Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm từ rừng quốc gia cúc phương ninh bình sinh tổng hợp acetyl xylan esterase và bước đầu tinh sạch enzyme này

Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn PGS TS Lê Mai Hương cho em hội làm việc học tập phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Viêt Nam Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Đỗ Hữu Nghị tận tình bảo, dạy dỗ, hướng dẫn em để em hồn thành tốt khóa luận Em xin chân thành cảm ơn cán nhân viên phòng yêu quý, tận tình giúp đỡ em, tạo điều kiện thuận lợi cho em trình thực tập phòng Sinh học thực nghiệm Em xin chân thành cảm ơn thầy, cô khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội tận tình giảng dạy giúp đỡ em thời gian học tập trường Cuối em kính chúc quý thầy cô, cô chú, anh chị phịng Sinh học thực nghiệm ln dồi sức khỏe, đạt nhiều thành công nghiệp nghiên cứu khoa học truyền đạt tri thức cho hệ sinh viên trẻ Hà Nội, ngày 21 tháng năm 2015 Sinh viên thực Hà Thị Như Quỳnh Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu nấm đảm (Basidiomycota) nấm túi (Ascomycota) 1.1.1 Nấm đảm (Basidiomycota) 1.1.2 Nấm túi (Ascomycota) `1.2 Cấu trúc đặc điểm xylan pectin enzyme carbohydrate esterase thủy phân xylan 1.2.1 Cấu trúc đặc điểm xylan 1.2.2 Cấu trúc đặc điểm pectin 1.2.3 Các enzym carbohydrate esterase thủy phân xylan CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14 2.1 Nguyên liệu 14 2.1.1 Chủng nấm 14 2.1.2 Các loại môi trường 14 2.1.3 Máy móc, thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 15 2.1.4 Hóa chất 15 2.2 Phương pháp 16 2.2.1 Phân lập nấm 16 2.2.2Sàng lọc chủng nấm có khả sinh enzyme acetyl(xylan) esterase 16 2.2.3 Môi trường sàng lọc, cảm ứng sinh tổng hợp enzyme 17 2.2.4 Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme 17 Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 2.2.5 Động học lên men sinh tổng hợp enzyme 18 2.2.6 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 18 2.2.7 Tách chiết tinh enzyme 18 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Kết phân lập 20 3.2 Kết sàng lọc lựa chọn chủng nấm sinh enzyme cao 20 3.3 Cơ chất điều kiện thích hợp lên men sinh tổng hợp enzyme nấm Alternaria sp SP66 23 3.3.1 Cơ chất cảm ứng sinh tổng hợp acetyl(xylan) esterase 23 3.3.2 Điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp cho lên men sinh tổng hợp enzyme chủng nấm Alternaria sp SP66 25 3.4 Kết (bước đầu) tinh acetyl(xylan) esterase 27 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CS: Cộng VSV: Vi sinh vật Mw: Trọng lượng phân tử (molecular weight) km: Hằng số xúc tác(michaelis constant) pI: Điểm đẳng điện(Isoelectrics point) Vmax:Vận tốc phản ứng cực đại (maximal Velocity) Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Đặc tính số acetyl(xylan) esterase từ nguồn vi sinh vật (bao gồm enzyme tái tổ hợp) 13 Bảng 2: Hoạt tính sinh acetyl(xylan) esterase (AE) chủng nấm nghiên cứu 21 Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình : Các dạng thể nấm túi Ascomycota Hình 2: Cấu trúc xylan enzym thủy phân xylan Hình 3: Các phần acetyl hóa feruloyl cấu trúc pectin Hình 4: Chủng nấm SP66 phân lập từ rừng quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình) phát triển mơi trường thạch 22 Hình 5: Trình tự nucleotide chủng nấm SP66 23 Hình 6: Bước đầu tinh protein biểu hoạt tính acetyl(xylan) esterase từ môi trường nuôi cấy nấm Alternaria sp SP66 sắc kí