Nghiên cứu khả năng sinh độc tố một số chủng nấm mốc sinh độc tố trong không khí môi trường lao động

Khoa Công Nghệ Sinh Học Triệu Thị Vân Anh LỜI CẢM ƠN Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới Ths Vũ Duy Thanh KS Lê Anh Thư Phòng Giám sát Phân Tích Mơi Trường Lao Động, Trạm Quan Trắc Phân tích mơi trường lao động tận tình hướng dẫn tơi q trình nghiên cứu hồn thành khố luận Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể khoa học Phịng Giám sát Phân tích mơi trường lao động, Trạm quan trắc phân tích mơi trường lao động trực thuộc Viện nghiên cứu Khoa học kỹ thuật Bảo hộ lao động tạo điều kiện cho thực khố luận Nhân dịp tơi xin cảm ơn thầy cô khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội giúp đỡ q trình học tập trang bị cho tơi kiến thức, phương pháp nghiên cứu khoa học Cuối tơi muốn bày tỏ lịng cảm ơn tới gia đình, bạn bè động viên, tạo điều kiện vật chất tinh thần cho thời gian qua Xin chân thành cám ơn! Hà Nội, ngày 14 tháng năm 2017 Sinh viên Triệu Thị Vân Anh i Khoa Công Nghệ Sinh Học Triệu Thị Vân Anh DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MTLĐ Môi trường lao động SA Sabourand Agar CAM Coconut Agar Medium PDA Potato Dextro Agar NCBI National Center for Biotechnology Information d Đường kính khuẩn lạc ADM Aspergillus Differentiation Medium Base A fumigatus Aspergillus fumigatus A flavus Aspergillus flavus A niger Aspergillus niger A aureus Aspergillus aureus A nidulans Aspergillus nidulans A versicoler Aspergillus versicolor A terreus Aspergillus terreus A keratitis Aspergillus keratitis KT Kích thước CFU Colony Forming Unit ACGIH American conference of Governmental industrial hygienists ii Khoa Công Nghệ Sinh Học Triệu Thị Vân Anh DANH MỤC CÁC BẢNG STT Bảng Bảng Tên bảng Kết lấy mẫu nấm phương Trang 33 pháp chủ động Bảng Kết lấy mẫu nấm phương 34 pháp thụ động Bảng Ngày quan sát 08/2/2017 mẫu 37 VA-11 Bảng Ngày quan sát 10/2/2017 mẫu 38 VA-11 Bảng Ngày quan sát 14/2/2017 mẫu 39 VA-11 Bảng So sánh mẫu VA-11 môi trường 40 sau 10 ngày nuôi cấy Bảng Ngày quan sát 7/2/2017 mẫu VA-16 41 Bảng Ngày quan sát 9/2/2017 mẫu VA-16 42 Bảng Ngày quan sát 10/2/2017 mẫu 43 VA-16 10 Bảng 10 Ngày quan sát 12/2/2017 mẫu 44 VA-16 So sánh mẫu VA-16 môi trường 11 Bảng 11 12 Bảng 12 Kết quan sát vi thể mẫu VA-11 47 13 Bảng 13 Kết quan sát vi thể mẫu VA-16 49 sau 10 ngày nuôi cấy 45 iii Khoa Công Nghệ Sinh Học Triệu Thị Vân Anh DANH MỤC CÁC HÌNH TT Hình Tên hình Hình Hình Hình Các kiểu cuống bào tử đính Aspergillus 10 Hình Địa điểm lấy mẫu 32 Hình Cơ quan sinh sản mẫu VA-11 47 Hình Hình Cơ quan sinh sản mẫu VA-16 kính 4X 48 Hình Kết giải trình tự gen VA-11 50 Hình 10 Hình 10 11 Hình 11 Sợi nấm cấu tạo vách tế bào nấm (theo Samson ctv, 1995) Một số hình dạng khuẩn lạc nấm (theo Samson ctv, 1995) Cơ quan sinh sản mẫu VA-16 kính 40X So sánh độ tương đồng đoạn gen mẫu VA-11 với Genbank Kết giải trình tự gen VA-16 So sánh độ tương đồng đoạn gen mẫu VA-16 với Genbank Trang 7 48 51 53 54 iv Khoa Công Nghệ Sinh Học Triệu Thị Vân Anh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv MỞ ĐẦU 1.1 Tổng quan nấm mốc 1.1.