5 1.KHÁI NIỆM CHUNG 1.1.Đặc điểm 1.2 Cơ chế gây bệnh 16 2.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƢỚC 17 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU20 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU: 20 2.1.1.Thu thập mẫu bệnh phẩm chủng vi khuẩn .20 2.1.2 Bảo quản vận chuyển mẫu bệnh phẩm chủng vi khuẩn 21 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 21 2.3.NGUYÊN VẬT LIỆU 22 2.3.1 Thiết bị phòng thí nghiệm 22 2.3.2 Hóa chất nghiên cứu 24 2.3.3 Vật liệu nghiên cứu 26 2.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.4.1 Quy trình phát nhanh vi khuẩn lao khơng điển hình .27 2.4.2 Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số từ bệnh phẩm 31 2.4.3 Phƣơng pháp thiết kế cặp mồi đặc hiệu 32 2.4.5 Phƣơng pháp đọc phân tích trình tự nucleotid 39 2.4.6.Tách chiết DNA tổng số từ mẫu 40 2.4.7.Điện di SafeView™-Classic 41 2.5 GIẢI TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GENE TRÊN PHẦN MỀM CHUN DỤNG: 42 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 44 iv 3.1.KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ 44 3.2 KẾT QUẢ NHÂN GEN (PCR) 45 3.3.KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDError! Bookmark not defined 3.4.THỜI GIAN HỒN THÀNH MỘT LẦN XÉT NGHIỆM 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC 63 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFB : Trực khuẩn kháng axit (Acid-fast bacilli) AND : Deoxyribo nucleic Acid KSĐ : Kháng sinh đồ LJ : Môi trƣờng đặc cấy Mycobacterium tuberculosis Lowenstein-Jeelsen MTB : Mycobacterium tuberculosis NTM :Nontuberculosis mycobacteria MAC :Mycobacterium avium complex PCR : Kỹ thuật nhân gen (Polymerase Chain Reaction) TCYTTG : Tổ chức y tế Thế giới (World Health Organization) NALC : N-acetyl L-cysteine For : Mồi xi Rev : Mồi ngƣợc vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1: Ước tính ca bệnh nhiễm lao (các thể) tồn cầu 2013… Hình Hình ảnh trực khuẩn kháng axit - AFB kính hiển vi với đặc tính nhuộm Ziehl – Neelsen Hình 3: M.Avium mơi trường Lowenstein –Jensen sau tuần ni cấy Hình 4: M.Abscesus môi trường Lowenstein – Jensen sau tuần nuôi cấy 10 Hình 5: Cấu tạo thành tế bào M Tuberculosis complex 11 Hình 6: Tỉ lệ ca bệnh vi khuẩn nhóm NTM gây khu vực châu Á 14 Hình 7: Ảnh minh họa liệu tìm kiếm thơng tin qua từ khóa “mycobacterium” cổng thông tin NCBI 30 Hình 8: Ảnh minh họa liệu tìm kiếm nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium 16S” cổng thông tin NCBI 31 Hình 9: Ảnh minh họa liệu tìm kiếm nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium rpoB” cổng thơng tin NCBI 32 Hình 10: Ảnh minh họa liệu tìm kiếm nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium hsp65” cổng thơng tin NCBI 32 Hình 11: Kết trình tự thu nhận hiển thị phần mềm BioEdit 41 Hình 12: Kết trình tự so sánh với mẫu đối chứng 42 Hình 13: Kết trình tự so sánh với ngân hàng gen giới (Genbank) để tìm tương đồng 43 Hình 14: Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ mẫu 44 Hình 15: Kết điện thí nghiệm tìm nhiệt độ bắt cặp nồng độ DNA tổng số phù hợp 46 Hình 16 Kết điện di sản phẩm PCR – M.Avium 48 Hình 17 Kết