trao đổi anion DEAE Sepharose 27 Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1: Hoạt tính sinh acetyl(xylan) esterase chủng nấm Alternaria sp SP66 điều kiện môi trường bổ sung chất khác 24 Biểu đồ 2: Hoạt tính sinh acetyl(xylan) esterase chủng Alternaria sp SP66 môi trường nuôi cấy lỏng chất rơm giá trị nhiệt độ khác 25 Biểu đồ 3: Hoạt tính sinh acetyl(xylan) esterase chủng Alternaria sp SP66 môi trường nuôi cấy lỏng chất rơm giá trị pH khác 26 Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Hiện trái đất, năm thực vật sản sinh lượng sinh khối khổng lồ ước tính đạt tới bốn mươi tỷ Tất hoạt động người loài động vật cần đến thực vật Chúng nguồn lương thực để nuôi sống người động vật đồng thời nguồn cung cấp nguyên, nhiên vật liệu cho ngành cơng nghiệp Để thay đổi tính chất vật liệu đầu vào cho phù hợp với sản phẩm mong đợi người ta phải tìm cách thay đổi cấu trúccủa thành tế bào thực vật Tuy nhiên thành tế bào thực vật lại có cấu tạo vững cellulose, hemicellulose lignin để phá hủy phần tồn chúng người ta thường sử dụng phương pháp hóa – lý xử lý nhiệt độ cao, áp suất cao, hóa chất mạnh axit mạnh hay kiềm mạnh Do chi phí để sản xuất sản phẩm giấy thường cao gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến mơi trường sinh thái Chính mà u cầu đặt phải thay phương pháp an tồn mơi trường Và giải pháp cho vấn đề loại enzym thủy phân polymer sinh học kể Nhưng để phân giải hiệu polymer bền này, enzyme phân giải mạch chính, cần có enzyme thủy phân liên kết ester thuộc nhóm carbohydrateesterase (CE) như: acetyl(xylan) esterase; cinnamoyl esterase; feruloyl esterase; carboxyl esterase; S-formylglutathione hydrolase; N-acetylglucosamine 6-phosphate deacetylase; N-acetylglucosamine 6-phosphate deacetylase…Trong tham gia vào q trình chuyển hóa lignocellulose chủ yếu có p-coumaryl/feruloyl esterase acetyl(xylan) esterase, hoạt động mạch nhánh cấu trúc polysaccharide thành tế bào để phân cắt liên kết cầu nối chuỗi xylan xylan với lignin; chúng đóng vai trị quan trọng giai đoạn đầu trình phân hủy lignocellulose (Williamson & cs., 1998, Wong 2006) Theo sở liệu CAZy (http://www.cazy.org; Cantarel& cs., 2009), carbohydrate esterase enzyme xúc tác đề-acetyl hóa liên kết O- hay N- saccharide vị trí thế, ester hay amid, đơn vị đường đóng vai trị alcohol hay amin Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 Một enzyme quan tâm enzyme acetyl(xylan) esterase vai trò chúng ứng dụng công nghệ sản xuất giấy bột giấy, dệt may, công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi,… Tuy ứng dụng nhiều lĩnh vực sống, ứng dụng thực tiễn enzyme có hạn chế thiếu thơng tin đặc tính xúc tác, điều kiện tối ưu sinh tổng hợp enzyme sử dụng quy mô lớn Thông qua đề tài nghiên cứu: “Phân lập tuyển chọn chủng nấm từ rừng quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình) sinh tổng hợp acetyl(xylan) esterase bước đầu tinh enzyme này” hy vọng bước đầu tuyển chọn chủng nấm có khả sinh tổng hợp enzyme acetyl(xylan) esterase, biết có vai trị liên quan đến chuyển hóa xylan, cơng cụ quan trọng nghiên cứu chế cấu trúc thành tế bào thực vật bước đầu thu nhận enzyme Mục tiêu đề tài • Phân lập, định tên (bằng phương pháp hình thái sinh học phân tử) số chủng (nấm đảm, nấm túi) rừng quốc gia Cúc Phương • Đánh giá tuyển chọn chủng có khả sinh tổng hợp enzyme acetyl(xylan)esterase • Bước đầu tinh protein enzyme có hoạt tính acetyl(xylan) esterase từ (một) chủng nấm phân lập Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1Giới thiệu nấm đảm (Basidiomycota) nấm túi (Ascomycota) 1.1.1 Nấm đảm (Basidiomycota) • Đặc điểm Nấm đảm (Basidiomycota) lớp nấm lớn, số hoại sinh, nhiều lồi ăn đa số kí sinh thực vật Lớp nấm phổ biến, chúng gồm nấm ăn, nấm cỏ giầy, đặc trưng cấu tạo đảm bào tử đảm Ở nấm đảm khuẩn ti có vách ngăn bào tử không di động Khuẩn ti nấm đảm sinh phồng lên đặc trưng, gọi u nối, chúng đóng vai trị đặc biệt di truyền hạch nhân Hầu hết nấm đảm sống cạn Hệ sợi nấm phát triển, sợi nấm có vách ngăn ngang chưa hồn chỉnh Sinh sản vơ tính đính bào tử, sinh sản hữu tính bào tử đảm hình thành ngồi đảm Q trình sinh sản hữu tính diễn sau: Các bào tử đảm, hình thái giống nhau, mặt sinh lý có khác nhau, nảy mầm cho loại sợi nấm sơ cấp khác tính (gọi sợi âm sợi dương) Mỗi tế bào sợi mang nhân đơn bội Khi tế bào đầu sợi gặp kết hợp thành tế bào nhân phát triển thành sợi thứ cấp có đời sống kéo dài Ðến lúc tế bào đầu sợi mọc ống nhỏ hướng phía gốc tế bào hai nhân phân chia thành 4, đồng thời xuất vách ngăn, tách thành tế bào: tế bào đỉnh chứa nhân, tế bào ống tế bào chân gốc chứa nhân (2 tế bào sau hợp lại thành tế bào có nhân) Tế bào đỉnh phát triển thành đảm: nhân kết hợp với phân chia liên tiếp lần, lần đầu giản nhiễm, nhân Tế bào phình to ra, phía mọc u nhỏ, nhân chui vào u biến thành bào tử đảm mọc bên ngồi đảm • Phân loại Dựa vào đặc điểm nấm đảm, số tác giả chia lớp nấm thành phân lớp Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 Dịch chiết thơ có hoạt tính acetyl(xylan) esterase thẩm tích 2-3 lần với đệm Na-acetate (10 mM, pH 4.5) Sau nạp mẫu lên cột trao đổi anion DEAE Sepharose CL-6B (GE Healthcare) Các protein hoạt tính acetyl(xylan) esterase rửa giải với gradient muối NaCl từ 0-1.5M đệm Na-acetate 10 mM, pH 4.5 Thu phân đoạn (4ml/phân đoạn) với tốc độ dòng 3ml/ph Các phân đoạn xác định hàm lượng protein hoạt tính enzyme với chất p-nitrophenyl acetate (mục 2.2.6) Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 19 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập Các mẫu (nấm, lá, gỗ mục) thu thập từ Vườn quốc gia Cúc Phương tiến hành phân lập môi trường thạch malt có bổ sung kháng sinh Sau đến ngày nuôi tủ ổn nhiệt 300C khuẩn lạc khác cấy chuyển sang đĩa petri chứa môi trường thạch malt riêng biệt tiếp tục cấy chuyển đến lần để làm Dựa việc quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc hệ sợi, chủng nấm tập hợp thành sưu tập gồm 16 chủng, sưu tập dùng để thử khả sinh tổng tổng hợp acetyl(xylan) esterase thí nghiệm 3.2 Kết sàng lọc lựa chọn chủng nấm sinh enzyme cao • Kết sàng lọc mơi trường rắn: Để đánh giá xác hoạt tính chủng nấm thử nghiệm nhằm tìm chủng có hoạt tính tốt cho mục tiêu nghiên cứu sâu hơn, thực sàng lọc hoạt tính enzyme acetyl(xylan) esterase chủng nấm mơi trường ni cấy rắn có bổ sung nguồn lignocelluloses tự nhiên (mùn gỗ rơm) Việc thử hoạt tính enzyme chủng nấm thực sau 25 ngày nuôi cấy môi trường trên, hoạt tính cao chủng nấm sau ngày xác định so sánh với chủng nấm Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 20 Bảng 2: Hoạt tính sinh acetyl(xylan) esterase (AE) chủng nấm nghiên cứu STT Tên chủng Hoạt độ enzyme (U/L) Nấm đảm (Basidiomycota) Tyromyces lacteus SH01 Poria versipora HL02 Trametes palisoti SH05 18,6 Marasmius maximus SH02 Polystictus didrichsenii SH12 24,8 SH03 11,4 Ganoderma austral G2 Nấm túi (Ascomycota) Bisporella citrine SH30 Hexagonia apiaria SH01 10 Xylaria sp.SH02 6,2 Daldinia concentrica Rye00 12 Xylariasp SH03 3,8 13 Daldinia SH 01 14 CP564 17,5 15 SP66 193,4 16 Kretzschmaria deusta SH03 11 Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 21 Hình 4: Chủng nấm SP66 phân lập từ rừng quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình) phát triển môi trường thạch Kết Bảng cho thấy, có số 16 chủng nấm phân lập biểu hoạt tính sinh enzyme acetyl(xylan) esterase, có chủng thuộc Ascomycota chủng thuộc Basidiomycota Đặc biệt, hoạt độ enzyme acetyl(xylan) esterase chủng nấm SP66 (thuộc nhóm nấm Ascomycota) có giá trị cao 193,4U/L Hoạt độ tương đối cao quan sát hai chủng nấm thuộc Basidiomyota làSH05 SH12 với hoạt tính 18,6U/L 24,8U/L Nhìn chung, xét theo tỉ lệ (%) biểu hoạt tính enzyme acetyl(xylan) esterase lồi nấm nghiên cứu thuộc ngành Ascomycota (44,4%, số chủng) cao so với nấm thuộc ngành Basidiomycota (42,9%, số chủng nấm) Từ kết trên, lựa chọn chủng ký hiệu SP66 để tiến hành khảo sát điều kiện tối ưu cho sinh trưởng, phát triển khả sinh enzyme acetyl(xylan) esterase Vì vậy, chủng SP66 định tên phương pháp sinh học phân tử kết hợp với phân loại hình thái (mục 2.2.1) Kết quảcho thấy trình tựmẫu nấm SP66 (Hình 5) tương đồng cao 99% với số loài chi Alternaria (Alternaria tenuissima JX523613, Alternaria compacta FR846405, Alternaria tomatophila HE803347, ) thuộc họ Pleosporaceae Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 22 > SP66 GCGGGCTGGACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCT TGTCTTTTGGGGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGAC AAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATT ACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGC GAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTT TGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCG TCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTG CTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCG CAGCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCAATTAAGCCT TTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGC ATATCAATAAAGCGGAGGA Hình5: Trình tự nucleotide chủng nấm SP66 có độ dài 572 nucleotide tương đồng cao (99%) với số loài chi Alternaria 3.3 Cơ chất điều kiện thích hợp lên men sinh tổng hợp enzyme nấm Alternaria sp SP66 Trong phần lớn trường hợp thành phần mơi trường, thời gian nuôi cấy, nhiệt độ pH… yếu tố ảnh hưởng nhiều đến khả sinh tổng hợp enzyme nấm Các yếu tố điều chỉnh để làm tăng sinh trưởng, suất hàm lượng chất có hoạt tính sinh học Dưới đây, khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến khả sinh trưởng phát triển đến khả sinh tổng hợp enzyme acetyl(xylan) esterase chủng nấm lựa chọn 3.3.1 Cơ chất cảm ứng sinh tổng hợp acetyl(xylan) esterase Để khảo sát chất cảm ứng thích hợp cho sinh tổng hợp acetyl(xylan) esterase chủng Alternaria sp SP66, tiến hành nuôi lắc môi trường sử dụng chất khác bao gồm: bã ngô (BN), mùn gỗ (MG), rơm (RR), Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 23 oliu(Olv),triglyceride (Tri) đối chứng (ĐC), 25°C,200 vòng/phút, 27 ngày Kết thể biểu đồ sau: Hoạt tính acetyl(xylan) esterase (U/L) 160 140 120 MG 100 RR 80 BN 60 Olv Tri 40 ĐC 20 0 12 15 18 21 24 27 Thời gian (Ngày) Biểu đồ 1: Hoạt tính sinh acetyl(xylan) esterase chủng nấm Alternariasp SP66 điều kiện môi trường bổ sung chất khác nhau: bã ngô (BN), mùn gỗ (MG), rơm (RR), oliu (Olv), triglyceride (Tri) đối chứng (ĐC) Kết thử nghiệm môi trường nuôi cấy lỏng cho thấy, nguồn carbohydrate có ảnh hưởng khác đến sinh tổng hợp acetyl(xylan) esterase chủng Nguồn cacbohydrate thô rơm, mùn gỗ bã ngô cho thấy cảm ứng sinh enzyme mạnh Theo đó, hoạt độ acetyl(xylan) esterase tăng dần theo thời gian giá trị cao đạt tới 131,9U/Ltrong môi trường 2% rơm sau 12 ngày nuôi cấy lắc, hoạt độ acetyl(xylan) esterase cao xác định suốt trình sinh trưởng mùn gỗ với hoạt tính ~125,4U/L, sau giảm dần.