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo 1.1.2 Đặc điểm sinh trưởng sinh sản 1.1.3 Phân loại nấm mốc 11 1.1.4 Vị trí, vai trị nấm mốc 13 1.2 Tổng quan nấm mốc có khả sinh độc tố giới 14 1.2.1 Tình hình nghiên cứu nấm mốc sinh độc tố 14 1.2.2 Phương pháp xác định nấm mốc sinh độc tố 16 1.3 Tình hình nghiên cứu Việt Nam nấm mốc sinh độc tố có khơng khí mơi trường lao động 21 1.3.1 Tình hình nghiên cứu nấm mốc sinh độc tố có khơng khí mơi trường lao động 21 1.3.2 Phương pháp xác định nấm mốc sinh độc tố 23 2.1 Đối tượng, phương pháp lấy mẫu nấm mốc khơng khí 25 2.2 Xác định đặc điểm sinh học nấm mốc sinh độc tố 29 2.2.1 Phương pháp quan sát hình thái ( đại thể, vi thể) 29 3.1 Kết lấy mẫu nấm mốc có khả sinh độc tố có mặt khơng khí mơi trường lao động 32 3.1.1 Mật độ nấm mốc sinh độc tố có khơng khí MTLĐ xác định phương pháp chủ động 32 3.1.2 Mật độ nấm mốc sinh độc tố có khơng khí MTLĐ xác định phương pháp thụ động 34 3.2 Kết đặc điểm sinh học chủng nấm mốc sinh độc tố có khơng khí MTLĐ mơi trường khác 35 3.2.1 Kết quan sát đại thể 36 3.2.2 Kết quan sát vi thể 46 3.3 Mức độ nguy hại nấm mốc sinh độc tố phân lập 56 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 4.1 Kết luận 59 4.2 Kiến nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 v Khoa Công nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Nấm Aspergillus spp chủng nấm lớn nhất, tồn khắp nơi hay gặp vùng khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới Nó có khoảng 100 lồi có khoảng 20-30 lồi gây bệnh cho người, thường gặp chủng A fumigatus, A flavus, A niger như: A aureus, A flavus gây viêm da; A niger gây viêm tai, phổi, dị ứng, hen; A nidulans, A versicolerr, A terreuss gây viêm da chân, tay, viêm quanh móng; A keratitis gây viêm giác mạc; đặc biệt A fumigatus A flavus hay gây viêm phổi.[10] Nấm Aspergillus spp tồn đất, không khí, thực phẩm ngơ, lúa hay thức ăn ôi thiu Ở nước ta, thời tiết nóng ẩm, môi trường sinh hoạt điều kiện vệ sinh chưa cao nên bệnh nấm dễ phát triển Nấm phát triển môi trường không cần ánh sáng mặt trời, môi trường nghèo chất dinh dưỡng, cần có nhiệt độ độ ẩm thích hợp Nấm tồn tự nhiên, khắp nơi giới hầu hết người tiếp xúc với nấm tình trạng nhiễm nấm trở nên gây bệnh phụ thuộc vào mức độ chất truyền nhiễm sức đề kháng thể.[17] Nhóm Aspergillus spp nhóm có nhiều chủng loại nấm sinh độc tố bào tử phát tán khơng khí, gặp điều kiện thuận lợi chúng sinh trưởng phát triển loại chất, sản phẩm khác nhau, chế biến lương thực nguy bị nhiễm độc tố cao bị bào tử nấm mốc xâm nhiễm Phạm vi ký chủ rộng, khả phát tán lớn nên việc phịng trừ nấm hại thường khó khăn Đặc biệt khơng khí khó kiểm sốt, chưa có nhiều nghiên cứu việc tiếp xúc với nấm mốc độc tố khơng khí, đưa giải pháp kiểm sốt chúng Khoa Cơng nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh Loại nấm có chủng lây truyền cho người qua đường hô hấp, lơ lửng khơng khí phát tán theo gió Nếu bị nấm Aspergillus spp nhiễm vào phổi khó nhận biết khơng có triệu chứng rõ rệt Chỉ tế bào nấm xâm lấn vào phế quản bệnh nhân có phản xạ ho Phương thức gây bệnh Aspergillus spp gây bệnh da sau tiến triển gây bệnh hệ thống ngược lại.[18] Ngồi nấm cịn gây bệnh hệ thần kinh: Khi nhiễm nấm bệnh nhân không điều trị ngay, thông qua hốc mặt hay hốc sọ, nấm xâm nhập vào bên gây viêm não, viêm tiểu não Có khoảng 100 loại vi nấm gây bệnh cho người, đó: 20 loại gây bệnh nội tạng làm chết người 35 loại gây bệnh nội tạng nhẹ, bệnh da mô da, mạch bạch huyết, 45 loại gây bệnh da màng nhày Các vi nấm gây bệnh nhiều yếu tố: men (vi nấm da), học (chốc đầu), độc tố (aflatoxin A flavus tiết ra), viêm (Cryptococcus neoformans) miễn dịch Một số bệnh vi nấm gây thường gặp chia làm nhóm chính: Nhóm bệnh vi nấm ngoại biên gây ra, nhóm bệnh vi nấm ngồi da, nhóm bệnh vi nấm nội tạng Các loại độc tố sinh từ loại nấm mốc điển hình như: -Aflatoxin: Aflatoxin tìm thấy nhiều khô dầu phộng, khô dầu dừa, bắp, cám, … A flavus A parasiticus sinh ra, độc tố gây tổn thương gan, thận, mật , làm giảm khả tiết sữa, đẻ trứng sức đề kháng gia súc, gia cầm Theo Tổ chức bệnh ung thư Quốc tế aflatoxin xếp vào danh sách tác nhân gây ung thư cho người Aflatoxin chủ yếu loài vi nấm A flavus A parasiticus tạo Ngoài Aspergillus spp chúng nguyên nhân gây bệnh cho động vật thực vật có người vật nuôi Khoa Công nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh -Ochatoxin A: A ochraceus sinh ra, nguyên liệu dễ nhiễm độc tố cám gạo, lúa mì, bột mì, bắp, đậu nành, cà phê Độc tố gây hại đến gan thận động vật Tương tự aflatoxin, độc tố gây nên giảm sức đề kháng tác nhân gây ung thư người -Citrinin: Độc tố sinh P citricum có nhiều gạo để mốc, độc tố gây hại cho thận, gây hoại tử nhiễm trùng làm tổn hại đến chất lượng quầy thịt -Tricothecenes (T2-toxin): F tricinotum sinh thường nhiễm nhiều bắp, gạo bị mốc Ảnh hưởng độc tố làm giảm tính thèm ăn gia súc, kèm theo triệu chứng nôn mửa làm giảm suất động vật ni Heo lồi gia súc nhạy cảm với tricothecenes -F2 -Toxin (zearlenon): F roseum sinh ra, theo quan sát thấy nhiều bắp, lúa mạch, lúa mì Heo loài động vật dễ quan sát, bị nhiễm độc âm hộ bị sưng đỏ, đơi núm vú sưng đỏ, dẫn tới sa trực tràng âm đạo, tử cung nở rộng có tượng thối hóa buồng trứng Trong số độc chất aflatoxin A flavus A parasiticus sinh có mức nguy hiểm lớn Aflatoxin bao gồm loại khác (B1, B2, G1, G2, M1 M3), độc tính cao aflatoxin B1 Sự nguy hiểm chỗ có khả gây hại với liều lượng nhỏ, kg thức ăn cần nhiễm mg đủ làm hỏng gan Độc chất lại bền vững với nhiệt, đem đun sôi 100 oC nồi bình thường nhiệt độ cao nồi áp suất, hay nhiệt độ từ máy ép đùn viên thức ăn gia súc aflatoxin khơng bị phân hủy Ngoài khả tạo số loại độc chất có số bệnh nguy hiểm tìm thấy nguyên nhân loại nấm gây Các aflatoxin cấu tạo gồm bốn hợp chất thuộc nhóm furanocouramin, sản phẩm trao đổi chất tạo A flavus A parasiticus Hiện có Khoa Cơng nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh 16 loại độc tố afalatoxin tìm thấy chế sinh độc tố phát ký hiệu B1, B2, G1, G2, M1, M2, P1, Q1 Các aflatoxin B1 G1 biết đến nhiều nhất, aflatoxin B1 có chứa vịng lacton aflatoxin G1 có chứa vịng lacton Qua nghiên cứu phát nhiều Aspergillus có gần 700 lồi có 19 lồi gây bệnh cho người Những lồi phân lập phỗ biến bao gồm: A fumigatus, A flavus, A niger, A terreus Trong đó, 90 % trường hợp nhiễm Aspergillus A Fumigatus Xuất phát từ vấn đề trên, đồng thời tham gia nghiên cứu đề tài cấp “Nghiên cứu phân lập định danh phương pháp sinh học phân tử số nấm mốc gây hại khơng khí mơi trường lao động” Trạm quan trắc phân tích mơi trường lao động - Viện Nghiên cứu Khoa học kỹ thuật Bảo Hộ lao động, đồng ý hướng dẫn ThS Vũ Duy Thanh, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu khả sinh độc tố số chủng nấm mốc phân lập không khí mơi trường lao động” Mục tiêu nghiên cứu Xác định khả sinh độc tố số nấm mốc phân lập khơng khí mơi trường lao động Nội dung nghiên cứu - Mật độ nấm mốc có khả sinh độc tố có khơng khí môi trường lao động sở chế biến nông sản - Xác định độc tố nấm mốc phân lập khơng khí sinh Khoa Cơng nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm mốc 1.1.