điện di sản phẩm PCR – M.Abscessus 50 Hình 18 Kết điện di sản phẩm PCR – M.Avium + M.Abscessus 52 vii DANH MỤC BẢNG, SƠ ĐỒ Bảng Danh sách mẫu 16 Bảng Biểu mẫu tra kết cấy 27 Bảng Thành phần phản ứng PCR 34 Bảng Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại DNA tổng số thu từ mẫu 36 Bảng Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự 37 Sơ đồ Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự 37 viii MỞ ĐẦU Cho đến thời điểm tại, vào kỷ thứ 21, vi khuẩn lao gây vấn đề trầm trọng cho y tế sức khỏe cộng đồng Mặc dù đầu tƣ cho y tế tốt nhiều với phƣơng tiện trang thiết bị máy móc đại, phƣơng pháp chẩn đoán hiệu làm giảm thiểu ca lây truyền nhiễm lao mới, nhƣng tƣợng mắc lao khơng điển hình (Nontuberculosis mycobacteria - NTM) lại gia tăng đối tƣợng bệnh nhân có tình trạng suy giảm miễn dịch, có tiền sử bệnh lý mãn tính phổi hay có bất thƣờng kiểu gen bệnh xơ hóa kén, α-antitrypsin, interferon-gamma (IFN-), interleukin-12 Tại Việt Nam, việc chẩn đoán NTM bệnh viện sở y tế từ trƣớc đến sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống cho kết chậm (15 – 20 ngày) thƣờng xuyên bị tạp nhiễm, nên khả đặc hiệu chẩn đoán thấp Ở lĩnh vực chẩn đoán sinh học phân tử gần nhƣ chƣa có nghiên cứu vấn đề triển khai đƣợc ghi nhận Cũng phải nói việc chẩn đốn cận lâm sàng NTM sở y tế Việt Nam chƣa đƣợc đầu tƣ nghiên cứu cách có bản, điều góp phần đƣa bệnh lao khơng điển hình NTM âm thầm bùng phát gây tác hại lớn đến sức khỏe kinh tế ngƣời bệnh Do vậy, Nhóm nghiên cứu đề xuất nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chẩn đoán sinh học phân tử đại việc chẩn đốn phát sớm có mặt vi khuẩn lao khơng điển hình (NTM) mẫu bệnh phẩm bệnh nhân nghi mắc lao nhƣng không đáp ứng với công thức điều trị lao thông thƣờng, mục tiêu nghiên cứu tập trung tối ƣu khâu trình thực nhƣ khâu xử lý mẫu, tách chiết DNA vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm khâu xác định kết theo hƣớng đơn giản, dễ thao tác, hạn chế tối đa khả nhiễm chéo mẫu xét nghiệm, an toàn cho ngƣời sử dụng thân thiện với môi trƣờng [3] Bệnh Lao (Mycobacterium Tuberculosis - MTB) – Tác nhân gây bệnh nhiễm trùng chiếm tỉ lệ tử vong hàng đầu Quốc gia phát triển khoảng 15 năm trở lại Cùng với bùng phát đại dịch HIV tồn cầu, mơi trƣờng sống ngày suy thoái, ngƣời nhập cƣ từ quốc gia phát triển, bệnh nhân mắc lao bỏ điều trị … ảnh hƣởng trực tiếp tới khả miễn dịch ngƣời sức khỏe cộng đồng, quan trọng quay trở lại bệnh lao – lao kháng thuốc đặt nhân loại lần đối diện với đại dịch lao tƣởng nhƣ đƣợc toán kỷ trƣớc.[2] Hình 1: Ước tính ca bệnh nhiễm lao (các thể) tồn cầu 2013 Cịn nƣớc phát triển, nơi bệnh lao đƣợc khống chế bệnh lao khơng điển hình (Non Tubercolusis Mycobacterium – NTM) lại tác nhân gây nhiễm trùng âm thầm nguy hại bệnh nhân mắc bệnh liên quan đến tình trạng miễn dịch Giếng 1: Thang chuẩn 50bp (Fermentas) Giếng - 4: Mẫu bệnh phẩm NTM 7, 8, Hình 15 Kết điện di sản phẩm PCR – M.avium + M.abscesus Phiên giải kết quả: Kết điện di cho thấy: Phản ứng multiplex PCR với mồi đặc hiệu (16S hps65) nhân nhân thành cơng đoạn gen đích quan tâm có mẫu bệnh phẩm bao gồm gen 16S hps 65 có kích