Đáng ý, chủng Alternaria sp SP66 gần không biểu hoạt tính enzyme mơi trường bổ sung 2% chất olive môi trường bổ sung chất triglyceride (phần ester có nhiều dầu thực vật) hoạt tính enzyme đo hoạt độ cao 73,2U/L Qua thí nghiệm, chúng tơi chọn mơi trường chất rơm để thực bước Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 24 nghiên cứu Vì môi trường rơm, khả sinh tổng hợp enzyme acetyl(xylan) esterase chủng nấm Alternaria sp SP66 tương đối cao rơm nguồn chất giàu lignocellulose dễ kiếm, giá thành rẻ 3.3.2 Điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp cho lên men sinh tổng hợp enzymebởi chủng nấm Alternaria sp SP66 Nhiệt độ pH yếu tố quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến khả sinh trưởng phát triển đến khả sinh trưởng phát triển nấm, định hiệu suất q trình lên men • Nhiệt độ Đối với chủng nấm, dải nhiệt độ thích hợp cho phát triển chúng thường nằm khoảng từ 28 - 35°C Để đánh giá xác ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp enzyme acetyl(xylan) esterase chủng nấm Alternaria sp SP66, chúng tơi tiến hành thí nghiệm ni cấy chúng mơi trường lên men lỏng có bổ sung 2% rơm giá trị nhiệt độ 23, 30, 35, 40 45°C thời gian tuần Kết thí nghiệm biểu biểu đồ U/L 120 100 80 Hoạt độ acetyl esteras e (U/L) 60 40 20 23°C 30°C 35°C 40°C 45°C Nhiệt độ (°C) Biểu đồ2: Hoạt tính sinh acetyl(xylan) esterase chủng Alternaria sp.SP66 môi trường nuôi cấy lỏng chất rơm giá trị nhiệt độ khác Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 25 Từ Biểu đồ cho thấy, nhiệt độ ảnh hưởng rõ ràng đến khả sinh tổng hợp enzyme acetyl(xylan) esterase Khoảng nhiệt độ phù hợp cho phát triển sinh trưởng chủng nấm khoảng từ 23 -30°C Trong đó, hoạt độ enzyme cao xác định 96,78U/L 30°C Và nhiệt độ tăng khả sinh enzyme chủng giảm (hoạt độ enzyme giảm ~33% nhiệt độ tăng từ 30 -35°C) Và ni cấy 45°C hoạt tính acetyl(xylan) esterase gần khơng biểu • Ảnh hưởng pH pH yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến khả sinh trưởng phát triển chủng VSV trình lên men.Khoảng pH phù hợp cho phát triển nấm thường nằm khoảng từ 5,0 đến 8,0 Ở thí nghiệm tiếp theo, tiến hành nuôi cấy chủng nấm Alternaria sp SP66 giá trị pH khác để đánh giá xác ảnh hưởng pH đến khả sinh acetyl(xylan) esterase Kết thí nghiệm biểu biểu đồ sau : U/L 120 100 Hoạt độ acetyl esterase (U/L) 80 60 40 20 5,0 5,5 6,0 pH 6.5 7,0 8,0 Biểu đồ 3: Hoạt tính sinh acetyl(xylan) esterase chủng Alternaria sp SP66 môi trường nuôi cấy lỏng chất rơm giá trị pH khác Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 26 Kết từ biểu đồ chủng Alternaria sp.SP66 sinh trưởng phát triển tốt môi trường bổ sung chất rơm khoảng pH 5,5 – 6,5 Trong đó, pH 6,0 thích hợp cho phát triển sinh trưởng chủng nấm Tại pH 6,0 hoạt độ acetyl(xylan) esterase đo 104,84U/L, cao so với pH khác Vì vậy, nghiên cứu tiếp theo, chúng tơi lựa chọn pH 6,0 ph thích hợp cho sinh trưởng khả sinh enzyme acetyl(xylan) esterase