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo 1.1.1.1 Đặc điểm hình thái kích thước Nấm mốc số nấm thể đơn bào có hình trứng, đa số có hình sợi, sợi có ngăn vách (đa bào) hay khơng có ngăn vách (đơn bào) Sợi nấm thường ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác tùy lồi Đường kính sợi nấm thường từ 3-5 µm, có đến 10 µm, chí đến mm Chiều dài sợi nấm tới vài chục cm Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng Các sợi nấm phân nhánh nhánh lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm (Hình 1) Trên mơi trường đặc trưng số chất tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm đoạn sợi nấm phát triển thành hệ sợi nấm có hình dạng định gọi khuẩn lạc nấm.(Hình 2) Nấm mốc có dạng: khuẩn ty (hay sợi nấm) bào tử [13] *Khuẩn ty (Hypha) hay sợi nấm: - Khuẩn ty có cấu tạo dạng sợi phân nhánh, sợi sinh trưởng đỉnh Khuẩn ty sinh từ bào tử, tùy loại mà khuẩn ty có hình lị xo, xoắn ốc, vợt, sừng hươu, lược… - Sợi nấm có loại: + Sợi nấm có vách ngăn: loại có phần lớn loại nấm mốc Sợi nấm chuỗi tế bào tạo nên Sợi nấm lớn lên tế bào không ngừng phân cắt, nên thể chúng có cấu tạo đa bào đơn nhân Ví dụ: Aspergillus, Penicillinum… Khoa Cơng nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh Hình 5: Cơ qua sinh sản mẫu VA-11 Bảng 12: Kết quan sát vi thể mẫu VA-11 Cơ quan sinh sản Đầu Cuống Thông số đánh giá Đặc điểm tầng cân đối, dày đặc, tầng Mọc từ môi trường từ sợi khí sinh Kích thước (µm) 52,13-160,65 x 10,71-107,1 16,06-214,2 x 2,75-3,3 Thể bình Hình chai 9,9-13,2 x 1,65-2,2 Bào tử Elip 3,3-4,4 x 2,2-3,3 Từ bảng 14 cho thấy VA-11 có đặc điểm gần trùng hợp với mô tả nhà nghiên cứu trước Nguyễn Lân Dũng Đặng Vũ Hồng Miên, kết định danh sơ mẫu VA-11 Penicillium purpurogenum 47 Khoa Công nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh *Đối với mẫu A16: Do kích thước khuẩn lạc lớn dẫn đến có khả kích thước bào tử lớn, dễ quan sát vi thể soi trực tiếp kính hiển vi quang học Qua nghiên cứu, lựa chọn phương pháp cắt miếng thạch đặt lamen lên miếng thạch vừa cấy để quan sát vật kính 4x 40x Hình 6: quan sinh sản mẫu VA-16 vật kính 40X Hình 7: mẫu VA-16 vật kính 4X 48 Khoa Cơng nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh Bảng 13: Kết quan sát vi thể mẫu VA-16 Cơ quan sinh sản Đầu Thơng số đánh giá Đặc điểm Hình cầu,tỏa tia xé rách Kích thước (µm) 75-275 Cuống Khơng màu,xù xì 150-1125 x15-19 Bọng Dạng gần cầu đến chùy 21-45 x 27 -64 lớp hình tam giác ngược 8-15 x 4,5-5 Lớp hình chai 7-11 x 4-5 Thể bình Bào tử Hình cầu oval,có gai mịn (xù xì) 4-5 Kết quan sát vi thể mẫu Aspergillus VA-16 cho thấy đầu mọc từ chất, hình cầu, hình tỏa tia, hình xé rách kích thước 75-275 µm, cuống khơng màu xù xì có kích thước 150-1125 x15-19 µm, bọng hình gần cầu đến chùy có kích thước 21-45 x 27 -64 µm, có loại thể bình lớp lớp 2, bào tử hình cầu có gai rõ có KT 4-5 µm Cho thấy có đặc điểm gần trùng hợp với mơ tả nhà nghiên cứu trước Nguyễn Lân Dũng Đặng Vũ Hồng Miên, kết định danh sơ mẫu Aspergillus VA-16 Aspergillus flavus 49 Khoa Công nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh 3.2.3 Kết sinh học phân tử Định danh phương pháp quan sát đại thể quan sát vi thể định danh chủng nấm