thƣớc 453 163 bp, hồn tồn phù hợp với thiết kế lý thuyết, giúp phát đồng thời chủng vi khuẩn Dựa theo kết ta thấy Đã thành công việc thử nghiệm kỹ thuật multiplex PCR cho nhân đoạn gen 16S Avium hps65 Abscessus từ mẫu bệnh phẩm, có kích thƣớc 453 163 bp phù hợp với tính tốn lý thuyết cặp mồi thiết kế Nhìn chung phƣơng pháp phát chủng vi sinh vật gây nhiễm khuẩn, PCR đa mồi phƣơng pháp nhanh chóng thuận lợi giá thành rẻ so với phƣơng pháp đại nhƣ lai miễn dịch giải trình tự hệ thƣờng đƣợc áp dụng phổ biến bệnh viện 53 3.3 KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN Sản phẩm PCR đƣợc tinh cách bổ sung µl EDTA 125mM, 60 µl cồn 100% ủ nhiệt độ phòng 15 phút Tiếp đó, ly tâm 12000 v/p 15 phút để tủa đoạn DNA, sau loại bỏ cồn Bổ sung 60 µl cồn 70% ly tâm 10000 v/p 10 phút Làm khô kết tủa DNA, bổ sung 10 µl Hi-DiTM Formamide biến tính 95oC phút Các mẫu đƣợc tra vào giếng khay đựng mẫu, sau điện di ống mao quản 80 cm x 50 µl với polymer POP-4™ Kết đƣợc xử lý phần mềm DNA star BioEdit Hình 16: Kết trình tự thu nhận hiển thị phần mềm BioEdit 54 Hình 17: Kết trình tự so sánh với mẫu đối chứng Kết trình tự gen thu đƣợc đƣợc đƣa lên ngân hàng gen giới Genbank: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi để so sánh tính tƣơng đồng kết 55 Hình 18: Kết trình tự so sánh với ngân hàng gen giới (Genbank) để tìm tương đồng 56 Phân tích trình tự nucleotid Qua hình ảnh trình tự nucleotid phần 2.5 thu nhận đƣợc cho thấy: - Hình 1: Kết hình ảnh trình tự thu nhận đƣợc cho peak rõ ràng, không bị nhiễu chứng tỏ cặp mồi đƣợc thiết kế xác, phù hợp Kích thƣớc đoạn gen thu nhận đƣợc với kích thƣớc thiết kế lý thuyết (~453bp) - Hình 2: Trình tự chủng M.Avium phân lập từ mẫu bệnh BN01 đƣợc so sánh với trình tự chủng chuẩn M.Avium (ATCC-25291) thƣơng mại, trình tự chủng chuẩn M.Avium ATCC-25291 đƣợc công bố ngân hàng gen quốc tế mã số GQ153272 trình tự chủng vi khuẩn lao đƣợc công bố ngân hàng gen quốc tế với mã số JX 266698 để đánh giá khác biệt Kết cho thấy: trình tự chủng ATCC-25291 thƣơng mại có trình tự tƣơng đồng 100% so với trình tự chủng ATCC-25291 đƣợc cơng bố ngân hàng gen quốc tế mã số GQ153272 Trình tự BN01 phân lập đƣợc có tính tƣơng đồng với trình tự ATCC-25291 vùng gen định danh 16S (độ tƣơng đồng 100%), có khác biệt vị trí so với trình tự vi khuẩn lao JX266698 Trình tự cặp mồi nhân đoạn gen 16S đƣợc đánh dấu giống với chủng M.Avium sai khác/ thêm bớt nu/mồi trình tự chủng vi khuẩn lao đầu 3’ mồi, điều giải thích tính đặc hiệu cặp mồi chẩn đoán vi khuẩn lao khơng điển hình - Hình 3: Kết trình tự thu đƣợc đem so sánh với ngân hàng gen giới để tìm tƣơng đồng kết quả, Hình ảnh cho thấy trình tự thu đƣợc có độ tƣơng đồng tuyet doi 100% so với chủng M.Avium đƣợc ghi nhận Genbank, trình tự gen thu đƣợc hồn tồn khơng lẫn với chủng khác họ Mycobacterium đặc biệt Micobacterium Tubercolusis 57 3.4 THỜI GIAN HOÀN THÀNH MỘT LẦN XÉT NGHIỆM - Tổng thời gian tồn q trình thí nghiệm mẫu bệnh phẩm từ 24 đến 48 Trong thời gian trung bình cơng đoạn nhƣ sau: - Nhƣ so với phƣơng pháp xét nghiệm truyền thống, thời gian chờ đợi kết đƣợc giảm xuống đáng kể, thay từ 10-20 ngày cịn 