chủng nấm Alternaria sp SP66 3.4 Kết (bước đầu) tinh acetyl(xylan) esterase Dịch chiết enzyme thô (8650ml) từ môi trường nuôi cấy nấm sau tuần cô đặc siêu lọc (màng lọc 10 kDa cut-off) thu 1280ml Sau đó, protein có hoạt tính enzymecó khả chuyển hóa chất methyl acetate (acetyl(xylan) esterase) tinh cột sắc ký lỏng Bước đầu, trình rửa giải protein thực qua sắc ký trao đổi anion DEAE Sepharose Hình 6: Bước đầu tinh protein biểu hoạt tính acetyl(xylan) esterase từ môi trường nuôi cấy nấm Alternaria sp SP66 sắc kí trao đổi anion DEAE Sepharose (-) Protein (mg/ml) hoạt tính acetyl(xylan) esterase Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 27 Kết thu lượng protein tổng 183.4mg phân đoạn có biểu hoạt tính acetyl(xylan) esterase thể tích đệm rửa 488-528ml với hoạt tính cao đạt 28,2U/ml (tổng hoạt tính 629U) (Hình 6), phân đoạn có sử dụng cho nghiên cứu để tinh enzyme từ dịch lên men chủng Alternaria sp SP66 nghiên cứu đặc tính protein enzyme Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận • Từ mẫu nấm thu Vườn quốc gia Cúc phương (Ninh Bình), chúng tơi tiến hành phân lập 16 chủng nấm, chủng thuộc ngành nấm đảm (Basidiomycota) chủng thuộc ngành nấmtúi (Ascomycota) • Từ chủng phân lập xác định chủng có khả sinh enzyme acetyl(xylan) esterase (hoạt tính từ 3,8U/L (chủng Xylaria sp SH03) đến 193,4U/L (chủng ký hiệu SP66)) • Chủng có khả sinh enzyme cao (SP66) định tên phương pháp định tên sinh học phân tử loàiAlternaria sp • Cơ chất giàu lignocellulose thích hợp cho phát triển sinh tổng hợp enzyme chủng Alternaria sp SP66 rơm mùn gỗ với hoạt tính acetyl(xylan) esterase đạt 131,9U/L 125,4U/L sau 12 ngày ni cấy • pH nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme Alternaria sp SP66 pH6 30oC • Bước đầu tinh enzyme từ môi trường lến men lỏng Alternaria sp SP66 với phân đoạn hoạt tính acetyl(xylan) esterase với tổng hoạt tính 629U phân tách cột trao đổi anion DEAE Sepharose Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 29 Kiến nghị Từ kết nghiên cứu cho thấy chủng nấm túi Alternaria sp SP66 có khả sinh tổng hợp enzyme acetyl(xylan) esterase cao môi trường chất vật liệu thô, dễ kiếm Bước đầu tinh phân đoạn có hoạt tính enzyme qua sắc ký trao đổi ion, bước tinh protein (Vd sắc ký lực, sắc ký lọc gel…) cần thực để thu enzyme tinh sạch, từ nghiên cứu đặc tính hóa-lý đặc hiệu chất enzyme (MW, pI, km, Vmax…) Tiếp tục nghiên cứu khả sinh enzyme thuộc nhóm carbohydrate esterase (như feruloyl esterase) từ chủng Alternaria sp SP66 Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO Hồ Sĩ Tráng, Cơ sở hóa học gỗ xenluloza, tập tập 2, NXB Khoa học kĩ thuật,2006 Benoit I, Danchin EG, Bleichrodt RJ & de Vries RP (2008) Biotechnological applications and potential of fungal feruloyl esterases based on prevalence, classification and biochemical diversity Biotechnol Lett 30: 387-396 Biely, P (2012) Microbial carbohydrate esterases deacetylating plant polysaccharides Biotechnol Adv.30: 1575-1588 Christakopoulos, P., Mamma, D., Kekos, D., Macris, B (1999) Enhanced acetyl esterase production by Fusarium oxysporum World J Microbiol Biotechnol.15: 443-446 Gordillo F, Caputo V, Peirano A, et al (2006) Penicillium purpurogenum produces a family acetyl xylan esterase containing a carbohydrate-binding module: characterization of the protein and its gene Mycol Res.110: 1129-1139 Kawabata K, Yamamoto T, Hara A, et al (2000) Modifying