Penicillium purpurogenum chủng nấm Aspergillus flavus có mặt khơng khí MTLĐ sở chế biến thức ăn gia súc Để khẳng định xác chủng nấm mốc Penicillium purpurogenum chủng nấm mốc Aspergillus flavus dùng phương pháp sinh học phân tử có đọ xác cao Trong nghiên cứu thực giải trình tự gen hai chủng nấm mốc VA-11 VA-16 phân lập khơng khí MTLĐ sở chế biến thức ăn gia súc Proconco Hải Phịng Kết giải trình tự gen trình bày 3.2.3.1 Kết sinh học phân tử mẫu VA-11 Hình 8: kết giải trình tự gen mẫu VA-11 50 Khoa Công nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh Penicillium purpureogenum genomic DNA sequence contains ITS1, 5.8S rRNA gene, ITS2, 28S rRNA gene, strain DI16-125 Sequence ID: LT558947.1Length: 1087Number of Matches: Related Information Range 1: 33 to 776GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities Gaps Strand 1375 bits(744) 0.0 744/744(100%) 0/744(0%) Plus/Minus Query CCAGACGGGATTCTCACCCTCTATGACGGCCCGTTCCAGGGCACTTAGACGGGGACCGCA 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 776 CCAGACGGGATTCTCACCCTCTATGACGGCCCGTTCCAGGGCACTTAGACGGGGACCGCA 717 Query 61 CCCGAAGCATCCTCTGCAAATTACAACTCGGACCCCAAAGGGGCCAGATTTCAAATTTGA 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 716 CCCGAAGCATCCTCTGCAAATTACAACTCGGACCCCAAAGGGGCCAGATTTCAAATTTGA 657 Query 121 GCTCTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTGAGGCAATCCCGGTTGGTTTCTTTTCCTCCGCT 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 656 GCTCTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTGAGGCAATCCCGGTTGGTTTCTTTTCCTCCGCT 597 Query 181 TATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAACTCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTTGTAAAA 240 Sbjct 596 TATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAACTCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTTGTAAAA 537 Query 241 AGATGTGGTGGTGACCAACCCCCGCAGGTCCTTCCCGAGCGAGTGACAGAGCCCCATACG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 536 AGATGTGGTGGTGACCAACCCCCGCAGGTCCTTCCCGAGCGAGTGACAGAGCCCCATACG 477 Query 301 CTCGAGGACCAGACGGACGTCGCCGCTGCCTTTCGGGCAGGTCCCCAGGGGGACCACACC 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 476 CTCGAGGACCAGACGGACGTCGCCGCTGCCTTTCGGGCAGGTCCCCAGGGGGACCACACC 417 Query 361 CAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAAT 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 416 CAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAAT 357 Query 421 GCCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACAT 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 51 Khoa Công nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh Sbjct 356 GCCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACAT 297 Query 481 TACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAA 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 296 TACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAA 237 Query 541 AGTTTTGACAATTTTCATATCACTCAGACAGCCCATCTTCATCAGGGTTCACAGAGCGCC 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 236 AGTTTTGACAATTTTCATATCACTCAGACAGCCCATCTTCATCAGGGTTCACAGAGCGCC 177 Query 601 TCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGACGGATGTCCCCCGGCGACCGGGTGGCCCCGGTGGGCCC 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 176 TCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGACGGATGTCCCCCGGCGACCGGGTGGCCCCGGTGGGCCC 117 Query 661 