24-48 Đây ƣu điểm vƣợt trội việc chẩn đoán phƣơng pháp multiplex PCR 58 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1.1 Thời gian phát vi khuẩn qua mẫu bệnh phẩm theo phƣơng pháp PCR rút ngắn, 24h - 48h so với 15 – 20 ngày theo phƣơng pháp truyền thống 1.2 Nhóm nghiên cứu thành cơng bƣớc đầu việc thiết kế, chứng sở khoa học hoàn thiện đƣợc sản phẩm sinh phẩm chẩn đoán nhanh bệnh NTM 1.3 Bộ sinh phẩm thỏa mãn đƣợc điều kiện đặt đề tài là: Chất lƣợng, nhanh chóng, đơn giản, an toàn thân thiện KIẾN NGHỊ 2.1 Để tiếp tục thực đề tài, nhóm muốn hoàn thiện triển khai sản phẩm với phổ chẩn đoán rộng từ – chủng NTM gây bệnh phổ biến lần xét nghiệm thay nhƣ 2.2 Nâng cấp kỹ thuật chẩn đốn PCR định lƣợng thay định tính nhƣ 2.3 Đƣa thêm vào sinh phẩm tiêu chuẩn kiểm chuẩn nhƣ kiểm chứng dƣơng âm tính giả nhằm nâng cao hiệu suất độ xác chẩn đoán 2.4 Đăng ký thử nghiệm sản phẩm sở y tế nhằm xác định xác độ nhạy độ đặc hiệu sản phẩm 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyên, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật Y học, Nhà xuất giáo dục Nguyễn Xuân Triều (2006), "Chẩn đoán lao", Bài giảng lao bệnh phổi Khoa Sau đai hoc, Học viện quân y Phạm Hùng Vân (2007), Các quy trình kỹ thuật sinh học phân tử thường sử dụng chẩn đoán nghiên cứu y sinh học Nhà xuất Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh Aitken ML, Limaye A, Pottinger P, Whimbey E, Goss CH, Tonelli MR, Cangelosi GA, Dirac MA, Olivier KN, Brown-Elliott BA, McNulty S, Wallace RJ., Jr 2012 Respiratory outbreak of Mycobacterium abscessus subspecies massiliense in a lung transplant and cystic fibrosis center Am J Respir Crit Care Med 185:231–232 10.1164/ajrccm.185.2.231 Macheras E, Roux AL, Bastian S, Leao SC, Palaci M, Sivadon-Tardy V, Gutierrez C, Richter E, Rusch-Gerdes S, Pfyffer G, Bodmer T, Cambau E, Gaillard JL, Heym B 2011 Multilocus sequence analysis and rpoB sequencing of Mycobacterium abscessus (sensu lato) strains J Clin Microbiol 49:491–499 10.1128/JCM.01274-10 Bryant JM, Grogono DM, Greaves D, Foweraker J, Roddick I, Inns T, Reacher M, Haworth CS, Curran MD, Harris SR, Peacock SJ, Parkhill J, Floto RA 2013 Whole-genome sequencing to identify transmission of Mycobacterium abscessus between patients with cystic fibrosis: a retrospective cohort study Lancet381:1551–1560 10.1016/S0140- 6736(13)60632-7 Harada T, Akiyama Y, Kurashima A, Nagai H, Tsuyuguchi K, Fujii T, Yano S, Shigeto E, Kuraoka T, Kajiki A, Kobashi Y, Kokubu F, Sato A, Yoshida S, Iwamoto T, Saito H 2012 Clinical and microbiological 60 differences between massiliense lung Mycobacterium diseases J abscessus Clin and Mycobacterium Microbiol 50:3556–3561 10.1128/JCM.01175-12 Jung Y, Song KH, Choe PG, Park WB, Bang JH, Kim ES, Kim HB, Park SW, Kim NJ, Oh MD.Int disseminated Mycobacterium receiving antiretroviral complex prophylaxis J STD AIDS avium-complex infection in therapy 2017 with use Jan Incidence HIV of patients of Mycobacterium avium- 1:956462417713432 doi: 10.1177/0956462417713432 Zelazny AM, Root JM, Shea YR, Colombo RE, Shamputa IC, Stock F, Conlan S, McNulty S, Brown-Elliott BA, Wallace