effects of ferulic acid on azoxymethane-induced colon carcinogenesis in F344 rats Cancer Lett.157: 15-21 Liers C, Ullrich R, Steffen KT, Hatakka A & Hofrichter M (2006) Mineralization of 14 C-labelled synthetic lignin and extracellular enzyme activities of the wood-colonizing ascomycetes Xylaria hypoxylon and Xylaria polymorpha Appl Microbiol Biotechnol.69: 573-579 Mori H, Kawabata K, Yoshimi N, Tanaka T, Murakami T, Okada T & Murai H (1999) Chemopreventive effects of ferulic acid on oral and rice germ on large bowel carcinogenesis Anticancer Res.19: 3775-3778 Hirabayashi T, Ochiai H, Sakai S, Nakajima K & Terasawa K (1995) Inhibitory effect of ferulic acid and isoferulic acid on murine interleukin-8 production in response to influenza virus infections in vitro and in vivo Planta Med.61: 221226 Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 31 10 Edeas M, Khalfoun Y, Lazizi Y, Vergnes L, Labidalle S, Postaire E & Lindenbaum A (1995) Effect of the liposolubility of free radical scavengers on the production of antigen P24 from a HIV infected monocytic cell line C R Seances Soc Biol Fil 11 Pouvreaua, L., Jonathana, M.C., Kabel, M.A., Hinzb, S.W.A., Gruppena, H., Scholsa, H.A (2011) Characterization and mode of action of two acetyl xylan esterases from Chrysosporium lucknowense active towards acetylated xylans 12 Linden J, Samara M & Decker S (1994) Purification and characterization of an acetyl esterase from Aspergillus niger 13 Sundberg M, Poutanen K (1991) "Purification and properties of two acetylxylan esterases of Trichoderma reesei".Biotechnol Appl Biochem 14 Poutanen K, Sundberg M, Korte H, Puls J (1990) "Deacetylation of xylans by acetyl esterases of Trichoderma reesei" Appl Microbiol Biotechnol 15 Puls, J., Chemistry and biochemistry of hemicellulose: Relationship between hemicellulose structure and enzymes required for hydrolysis, Macromol Symp 120, 183-196, 1997 16 Bissoon, S., Christov, L and Singh, S., Bleach boosting effects of purified xylanase from Thermomyces lanuginosus SSBP on bagasse pulp, Process Biochem 37, 567-572, 2002 17 Dervilly, G., Thibault, J F and Saulnier, L., Experimental evidence for a semiflexibile conformation for arabinoxylans, Carbohydrate Res 330, 365-372, 2001 18 Wong, K.K.Y., Tan, L U L and Saddler, J N., Mutiplicity of β-1-4-xylanase in microorganisms: Functions and application, Microbial, Rev 52, 305-317, 1988 19 Kulkami, N., Shendye, A and Rao, M., Molecular and biotechnological asspects of xylanase FEMS Microbiol Rev 23, 411-456, 1990 20 Cantarel, B.L., Coutinho, P.M., Rancurel, C., Bernard, T., Lombard, V., Henrissat, B (2009) The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics Nucleic Acids Res 37:D233-238 Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 32 21 Booth C (1971), The genus Fusarium, Commonwealth Mycologycal Institute, Kew Surrey, England 22 Domsh K.H (1981), Compendium of soil fungi, W Gams and Traute-Heidi Anderson Academic Press, London-Orlando-New York Sandiego-Austin-TokyoSydney-Toronto 23 Sunna A, Antranikian G Xylanolytic enzyme từ nấm vi khuẩn Critical Reviews in Biotechnology 1997;17: 39–67 24 Kulkarni Sayali , Patil Sadichha and Satpute Surekha1 Microbial Esterases: An overview Department of Microbiology, Sinhgad College of Science, Ambegaon Bk, Pune-411041, Maharashtra, India 25 http://www.cazy.org Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 33