GCCGAAGCAACAGGTGTTGGAGACAAGGGTGGGAGGTTGGGCCGCGAGGGGCCCTCACTC 720 Sbjct 116 GCCGAAGCAACAGGTGTTGGAGACAAGGGTGGGAGGTTGGGCCGCGAGGGGCCCTCACTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Query 721 GGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCA 57 744 |||||||||||||||||||||||| Sbjct 56 GGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCA 33 Hình 9: So sánh độ tương đồng đoạn gen mẫu VA-11 với Genbank Kết định danh phương pháp sinh học phân tử cho thấy mẫu VA.11 có độ tương đồng 100% so với chủng nấm Kết hợp với so sánh đặc điểm hình thái khẳng định chủng nấm Penicillium purpurogenum Chủng nấm có khả sinh độc tố Rubrotoxin 52 Khoa Công nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh 3.2.3.2 Kết sinh học phân tử mẫu VA-16 Hình 10: Kết giải trình tự gen mẫu VA-16 53 Khoa Cơng nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh Aspergillus flavus isolate F4 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Sequence ID: JF951750.1Length: 956Number of Matches: Related Information Range 1: 78 to 953GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities Gaps 1618 bits(876) 0.0 876/876(100%) 0/876(0%) Query Strand Plus/Plus CCATCCCAGACGGGATTCTCACCCTCTCTGACGGCCCGTTCCAGGGCACTTAGACAGGGG 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 953 CCATCCCAGACGGGATTCTCACCCTCTCTGACGGCCCGTTCCAGGGCACTTAGACAGGGG 894 Query 61 CCGCACCCGAAGCATCCTCTGCAAATTACAATGCGGACCCCGAAGGAGCCAGCTTTCAAA 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 893 CCGCACCCGAAGCATCCTCTGCAAATTACAATGCGGACCCCGAAGGAGCCAGCTTTCAAA 834 Query 121 TTTGAGCTCTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTGAGGCAATCCCGGTTGGTTTCTTTTCCT 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 833 TTTGAGCTCTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTGAGGCAATCCCGGTTGGTTTCTTTTCCT 774 Query 181 CCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGA 240 Sbjct 773 CCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGA 714 Query 241 AAAAGATTGATTTGCGTTCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCC 300 Sbjct 713 AAAAGATTGATTTGCGTTCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCC 654 Query 301 CATACGCTCGAGGATCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTGGGGCCCGTcccccccGGAG 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 653 CATACGCTCGAGGATCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTGGGGCCCGTCCCCCCCGGAG 594 54 Khoa Công nghệ sinh học Query 361 Triệu Thị Vân Anh AGGGGACGACGACCCAACACACAAGCCGTGCTTGATGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGG 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 593 AGGGGACGACGACCCAACACACAAGCCGTGCTTGATGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGG 534 Query 421 CATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACGGAA 480 Sbjct 533 CATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACGGAA 474 Query 481 TTCTGCAATTCACACTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAG 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 473 TTCTGCAATTCACACTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAG 414 Query 541 AGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCGATACAATCAACTCAGACTTCACTAGATC 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 413 AGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCGATACAATCAACTCAGACTTCACTAGATC 354 Query 601 AGACAGAGTTCGTGGTGTCTCCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGCTGAGAGCCCCCGGCGGCC 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 353 AGACAGAGTTCGTGGTGTCTCCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGCTGAGAGCCCCCGGCGGCC 294 Query 661 ATGAATGGCGGGCCCGCCGAAGCAACTAAGGTACAGTAAACACGGGTGGGAGGTTGGGCT 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 293 ATGAATGGCGGGCCCGCCGAAGCAACTAAGGTACAGTAAACACGGGTGGGAGGTTGGGCT 234 Query 721 CGCTAGGAACCCTACACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTT 780 Sbjct 233 CGCTAGGAACCCTACACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTT 174 Query 781 ACGACTTTTACTTCCTCTAAATGACCGGGTTTGACCAACTTTCCGGCCCTGGGGGGTCGT 840 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 173 ACGACTTTTACTTCCTCTAAATGACCGGGTTTGACCAACTTTCCGGCCCTGGGGGGTCGT Query 841 TGCCAACCCTCCTGGGCCAGTCCGAAGGCCTCACCG 114 876 |||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 113 TGCCAACCCTCCTGGGCCAGTCCGAAGGCCTCACCG 78 Hình 13: So sánh độ tương đồng đoạn gen mẫu VA-16 với Genbank 55 Khoa Công nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh Kết định danh phương pháp sinh học phân tử cho thấy mẫu VA-16 có độ tương đồng 100% so với chủng nấm Kết hợp với so sánh đặc điểm hình thái khẳng định chủng nấm Aspergillus Flavus Chủng nấm có khả sinh độc tố Aflatoxin 3.3 Mức độ nguy hại nấm mốc sinh độc tố phân lập Kết nghiên cứu phát hai chủng nấm mốc Aspergillus Flavus Penicillium purpurogenum sinh độc tố Aflatoxin Rubrotoxin Theo khuyến cáo tổ chức WHO độc tố Aflatoxin xếp vào danh sách tác nhân gây ung thư cho người, tổn thương đến gan, thận, mật, làm giảm khả tiết sữa, đẻ trứng sức đề kháng gia súc, gia cầm Aflatoxin gây viêm da, viêm phổi, gan thận, mật Đối với bệnh nhân suy giảm miễn dịch mắc bệnh AIDS thường hay bị A flavus gây bệnh nấm da đầu Rubrotoxin gây phá hủy quan thể có phơi nhiễm lâu dài với gan, thận; viêm phổi, hen xuyễn, viêm dày… Ngoài Rubrotoxin gây thiếu máu xuất huyết gà Qua nghiên cứu cho thấy khơng khí MTLĐ sở chế biến thức ăn Proconco Hải Phịng có chứa nấm mốc Aspergillus Flavus Penicillium purpurogenum Kiểm tra kết lấy mẫu cho biết tổng nấm Aspergillus Flavus khơng khí MTLĐ chi nhánh công ty cổ phần Việt Pháp sản xuất thức ăn gia súc Proconco Hải Phòng 80 ± CFU/m3 khơng khí, tổng nấm Penicillium purpurogenum 65 ± CFU/m3 khơng khí Tổng nấm 145 ± CFU/m3 khơng khí, số lớn gần gấp lần mức kiến nghị WHO tổng nấm nhà cho chủng loại ( 50 CFU/m3 khơng khí) [14] Người lao động việc thường xuyên có nguy tiếp xúc với chủng nấm mốc gây hại nói chung hai chủng nấm 56 Khoa Công nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh Aspergillus Flavus Penicillium purpurogenum nói riêng ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, sản phẩm trình sản xuất 57 Khoa Công nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh 58 Khoa Công nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đã nghiên cứu lấy mẫu nấm mốc khơng khí MTLĐ chi nhánh công ty cổ phần Việt Pháp sản xuất thức ăn gia súc Proconco Hải Phòng phương pháp chủ động thụ động Kết xác định tổng nấm có khơng khí vị trí 153 ± 19 CFU/m3 khơng khí, vị trí 197±24 CFU/m3 khơng khí, vị trí 319 ± 24 CFU/m3 khơng khí Đã phân lập định danh nấm mốc Penicillium purpurogenum Aspergillus Flavus khơng khí MTLĐ sở chế biến lương thực Kết giải trình tự gen đoạn gen ITS khẳng định hai chủng nấm Penicillium