RJ, Jr., Olivier KN, Holland SM, Sampaio EP 2009 Cohort study of molecular identification and typing of Mycobacterium abscessus, Mycobacterium massiliense, and Mycobacterium bolletii J Clin Microbiol 47:1985–1995 10.1128/JCM.01688-08 10.Heydari H, Wee WY, Lokanathan N, Hari R, Mohamed Yusoff A, Beh CY, Yazdi AH, Wong GJ, Ngeow YF, Choo SW 2013 MabsBase: a Mycobacterium abscessus genome and annotation database PLoS One 8:e62443 10.1371/journal.pone.0062443 11.Libanore, M., Bicocchi, R., Ghinelli, F., 1992 Mixed bronchial infection due to Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium aviumintracellulare in an AIDS patient Infection 20, 298– 299 12.Huang CC, Chen JH, Hu ST, Chiou CS, Huang WC, Hsu JY, Lu JJ, and Shen GH, 2012 Combined rpoB duplex PCR and hsp65 PCR restriction fragment length polymorphism with capillary electrophoresis as an effective algorithm for identification of Mycobacterial species from clinical isolates BMC Microbiology 12,137 61 13.Falkinham JO III, 2011 Nontuberculous mycobacteria from household plumbing of patients with nontuberculous mycobacteria disease Emerg Infect Dis 17:419–24 14.Saini V, Raghuvanshi S, Talwar GP, Ahmed N, Khurana JP, Hasnain SE, Tyagi AK, Tyagi AK (2009) Polyphasic taxonomic analysis establishes Mycobacterium indicus pranii as a distinct species PLoS One 16;4(7) 15.Kim BJ, Hong SK, Lee KH, Yun YJ, Kim EC, Park YG, Bai GH, Kook YH (2004) Differential identification of Mycobacterium tuberculosis complex and nontuberculous mycobacteria by duplex PCR assay using the RNA polymerase gene (rpoB) J Clin Microbiol 42(3):1308-12 16.September S M.,V S Broăzel, and S N Venter (2004) Diversity of Nontuberculoid Mycobacterium Species in Biofilms of Urban and Semiurban Drinking Water Distribution Systems Applied and environmental microbiology, 7571–7573 Vol 70, No 12 17.Lopez-Alvarez R; Claudia Badillo-Lopez; Jorge F Cerna-Cortes; Ivan Castillo-Ramirez; Sandra Rivera-Gutierrez; Addy C Helguera-Repetto; Diana Aguilar; Rogelio Hernandez-Pando; Sofia Samper; Jorge A Gonzalez-yMerchand (2010) First insights into the genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis isolates from HIV-infected Mexican patients and mutations causing multidrug resistance BMC Microbiology, 10:82 18.Thomson R, Carter R, Tolson C, Coulter C, Huygens F and Hargreaves M (2013) Factors associated with the isolation of Nontuberculous mycobacteria (NTM) from a large municipal water system in Brisbane, Australia BMC Microbiology, 13:89 19.Turenne TC Y.,V J Cook,T V Burdz,1 R J Pauls,3 L Thibert, J N Wolfe1 and A Kabani (2004) Mycobacterium parascrofulaceum sp nov., novel slowly growing, scotochromogenic clinical isolates related to 62 Mycobacterium simiae International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54, 1543–1551 20.Turenne TC, Tschetter L, Wolfe J, Kabani A (2001) Necessity of quality controlled 16S rRNA gene sequence databases identifying nontuberculous mycobacterium species J Clin Microbiol, 39: 3637–3648 21.Chimara E1, Ferrazoli L, Ueky SY, Martins MC, Durham AM, Arbeit RD, Leão SC (2008) Reliable identification of mycobacterial