purpurogenum Aspergillus Flavus với độ tương đồng so với Genbank 100% Đã đánh giá tổng nấm khơng khí MTLĐ sở chế biến thức ăn gia súc vượt mức cho phép số nước – tổ chức quốc tế ( Việt Nam chưa có quy chuẩn tổng nấm khơng khí MTLĐ ) Đã đánh giá tổng nấm khơng khí MTLĐ sở chế biến thức ăn gia súc vượt mức cho phép WHO 4.2 Kiến nghị Do thời gian nghiên cứu có hạn khuôn khổ luận văn thực định danh hết chủng nấm mốc có nguy sinh độc tố số chất hóa học khác khơng khí MTLĐ ảnh hưởng đến người lao động sản phẩm lương thực Kiến nghị đề tài tiếp tục nghiên cứu, định danh chủng nấm mốc sinh độc tố số chất hóa học gây hại.Đánh giá so sánh chủng thu với tiêu chuẩn WHO nước – tổ chức quốc tế 59 Khoa Công nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bệnh nấm Aspergillosis – chuyên trang y học từ PGS Nguyễn Ngọc Thụy Đại cương nấm vi nấm - VOER Đặng Vũ Hồng Miên (2015) “Hệ nấm mốc Việt Nam” NXB Khoa học kỹ thuật Nguyễn Quốc Tuấn, 2009 Đề tài "Khảo sát nhiễm vi sinh khơng khí phịng phẫu thuật, phòng hồi sức số bệnh viện thành phố hồ chí minh", Viện Vệ sinh - Y tế cơng cộng thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập II, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội http://www.baomoi.com/bo-kit-phat-hien-nhanh-doc-to-nam-trong- thuc-pham-se-duoc-san-xuat-so-luong-lon/c/4038188.epi Tiêu chuẩn ngành y tế: Thường quy kỹ thuật định danh nấm mốc Aspergillus Flavus, Aspergillus Niger, Aspergillus Fumigatus thực phẩm -Nhóm TQTP 52, TCN-TQTP 0001:2003 Có hiệu lực từ ngày 25 tháng năm 2003 Vũ Duy Thanh, Lê Anh Thư, Nguyễn Thế Trang (2015) “Nghiên cứu đánh giá có mặt nấm vi khuẩn hiếu khí khơng khí sở sản xuất thức ăn gia súc” Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học tự nhiên công nghệ Tập 6S, trang 150 – 157 Vũ Duy Thanh (2014) Đề tài “ Nghiên cứu xây dựng quy trình đánh giá có mặt nấm mốc vi khuẩn hiếu khí khơng khí mơi 60 Khoa Công nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh trường lao động”, Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam-Viện sinh thái tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học 10 Lê Thị Thu Hằng (2009) ).“ Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nấm bệnh Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin kỹ thuật PCR” Luận văn thạc sỹ Học viện Nông nghiệp 11 Ngô Thị Mai – “Sự ô nhiễm vi sinh vật không khí, phương pháp kiểm tra tiêu chuẩn đánh giá” 12 Nấm mốc độc tố aflatoxin: ĐHQG TPHCM-Trường ĐH Bách khoa-Khoa Kỹ Thuật Hóa Học-Bộ mơn Cơng Nghệ Hóa Và Thực Phẩm 13 Thư viện học liệu Mở Việt Nam Giống (chi ) Aspergillus TÀI LIỆU TIẾNG ANH 14 Domenico Davolos, Biancamaria Pietrangeli DNA sequencing and phylogenetic analysis of allergen- encoding genes form airborne moulds and Yeast Prevetion today -July-September 2007.Vol 3, n3, p 23-35 15 James Clayton (1986) “Airborne aflatoxin and Aspergillus flavus/Parasiticus prevalence in Georgia corn processing facilities” University of Georgia 16 Sales Anthony C * Takumi Yoshizawa (2006) Journal of the Science of Food and Agriculture,Volume 86 , Issue 15 , pages 2534–2542 17 Masayuki Machida Katsuya Gomi (2010) Aspergillus : Molecular Biology and Genomics Nhà xuất Caister Academic Press 18 Ronald P de Vries , Isabelle Benoit Gelber Mikael Rørdam Andersen (2016) Aspergillus and Penicillium in the Post-genomic Era Nhà xuất Caister Academic Press 61