species by PCR-restriction enzyme analysis (PRA)-hsp65 in a reference laboratory and elaboration of a sequence-based extended algorithm of PRA-hsp65 patterns BMC Microbiol 20;8:48 22.Biosafety laboratory manual 3rd edition – WHO – GENEVA 2004 23.Polly E Parsons MD, John E Heffner MD; Pulmonary/respiration thepary 3rd editon; Copyright © 2006 by Elsevier Inc All rights reserved 24.William J Mason Add all; Multiplex PCR Protocol for the Diagnosis of Staphylococcal Infection; J Clin Microbiol 2001 Sep; 39(9): 3332–3338 25.Elfath M Elnifro; Multiplex PCR: Optimization and Application in Diagnostic Virology; Clin Microbiol Rev 2000 Oct; 13(4): 559–570 26 Winthrop KL, McNelley E, Kendall B, Marshall-Olson A, Morris C, Cassidy M, Saulson A, Hedberg K 2010 Pulmonary nontuberculous mycobacterial disease prevalence and clinical features: an emerging public health disease Am J Respir Crit Care Med 182:977–982 10.1164/rccm.201003-0503OC 27.Jonsson BE, Gilljam M, Lindblad A, Ridell M, Wold AE, WelinderOlsson C 2007 Molecular epidemiology of Mycobacterium abscessus, with focus on cystic fibrosis J Clin 10.1128/JCM.02592-06 63 Microbiol 45:1497–1504 28.Griffith DE 2011 The talking Mycobacterium abscessus blues Clin Infect Dis 52:572–574 10.1093/cid/ciq252 29.Jarand J, Levin A, Zhang L, Huitt G, Mitchell JD, Daley CL 2011 Clinical and microbiologic outcomes in patients receiving treatment for Mycobacterium abscessus pulmonary disease Clin Infect Dis 52:565–571 10.1093/cid/ciq237 30.Nessar R, Cambau E, Reyrat JM, Murray A, Gicquel B 2012 Mycobacterium abscessus: a new antibiotic nightmare J Antimicrob Chemother 67:810–818 10.1093/jac/dkr578 31.Prammananan T, Sander P, Brown BA, Frischkorn K, Onyi GO, Zhang Y, Bottger EC, Wallace RJ., Jr 1998 A single 16S ribosomal RNA substitution is responsible for resistance to amikacin and other 2deoxystreptamine aminoglycosides in Mycobacterium abscessus and Mycobacterium chelonae J Infect Dis.177:1573–1581 10.1086/515328 32.Leao SC, Tortoli E, Euzeby JP, Garcia MJ 2011 Proposal that Mycobacterium massiliense and Mycobacterium bolletii be united and reclassified as Mycobacterium abscessus subsp bolletii comb nov., designation of Mycobacterium abscessus subsp abscessus subsp nov and emended description of Mycobacterium abscessus Int J Syst Evol Microbiol 61:2311–2313 10.1099/ijs.0.023770-0 33.Ripoll F, Pasek S, Schenowitz C, Dossat C, Barbe V, Rottman M, Macheras E, Heym B, Herrmann JL, Daffe M, Brosch R, Risler JL, Gaillard JL 2009 Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus PLoS 10.1371/journal.pone.0005660 64 One 4:e5660 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU 65 Chủng chuẩn: M.Avium ATCC-25291 Đƣợc nhập từ Công Ty: Microbiologics Inc Hoa Kỳ (http://microbiologics.com/Products/All-KWIK-STIK-Products/0544P) Cấy vạch đĩa peptri Chủng chuẩn Avium ATCC® 25291TM (đốm trắng) đƣợc nuôi cấy môi trƣờng lowenstein Jansen phù hợp Chủng vi khuẩn thu nhận từ bệnh nhân đƣợc nuôi ống thạch nghiêng chứa môi trƣờng Lowenstein thời gian tuần 66 Mycobacterium abscesus complex môi trường Lowenstein – Jensen sau tuần nuôi cấy 67